作者：李加友 主编 尤忠毓、朱长俊 副主编
出版社：化学工业出版社
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生物工程专业实验指导试读：
前言
一般来说，工科学生大学期间需要多门实验课程的训练，每门课程都有相应的实验指导书。但是我们也发现，由于每门实验课程指导书都追求全面，所以导致很多重复；同时对于一个专业来说，知识系统显得割裂，不能很好体现人才培养方案的意图。在这种情况下，我们根据普通本科院校生物工程专业所设置核心课程对实验项目及内容的要求，进行了创新和尝试，把生物工程专业几门核心课程实验编写到一起，成为这本《生物工程专业实验指导》，力求结构更紧凑，内容更合理，实用性更强，使专业学生一本在手，可以解决专业上很多问题，大大提高指导书的使用效率；同时本书对如何将专业特色体现在实验课中，也进行了深入的探索。本书是生物工程专业一线教师通过几年的教学改革和实践获得的成果，目的是帮助学生巩固专业理论知识，掌握基本的实验方法和操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，增强创新意识和创新能力。
全书共分六章，第一章为生物工程实验室管理和要求，主要是生物工程专业学生进入实验室需要了解和掌握的相关要求，包括实验室管理总则、实验室人员行为规范、实验设备及耗材管理、实验室药品管理、微生物实验室菌种管理制度及实验室安全卫生管理。通过学习教育，使学生掌握生物工程专业实验室基本要求，学会使用常见的仪器设备，获得实验的基本技能，养成良好的实验习惯。第二章为生物化学实验，生物化学作为专业基础课程，具有重要的地位。本章共有9个实验，旨在让学生逐步掌握生物化学（简称生化）技术、接受生化思维，对生化作为基础学科有更深的理解。本章内容主要包括色谱、离心、电泳、滴定、分光光度、酶学、简单分子生物学等相关实验。第三章为微生物学实验，共安排了12个实验，包括光学显微镜使用、微生物形态观察、微生物染色及大小测定等基本技能实验和培养基配制、平板分离技术、细菌总数测定等综合实验技术，另外设置了环境因素对微生物的影响、酸奶制作、微生物诱变及生理生化反应等探索性实验，通过实验，学生可掌握微生物的观察、测量及培养的基本操作方法，并加强对微生物在实践中应用的理解。第四章为分子生物学与基因工程实验，包括9个实验，让学生在生化和微生物实验的基础上开展一些前沿实验内容，主要以系列实验方式呈现，包括基因组提取、PCR扩增、酶切、感受态细胞制备、重组子构建、质粒转化与鉴定、外源基因的表达检测等，是学生提高生物工程能力的重要举措。第五章为发酵工程实验，包括5个实验，分别为菌种制备与保藏、发酵过程控制、活性干酵母制备、酵母固定化技术以及灵菌红素制备等，学生通过实验能够对专业知识有更好的理解，并能掌握设备的工作原理，为将来继续深造和就业奠定基础。第六章为分离工程实验，包括3个综合性实验，涉及提取、分离纯化、结构鉴定等，是生物工程专业学生掌握相关技能的重要途径。
本书所编写的实验项目均在编者所在学校经过多年实践和应用，也历经多次修改。相信成书后一定会对普通高校生物工程专业学生开展实验、理解实验目的具有较好的指导作用。
本书由李加友担任主编，尤忠毓、朱长俊担任副主编；由嘉兴学院生物与化学工程学院生物工程专业李加友、尤忠毓、朱长俊、刘晓侠、于建兴、王玉洁、孙诗清等教师编写；朱长俊进行了统稿工作。
本书的出版得到了嘉兴学院教务处、生物与化学工程学院领导的大力支持，在此表示衷心感谢。
由于时间仓促、作者水平有限，书中的疏漏之处敬请读者指正。编者第一章 生物工程实验室管理和要求第一节 实验室管理总则（1）实验室管理是所有实验人员共同的责任，每一位实验人员都应对实验室的正常、高效运转尽自己的义务和责任，自觉遵守实验室的规章制度和管理办法。（2）本章程为实验人员的行为规范，目的是使大家在一个有组织、有秩序的环境下工作，为大家提供一个能充分开展实验教学的空间，使大家养成良好的工作习惯，为获得良好的实验结果奠定基础。（3）实验室的管理原则如下。
①岗位责任制原则 实验室的每一项管理工作都有明确的责任要求，并有专人负责。
②规范化原则 管理制度化，从设备、器材、药品等的使用到实验方法、安全卫生都制定标准化的规范，大家都按照规范执行，以确保管理工作的有效性和连续性。
③记录监督原则 实验室管理的各方面都要求有及时、准确的记录，以保证实验室所有工作的可追溯性。第二节 实验室人员行为规范（1）严格遵守本单位对于实验室管理相关的各项规章制度。（2）每位实验室成员都应以主人翁精神参与实验室的建设与管理，积极参加实验室的各种活动（包括公益劳动），自觉维护本实验室的声誉。（3）对所有违规人员和行为，管理员将进行登记，屡教不改者，从重处理。（4）实验室内严禁吸烟、喝酒和吃零食。（5）不准在实验室大声喧哗、随地吐痰、打闹。（6）未经许可，不得随意把其他无关人员带入实验室。（7）爱护仪器设备，节约用水、电及实验材料等，注意安全。（8）室内设备仪器不得擅自拆卸、挪动，与本人实验无关的设备不可随意开启。（9）实验仪器的使用要严格遵守操作规程，并认真填写设备使用记录，设备存放应做到整洁有序，便于检查使用。（10）必须注意实验安全，加强安全防范意识。（11）注意公共卫生，不准随意丢弃杂物废纸等，影响实验室环境卫生。（12）高温、高压及易燃易爆实验，需要特别注意安全防范。（13）最后离室者，做好安全检查，检查仪器电源、空调、水、气瓶、门、窗等是否关好，并在最后离室登记簿上签名。第三节 实验设备及耗材管理1.实验设备管理（1）实验设备按指定位置摆放，不得擅自改变仪器设备及其附件的存放位置。确需移动位置时，必须经管理人员同意，使用后应及时整理复原。（2）精密仪器须专人负责管理，使用者经过培训合格后方能使用，对于没有按规定操作导致设备故障者，要追究其责任。（3）严格遵守各种仪器的操作规程和登记制度，凡对拟使用的仪器的操作不熟悉者，务必先学习使用方法。发现仪器故障者，有义务立即向管理人员报告，以便及时维修。凡属违反操作规程而损坏仪器者，视情况进行处罚。（4）各通电设备在使用完毕后，应切断电源，以保证安全。（5）必须严格执行仪器设备运行记录制度，记录仪器运行状况、开关机时间。（6）使用前，首先检查仪器清洁卫生，仪器是否有损坏，接通电源后，检查是否运转正常。发现问题及时报告管理人员，并找上一次使用者问明情况，知情不报者追查当次使用者责任。（7）显微镜的目镜在使用前后必须用浸有乙醇（酒精）的透镜纸擦净。（8）微生物实验后，实验室须立即收拾整洁、干净。如有菌液污染须用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖污染区半小时后擦去（含芽孢类菌液污染应延长消毒时间）。带菌工具（如吸管、玻璃棒等）在洗涤前须用3%来苏尔液浸泡消毒。2.玻璃器材的存放、洗涤（1）使用玻璃器材应轻拿轻放，严格按照其使用条件来使用。（2）实验所用的玻璃仪器应按照标签存放于指定位置，使用后应及时洗涤干净并放回原处。第四节 实验室药品管理1.药品试剂的使用、存放及购买（1）对实验室内易燃、易爆、腐蚀性和剧毒性药品应分类管理并有相应的药品目录，使用时应做好领用记录（领用人、领用量、领用日期及用途）。（2）所有药品必须有明显的标志。对字迹不清的标签要及时更换，对过期失效和没有标签的药品不准使用，并要进行妥善处理。（3）使用强酸强碱等化学试剂时，应按规定要求操作和储存；使用有机溶剂和挥发性强的试剂时应在通风良好的地方或在通风橱内进行。（4）同种药品或试剂使用完后再开启新瓶，药品使用完后放回原处。（5）采购药品前应先盘查药品柜内库存，然后按需购买。2.公用溶液的配制、存放及标记（1）因实验需要而自行配制的公用溶液存放于指定位置的实验台面上。（2）试验药剂容器都要有标签，标签上要注明溶液名称、浓度、配制者姓名、配制日期等信息；无标签或标签无法辨认的试剂都要当成危险物品重新鉴别后小心处理，不可随便乱扔，以免引起严重后果。（3）实验室中摆放的药品如长期不用，应放到药品储藏室，统一管理。第五节 微生物实验室菌种管理制度1.菌种保存（1）实验室全部菌种都应由菌种负责人记录在册并妥善保存，菌种上应贴上明显的标签，标明名称、编号、购买日期等。（2）每天检查一次保存菌种的冰箱温度，并作记录，每周检查菌种管的棉塞是否松动，菌种外观及干燥状态，如有异常应及时处理，并填写菌种检查记录。（3）每次移植培养后，要与原种的编号、名称逐一核对，确认培养特征和温度无误后，再继续保存。2.菌种的传代、接种和使用（1）实验室正在使用的菌种由各使用者自行纯化和更新斜面。使用者结束该菌种的使用后要将自己使用的菌株纯化后交负责人保存，并填写使用记录。（2）每株菌种应建立菌种使用及传代记录，斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔。（3）实验人员传代时使用须核对名称、编号，传代代数及日期，所用培养基。（4）任何人未经领导允许，不得私自将菌种带出实验室或给他人。第六节 实验室安全卫生管理1.安全（1）实验室规定在进行任何实验操作时都应穿着实验服（白大褂），若因违反此规定而导致的衣物损伤甚至人身伤害应自己负责。（2）实验时小心仔细，全部操作应严格按照操作规程进行，禁止用嘴吸取菌液或试剂。万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤灼伤等意外情况发生时，应立即报告实验室管理人员，及时处理，切勿隐瞒。（3）涉及挥发性、刺激性及有毒试剂的操作必须在通风橱内进行，对违规者追究其责任。进行有毒、有害、有刺激性物质或有腐蚀性物质操作时，应戴好防护手套，在特定实验台上操作，不要污染其他工作台。（4）实验过程中，切勿使乙醇（酒精）、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉电源，再用湿布或沙土掩盖灭火，必要时用灭火器。（5）消防器材要定时检测，放置在便于使用的地方，保证随时可用，且其周围不可堆放其他物品、杂物。（6）实验人员都必须熟悉实验室内水、电、气开关的分布情况，在遇到紧急情况的时候应立刻关闭相应的开关。还应该熟悉大楼的各种应急措施，包括灭火器和火情警铃按钮。（7）火情紧急对策。若发现火情，应立即呼叫，并拨119报火警。（8）实验室内严禁吸烟，加强对室内易燃品、易爆品、腐蚀性物品等的管理，严格按实验规程操作。（9）实验室产生的工作废液，应妥善处理。（10）工作结束后，清理工作过的台面及区域，保持整洁。（11）实验完毕后和下班离开实验室时，应切断电源（必须通电的除外）、水源、气源、清理实验场所、关好门窗后方能离开。所有实验需过夜的，应安排人员值守。（12）钥匙为实验室工作人员进入实验室的通行证，不得转借。钥匙的持有者应对实验室的安全负责。2.卫生
实验室管理人员应定期彻底打扫实验室、无菌室，擦拭窗户、桌面、仪器、水池及地面。每日安排值日生，负责垃圾和水池的清理。（1）实验台 保持实验台的清洁卫生。用完的试剂应立即放归原处。养成良好的工作习惯，及时处理实验过程中使用过的器皿、废液、废物等。（2）无菌室和超净台 使用无菌室和超净台的人员，在用完后，需及时使用84消毒液清洁无菌室和超净工作台。（3）仪器设备 仪器使用完后，要及时清理，盖上仪器罩。保持仪器设备干净，无尘。（4）水池及水池柜体内面和地面 每日值日生要负责清洁水池及水池柜体内面和地面。固形物（如固态培养基等）严禁倒入水池。（5）办公区 办公区应保持整洁。各种杂物和废弃物应及时清理。大家有责任保持环境整洁。合理使用办公区的仪器，节省耗材，自觉遵守其相关的规定。第二章 生物化学实验实验一 氨基酸纸色谱一、实验目的
1.通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸色谱的基本原理及操作方法。
2.通过实验，理解氨基酸与茚三酮的显色反应原理，掌握显色反应现象。二、实验原理
色谱法又称层析法，是一项重要的分离分析技术，利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。
根据色谱的工作原理可分为：分配色谱、吸附色谱、亲和色谱、离子交换色谱。根据色谱支持物的不同可分为：纸色谱、柱色谱、薄层色谱、凝胶过滤色谱。氨基酸的纸色谱属于分配色谱，其原理是利用各种物质在两种互不溶解的溶剂中分配系数的不同，从而达到分离的目的。分配色谱一般用于分离在水和有机溶剂中都有一定溶解度的混合物。
纸色谱的分配过程是一部分溶质随有机相（展层溶剂）移动，离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配（图2-1）。一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数，称为分配系数（K）。D图2-1 氨基酸纸色谱示意图
由于各种物质的分配系数（K）不同，随展层溶剂移动的速率D也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移值（R）或迁移率f表示：
对于水-正丁醇的溶剂体系，氨基酸极性越小，K值越大，R值Df也越大，一定时间内随流动相迁移的距离越大，反之迁移距离越小。三、器材和试剂1.器材
展开槽，色谱滤纸（约15cm×15cm），电吹风机，喷雾器，毛细管，铅笔，针线，烘箱等。2.试剂（1）氨基酸标准液 6mg/mL。（2）未知氨基酸溶液 6mg/mL。（3）展层剂 水饱和正丁醇（或苯酚）溶液，即4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取扩展剂倒入培养皿中备用。（4）显色剂 0.3%茚三酮丙酮溶液。四、实验内容1.色谱滤纸的准备
用铅笔在色谱滤纸上距离一端2～3cm处划直线（记为色谱底边点样线），在直线上标记标准氨基酸和未知氨基酸点样位置，并作上记号。2.点样（少量多次）
用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.3cm，干燥后再点样，重复3次。注意样品点不要吹得太干燥，否则，样品物质的分子会牢牢吸附在色谱滤纸的纤维上，出现拖尾现象。3.缝合成圆柱体（依据展开槽类型，选做）
小心将色谱滤纸沿垂直底边的两条边，以针线缝合，制成圆柱体（图2-2）。注意，缝合针线应靠近边缘，不可出现在氨基酸色谱点可能色谱经过的区域。图2-2 缝合成圆柱体4.展层
将滤纸放入展开槽，使滤纸底边以下部分浸入液面，但不要使液面没过点样线。展层50～60min，取出滤纸，用铅笔绘出溶剂前沿线（图2-1）。5.显色
将滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸点样线和溶剂前沿有效面上，吹干后放在80℃烘箱中烘干显色。五、结果与分析
用铅笔描出色斑轮廓，找出中心点。如果斑点形状不规则或出现明显的“拖尾”，则圈出颜色集中均匀的部分。
观察记录标准品和样品氨基酸与茚三酮溶液反应后的颜色，测量色谱点和溶剂前沿距离，并计算各色斑的R值，对照氨基酸标准品，f确定未知样品中氨基酸种类。六、思考题
1. R值的概念。f
2.如何计算R值？影响该值的因素有哪些？f
3.纸色谱分离氨基酸的原理是什么？
4.分析造成色斑拖尾现象的原因。七、注意事项
1.点样量要适当，点样要均匀。
2.尽可能不要用手去触摸滤纸有效面。
3.色谱分离时间根据色谱系统的具体情况而定，使分配系数相近的氨基酸分开。
4.喷茚三酮溶液时要均匀、适量，不可过多。实验二 蛋白质浓度测定（凯氏定氮法）一、实验目的
1.学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术。
2.学会使用凯氏定氮仪。二、实验原理
生物材料的氨基酸含量测定在生物化学研究中具有一定的意义，凯氏定氮法是目前常用的蛋白质含量测定方法。该方法是利用蛋白质中含氮量约为16%，且相对恒定，测出含氮量，从而可推知蛋白质含量。实验分消化和测定两个部分。
消化是有机物（蛋白质）与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，往往在消化时添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。以甘氨酸为例，消化过程可表示如下：CHNHCOOH+3HSO2CO+3SO+4HO+NH222422232NH+HSO（NH）SO324424
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的物质的量（相当于待测物中氨的物质的量）计算出待测物中的总氮量。
本法适用于0.2 ～ 2.0mg的氮量测定。三、器材和试剂1.器材
凯氏定氮烧瓶，凯氏定氮蒸馏装置，50mL容量瓶，3mL微量滴定管，分析天平，烘箱，电炉，100mL蒸馏烧瓶，小玻璃珠，坩埚钳，锥形瓶，铁架台等。2.试剂（1）浓硫酸 200mL。（2）粉末硫酸钾-硫酸铜混合物 16g（KSO与CuSO·5HO以24423∶1配比研磨混合）。（3）30%氢氧化钠溶液 1000mL 。（4）2%硼酸溶液 5000mL。（5）标准盐酸溶液 约0.01mol/L。（6）混合指示剂（田氏指示剂） 由50mL 0.1%美蓝乙醇溶液与200mL 0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，储存于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围窄且灵敏。（7）市售标准面粉和富强粉 各2g。四、实验内容1.样品处理
固体样品测定时需烘干至恒重。在称量瓶中称一定量磨细的样品（如0.1g左右的干燥面粉），然后置于105℃的烘箱内干燥4h。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1h后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
液体样品（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。2.消化
取4个100mL凯氏烧瓶，标号。各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂（KSO-CuSO·5HO）200mg，消化液（浓2442硫酸）5mL。在3号及4号瓶中各加0.1mL蒸馏水和与1号及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为2止。
定容：冷却后，加蒸馏水约10mL（注意慢加，随加随摇），然后将瓶中溶液倾入50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。3.连接和洗涤凯氏定氮仪
按照图2-3连接凯氏定氮仪，在P、P、P位置夹上自由夹后，134将其固定在铁架台上，并调试好。图2-3 改良型凯氏定氮仪D—加样口；E—冷凝水进水口；F—冷凝管口；G—冷凝水出水口
①接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水（先关闭进水口，以排水口高度为宜），将蒸馏水由加样室加入反应室，用电磁炉将其加热烧开，让发生器中蒸汽通过气孔进入反应室。
②将电磁炉移开片刻，打开自由夹P，使冷水进入蒸汽发生3器，此时由于蒸汽发生器产生负压，将反应室中蒸馏水吸出，待蒸汽发生器水位距离反应室孔约2cm左右，关闭自由夹P，之后打开蒸汽3发生器放水阀P，使水位下降到排水口高度。再次将蒸馏水加入到1反应室中，如此反复清洗3～5次。
③清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶（盛有5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液）。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。4.蒸馏（1）准备工作 50mL锥形瓶数个，各加入5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹P，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂4溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。（2）加样 用移液管取5mL消化液，细心地通过加样室加入反应室中，随后加入30% NaOH溶液5mL，立即关闭自由夹P，在加样漏4斗中加少量蒸馏水做水封。（3）蒸馏
①打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出）。
②打开电磁炉，蒸馏开始，当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约2～3min），开始计时，蒸馏3min，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1min，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。
蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此3～5次。最后将自由夹P、P同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换13掉，继续下一次蒸馏。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。5.滴定
全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。记录滴定现象和数据。五、结果与分析
样品总含氮量计算公式如下：
式中，c为标准盐酸溶液物质的量浓度，mol/L；V为滴定样品用1去的盐酸溶液平均体积，mL；0.014为氮的毫摩尔质量，g/mmol；V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均体积，mL； W为样品质量，g；5为测定时消耗的消化液体积，mL；100为换算为每100g样品中所含有的含氮量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量：蛋白质含量（g/100g）=总氮量×6.25六、思考题
1.何谓消化？如何判断消化终点？
2.在实验中加入粉末硫酸钾-硫酸铜混合物的作用是什么？
3.固体样品为什么要烘干？
4.蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？
5.如何证明蒸馏器洗涤干净了？本实验应如何避免误差？七、注意事项
1.测定开始前，要确保凯氏定氮仪已经洗涤干净。
2.在反应室中加入NaOH前，将冷凝管口浸没在硼酸指示剂溶液内，以确保产生的NH被硼酸全部吸收。3
3.从观察到硼酸指示剂溶液变绿色开始，继续吸收冷凝液3min，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口。实验三 福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的
1.学习利用呈色反应原理测定蛋白质浓度。
2.掌握福林（Folin）-酚试剂法测定蛋白质浓度的基本原理和操作。二、实验原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或带有苯环结构的色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。在一定范围内，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。三、器材和试剂1.器材
牛血清蛋白片，722型分光光度计，试管×10，移液管0.50mL×4、0.10mL×2、0.20mL×2、5.0mL×1。2.试剂（1）福林-酚试剂A 碱性铜溶液。
甲液：取NaCO 2g溶于100mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液中。23
乙液：取CuSO·5HO晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100mL中。42
临用时按甲∶乙=50∶1混合使用。（一日内有效）（2）福林-酚试剂B 将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700mL蒸馏水、50mL 85%磷酸及100mL浓盐酸置于1500mL的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL及液溴数滴，开口煮沸15min，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000mL，过滤，滤液呈微绿色，储存于棕色瓶中。临用时，用1mol/L的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。（3）1mg/mL牛血清蛋白溶液 称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000mL。（4）未知样品溶液。四、实验内容1.标准曲线测定
取8支干燥的试管，编号，按表2-1顺序加入试剂，混匀，室温放置10min，各管再加福林-酚试剂B 0.5mL，30min后比色（500nm），记录各管吸光度数据，每个样品读数3次并记录。2.样品测定
取2支干燥试管，编号，按测标准曲线方法（表2-1），依次加入样品溶液0.5mL，福林-酚试剂A 4.0mL，混匀静置10min，再加入福林-酚试剂B 0.5mL，混匀，反应30min后，500nm波长下测吸光度并记录。表2-1 标准曲线的绘制及样品测定五、结果与分析
将所记录数据填在数据记录表中（表2-2）。表2-2 数据记录表
换算各标准曲线点含蛋白质质量，以蛋白质质量为横坐标2（mg）、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得标准方程和R。将样品蛋白质吸光度代入方程，计算样品蛋白质含量。六、思考题
1.说明福林-酚试剂法的优缺点。
2.福林-酚试剂法较双缩脲法灵敏，为什么？
3.为什么加入福林-酚试剂B后要马上混匀？七、注意事项
1.在实验时，不要将牛血清蛋白和样液加反。
2.福林-酚试剂B加入后，应立即混匀。
3.一定要注意实验的时间，因为溶液的吸光光度值是随着时间延长在不断增大的，如果时间超过了30min，则测得的吸光光度值就不准确。
4.在使用分光光度计时，拿比色皿时要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污使测量值不准确。
5.在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦。
6.在比色皿中装入的液体量约为比色皿体积的2/3。实验四 酵母RNA的提取及组分鉴定一、实验目的
1.掌握RNA的组分和鉴定方法。
2.学习稀碱法提取酵母RNA的原理与操作。二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3～4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用 0.2% NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH为2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达 2.67%～10.0%，而DNA含量仅为 0.03%～0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。三、器材和试剂1.器材
干酵母粉（市售），电子天平，100mL烧杯，50mL量筒，10mL量筒，0.5mL移液管，1mL 移液管，2mL 移液管，5mL移液管，离心机，锥形瓶，研钵，沸水浴装置等。2.试剂（1）0.2%氢氧化钠溶液 2g NaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。（2）浓盐酸（AR）。（3）95%乙醇。（4）酸性乙醇（CP）。（5）氨水（CP）。（6）10%硫酸溶液 浓硫酸（相对密度1.84）10mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。（7）5%硝酸银溶液 5g AgNO溶于蒸馏水并稀释至100mL，储3存于棕色瓶中。（8）苔黑酚-三氯化铁试剂 将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl·6HO。临用时配制。32（9）定磷试剂。四、实验内容1. RNA的提取
称取8g干酵母粉于100mL研钵中，干研磨，转入锥形瓶后加入 0.2% NaOH溶液 40mL，沸水浴加热 30min，经常搅拌，冷却后离心5min（4000r/min）。取上清液，缓慢加入至30mL酸性乙醇中，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，离心5min（4000r/min），沉淀备用。
向沉淀中加10%硫酸液10mL，转入锥形瓶中，加热至澄清，将RNA水解，即为水解液，进行组分鉴定。2.鉴定（1）核糖 取水解液1mL，加苔黑酚-三氯化铁试剂 1mL，水浴加热，观察颜色变化。（2）嘌呤碱 取水解液1mL，加氨水2mL及硝酸银溶液1mL，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置几分钟）。（3）磷酸 取水解液1mL、定磷试剂1mL，水浴加热，观察颜色变化。五、结果与分析
观察记录实验过程中的现象，对其中重要的现象（比如分层、沉淀产生、颜色反应等）作分析讨论。六、思考题
1.所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？
2. RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？
3.本法提取的RNA是否具有生物活性？为什么？七、注意事项
1. RNA水解过程中，需要边加热边搅拌。
2.鉴定嘌呤碱时，如果现象不明显，可适当多加1mL氨水，然后加硝酸银。实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质一、实验目的
1.掌握电泳的基本原理。
2.学会薄膜电泳的基本操作。
3.掌握血清中不同蛋白质的分离方法。二、实验原理
本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。血清中含有5种不同蛋白质（表2-3）。将这些蛋白质置于pH值为8.6的缓冲液中，由于pI 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白、α-球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋12白。 经染色脱色观察不同蛋白质的区带。三、器材和试剂1.器材 电泳仪，电泳槽，醋酸纤维素薄膜，点样器，滤纸，剪刀，镊子，分光光度计，铅笔等。2.试剂（1）新鲜血清（无溶血现象）。（2）巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于少量蒸馏水后定容至1000mL。（3）染色液 称取氨基黑10B 0.5g，加入蒸馏水40mL、甲醇50mL和冰醋酸10mL，混匀，储存于试剂瓶中。（4）漂洗液 取95%乙醇45mL、冰醋酸5mL和蒸馏水50mL，混匀。（5）透明液 冰醋酸25mL、95%乙醇75mL，混匀。（6）洗脱液 0.4mol/L NaOH。四、实验内容1.醋酸纤维素薄膜的润湿和选择 将2.0cm×8.0cm薄膜用铅笔做上记号，放入缓冲液中浸泡20min，整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀（实验中应选择质地均匀的膜）。2.制作电桥 将巴比妥缓冲液（pH 8.6）倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。3.点样与电泳 取出浸透的薄膜，平放在滤纸上（无光面向上），轻轻吸去多余的缓冲液。用点样器蘸取血清，“印”在薄膜的点样区（距离底边约2cm），点样区要呈粗细均匀一直线，只可点一次。将点好样的薄膜两端紧贴在电泳槽支架的滤纸桥上，无光泽面向下，点样端置负极（注意，点样线不可以与电泳桥直接接触），接通电源，电压160V，电泳25min。4.染色与浸洗 电泳完毕后，切断电源，用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑10B染色液中，10min后取出。再浸泡于漂洗液，反复漂洗，直至背景无色为止。5.结果判断 一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α-球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。12五、结果与分析 观察电泳结果，试分析产生的各电泳条带分别是何种蛋白质，讨论各种蛋白质在血清中的含量。六、思考题 1.影响蛋白质电泳迁移速度的因素有哪些？ 2.为什么通常蛋白质电泳缓冲液的pH偏碱性？七、注意事项 1.醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕，甚至烧断。 2.缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。 3.电泳槽中缓冲液要保持清洁（数天过滤），两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。 4.通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。实验六 酶促反应的影响因素一、实验目的 1.了解温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速率的影响。 2.学习检定温度、抑制剂影响酶促反应速率的方法。二、实验原理 在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现其活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH称为该酶的最适温度、最适pH。 在酶促反应中，酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是抑制剂。 本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。 淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精（遇碘呈紫色）→红色糊精（遇碘呈红色）→无色糊精（遇碘不呈色）→麦芽糖（遇碘不呈色）→葡萄糖（遇碘不呈色）。 所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。三、器材和试剂1.器材 试管和试管架，恒温水浴，冰浴，吸量管（1mL 6支、2mL 4支、5mL 4支），滴管，量筒，玻璃棒，白瓷板，秒表，烧杯，棕色瓶。2.试剂（1）新鲜唾液稀释液（唾液淀粉酶液） 每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5min后使其流入量筒并稀释至200倍（稀释倍数可因人而异）混匀备用。（2）1%淀粉溶液A（含0.3%NaCl） 将1g可溶性淀粉及0.3g氯化钠混悬于5mL蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的60mL蒸馏水中，搅动煮沸1min，冷却至室温，加水至100mL，置冰箱中保存。（3）1%淀粉溶液B（不含NaCl）。（4）碘液 称取2g碘化钾溶于5mL蒸馏水中，再加入1g碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水295mL，混匀储存于棕色瓶中。（5）1% NaCl溶液。（6）1% CuSO溶液。4（7）1% NaSO溶液。24四、实验内容1.温度对酶促反应的影响 取4支洁净试管编号，按表2-4进行操作。表2-4 温度对酶促反应的影响 单位：mL2.激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 取4支洁净试管编号，按表2-5加入各试剂。表2-5 激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 单位：mL五、结果与分析 根据结果记录，分析影响酶活性的各因素，得出酶活性影响因素结论。六、思考题 1.什么是酶的最适温度、最适pH？它们是酶的特征物理常数吗？ 2.激活剂分几类？氯化钠属哪种类型？硫酸钠对淀粉酶的活性有无影响？七、注意事项 1.加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想的颜色梯度变化。 2.用玻璃棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后，立即放回试管中一起保温。实验七 碱法提取质粒DNA一、实验目的 1.掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用方法。 2.掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。二、实验原理 从细菌中分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的目的。首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液Ⅱ（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液Ⅲ中和后，宿主染色体DNA分子量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，质粒DNA则由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。最后用75%乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存，用于下一步凝胶电泳鉴定。三、器材和试剂1.器材 恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，制冰机，电子天平，pH计，量筒（10mL，100mL，500mL，1000mL），烧杯（50mL，100mL，500mL，1000mL），一次性手套，玻璃棒，称量勺，微量移液器（1000μL，200μL，20μL），酒精灯，灭菌的1.5mL离心管（eppendorf管），灭菌吸头（1000μL，200μL），相应的吸头盒，吸水纸，250mL锥形瓶，含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。2.试剂（1）2mol/L葡萄糖 36g葡萄糖，溶于60mL蒸馏水中，再加蒸馏水至100mL，然后用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存。（2）10% SDS（十二烷基硫酸钠） 1g SDS，溶于60mL蒸馏水中（加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2）再加蒸馏水至100mL，无需灭菌。因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。称后要及时清洁称量区。（3）2mol/L NaOH NaOH 8g，溶于10mL 蒸馏水中，再加蒸馏水至100mL。（4）1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 蒸馏水600mL，Tris 121.2g；HCl 35mL；用HCl将pH调至8.0，再加蒸馏水至1000mL。（5）2mol/L Tris-HCl（pH7.4） 蒸馏水300mL；Tris 121.2g；HCl 35mL；用HCl将pH调至7.4，再加蒸馏水至500mL。（6）0.1mol/L EDTA（pH8.0） 18.7g EDTA Na·2HO，溶于22300mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH将pH调至8.0，加蒸馏水至500mL，室温保存。（7）去离子灭菌水。（8）70%乙醇 用新开装的无水乙醇35mL，加去离子灭菌水定容至50mL配成，储存于4℃冰箱，用后即放回。（9）氨苄西林（Amp） 100mg/mL。（10）卡那霉素（Kan） 50mg/mL。（11）培养基 LB液体培养基（pH 7.0）200mL分装在6个100mL体积的锥形瓶内，灭菌。（12）TE缓冲液 pH7.4，配制10mL。（13）溶液Ⅰ 按表2-6的配方配制50mL，灭菌，0～4℃保存。表2-6 溶液Ⅰ的配方（14）溶液Ⅱ 按表2-7的配方现配现用，配制100mL。表2-7 溶液Ⅱ的配方（15）溶液Ⅲ 配制100mL，灭菌，储存于4℃冰箱，用后即放回。 29.4g乙酸钾，加50mL蒸馏水，用冰醋酸将pH 调至4.8，再加蒸馏水至100mL。（16）Tris饱和酚（pH7.0） 苯酚需要重蒸后加Tris-HCl（pH7.4）制成饱和酚。（17）Tris饱和酚（pH7.0）-氯仿-异戊醇 体积比25∶24∶1。四、实验内容 实验内容和步骤见表2-8。表2-8 实验内容和步骤五、结果与分析 通过肉眼观察：是否有白色絮状沉淀，量多还是少。具体提取质粒质量可以通过电泳检验。六、思考题 1.溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的主要成分及作用是什么？ 2.本实验中，质粒DNA与基因组染色体DNA是如何分离开来的？实验八 VC含量测定——2，6-二氯酚靛酚滴定法一、实验目的 1.学习2，6-二氯酚靛酚滴定法定量测定维生素C的原理和方法。 2.掌握滴定管基本操作过程。二、实验原理 VC（维生素C）是一种水溶性维生素，是人类重要的营养素之一，绿色蔬菜和水果中含量很丰富。VC有强的还原性，在碱性条件、加热并有氧化剂存在时VC易被氧化破坏。2，6-二氯酚靛酚在碱性溶液中为蓝色，在酸性溶液中为红色，被还原后变为无色。因此可用2，6-二氯酚靛酚测样品中的VC含量，VC可将染料还原为无色，同时VC被氧化成脱氢VC，VC全部被氧化后，滴入的染料使溶液呈淡粉红色。根据消耗染料的量可计算出样品中VC的含量。三、器材和试剂1.器材 电子天平，量筒，研钵，漏斗，5mL微量滴定管，纱布，50mL容量瓶，1.0mL移液管，10.0mL移液管，100mL锥形瓶，猕猴桃若干等。2.试剂（1）1%草酸溶液 称取10g草酸，加水至1000mL。（2）2%草酸溶液 称取20g草酸，加水至1000mL。（3）VC标准液 准确称取10mg VC溶于100mL 1%草酸中，即VC的浓度为 0.1mg/mL。（4）0.05 %的2，6-二氯酚靛酚溶液 称取2，6-二氯酚靛酚500mg，溶于300mL含有104mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至1000mL，过滤于棕色瓶中，储存于冰箱内。四、实验内容1.提取VC 称取猕猴桃10～15g，加入15mL 2%草酸溶液，用研钵磨成匀浆。两层滤布过滤取得滤液，用少量2%草酸溶液洗研钵几次，倒入滤渣中，合并滤液，定容至50mL。（注意：切勿过量）2.标准液滴定 取VC标准液4mL于100mL锥形瓶中，加6mL 1%草酸溶液，用2，6-二氯酚靛酚溶液（滴定液）滴定至淡红色。记录所消耗滴定溶液的量，计算出1mL滴定溶液所能氧化VC的量。3.空白滴定 取10mL 1%草酸溶液放入锥形瓶中，滴定，方法同“2.标准液滴定”中的操作，作为空白对照。4.样品滴定 另吸取两份10mL样品，放入两个锥形瓶中，分别滴定，方法同“2.标准液滴定”中的操作。记录滴定溶液所用的体积。五、结果与分析 取两份10mL样品所用染料溶液体积的平均值，代入下面公式计算100g样品中还原型VC的含量： 式中，V为滴定样品所消耗染料溶液的平均体积，mL； V为滴12定空白对照所消耗染料溶液体积，mL；V为样品提取液的总体积，mL；V为滴定时所取的样品提取液的体积，mL；c为1mL染料溶液所3能氧化VC的质量，mg/mL；m为样品的质量，g。六、思考题 1.说明VC的分类、结构和作用，本实验测定的是何种VC？ 2.为什么VC长时间暴露在空气中会失效？七、注意事项 1.样品提取过程避免与铜、铁接触，滴定过程要迅速，不超过2min，样品滴定消耗染料以1～5mL为宜，如超出此范围，应增加或减少样品用量。 2.如果样品泡沫过多，可加几滴辛醇消泡。 3.样品中含有色素会干扰对终点的判断。 4.本法只能测定还原型VC，不能测出具有相同生理功能的氧化型VC和结合型VC。 5.用2%草酸溶液制备提取液可有效抑制VC氧化酶，而1%草酸溶液无此作用。实验九 过氧化氢酶米氏常数（K）的测定m一、实验目的 1.学习米氏常数（K）的测定方法。m 2.掌握米氏常数的概念和意义。二、实验原理 过氧化氢酶（catalase，CAT）能催化下列反应，HO浓度可用22KMnO在硫酸存在下滴定测知。42HO2HO+O↑22222KMnO+5HO+3HSO2MnSO+KSO+5O↑+8HO4222442422 求出反应前后HO的浓度差即为反应消耗的HO，根据酶促反2222应速率为单位时间内底物的消耗量，计算酶促反应速率。再根据米氏方程的双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数（图2-4）。图2-4 米氏方程的双倒数图三、器材和试剂1.器材 电子天平，量筒，研钵，漏斗，5mL微量滴定管，纱布，50mL容量瓶，1.0mL移液管，10.0mL移液管，锥形瓶，马铃薯若干。2.试剂（1）0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100mL容量瓶中，加入浓HSO 5mL，加蒸馏水至刻度，充分混匀。此液可储存数周。24（2）约0.02mol/L KMnO储存液 称取KMnO 3.4g，溶于441000mL蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。（3）0.004mol/L KMnO应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20mL4于锥形瓶中，于70℃水浴中用KMnO储存液滴定至微红色，根据滴4定结果算出KMnO储存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释4都必须重新标定储存液。（4）约0.05mol/L HO液 取20%HO（AR）40mL于1000.0mL2222量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO应用液标4定，稀释至所需浓度。（5）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。（6）酶液 称取马铃薯5g，加缓冲液10mL，匀浆，过滤。四、实验内容1. HO浓度的标定22 取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/L的HO溶液2.0mL22和25%HSO溶液2.0mL，分别用0.004mol/L KMnO应用液滴定至微244红色。从滴定用去KMnO应用液的体积（mL），求出HO的物质的422量浓度。2.反应速率的测定 取干燥洁净50mL锥形瓶5只，编号，按表2-9操作。表2-9 反应速率的测定方法 依次加入酶液每瓶0.5mL，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25% HSO溶液2.0mL，边加边摇，使酶促反应立即终止。243.滴定 用0.004mol/L KMnO应用液滴定各瓶至微红色，记录KMnO消44耗量（mL）。五、结果与分析1.反应速率的计算：以反应消耗的HO物质的量（mmol）22表示 反应速率=加入的HO物质的量（mmol）-剩余的HO物质的量2222（mmol） 即：HO物质的量浓度×加入的体积（mL）-KMnO应用液物质224的量浓度×消耗的KMnO应用液体积（mL）×5/24 式中，5/2为KMnO与HO反应中的换算系数。4222.求K值m 下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的K值，供计算参m考。已知KMnO为0.004mo1/L，标定出HO浓度为0.05mol/L，如表4222-10所示。表2-10 K值的测定方法m六、思考题 1. K值的意义是什么？m 2. 测酶K值的实验中，需要特别注意哪些操作？m第三章 微生物学实验实验十 普通光学显微镜的使用及微生物形态观察一、实验目的 1.掌握普通光学显微镜的结构、各部分功能和使用方法。 2.掌握显微镜分辨率的定义。 3.了解微生物在光学显微镜下的基本形态。二、实验原理 光学显微镜是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在微生物学、细胞生物学、组织学、病理学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途。现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又被称为复式显微镜。普通光学显微镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，构造如图3-1所示，光学系统则主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。图3-1 普通光学显微镜构造示意图 在光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率（resolution）或者分辨力（resolving power）。分辨率是指显微镜能清楚分辨两点之间最小距离的能力，分辨率越小，分辨能力越高。从物理角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象和物镜的性能限制，可表示为： 式中，λ为光源光波波长；NA为物镜的数值孔径。 数值孔径则取决于物镜的镜口角以及样品和物镜之间介质的折射率，可以表示为： 式中，n是样品和物镜之间介质的折射率；θ是物镜镜口角（实际工作中，镜口角一般不超过120°）。 高倍镜和低倍镜镜头工作时，介质为空气，n为1，NA都较小，油镜镜头工作时，介质为香柏油，其折射率为1.52，所以油镜具有更大数值孔径（1.25左右）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径为0.65左右的高倍镜的最小分辨率为0.4μm，而油镜的分辨率可以达到0.2μm左右。 显微镜还有另外一个重要参数是放大倍数，其等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。三、器材和试剂1.器材 普通光学显微镜，擦镜纸。2.试剂 无水乙醚，香柏油。3.菌种 细菌三型标本片，酿酒酵母标本片，青霉标本片，曲霉标本片。四、实验内容1.观察前准备 ①将显微镜小心地从镜箱中取出（移动显微镜时应以右手握住镜臂，左手托住镜座），放置在实验台的偏左侧，以镜座的后端离实验台边缘约6～10cm为宜。 ②连上电源，打开电源开关，调节亮度调节旋钮至电源灯亮起。 ③根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜。2.显微镜观察 一般情况下，特别是初学者，进行显微镜观察时要遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对较大，容易发现目标。（1）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，调节载物台使得观察对象处于物镜的正下方。调节物镜转换器，使得低倍镜进入工作状态。用粗调手轮慢慢升起载物台，使得标本片与低倍镜镜头距离约为0.5cm时（注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避免损坏镜头和玻片），然后在目镜上观察，同时慢慢转动粗调手轮使载物台下降，直至视野中出现物像为止，再转动微调手轮，使视野中的物像最清晰。 如果需要观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用标本移动器前后、左右移动标本的位置，使物像进入视野并移至中央。在调焦时如果镜头与玻片标本的距离已超过了1cm还未见到物像时，应按上述步骤重新操作。（2）高倍镜观察 在使用高倍镜观察标本前，将低倍镜下的观察对象移至视野中央，同时调准焦距使被观察的物像最清晰。轻轻转动物镜转换器，将高倍镜调节至工作状态，根据物镜的同焦现象，此时，视野中一般可见到不太清晰的物像，只需调节微调手轮，可使物像清晰。（3）油镜观察 用高倍镜找到所需观察的标本物像，并将需要进一步放大的部分移至视野中央，将高倍镜镜头转离工作状态，在样品区域滴加一滴香柏油，将油镜镜头转至工作状态（切不可将高倍镜转动经过加有镜油的区域），油镜的下端镜面一般应正好浸在油滴中。调节聚光器至最高位置并开足光圈，双眼注视目镜中，同时小心而缓慢地转动微调手轮，直至视野中出现清晰的物像，仔细观察标本并记录所观察的结果。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]