作者：李永哲
出版社：人民卫生出版社
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自身抗体免疫荧光图谱试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
自身抗体免疫荧光图谱/李永哲主编．—北京：人民卫生出版社，2014
ISBN 978－7－117－19535－5
Ⅰ．①自… Ⅱ．①李… Ⅲ．①自身抗体－免疫荧光－图谱 Ⅳ．①Q939．91－64
中国版本图书馆CIP数据核字（2014）第175801号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
版权所有，侵权必究！自身抗体免疫荧光图谱
主 编：李永哲
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制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司
排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司
制作时间：2018年1月
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标准书号：ISBN 978－7－117－19535－5/R·19536
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李永哲 北京协和医院研究员，教授，博士研究生导师，风湿免疫科实验室负责人。主要从事自身免疫性疾病实验诊断技术临床应用及发病机制等研究工作。20世纪80年代末开始从事自身抗体检测及临床应用工作，90年代初在国内建立抗中性粒细胞胞浆抗体免疫荧光检测方法，并应用于临床常规检测。二十多年来致力于自身抗体检测及临床应用工作，尤其近年在卫生行业科研专项“风湿免疫病诊疗关键技术临床推广及转化应用研究”项目的支持下，在全国30个省、直辖市、自治区开展针对自身抗体等风湿免疫病实验诊断技术的检测方法、质量保证、临床意义和临床应用等的“风湿免疫病实验诊断技术全国培训项目”系列巡讲，听众逾万人，涉及3000余家医院，为全国自身抗体检测临床推广普及做了大量工作。以课题负责人承担国家自然科学基金项目6项。作为课题主要成员（分课题负责人或课题组组长）参与国家科技部“863”计划基金项目、“十一五”和“十二五”国家科技支撑计划课题、国家科技重大专项创新药物研究开发技术平台建设课题、卫生公益性行业科研专项、国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”等10余项国家级大项科研课题研究工作。自身免疫性疾病自身抗体及其靶抗原研究获国家发明专利6项，近年以第一作者和通讯作者发表论文100余篇，以第一作者或通讯作者在《Nat Genet》、《Mol Cell Proteomics》、《J Proteome Res》等国际著名学术期刊发表SCI收录论文30篇，主编或参编专著12部。2010年被《科学时报》评选为“中国检验医学年度十大杰出青年学科带头人”。现任中国医师协会风湿免疫科医师分会自身免疫性疾病实验室诊断技术专业委员会主任委员、中国中西医结合学会检验医学专业委员会副主任委员、中华医学会检验医学分会临床免疫学组委员、中国医师协会风湿免疫科医师分会常委、中国医师协会检验医师分会常委、中国免疫学会临床免疫分会委员、北京中西医结合学会检验医学专业委员会副主任委员、北京医师协会转化医学专家委员会委员等。现任《中华检验医学杂志》、《中华医学杂志》等10余种核心期刊编委、特邀编委、编审专家﹑特邀审稿人等。副主编简介
胡朝军 助理研究员，中国医师协会风湿免疫科医师分会自身免疫性疾病实验诊断技术专业委员会委员。2005年毕业于华西医科大学，同年就职于北京协和医院风湿免疫科。2014年到美国约翰霍普金斯大学访问学习。自参加工作以来一直从事自身免疫性疾病临床实验诊断及发病机制研究工作。作为课题第一负责人承担国家自然科学基金青年基金1项、中国医学科学院北京协和医院科研基金项目1项。作为课题主要参与者参与多项科研基金研究工作，包括国家自然科学基金项目5项，国家863计划基金项目3项，国家科技基础条件平台项目基金项目1项，获得国家发明专利2项。近年来参编专著4部，以第一作者名义发表研究论文28篇，其中SCI收录论文11篇。副主编简介
周仁芳 副主任检验师，在职研究生学历，1998年毕业于上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）检验系，同年参加工作，2009年到北京协和医院风湿免疫科实验室进修学习。现任温州医科大学附属温岭医院检验科副主任，中国医师协会风湿免疫科医师分会自身免疫性疾病实验诊断技术专业委员会委员。近年来，主要从事自身免疫性疾病的实验室诊断和临床研究工作。参编《实用临床实验室管理学》等专著2部，以第一作者名义发表论文12篇。参与、主持国家“十一五”科技项目、省市级课题多项，并以第一负责人获市科技进步二等奖1项。副主编简介
黄清水 副主任医师，副教授，临床检验诊断学专业硕士研究生导师，中国医师协会风湿免疫科医师分会自身免疫性疾病实验诊断技术专业委员会委员。1996年大学毕业后先后在急诊科、内科、传染科和儿科从事临床医师工作5年，熟悉常见病、多发病的诊断与治疗。2004年临床检验诊断学专业硕士研究生毕业后至今在南昌大学第一附属医院检验科工作，主要从事免疫学检验，尤其是自身免疫性疾病的实验室诊断。目前主要承担南昌大学医学院临床医学专业、检验专业“诊断学”、“临床免疫学和免疫检验”教学。主持或参与国家级、省级及厅级课题10余项，主编、副主编或参译专著4部，以第一作者名义发表论文20篇。主要研究方向为循证检验医学、自身免疫性疾病的实验室诊断。序 一
由李永哲教授主编的《自身抗体免疫荧光图谱》经过多年的积累和准备终于问世了。这本图谱收集了近300幅自身抗体的免疫荧光图片，涵盖了目前常见的结缔组织病和器官特异性自身免疫性疾病相关自身抗体免疫荧光图形，既有传统的抗核抗体谱的各种图形，也展示了近些年来越来越被重视及普及的有关消化系统等器官特异性自身免疫病相关自身抗体。这些自身抗体图谱的展示，为自学者以及有一定基础的实验室自身抗体检测的学者提供了良好的学习材料。
风湿免疫病学是一个涵盖众多疾病的学科，中国早在三千多年前就有描述，但现代风湿免疫病学真正进入中国的时间是在20世纪中叶，三十年前中国才建立了全国风湿免疫病学的学会，所以风湿免疫病学在中国还是一个相对年轻的学科，是一个正在蓬勃发展的学科。风湿免疫病大多是全身性疾病，可以影响各个系统，在临床上同一个疾病可以以不同的临床表现为首发症状，不同的疾病又可以有同样的表现，因此通常被认为是临床中的疑难杂症，而这些疾病除了在影像学上有疾病的某个阶段会出现特征性表现以及组织病理有特征性变化外，自身抗体的出现给予临床诊断和治疗极大的帮助。比如系统性红斑狼疮，以往对它的诊断只有出现特定的红斑皮疹才能确立，自从1948年Hargreve发现了狼疮细胞，才使得该病的诊断有了依据。1957年发现抗核抗体，以后陆续发现的抗dsDNA抗体，抗Sm抗体等，使得该病能够得以及时诊断，预后才有了根本的改善。再比如，以往人们常常会发现一些临床上碱性磷酸酶和转肽酶异常的肝病患者。这些患者多年后有的发展成肝硬化，但肝炎病毒检查阴性，这也是困惑临床诊断的一个问题。自从人们发现抗线粒体抗体和这其中一部分患者有关后，证明这也是一种自身免疫性肝病——原发性胆汁性肝硬化，因此该病的诊断也变得比较容易和明确了。因此，自身抗体的发现和检测是风湿免疫病学临床发展的关键环节之一。一个医院，一个风湿免疫病学科没有过硬的自身抗体检测支持技术，将很难成为一个全面发展的综合医院。风湿免疫病学科也难成为名副其实的风湿免疫病专科。
感谢作者为中国风湿免疫病学发展出了一本好书，它必将成为临床风湿免疫病医生和实验技术人员的良师益友，在中国风湿免疫病学的发展中发挥极大的促进作用。张奉春2014年6月序 二
荧光显微术，特别是自身抗体免疫荧光技术的出现促进了自身免疫性疾病的诊治。早在1957年我国就引进了荧光抗体技术，但是当时该技术主要应用于传染性疾病的快速诊断领域，直至1967年、1968年和1970年三次国际免疫荧光学术会议的召开，对免疫荧光技术的标准化、定量化等问题进行了交流和深入讨论之后，免疫荧光技术才逐渐在自身免疫性疾病诊疗领域应用并普及。1974年军事医学科学院在国内举办了第一次免疫荧光技术培训班，这些国内外的学术会议，无疑极大促进了国内免疫荧光技术的发展和普及。1975年在北京协和医院临床科室的大力支持和指导下，检验科创建了国内首家自身抗体免疫荧光检测实验室，自己动手建立了8项免疫荧光标记技术及抗原片制备技术和15种自身抗体的检测方法，从此铸就了荧光免疫室专业技术的发展历程。如今检验科荧光免疫室并入风湿免疫实验室组建成教育部风湿免疫病重点实验室和全国自身抗体检测中心，是时代的需要，是业务技术整合的必然，相信蓝色的激发光永远激发出更多翠绿色的荧光。
荧光显微术的魅力在于微观世界下，特异性的抗原和抗体反应与组织病理学结合后所呈现的绚丽的、形态各异的表现。1995年欧蒙（德国）医学实验诊断股份公司进入中国市场，为中国的自身免疫性疾病的实验室诊断和实验技术方法提供了标准化的帮助。现在李永哲教授领导着风湿免疫科实验室，我相信有风湿科这样强大的临床医学阵容，免疫荧光技术在我国会发展得越来越好，造福越来越多的自身免疫病患者。《自身抗体免疫荧光图谱》是一本具有形态各异的组织学定位的自身抗体免疫荧光指导性的工具书，希望能成为同道们的工作参考书。王惠珍2014年6月序 三
In parallel to the enormous industrial development in China，the health system has made a remarkable progress in the past twenty years．Nowadays，most Chinese in the country are able to access the ultra－modern medicine including diagnostic methods，especially the detection of autoimmune diseases which about 8%of total diagnoses．
随着中国工业化史无前例的发展，中国的医疗卫生系统在过去的二十年中取得了令人瞩目的发展。如今，大多数中国人在本国内就可以享受到包括诊断技术在内的尖端的医学技术，尤其是占疾病诊断总量8%的自身免疫性疾病检测。
The principal author of this“IMMUNOFLUORESCENCE ATLAS OF AUTOANTI－BODIES”，Dr．Li Yongzhe，is one of the pioneers in the field．He established and promoted this diagnostic in the early nineties at Beijing Union Hospital．We have been closely connected with him since 1996；We spent a great amount of time together and supported each other in autoimmune diagnostics．In the mid－nineties，Li Yongzhe published the first illustrated autoimmune diagnostic book，and he provided the country for many years with tissue sections and human epithelial cell for immunofluorescence diagnostics of autoantibodies．Li Yongzhe is one of the great experts in China．《自身抗体免疫荧光图谱》的主编李永哲教授于20世纪90年代初就已开始在北京协和医院建立和推行自身抗体的检测，是这个领域的先行者之一。我们从1996年开始就与李永哲教授建立了密切的合作关系，并相互扶持、共同致力于自身免疫诊断，在之后的十几年为国内同仁提供组织切片和人上皮细胞作为自身抗体免疫荧光诊断的基质。在中国，李永哲教授堪称自身免疫性疾病诊断领域的杰出专家之一。
Since this diagnostic has been established in many hospitals nowadays，it has become essential to share the knowledge of immunofluorescence with a broader audience，which the author hasexcellently achieved with this album．
现如今很多医院已建立了自身免疫诊断技术方面的科室，因此，能够和更多的读者分享免疫荧光方面的知识是一件非常有意义的工作，这也是这本书作者希望实现的目标。
I wish Li Yongzhe and his book every success！
我衷心地祝愿李永哲教授和他的书圆满成功。文夫瑞德·斯特克EUROIMMUN AG德国欧蒙医学实验诊断股份公司前 言
随着蛋白纯化技术、基因重组技术及生物信息学等生物技术的飞速发展，自身抗体的检测不断细化深入到对特异性靶抗原的检测。但是，自身抗体免疫荧光技术因其具有对自身抗体检测全面，能检测未知或难以纯化靶抗原的自身抗体、可发现新抗体等优势，该技术仍然是自身抗体检测的经典、常规实验技术。如抗核抗体的检测虽然目前存在多种检测技术平台，但免疫荧光技术仍然被美国风湿病学会（ACR）、欧洲自身免疫标准化促进会（EASI）等专业学会推荐为ANA检测的“金标准”或“参考方法”。
目前国内自身抗体免疫荧光专业图谱类书籍非常缺乏，自身抗体免疫荧光检测项目不断更新和丰富，因此国内自身抗体检测的临床工作者急需一本既侧重于临床实用价值，又能反映该领域最新进展，与时俱进的自身抗体免疫荧光图谱。《自身抗体免疫荧光图谱》一书的编写出版立意于十余年前，由于种种原因迟迟未成书。2009年，随着国内自身抗体免疫荧光检测技术的推广普及，越来越多的自身抗体检测工作者难以获得能满足临床工作需要的参考图谱。因此，在与自身抗体领域多位专家商讨后，我们重新组织了一批在临床一线工作，临床实践经验非常丰富、专业理论知识基础扎实的同行在人民卫生出版社重新启动、策划了本书的编辑出版工作。历时5年，经过多位该领域专家、同行的反复讨论修改终于定稿成书。《自身抗体免疫荧光图谱》尽量涵盖自身抗体免疫荧光技术检测领域的最新观点，既对各种荧光模型进行详细的鉴定描述，也对与该荧光模型易于混淆的临床其他常见荧光模型进行鉴别要点的阐述，同时阐明各个荧光模型对应的靶抗原和临床意义。因此，该图谱既侧重临床应用，又具有一定的理论深度。相信此图谱的出版无论对自身抗体检测的实验室一线工作者，还是对自身免疫性疾病诊疗的临床一线医生以及与自身免疫性疾病有关学科的工作者都有很强的借鉴作用。
感谢本书编写过程中所有给予帮助的专家、同行。感谢北京协和医院对风湿免疫科自身抗体检测中心的大力支持。感谢风湿免疫科所有同事对实验室开展自身抗体检测工作的支持与帮助。感谢北京协和医院皮肤科、上海华山医院神经内科以及德国欧蒙医学实验诊断股份公司Winfried Stocker教授为本书编写提供的部分珍贵图片。感谢自身抗体检测领域前辈们多年来的激励和各位编者的辛勤工作，使本图谱在近几年来几经易稿、定稿，现终于装订成册。但由于水平有限，图谱中难免存在错误和不足之处，恳请同道们不吝赐教！李永哲2014年6月于北京第一章 免疫荧光技术第一节 免疫荧光技术
免疫荧光技术（immunofluorescence technique）是利用抗原抗体反应的高特异性、高敏感性及荧光标记物质的准确示踪性相结合的一种标记技术，也是标记免疫技术中发展最早的一种实验技术。
1941年Coons等首先应用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记抗体，检测小鼠组织切片中的肺炎球菌荚膜多糖抗原。1957年Holborow及Friou等通过建立免疫荧光抗体技术（fluorescence antibody technique，FAT）检测抗核抗体，从此该技术被广泛应用于自身免疫性疾病相关自身抗体的临床检测。1958年Riggs等合成性能优良的FITC，同年Marshall等使用直接标记法使得荧光标记抗体技术得以进一步改进优化，从而使免疫荧光技术得以不断推广应用。20世纪70年代以来，随着其他标记免疫测定技术（放射免疫测定技术和酶免疫测定技术）的建立，免疫荧光技术也不断发展。建立了目前临床常用的荧光免疫测定技术（fluorescence immunoassay，FIA），以及另一种以荧光标记抗体检测快速流动状态的细胞或生物颗粒的流式细胞分析技术（flow cytometry，FCM）。
目前，根据免疫荧光抗体技术不同的检测原理，通常分为以下四类：一、直接免疫荧光法
直接免疫荧光法（direct immunofluorescence assay）利用荧光标记的抗体直接与待测标本上的抗原进行特异性反应，从而检测标本抗原。此方法操作简单、特异性高，但敏感性偏低，检测每一种抗原需要相应的标记抗体。目前可用于组织病理免疫荧光检查（如肾活检、皮肤活检和狼疮带检查）及病原体抗原等检测。二、间接免疫荧光法
间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay）利用基质中的相应抗原与待测样本中的抗体进行反应后，而后加入荧光标记的二抗，从而检测样本中的抗体。此方法常用于检测标本中的未知抗体，敏感性比直接免疫荧光法高5～10倍，是目前临床检测自身抗体普遍采用的免疫荧光技术（图1－1－1）。图1-1-1 间接免疫荧光法模式图三、补体结合免疫荧光法
补体结合免疫荧光法（complement fixation immunofluorescence assay）在间接免疫荧光法的抗原抗体反应基础上加入补体，再用荧光标记的抗补体抗体进行结合反应。由于此方法操作较为烦琐，且补体不够稳定，易出现非特异性荧光。因此，目前较少应用于临床检测。四、双标记免疫荧光法
双标记免疫荧光法（double labeling immunofluorescence assay）使用不同荧光标记两种抗体，检测同一样本中的两种相应抗原。此方法在选择荧光标记物时需注意两种荧光的差异。第二节 荧光、标记荧光素和荧光标记抗体
荧光是具有一定特性的物质，从外界吸收并储存能量而进入激发态，当从激发态回到基态时，部分能量以电磁辐射的形式放射（即发光），停止能量供给后发光亦瞬间停止。
标记荧光素是一种吸收激发光作用后产生荧光，并能作为一种染料使用的有机化合物，目前常用的标记荧光素及其特性见表1－2－1。
标记荧光素要求：①能与蛋白质分子形成稳定的共价键化学结合，不易解离；②荧光效率高，与蛋白质结合的量少，且与蛋白质结合后保持较高的荧光效率；③与待标记的蛋白质结合后不影响其免疫学特性；④产生的荧光与组织自身荧光形成鲜明的对比；⑤与蛋白质结合的方法需简便、快速，未结合的荧光标记物易于清除。
荧光标记抗体中的抗体要求高特异性、高亲和力、效价合适及高纯度。标记的方法主要有直接标记法和半透膜渗透标记法，前者主要适用于要求的标记量大、标记速度快，但此方法的影响因素较多，常会引起非特异性荧光染色。后者适用于小量的抗体标记，标记均匀、非特异性荧光染色较少。对于荧光标记抗体的鉴定指标常使用抗体效价和荧光素（F）／蛋白质（P）结合比率，抗体效价使用琼脂双向扩散法在1∶16～1∶32，而对于F／P的结合率越高说明抗体分子上结合的标记荧光素越多。一般在以组织细胞为抗原基质时，以F／P在1～2为最适。表1-2-1 常用的标记荧光素及其相关特性第三节 荧光显微镜一、临床实验室常用荧光显微镜原理及特点
常用荧光显微镜的原理及特点见表1－3－1。表1-3-1 常用荧光显微镜的原理及特点二、荧光显微镜使用注意事项、保养及维护
以汞灯作为光源的荧光显微镜为例：
1．使用仪器前操作者应该熟悉仪器的标准化操作程序（SOP），明确仪器使用的相关要求。
2．使用仪器时要先接通激发光源开关5～15分钟，等电源稳定后，再观察标本。荧光显微镜每次使用以1～2小时为最佳，时间过长会使激发光强度下降，使观察荧光减弱。标本在紫外光照射3～5分钟后，荧光也会减弱。
3．使用仪器时避免反复开关，为延长激发光源使用寿命，至少在开启15分钟后可关闭电源；关闭电源后至少10分钟才可开启电源。
4．注意观察者的眼睛保护，长时间观察需注意定时休息，以免视疲劳影响观察结果和损伤视力，必要时使用防护眼镜。
5．使用仪器后及时关闭电源，并记录使用时间，对于超过200小时的激发光源需及时更换灯泡。
6．机械部分避免使用有机溶剂（乙醇、乙醚等），会腐蚀油漆和机械，应使用中性润滑剂；对于塑料部件可直接使用蘸水的软布擦洗。对于物镜镜头可用蘸少许二甲苯或镜头清洗液（3份乙醇＋1份乙醚）轻擦。
7．待荧光显微镜完全冷却后，盖好防尘罩。第四节 免疫荧光抗体技术在自身抗体检测中的临床应用
由于免疫荧光抗体技术（特别是间接免疫荧光法）在自身抗体的临床应用中具有如下优点：①高特异性：能按靶抗原分布对细胞、组织进行荧光染色；②基质易于制备：可适用于各种培养细胞、组织冷冻切片等实验基质；③一种技术可进行多个项目检测；④一种实验基质可鉴别多种自身抗体；⑤可发现新抗体，特别是未知或难以纯化靶抗原的自身抗体。故该技术已成为自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）相关自身抗体检测的常规实验技术（表1－4－1）。表1-4-1 可使用免疫荧光抗体技术检测的部分AID相关自身抗体续表第五节 免疫荧光抗体技术检测自身抗体的质量控制
目前，使用免疫荧光抗体技术检测自身抗体的自动化、标准化程度较低，且检测结果受主观判断影响较大，因而各实验室之间的结果差异较大。从项目的选择、标本采集和处理、试剂、仪器、操作、质量控制到分析后因素等各个环节，加强免疫荧光技术检测自身抗体的质量控制显得尤为重要。一、分析前因素（一）免疫荧光抗体技术检测自身抗体的项目选择
迄今已报道的自身抗体有上千种，仅系统性红斑狼疮（SLE）患者中存在的自身抗体可达百种以上。自身抗体的检测方法除免疫荧光技术外，还包括被动凝集试验（passive agglutination，PA）、对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIE）、免疫双扩散试验（double immunodiffusion，DID）、免疫沉淀试验（immnoprecipitation assay，IPA）、免疫印迹（immunoblot assay，IB）、放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、悬浮芯片技术（flexible multi－analyte profiling，xMAP）和蛋白芯片（protein microarrays chip，PMC）技术等。因此对于自身抗体的检测，要明确相关抗体的临床意义和检测方法学特点，合理选择免疫荧光技术检测自身抗体项目。本章第四节表1－4－1列出了可使用免疫荧光抗体技术检测的部分AID相关自身抗体。（二）标本采集和处理
免疫荧光抗体技术检测自身抗体时建议采用血清，在有特殊需要时（如狼疮性脑病时检测脑脊液中的抗核抗体）也可采用脑脊液、胸水和腹水。由于肝素锂可能会抑制某些抗原抗体反应，而乙二胺四乙酸（EDTA）和枸橼酸盐会螯合血浆中的金属离子增强竞争反应，减弱非竞争反应和荧光分析反应，因而在使用抗凝血浆时应慎重解释检测结果。在采集静脉血时应注意止血带使用时间延长可使血浆蛋白浓度增高5%，从而可使相应的抗体浓度增高。二、分析中因素（一）试剂
1．基质和固定方法
免疫荧光抗体技术检测自身抗体根据不同的检测需要，实验采用的基质和固定方法均不相同。在选择恰当的检测基质和固定方法时，医疗机构应评价相关采购材料，或由厂商提供相关信息，或从文献资料中获取相关信息。
如抗核抗体（ANA）检测所用的基质种类甚多，现广泛应用的是核浆丰富的HEp－2细胞，因为HEp－2细胞属于人类来源培养细胞（人喉癌上皮细胞），并且抗原种类丰富、特异性强、含量高，核大、细胞结构清晰、易于结果观察及荧光模型分析。采用未固定的实验基质时，部分抗原（如SS－A／Ro和nRNP）会在清洗的过程中丢失导致假阴性或对将高滴度的标本误判为低滴度。不同的固定方法对ANA检测的敏感性影响较大，实验室应向试剂厂家获取相关的信息。单独使用乙醇和甲醇固定基质会破坏SS－A／Ro抗原，所以建议采用丙酮或者羟基丙酮固定的基质片。
2．荧光素标记的结合物
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的多克隆羊抗人或兔抗人IgG抗体在免疫荧光技术检测自身抗体中的应用最广泛，并且已有商品化试剂。在选择和评价荧光素标记的结合物应考虑：抗体特异性（多克隆的或IgG特异的），FITC与蛋白质的结合比率（F／P），抗体与蛋白质的比率，特异性抗体的含量，以及结合物的工作浓度。（1）实验室应依据不同检测项目需要选择抗体类型，在免疫荧光抗体技术检测自身抗体中通常使用对IgG特异的荧光素标记的结合物，因为多克隆抗体会增加非特异性抗体的检出率。在约96%的SLE患者的ANA为IgG型，IgM型ANA与类风湿关节炎（RA）、药物和年龄相关，通常无明确诊断价值。但需注意的是，约4%的风湿性疾病患者可为高滴度的IgM型ANA阳性。（2）FITC与蛋白质的结合比率（F／P）应低于或等于3．0，高于3．0会增加非特异性着染。F／P值的测定和计算根据FITC浓度和蛋白质浓度计算。（3）抗体与蛋白质的比率应大于等于0．1。（4）特异性抗体的含量应为30～60μg／ml。（5）虽然试剂厂家提供了结合物的工作浓度，但实验室仍然应该对其进行评估。最常用的评估方法是免疫荧光棋盘滴定法，依据对已知核型和滴度的阳性质控血清进行系列稀释的最终滴度确定为最佳工作浓度，应同时带上阴性血清和缓冲液对照。（6）荧光素标记的结合物的参考品：国际免疫学联合会（International Union of Immunological Societies，IUIS）标准化委员会和WHO共同建立2份WHO／IUIS结合物国际标准品——FITC标记的羊抗人Ig（480010）和FITC标记的羊抗人IgM（抗μ链）。实验室可从瑞士日内瓦的WHO免疫学部门获得这两份标准品，标准品和商品或自制结合物同时以工作浓度稀释后分别与阴性对照、阳性对照和患者标本反应，从而比对商品或自制结合物的特异性等其他性能。（二）仪器设备
免疫荧光抗体技术检测自身抗体所用的荧光显微镜的光源系统主要包括传统的汞灯光源和更为先进的发光晶体二极管（LED）光源系统（表1－5－1）。采用荧光显微镜校准基片对荧光显微镜的发光强度进行定期校准有助于室间和室内的荧光显微镜的标准化。若使用多台显微镜，应进行显微镜之间的荧光强度比对，保证结果的一致性。显微镜应随时保持清洁，每年进行专业清洁，显微镜的清洁、维护和光源的更换都应记录。表1-5-1 传统的汞灯光源与发光晶体二极管（LED）光源系统性能比较续表（三）实验操作
1．加样
注意事项：①应快速加样，防止样本蒸发；②加样过程中，应尽量避免气泡产生和交叉污染；③待加完所有样本方可开始温育，以保证所有标本具有相同的反应时间。
2．温育
注意事项：①温育时温度和时间应按规定力求准确，且保证每一样本均与实验基质充分接触，样本间避免交叉污染；②荧光素标记的抗体加入后进行温育时，为避免荧光淬灭，应置于暗环境中反应。
3．清洗
注意事项：①清洗液的制备需严格按照说明进行；②清洗过程中，应尽量避免实验基质的破坏。
4．封片
注意事项：封片的好坏直接影响了荧光显微镜下的观察效果。甘油滴加要适量，太少会使盖玻片与载片不能黏合，太多会使观察时视野不清晰。
5．结果判读
注意事项：①尽量使用光强输出稳定的荧光显微镜进行结果判读；②为避免荧光淬灭，切勿光源长时间照射载片；③为保证实验结果的准确性，应由经验丰富的实验操作人员完成结果判读。（四）质量控制
1．室内质量控制
所有人员应按照实验室标准操作规程进行操作，并按操作规程完成质控和相关记录。免疫荧光抗体技术检测自身抗体多数为半定量，阳性结果通常用滴度或稀释度表示。如采用间接免疫荧光法时应每批操作都进行质控品的检测，质控品应包括阴性、阳性及临界阳性（弱阳性）质控品。除阴性、阳性质控品常由检测试剂盒提供外，临界阳性质控品（弱阳性）可自配。如ANA临界阳性质控品（弱阳性）的配制，对于1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释体系，选择1∶40～1∶80滴度为临界阳性质控品（弱阳性）；而对于1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200稀释体系，选择1∶100～1∶320滴度为临界阳性质控品（弱阳性）。其中阳性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性结果为阴性，即在控，否则为失控。
2．室间质量评价
室间质量评价目前国内有临检中心、医学会、临床实验室、厂家组织的室间质评活动；国际上每个国家均有自己的室间质量评价活动，其中美国病理学家协会（CAP）提供的自身抗体能力验证项目较为完整，基本涵盖了临床实验室常规自身抗体的检测项目。三、分析后因素
一般而言，免疫荧光抗体技术检测的自身抗体滴度越高，与疾病的相关性越高，对疾病的预示性越明确。因此，在临床实践中，不同的参考值范围（如阴性、弱阳性、阳性、强阳性）应该合理设定，以利于结果的判定。例如，强阳性的结果可以用使检测特异性高于98%甚至99%的临界值来定义。而对于免疫荧光抗体技术检测自身抗体不同实验室和检测系统的滴度比对，可通过标准物质的国际单位（IU／ml）来进行统一。
当出现免疫荧光抗体技术检测自身抗体结果与临床表现不符时，实验室人员应与临床医生一起，结合患者性别、年龄、其他实验室指标等特点，对检验结果作出合理解释及建议。第二章 自身抗体及自身免疫性疾病第一节 自身抗体一、自身抗体的概念
自身抗体（autoantibody）是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。二、自身抗体的分类
自身抗体有多种分类方法，根据自身抗原在体内分布的不同可分为器官／组织特异性自身抗体和非器官／组织特异性自身抗体；根据检测自身抗体所用实验基质的不同可分为细胞抗体和组织抗体；根据自身抗体临床意义不同可分为疾病标志性自身抗体、疾病特异性自身抗体、疾病相关性自身抗体、疾病非特异性自身抗体和生理性自身抗体。三、自身抗体检测的临床意义
自身抗体作为自身免疫性疾病（AID）的特征性标志，在AID的诊疗中具有广泛的临床意义：①AID诊断与鉴别诊断；②AID病情评估与治疗监测；③AID病程转归与预后判断；④AID预警等。四、自身抗体的检测方法
自身抗体的检测方法包括免疫荧光抗体技术（FAT）、补体结合试验（CFT）、PA、CIE、DID、IPA、IB、RIA、ELISA、CLIA、xMAP和PMC技术等。其中最常用的检测方法包括间接免疫荧光法（IIF）、ELISA、DID、CIE、IB及线性免疫印迹法（line immunoassay，LIA）等。
自身抗体不同检测方法的性能比较见表2－1－1。表2-1-1 自身抗体不同检测方法的性能比较第二节 自身免疫性疾病一、自身免疫性疾病的概念
当某种原因使机体自身免疫应答超过一定程度，导致机体发生病理改变和（或）功能障碍，这种因自身免疫应答引起的疾病称为自身免疫性疾病。二、自身免疫性疾病分类
目前AID尚无统一的分类标准，一般按受累器官组织的范围将AID分为器官特异性AID和器官非特异性（系统性）AID两大类（表2－2－1）。按受累器官组织系统分类可将AID分为结缔组织AID、消化系统AID、内分泌系统AID、神经系统AID、皮肤组织AID、泌尿系统AID、生殖系统AID、循环系统AID及血液系统AID等。按是否与其他疾病（或外因）的关联分类可将AID分为原发性AID和继发性AID。表2-2-1 常见AID的分类续表第三章 抗核抗体免疫荧光模型第一节 抗核抗体的概述一、抗核抗体的概念
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是以真核细胞的核成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称，属自身抗体中的一组抗体。随着免疫荧光抗体技术的改进，尤其是培养细胞抗原基质的广泛应用，目前对ANA的理解已不局限于细胞核成分，ANA靶抗原分布由传统的细胞核扩展到现在的整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架及细胞分裂周期蛋白等。因此，对于ANA概念的更新，已引起国内学者的争议。二、抗核抗体谱的分类
随着人们对ANA的认识不断加深，已衍生出具有不同临床意义的三十余种ANA，形成了抗核抗体谱（antinuclear antibodies，ANAs）。根据细胞内靶抗原分子的理化特性和分布部位，可将ANAs分为六大类（图3－1－1），每一大类又因不同的抗原特性分为若干亚类。图3-1-1 抗核抗体谱的分类三、抗核抗体的免疫荧光抗体技术
ANA免疫荧光抗体技术主要检测ANA总抗体，自1957年Holborow及Friou等首先以啮齿动物组织冷冻切片为抗原底物，应用IIF检测ANA。目前临床常规检测ANA，一直沿用IIF法作为ANA总抗体的筛查试验。IIF检测ANA时，所用抗原底物片的种类甚多，现广泛应用的是核浆丰富的培养细胞——HEp－2细胞（图3－1－2）作为ANA的检测底物。因HEp－2细胞具有如下优点：属人来源培养细胞（人喉癌上皮细胞）；核抗原丰富、特异性强、含量高；核大、细胞结构清晰、易于结果观察及荧光染色核型分析。而使用纯化或重组抗原建立的ANA总抗体的其他筛查试验（如ELISA），存在由于纯化抗原过程的抗原性“减弱”或“失活”，或重组抗原的决定簇缺乏部分天然的高级结构及无法完全重组全部抗原成分等缺点。因此，免疫荧光抗体技术仍被美国风湿病学会（ACR）誉为ANA检测的“金标准”。图3-1-2 HEp－2细胞结构模式图四、抗核抗体免疫荧光模型
因被检血清中存在不同性质的特异性ANA，与底物靶抗原结合后，而后加入荧光素标记的二抗，通过荧光显微镜呈现形态各异的荧光染色模型。通过荧光模型分析，可初步判断相应抗体性质范围，从而指示进一步检测特异性抗体。临床常规检测ANA，常见的荧光模型如表3－1－1所示。
对于ANA免疫荧光模型，应该指出的是同一种自身抗体可以出现不同的荧光模型，不同的自身抗体也可以出现相同的荧光模型。荧光模型具有一定的提示作用，但仅根据荧光模型特点来推断抗体的特异性是片面的。除了抗着丝点抗体、抗PCNA抗体及一些具有特殊荧光模型抗体外（如抗高尔基抗体、抗中心体抗体等），对ANA特异性抗体的判断应根据特异性抗体检测方法（如ELISA、免疫印迹法等）来确定。
此外，IIF检测ANA，结果判断时应注意有丝分裂期（mitotic phase）细胞，尤其是中期细胞荧光染色特点，对荧光模型分析有重要帮助。有时同一份标本内因含有多种自身抗体，可出现不同的荧光模型（混合型），对标本进行不同稀释度的检测，有助于区分所含有的各种荧光模型。表3-1-1 IIF检测ANA常见荧光模型五、抗核抗体免疫荧光检测的临床意义
ANA免疫荧光抗体技术检测阳性最常见于各种AID患者，特别是系统性AID，也可见于器官特异性AID、感染、肿瘤患者及健康人群等（表3－1－2）。ANA免疫荧光检测在临床上是一个重要的筛查试验，阳性结果有助于进一步的特异性抗体检测和（或）确认试验。ANA阳性（高滴度）提示了AID的可能性，在AID的诊断与鉴别诊断、病情监测与疗效观察、病程转归与预后判断及疾病预警等方面有重要的临床意义（表3－1－3）。表3-1-2 ANA免疫荧光抗体技术（HEp－2细胞为实验基质）检测的阳性情况表3-1-3 ANA常见特异性抗体相关靶抗原及主要相关AID续表第二节 抗核抗体——细胞核荧光模型一、细胞核均质型（一）核仁区阳性的均质型
荧光染色模型
分裂间期HEp－2细胞核浆呈均匀荧光染色，细胞核仁区荧光染色强度与细胞核浆其他区域一致，部分标本可见分裂间期HEp－2细胞核膜内缘荧光染色加强，产生周边型荧光染色。分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体呈均匀着染，染色体区外周细胞核浆荧光染色阴性（图3－2－1）。猴肝组织冷冻切片中，组织细胞核呈均匀荧光染色（图3－2－2）。核仁区阳性的均质型（homogeneous with positive nucleoli patterns）图3-2-1 HEp－2细胞图3-2-2 猴肝组织（二）核仁区阴性的均质型
荧光染色模型
分裂间期HEp－2细胞核浆呈均匀荧光染色，细胞核仁区无荧光染色。分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体呈均匀着染，染色体区外周细胞核浆荧光染色阴性（图3－2－3）。猴肝组织冷冻切片中，组织细胞核呈均匀荧光染色，核仁区无荧光染色（图3－2－4）。核仁区阴性的均质型（homogeneous with negative nucleoli patterns）图3-2-3 HEp－2细胞图3-2-4 猴肝组织
鉴别要点
与核均质和斑点的混合型鉴别：核仁区阴性的均质型分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体呈均匀着染，染色体区外细胞核浆荧光染色阴性；而核均质和斑点的混合型分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体区呈均匀着染，浓缩染色体区外的核浆呈颗粒状荧光染色。
临床意义
此荧光模型常见于抗双链DNA（ds－DNA）抗体、抗组蛋白抗体（AHA）或抗核小体抗体（ANuA）等。抗dsDNA抗体主要见于SLE患者；抗组蛋白抗体可以在多种结缔组织病中出现，但在药物性狼疮（DIL）患者中阳性率较高；抗核小体抗体主要见于SLE患者，并且与狼疮肾有一定的相关性。
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