细胞因子及免疫学检验(txt+pdf+epub+mobi电子书下载)

作者:崔天盆

出版社:人民卫生出版社

格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT

细胞因子及免疫学检验

细胞因子及免疫学检验试读:

前言

细胞因子在机体免疫细胞之间、免疫细胞和非免疫细胞之间传递信息,在免疫应答与调节、免疫细胞分化和发育、组织修复、炎症反应、造血中发挥重要作用。细胞因子包括白细胞介素家族、干扰素家族、肿瘤坏死因子家族和转化生长因子家族,定性和定量检测这些细胞因子对于反映机体的免疫状态、疾病进程、预后有重要临床价值。在全身炎症反应综合征(SIRS)患者体内常存在细胞因子风暴、SARS冠状病毒、H7N9流感病毒等病原体感染,也常因细胞因子风暴导致患者死亡;动脉粥样硬化、心力衰竭、哮喘、肾损伤、肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、器官移植排斥反应、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等也常有细胞因子的变化。

本书第一部分介绍了39个白细胞介素,第二部分介绍了三类主要干扰素,第三部分介绍了转化生长因子和肿瘤坏死因子。同时,每一种细胞因子分别从基因、蛋白质结构、功能及与疾病的关系等方面进行阐述。因此,有别于免疫学教科书介绍各种细胞因子共同特点的方法,本书一一介绍不同的细胞因子,为促进其在临床中的应用提供有力的理论依据。

第四部分介绍细胞因子的免疫学检验,既包括临床检验应用的酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫发光、电化学发光、酶联免疫斑点试验(ELISPOT),也包括科研应用较多的液相芯片法、流式细胞术、免疫印迹法、免疫组化法、单分子酶联免疫吸附试验等,为读者对细胞因子的免疫学检验有一个全面的了解。然而,没有一种方法能包罗万象,每种方法均有其适应范围和局限性,因此,如何选择正确、适合的方法,还需依据标本种类、分析的用途、可提供的设备及成本而定。

本书坚持用清晰的逻辑、简明的语言和恰当的语言尽力勾勒出细胞因子的基础知识和检测方法。但是,由于编者知识和能力水平有限,编写过程中,在内容、文字、编排、图表等方面可能存在不足之处,恳请各位同道与读者不吝赐教。崔天盆2017年11月第一篇 白细胞介素第一章 白细胞介素-1一、白细胞介素-1家族简介(一)IL-1家族简介

白细胞介素-1家族(interleukin-1 family,IL-1F)包含11个成员,可称作IL-1F1~IL-1F11;其中绝大多数是促炎性细胞因子,主要通过刺激炎症和自身免疫病相关基因的转录,诱导环氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合酶、干扰素γ及黏附分子等效应蛋白的表达,在免疫调节及炎症反应中扮演重要角色。近年来,IL-1多数经典家族成员及其受体的信号传导途径和功能已经得到了广泛而深入的研究。

IL-1家族包括IL-1亚家族,IL-18亚家族和IL-36亚家族。其中,IL-1亚家族包括IL-1α、IL-1β、IL-33和IL-1受体拮抗剂;IL-18亚家族包括IL-18和IL-37;IL-36亚家族包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-38、IL-36Ra(表1-1)。IL-1家族主要成员具有促进炎症和增强获得性免疫的作用,也有些成员发挥抗炎作用。表1-1 白细胞介素-1家族(二)IL-1家族基因及氨基酸序列

IL-1基因簇位于人体2号染色体,含有9个IL-1样基因,其中六个位于IL-1A/IL-1B与IL-1RN之间,分别是IL-37、IL-36γ、IL-36α、IL-36β、IL-36RN和IL-38。

IL-1亚家族包括IL-1α、IL-1β、IL-33和IL-1Ra,均有前体蛋白形式。IL-1β的前体蛋白在胞浆被胱天蛋白酶-1剪切,成熟蛋白释放到胞外;而IL-1α前体蛋白被胞膜钙蛋白酶(calpain)和膜外中性粒细胞蛋白酶剪切而释放成熟蛋白;IL-33前体也被膜外中性粒细胞蛋白酶剪切;而IL-1Ra则含有信号肽。

IL-18亚家族包括IL-18、IL-37和IL-18Rα,此亚家族的前体相对较小。IL-18的前体蛋白需要被胱天蛋白酶-1剪切才能活化;目前IL-37前体片段的剪切方式尚不清楚。

IL-36亚家族包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-38、IL-36Ra,IL-38能与IL-36R结合,故属于此亚家族。

IL-1家族氨基酸的保守序列是A-X-D(A是亲水氨基酸如异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸;X是任何氨基酸;D是天门冬氨酸),此序列中的天门冬氨酸不是胱天蛋白酶-1的切割位点。A-X-D保守序列在维持IL-1家族三维结构的活性有重要意义。在A-X-D保守序列N端有9个氨基酸残基,当除去N端9个氨基酸残基后,IL-1家族成员形成β折叠结构,其中,IL-1β的N端有9个氨基酸残基可被胱天蛋白酶-1切割(图1-1)。图1-1 IL-1家族细胞因子的蛋白结构二、白细胞介素-1受体家族

IL-1受体家族包括11个成员(表1-2),它们的共同特征表现为:胞外段含3个免疫球蛋白样区(IL-18BP、TIR8除外);胞内含类似于TLR信号通路的MyD88信号通路所需的TIR结构域。TIR结构域是细胞感受微生物感染、启动固有免疫和炎症反应的关键感受器。IL-1受体家族可形成4个受体复合物,即IL-1R复合物(IL-1R1和IL-1RAcP)、IL-33R复合物(ST3和IL-1RAcP)、IL-18R复合物(IL-18Ra和IL-18Rb)和IL-36R复合物(IL-1Rrp2和IL-18BP),其中,IL-1RAcP为IL-1RⅠ受体辅助蛋白(IL-1RⅠ accessory protein)。除了这四种受体复合物外,同时还包括TIR8,它是IL-1负调节因子(图1-2)。表1-2 IL-1受体家族图1-2 IL-1家族细胞因子受体复合物

IL-1Ra一旦合成,立即分泌。人和鼠IL-1Ra可阻断IL-1α、IL-1β与其受体结合,充当促炎性细胞因子IL-1α、IL-1β的一个刹车分子,因此,人和鼠缺乏IL-1Ra可导致系统和局部炎症反应增强,人类缺乏IL-1Ra甚至可致死。IL-36Ra拮抗IL-36α、IL-36β、IL-36γ活性,IL-36Ra突变可导致人类发生严重银屑病。

IL-33是IL-1亚家族成员,之前称为IL-1F11,在Th2反应中发挥重要作用,IL-1β也与Th2反应有关。1994年,因发现IL-1R家族成员ST2,从而预测IL-33,ST2是IL-33的受体,其结构与IL-1、IL-1α受体具有同源性。IL-33也可与IL-1β、IL-1α和IL-36共用受体IL-1RAcP。雌激素诱导转录因子Fos活性进而调节ST2表达,雌激素的这个特性在调节IL-1和炎症中起重要作用。

类似于很多IL-1R家族成员,ST2有3个胞外Ig结构域和1个胞内TIR域。虽然ST2仍然在使用,但其现在被正式命名为IL-33Rα。IL-33Rα与IL-1R1一样结合其配体,但IL-33Rα传递信号需要IL-1RAcP。三、白细胞介素-1家族生物学功能(一)IL-1家族与天然免疫反应

在除人类外的大部分哺乳动物体内,病原体或其产物作用于宿主时,宿主通过增加防御反应,吞噬细胞浸润到感染部位,限制感染和杀灭病原体,肝脏合成急性时相反应蛋白,如抗蛋白酶等多种方式保护机体。

皮肤中的角质形成细胞(keratinocytes)、气道上皮细胞或胃肠道上皮细胞构成防止微生物入侵的第一道防线,这几种细胞均表达IL-1α、IL-18、IL-33和IL-36家族成员,对损伤迅速发生应答反应,故它们又被称为警报素(alarmins),警醒宿主启动免疫应答或炎症反应。它们与表层细胞中的其他防御因子如防御素(defensin)共同作用,直接抵抗微生物入侵。第一道防线表达的IL-1家族成员除了IL-1α均为前体形式,前体形式活性较低,只有在浸润的中性粒细胞释放的蛋白酶的作用下才能转换成有活性的形式,杀灭入侵的微生物。

1989年,Curtis BM克隆小鼠IL-1受体,发现IL-1受体的胞浆与1991年Gay NJ和Keith FJ发现的果蝇Toll受体具有高度同源性。IL-1受体家族和TLR家族均有TIR域,TIR域结合信号分子MyD88,MyD88也含有TIR域,TIR域-TIR域相互作用触发激酶瀑布反应,传递IL-1信号,促进下游基因转录,主要包括其他类型的细胞因子、趋化因子及宿主炎性介质。

Charles J提出天然免疫反应辅助宿主的获得性免疫反应的学说,即“天然免疫反应”调节“获得性免疫反应”,譬如有些天然免疫反应细胞因子如IL-2、IL-4、IL-6或淋巴细胞受体,像佐剂一样调节淋巴细胞生长因子,促进淋巴细胞克隆扩增,导致其产生中和抗体或细胞毒T细胞清除病原体。(二)其他功能

IL-1还可以调节体温、骨吸收、肌肉蛋白水解及通过TNF间接调节恶病质。在T细胞活化过程中,IL-1与IL-6,IL-21,IL-23和TGF-β一起促进Th17细胞分化。四、白细胞介素-1α

从进化角度来看,IL-1α是IL-1家族最古老成员,其原始氨基酸序列与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)高度相关。类似于FGF,IL-1α无信号肽,能与核DNA结合,细胞死亡时释放到胞外,可与受体直接结合。IL-1α结合IL-1RI受体,招募IL-1RAcP,形成异二聚体,传递信号,诱导炎症反应。

IL-1α组成性表达于多种细胞,包括正常细胞和肿瘤细胞,而IL-1β则没有组成性表达。角质形成细胞、胸腺上皮细胞、肝细胞、内皮细胞、包括整个胃肠道的黏膜上皮细胞、成纤维细胞均表达IL-1α前体。IL-1α前体可被膜外中性粒细胞蛋白酶剪切而释放活性蛋白,膜型IL-1α也具有活性。在成纤维细胞,组成性表达的IL-1α前体结合HAX-1(造血细胞内的非酪氨酸激酶底物)后,IL-1α-HAX-1复合物转位到细胞核内。(一)膜结合IL-1α

单核细胞和B细胞表面的IL-1α前体,即为膜结合IL-1α,膜结合IL-1α具有活性,其活性可被抗IL-1α抗体中和,而不被抗IL-1β抗体中和。内皮细胞在压力诱导下发生凋亡时,释放的凋亡小体含有核小体、组蛋白、完整IL-1α前体及成熟IL-1α。将此凋亡物注入小鼠体内,可诱导中性粒细胞浸润,然而,给予抗IL-1α抗体干预后可减少中性粒细胞浸润。(二)处理和分泌IL-1α

虽然IL-1α前体也具有活性,但分泌型IL-1α活性更强。采用重组N端113个氨基酸残基的IL-1α可与IL-1R结合,钙蛋白酶Ⅱ(calpainⅡ)促进IL-1α前体的剪切,且依赖钙离子。使用氢醌(hydroquinone)处理巨噬细胞,钙蛋白酶Ⅱ水平下降,抑制IL-1α前体的剪切。同时,IL-1α与IL-1β结合,IL-1β作为伴侣蛋白,IL-1α的分泌依赖于IL-1β,IL-1β缺陷小鼠不能分泌IL-1α。也有研究表明,IL-1β可结合HMGB-1,并增强HMGB-1活性,IL-1α分泌到胞浆外可与IL-1β和HMGB-1两者结合。(三)组成性表达IL-1α的生物学功能

尽管有很多用细菌和真菌诱导细胞因子的炎症性疾病模型,但是更多的炎症性疾病是无菌性炎症,如动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中、肿瘤、肾和肝功能衰竭等,无菌性炎症不依赖TLR2和TLR4信号通路。无菌性炎症中,缺血及低氧导致局部坏死,释放包括核酸在内的胞内容物,其中包括IL-1家族成员,IL-1α与局部巨噬细胞、上皮细胞表面IL-1R结合,触发炎症反应,导致中性粒细胞及单核细胞浸润。研究表明,肿瘤细胞分泌物诱导中性粒细胞浸润的炎症反应,可被缺乏IL-1R或中和IL-1α而抑制,但是不被中和IL-1β抑制。

无论是IL-1α前体,还是IL-1α,均是警报素,能快速启动炎症反应。内皮细胞因营养素缺乏,释放含有IL-1α前体和IL-1α的炎性凋亡体,炎性凋亡体诱导趋化因子和中性粒细胞浸润于血管周围,都有赖于IL-1α的参与。血小板既含IL-1α也有IL-1β,血小板源IL-1诱导内皮细胞释放趋化因子如IL-8及单核细胞释放MCP-1。血小板源IL-1在脑卒中导致的脑损伤和动脉粥样硬化中均有重要作用。(四)基于IL-1α缺陷小鼠的研究

实验研究表明IL-1α缺陷小鼠几乎不影响小鼠发育。在一些局部和全身炎症模型中,IL-1α缺陷小鼠体内出现发热和急性时相反应,而IL-1β缺陷小鼠则不能产生相应反应。与野生小鼠和IL-1β缺陷小鼠相比,IL-1α缺陷小鼠高脂肪饮食诱导后,体内动脉粥样硬化标志物和淀粉样蛋白A水平显著降低;且IL-1α缺陷小鼠体内非高密度脂蛋白胆固醇水平较高,表明膜型IL-1α在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。

糖皮质激素抑制IL-1β缺陷小鼠体内的炎症反应,但对IL-1α缺陷小鼠没有作用。IL-1α缺陷小鼠脑部IL-1β表达降低1.5倍,而IL-1β缺陷小鼠脑部IL-1α表达降低30倍。上述数据表明,IL-1β显著调控IL-1α表达,而IL-1α对IL-1β表达的调控能力较小。同时,胱天蛋白酶-1缺陷小鼠体内,IL-1α表达也明显降低。五、白细胞介素-1β(一)IL-1β是IL-1家族的重要成员

IL-1β是重要的炎性细胞因子,IL-1β和IL-1α结合相同的受体IL-1RI,启动促炎性反应。在发现树突状细胞之前,由于巨噬细胞分泌IL-1β,IL-1β被认为在巨噬细胞抗原递呈中起重要作用。无活性的IL-1β可被胞内胱天蛋白酶-1水解成有活性的IL-1β,当IL-1β基因内胱天蛋白酶-1剪切位点突变后,可导致致死性炎症反应,当阻断受体信号转导或采用IL-1β中和抗体,可逆转这种炎症反应。同时,IL-1β中和抗体可以治疗IL-1β介导的慢性炎症。

IL-1β还参与介导一类不同于经典自身免疫的“自身炎症反应(auto-inflammatory)”的疾病。虽然自身炎症反应和自身免疫反应都是炎症反应,但是自身炎症反应主要是IL-1β介导的,获得性免疫反应不参与其反应过程。(二)IL-1β是诱导细胞因子

区别于IL-1α,IL-1β前体在正常情况下不表达。健康人外周血单核细胞、骨髓细胞并没有IL-1β mRNA的组成性表达,同时,组成性表达IL-1α和IL-33前体的内皮细胞、皮肤角质细胞、成纤维细胞和上皮细胞不组成性表达IL-1β,即使予以TLR配体刺激也不表达。IL-1β主要由活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和NK细胞表达;急性髓系白血病、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、儿童髓系白血病等多种疾病的肿瘤细胞组成性表达IL-1β。黑色素瘤细胞也表达IL-1β前体,越是侵袭或转移能力高的肿瘤细胞IL-1β表达及活性水平越高。骨髓内中性粒细胞可诱导表达IL-1β前体,但外周血成熟中性粒细胞不再产生IL-1β。

与其他细胞因子的基因启动区不同,IL-1β基因启动调节区多达几千个碱基,除了cAMP反应元件,还有NF-κB样元件和AP-1位点。虽然IL-1β mRNA是反应必不可少,但是IL-1β前体转录和翻译不完全同步。非TLR配体如补体C5a、低氧、黏附到表面或凝血可诱导单核细胞中IL-1β mRNA转录水平升高,但是IL-1β蛋白质翻译水平并未明显增加,IL-1β mRNA聚集在核糖体,但是没有显著促进蛋白延伸,因此并没有完整蛋白的合成。这是由于编码区存在非稳定区所致,这些非稳定区也存在于IL-18和IL-37的基因中,导致IL-18和IL-37 mRNA不稳定。然而低浓度TLR配体与单核细胞TLR结合后,则诱导IL-1β蛋白翻译水平升高;利用IL-1诱导单核细胞也有相同的效应。(三)处理和分泌的IL-1β

几乎所有微生物产物都可通过TLR活化诱导IL-1β的产生,此外IL-1α和IL-1β也可在体外诱导单核细胞分泌IL-1β。无论何种刺激,IL-1β的分泌均活化胱天蛋白酶-1的剪切,在此过程中胱天蛋白酶-1前体需水解成胱天蛋白酶-1。然而,活化胱天蛋白酶-1需要炎症小体(inflammasome),炎症小体是一组复杂的蛋白质,参与先天免疫系统的激活。炎症小体含有细胞凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC),引起坏死性细胞死亡,同时也担负着将胱天蛋白酶-1(caspase-1)加工成激活型的重任。炎症小体的核心组分是NOD样受体蛋白3(NLRP3),NLRP3也被称为冷焦蛋白(cryopyrin),冷焦蛋白是核苷酸结合域富含亮氨酸重复蛋白家族(nucleotide-binding domain leucine-rich-repeat-containing family)的一名成员。最近报道显示,冷焦蛋白是某类病原菌-诱导的坏死性细胞死亡的一种重要的宿主介质。

外周血单核细胞用TLR激动剂刺激4小时后,释放IL-1β,且未观察到细胞死亡,在随后20~40小时内观察到其他细胞因子的释放。脂多糖(LPS)刺激单核细胞,15分钟后,IL-1β就开始显著升高,但4小时后,由于IL-1β mRNA的半衰期短和microRNA的作用,IL-1β mRNA开始衰减。IL-1刺激单核细胞,胞内cAMP水平升高,诱导IL-1转录和蛋白合成增加;相对于其他刺激因子,IL-1刺激合成的IL-1β mRNA能稳定维持24小时。同时,自身炎症患者的单核细胞,无TLR配体刺激可自发分泌IL-1β达24小时。

从健康人气道分离的巨噬细胞,给予LPS刺激后,不分泌IL-1β。然而,一旦加入外源ATP,就会释放IL-1β。除了ATP可活化P2X7受体,进而活化胱天蛋白酶-1,中性粒细胞来源的LL-37也可促进IL-1β的剪切和释放。胱天蛋白酶-1在胞浆或特化分泌的溶酶体内剪切IL-1β前体。IL-1β可以通过多种方式分泌到胞外,如溶酶体的胞吐、膜微体释放、直接通过转运体释放及外泌体释放等,一般情况下,释放活化的IL-1β伴随LDH的释放。焦亡是胱天蛋白酶-1依赖细胞死亡方式,也可释放IL-1β;增加胞内钙浓度,也可以依赖于磷脂酶C方式释放胞内成熟IL-1β。(四)功能激活突变的冷焦蛋白

CIAS1基因(编码冷焦蛋白)突变与自身炎症周期性发热综合征(以IL-1β过量生成为特征)相关。研究证实疾病相关的CIAS1突变,造成单核细胞株系内出现坏死性细胞死亡,表达突变冷焦蛋白的细胞比表达野生型冷焦蛋白的细胞释放更多IL-1β。CIAS1突变的患者体内,单核细胞经由一个依赖ASC和组织蛋白酶B(cathepsin B)程序而出现过量细胞死亡,并最终导致HMGB1的生成。由于人们认为疾病相关的冷焦蛋白突变是功能激活(gain-of-function)突变,那么野生型冷焦蛋白应该就具有与突变型冷焦蛋白相似的特质,只是表达水平较低或在刺激后才开始表达。(五)P2X7多态性及其炎症小体的激活

经典自身炎症性疾病如家族性地中海热(familial Mediterranean fever,FMF)和Cryopyrin相关周期性综合征(cryopyrin-associated periodic syndromes,CAPS)具有相似的临床表现,分泌较多的IL-1β,且IL-1R阻滞反应显著。这类疾病中NALP3无突变,可能P2X7本身存在突变或其他控制钾离子通道的基因存在突变,影响IL-1β的分泌。同时,P2X7受体基因多态性,导致功能多态性显著影响IL-1β的分泌。P2X7受体纯合子多态性患者的单核细胞分泌IL-18减少。P2X7受体的另一个多态性影响异体干细胞移植个体的生存率,这种个体并发菌血症比例高达68%,而野生型只有18%。P2X7受体缺陷小鼠表现为炎症、疼痛,小鼠体内IL-1β及其介导的IL-6生成水平均显著降低。

研究证明,类风湿关节炎患者的单核细胞经ATP刺激后,P2X7受体活化,导致IL-1β的分泌增多。ATP除了可以降低胞内钾离子,也可形成过氧亚硝酸盐(peroxynitrite),而胱天蛋白酶-1的活化需要过氧亚硝酸盐,因此,过氧亚硝酸盐减少可降低IL-1β的分泌。Pannexin-1是运输染料的通道蛋白,胱天蛋白酶-1剪切和通过P2X7受体分泌IL-1β途径均需要这种蛋白,同时,Pannexin-1也是LPS诱导IL-1β分泌所需要的。不仅ATP可刺激P2X7活化,“再生和耐受因子”也调节P2X7受体活性。(六)NLRP1多态性及IL-1β的释放

NLRP1基因与多种自身免疫性疾病如白癜风、艾迪生病、Ⅰ型糖尿病和类风湿关节炎相关。NLRP1基因L155H和M118V单倍型有更高的发病风险,当用TLR2和TLR4的激动剂刺激,单倍型2A的个体外周单核细胞释放较多组成性表达成熟的IL-1β;而IL-1α和TNFα表达无差异,且NLRP1 mRNA和蛋白水平也无差异。(七)非胱天蛋白酶-1介导IL-1β的释放

非胱天蛋白酶-1介导机制也可产生有活性的IL-1β。如在胱天蛋白酶-1缺陷小鼠体内无菌性炎症可诱导发热、升高IL-6、增加肝脏急性时相蛋白产生,而在IL-1β缺陷小鼠体内观察不到上述效应。无菌性炎症往往伴随中性粒细胞浸润,而中性粒细胞可产生IL-1β。中性粒细胞寿命很短,刺激几小时后就会死亡,胞内未处理的IL-1β前体可释放到胞外。有报道证实,中性粒细胞特异蛋白酶3能处理IL-1β和IL-18前体;而弹性蛋白酶、MMP9、颗粒酶A也能在胞外处理IL-1β前体。此外,肥大细胞类糜蛋白酶(chymase)也能产生有活性的IL-1β。蛋白酶3、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G能切割胱天蛋白酶-1位点的三个氨基酸残基,体外用蛋白酶3孵育IL-1β前体,可观察到25kD和15kD的IL-1β蛋白。IKK-β缺陷小鼠的髓系细胞比野生小鼠更易导致内毒素休克,外周血中IL-1β和中性粒细胞显著增加,阻断IL-1R可减少这种小鼠的死亡。IKK-β缺陷小鼠的IL-1β来源于中性粒细胞。(八)IL-1β缺陷小鼠

经过十年的连续繁殖,IL-1β缺陷小鼠没有明显自发性疾病,然而,皮下注射松节油(turpentine),IL-1β缺陷小鼠与野生小鼠反应明显不同。予以IL-1β缺陷鼠皮下注射松节油24小时后,无明显急性时相反应、无食欲减退、外周血IL-6未升高、无发热等现象,上述反应与注射抗IL-1R1抗体至野生小鼠的表现一致。酵母多糖诱导IL-1β缺陷鼠牙周炎的炎性反应降低。相反地,LPS处理IL-1β缺陷鼠明显加剧发热反应,且LPS处理IL-1β缺陷鼠对瘦素mRNA和蛋白表达无显著影响。

化学致癌物处理IL-1β缺陷鼠,肿瘤发生更慢或没有肿瘤发生;而化学致癌物处理的IL-1α缺陷鼠与野生小鼠之间无明显差异;而在化学致癌物刺激的IL-1Ra缺陷鼠中,肿瘤发生更快。注射化学致癌物局部有淋巴细胞浸润,而IL-1β缺陷鼠注射局部几乎没有中性粒细胞浸润,但IL-1Ra缺陷鼠体内中性粒细胞浸润增多。上述结果表明,IL-1β分泌到局部微环境,导致淋巴细胞和中性粒细胞浸润,而IL-1α对微环境影响较少。(九)IL-1β和自噬

自噬(autophagy)是一个自身细胞质或细胞器被自身吞噬包裹进入囊泡,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,其所包裹的内容物被降解的过程,为细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新提供原料。自噬在多种环境如缺血、缺氧、饥饿和生长因子缺乏等条件下均可被激活,产生代谢物和能量,维持细胞内环境的稳定,避免细胞死亡。自噬在肿瘤、神经变性性疾病和老化中有重要作用;同时也发现自噬可调节炎症反应,自噬在促炎性细胞因子产生中有重要作用,特别是IL-1β。在人体也观察到自噬在IL-1β的产生中起作用,抑制自噬可增加IL-1β产生;而同样处理却减少TNFα产生,因此说明自噬在IL-1β和TNFα这两个促炎性细胞因子中发挥不同作用。

在全基因组研究发现,两个自噬基因ATG16L1(位于染色体2q37.1)和IRGM(位于染色体5q33.1)突变,导致克罗恩病。2011年,研究发现另一个自噬基因ULK1的多态性与克罗恩病发病有关。NOD2突变个体,发生自噬缺陷,降低细菌清除,导致细菌持续存在,增加克罗恩病发病率。IL-1β在自噬相关基因导致克罗恩病发病中起重要作用。TLR4配体刺激ATG16-L1缺失的巨噬细胞,可产生高水平IL-1β和IL-18,且ATG16-L1敲除细胞胱天蛋白酶-1活性增强。用NOD2配体MDP刺激ATG16L1 300Ala等位基因细胞增加IL-1β和IL-6表达,而TLR2和TLR4配体刺激ATG16L1 300Ala等位基因细胞表达没有变化。六、白细胞介素-1与疾病的关系

IL-1及其受体参与不同急性和慢性炎症疾病的发生发展,包括败血症、休克、类风湿关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、肾病、偏头痛(migraine)、子宫内膜炎、肿瘤如肝、膀胱、胃肿瘤等,此外,注射疫苗也可诱导相应细胞因子反应。

炎性疾病有复杂的遗传背景,有些与IL-1家族基因有关。研究IL-1及其受体的单核苷酸多态性发现,IL-1与强直性脊柱炎、系统性硬化、阿尔茨海默病、严重牙周炎,终末肾炎、背痛综合征等疾病有不同程度的相关性,其中,IL-1A等位基因与皮肤过敏原点刺试验呈负相关。(一)IL-1基因簇多态性与哮喘、骨关节炎、自身免疫病的关系

IL-1RN rs2234678位点与怀孕时吸烟导致儿童哮喘相关。IL-1基因簇的可变重复核苷酸(variable nucleotide tandem repeats,VNTR)与英国患者膝关节炎相关,但是与髋关节炎无关。近年来,Meta分析结果表明,三个IL-1RN SNP如rs419598,rs9005,rs315943组成的单倍型与膝关节炎严重程度相关。基于家族和病例对照分析发现,IL-1R1的SNPs rs2287047与手关节炎严重程度相关。IL-1B SNPs rs1143634和rs1143633与小关节炎呈相关性。Meta分析发现,系统性特发青少年关节炎与IL-1基因簇的rs6712572,rs2071374,rs1688075和Il-1R的rs12712122基因多态性呈不同程度的相关性。

强直性脊柱炎与IL-1A基因多态性相关。Meta分析发现IL-1基因簇的IL-1RN VNTR、IL-1A的rs1800587、IL-36B的rs1900287与强直性脊柱炎相关;另一个Meta分析结果表明,IL-38的rs3811581、IL-1A的rs1800587、IL-1基因簇的rs2856836、rs17561及rs1894399与欧洲人强直性脊柱炎呈不同程度的相关性,而与亚洲人强直性脊柱炎无相关性;IL-38与非强直性脊柱炎表型相关。

银屑性关节炎也与IL-1基因簇相关。IL-1B启动子-511A/G(rs16944)与类风湿关节炎相关;亚洲人群IL-1A的rs1800587和IL-1B rs16944与GRAVES病和GRAVES眼病相关。意大利人群IL-1基因簇多态性与多发性硬化相关。研究发现,中国人群IL-1B和IL-1RN基因多态性与儿童IgA肾病相关;IL-1RN与蛋白尿呈相关性;IL-1A的rs3783553与斑秃呈一定的相关性,这个位点与microRNA-122结合,影响其功能。

血清中IL-1Ra水平可预测代谢综合征的进展,独立于CRP,影响Ⅱ型糖尿病的发病。IL-1基因簇基因变异与Ⅱ型糖尿病的发病呈相关性。(二)IL-1基因簇多态性与感染、慢性炎症的关系

巴西人群IL-1B基因rs1143634和NLRP3基因rs10754558与HIV-1感染相关。高风险型HPV与IL2rb/IL1RN/IL7R区的rs228942、rs419598、rs315950、rs7737000和rs9292618相关。

IL1RN启动子rs4251961(C/T)在侵袭性肺炎链球菌导致的疾病中扮演着重要的角色,死亡患者体内IL-1Ra水平显著高于幸存者,rs4251961 C等位基因与高血清IL-1Ra水平相关。

复发性口腔炎与IL-1B-511等位基因显著相关,但是与IL-1Ra VNTR无相关性。在美国、智利和中国进行大规模人群调查发现,高加索人种、非洲裔美国人、西班牙裔和亚裔多个人种IL-1基因与慢性牙周炎相关。

IL-1A基因rs17561和Ser114Ala及IL-1B rs16944与高加索人和土耳其人群慢性鼻窦炎合并鼻息肉相关。IL-1B rs1143634和rs1143639与肺纤维化的严重程度一致。(三)IL-1基因簇多态性与心肌梗死、脑卒中的关系

研究表明,年轻人群中心肌梗死、脑卒中与IL-1B启动子-511C(rs16944)相关。IL-1B和IL-10的基因变异也影响深静脉血栓的发病风险。(四)IL-1基因簇多态性与癌症的关系

IL-1RN与胃癌发病相关;IL-1RN VNTR和IL-1B-31T(rs1143627)增加非小细胞肺癌发病风险;慢性乙肝感染患者IL-1B基因启动子-511C(rs16944)与肝癌相关。IL-1B的一个等位基因与胃萎缩和胃癌相关,且与胃幽门螺杆菌疗效相关。IL-1A基因rs17561和rs4848300与卵巢癌发病相关;在意大利人群中,IL-1B+3954C>T多态性增加乳腺癌风险,而IL-6启动子-174G>C则有保护作用。日本吸烟人群中,IL-1B基因rs1143634的T等位基因增加肺癌风险。IL-1RN的rs2637988增加非霍奇金淋巴瘤的风险;最近,大规模调查发现,IL-1B rs16944增加多发性骨髓瘤风险。(五)IL-1基因簇多态性与其他疾病的关系

IL-1B和IL-1RN等位基因与肾移植的结局有关,特发性肺纤维化与IL-1RN基因多态性有关。多态性影响IL-1Ra mRNA和蛋白的表达,低IL-1Ra表达量与特发性肺纤维化发病相关。

美国人群研究发现IL-1R2与艾滋病患者睡眠质量差相关,IL-1R2 rs11674595和TNFA rs1041981与艾滋病患者的睡眠质量差相关。七、白细胞介素-1通路与疾病的治疗前景

由于IL-1是系统或局部炎症的关键细胞因子,因此IL-1通路拮抗剂在慢性炎症中有较好疗效,同时在急性炎症如心肌梗死的恢复期也有一定改善作用。1993年,合成重组IL-1R拮抗剂阿那白滞素(anakinra),anakinra可截断IL-1α和IL-1β信号转导,目前已被推荐用于治疗类风湿关节炎,但该药的半衰期短,需要每天注射。与抗TNF药物相比,anakinra的临床疗效中等,因此其临床使用较局限。

2008年5月,美国FDA批准IL-1受体阻断剂利那西普(rilonacept)。利那西普作为可溶性诱骗受体,是一种二聚体融合蛋白,由一种人IL-1受体组分(IL-1R1)的胞外部分配体-结合结构区和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)呈线性连接至人IgG1的Fc部分组成,利那西普分子量接近251kD。利那西普由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达后纯化。利那西普适用于治疗成年和12岁以上儿童的Cryopyin蛋白-相关周期性综合征,包括家族性冷自身炎症综合征(FCAS)、Muckle-Wells(穆-韦综合征:淀粉样变性-耳聋-荨麻疹-肢痛综合征,MWS)。2009年,FDA批准合成卡那奴单抗(canakinumab)并治疗Cryopyin蛋白-相关周期性综合征。卡那奴单抗是针对IL-1β的人源单抗,目前,也正在进行COPD、痛风、冠心病、精神分裂症的Ⅰ期临床试验。(崔天盆 陈 超)参考文献

1.龚非力.医学免疫学.第4版.北京:科学出版社,2014

2.Takayuki Y,Tomohiro Y. Ed. Cytokine Frontiers. Japan:Springer,2014

3.Ma XJ. Regulation of cytokine gene expression in immunity and diseases.1st ed. New York:Springer,2016

4.Blumberg H,Dinh H,Trueblood ES,et al. Opposing activities of two novel members of the IL-1 ligand family regulate skin inflammation. J Exp Med,2007,204(11):2603-2614

5.Cavalli G,Pappalardo F,Mangieri A,et al. Treating life-threatening myocarditis by blocking interleukin-1.Crit Care Med,2016,44(8):e751-e754

6.Colotta F,Re F,Muzio M,et al. Interleukin-1 type II receptor:a decoy target for IL-1 that is regulated by IL-4.Science,1993,261(5120):472-475

7.Curtis BM,Gallis B,Overell RW,et al. T-cell interleukin 1 receptor cDNA expressed in Chinese hamster ovary cells regulates functional responses to interleukin 1.Proc Natl Acad Sci U S A,1989,86(9):3045-3049

8.Dinarello CA,Simon A,van der Meer JW. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nat Rev Drug Discov,2012,11(8):633-652

9.Dinarello CA. IL-1:discoveries,controversies and future directions. Eur J Immunol,2010,40(3):599-606

10.Gay NJ,Keith FJ. Drosophila Toll and IL-1 receptor. Nature,1991,351(6325):355-356

11.Gay NJ,Gangloff M,Weber AN. Toll-like receptors as molecular switches. Nat Rev Immunol,2006,6(9):693-698

12.Garlanda C,Dinarello CA,Mantovani A. The interleukin-1 family:back to the future. Immunity,2013,39(6):1003-1018

13.Netea MG,Joosten LA,Li Y,et al. Understanding human immune function using the resources from the Human Functional Genomics Project. Nat Med,2016,22(8):831-833

14.Netea MG,van de Veerdonk FL,van der Meer JW,et al. Inflammasome-independent regulation of IL-1-family cytokines. Annu Rev Immunol,2015,33:49-77

15.Smith DE,Lipsky BP,Russell C,et al. A central nervous system-restricted isoform of the interleukin-1 receptor accessory protein modulates neuronal responses to interleukin-1.Immunity,2009,30(6):817-831

16.Smith DE,Hanna R,Della F,et al. The soluble form of IL-1 receptor accessory protein enhances the ability of soluble type II IL-1 receptor to inhibit IL-1 action. Immunity,2003,18(1):87-96

17.Wald D,Qin J,Zhao Z,et al. SIGIRR,a negative regulator of Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling. Nat Immunol,2003,4(9):920-927第二章 白细胞介素-2

白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)又称T细胞生长因子,是第一个被克隆的Ⅰ类细胞因子,由抗原激活后产生,在免疫应答和免疫+耐受中均具有重要意义。IL-2不仅可以促进CD8T细胞和NK细胞的增殖和细胞杀伤作用,还能调节抗原应答后T细胞的分化。研究发现,+IL-2可以促进CD4初始T细胞分化形成Th1和Th2,同时抑制Th17和Tfh细胞的分化。更为重要的是,IL-2也是调节性T细胞发育和维持稳定过程中一种重要的细胞因子。因此,IL-2具有广泛的生物学作用。目前IL-2已经作为一种治疗药物应用于临床细胞免疫治疗,同时抑制IL-2的信号传导也是肌纤维化、类风湿关节炎等疾病的治疗手段之一,最近研究还证实,低剂量的IL-2在自身免疫性疾病及炎性疾病的治疗中也发挥了重要作用。一、白细胞介素-2基因和蛋白

IL-2是由四个α螺旋形成的捆绑结构,分子量为15.5kD,主要由++抗原刺激的CD4T细胞产生,但CD8T细胞、树突状细胞、NKT细胞以及肥大细胞也能产生少量的IL-2。在T细胞中,IL-2的转录依赖于TCR信号诱导和共刺激信号的维持,转录后IL-2基因会被沉默掉,而IL-2 mRNA也会被快速降解,因此IL-2的分泌是一个快速又短暂的过程。

多种转录因子共同介导IL-2的转录,这些因子包括激活的T细胞核因子(NFAT)家族蛋白、活化的蛋白-1(AP-1)以及八聚体转录因子(OCT-1)等。TCR信号可以诱导AP-1,AP-1与NFAT结合后入核,可结合到IL-2的启动子位点,从而促进IL-2的转录。NF-κB在IL-2的基因座上有两个结合位点,NF-κB p50的同源二聚体抑制IL-2基因表达,而NF-κB p65/cRel可促进IL-2的表达。Oct1和Oct2在PMA和离子霉素的作用下,结合到八聚体的结合位点,并与AP-1共同作用诱导IL-2基因转录。除以上所述,SP-1、Egr-1、GABP以及TRIM28也是IL-2基因转录的正向调控因子。

IL-2的转录不仅有正向调节,也受负向调控。研究发现Zfxla(ZEB,TCF8)以及CREM通过与IL-2的启动子序列结合,可抑制报告基因的转录。T-bet(Tbox21)通过与Rel-A相互作用,再与邻近IL-2启动子结合,也可抑制IL-2的产生。除此外,BLIMP1和Aiolos也可抑制IL-2的表达,在IL-2的负反馈调节通路中STAT5和BLIMP1发挥着重要作用,静止状态的T细胞被抗原刺激活化后,即可产生IL-2,并表达高亲和力的IL-2R,IL-2R通过与IL-2的结合,激活STAT5并诱导BLIMP1的表达,从而抑制IL-2的表达。二、白细胞介素-2受体

IL-2受体(interleukin-2 receptor,IL-2R)是由三个亚单位共同组成的异源三聚体,包括IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)以及公有链γc(CD132)。人CD25含有251个氨基酸残基,CD122含有525个氨基酸残基,CD132含有347个氨基酸残基。单独的IL-2Rα结合IL-2亲和力低且不能传导信号,IL-2Rβ和γc共同构成中等亲和力受体,是IL-2信号传递所必需,而三聚体IL-2Rαβγ构成高亲和力受体,可介导信号的传导(图2-1)。图2-1 IL-2不同亲和力受体类型

除了一些前T细胞和前B细胞,大部分淋巴细胞不表达CD25,但当效应细胞被抗原激活后,淋巴细胞表面可短暂性表达CD25。因此在严重的自身免疫紊乱形成以前,CD25缺陷小鼠体内T和B细胞的发育均正常。在T细胞的体外实验研究中证实,CD25在活化T细胞中的高表达主要通过两个步骤来完成,首先细胞在TCR以及共刺激信号作用下,通过NF-κB、NFAT、AP-1以及CREB/AFT,诱导CD25中度表达;接着,IL-2和IL-2R的结合进一步激活STAT依赖的正反馈通路,进而诱导CD25高表达。除了活化T细胞,nTreg细胞表面持续性高表达CD25,除上述机制外,可能还与TGF-β信号传导有关。IL-2Rα除了以跨膜形式存在于细胞表面,还可以可溶性形式存在于体液中。当IL-2Rα从细胞膜上经酶解后进入血液,就形成了可溶性IL-2Rα(sIL-2Rα),sIL-2Rα可以和细胞膜表面的IL-2Rα竞争结合IL-2,从而导致膜型IL-2Rα与IL-2的结合减少,使IL-2对靶细胞作用减弱(图2-1)。正常人血清和尿液中可检出低水平的sIL-2Rα。研究发现,在感染、移植排斥和自身免疫性疾病患者体内sIL-2Rα的表达水平升高,且与疾病严重程度密切相关,因此,sIL-2Rα的水平监测对于疾病的诊断及预测具有一定的价值。

CD122是IL-2的受体组成成分,同时也是IL-15R的重要组成部+分。CD122组成性表达于NK细胞、NKT细胞、记忆性CD8T细胞以+及Foxp3Treg细胞,而当抗原刺激后,所有T细胞表面都能表达CD122。CD132是IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R、IL-15R和IL-21R信号传导的共有链,这些细胞因子受体共用γ链,可以解释其功能的冗余性,其中IL-2和IL-15对于调控淋巴细胞的稳态起非常重要的作用。虽然IL-2和IL-15受体共用β链和γ链,但与IL-2Rα不同,单独的IL-15Rα可高亲和力结合IL-15,且表达IL-15Rα的细胞与IL-15结合后还可反式呈递给另一个表达IL-15Rβγ的淋巴细胞,而单独的IL-2α结合IL-2的亲和力较低,且IL-2α虽具有反式呈递作用,但由于亲和力不够,与IL-2的结合也只是非常短暂的过程。总之,虽然IL-2和IL-15具有共同的受体亚基和信号转导通路,但在某些免疫学功能上具有不同甚至相反的作用。

IL-2与IL-2R的结合是一个非常短暂的过程,IL-2一旦被征募,IL-2受体复合物就会迅速被内化,IL-2、CD122和γc会在溶酶体中蛋白酶体的作用下迅速降解,而CD25定位于早期运铁蛋白的内含体中并被重新回收到质膜表面,因此IL-2依赖的T细胞克隆增殖需要IL-2长期的作用以及IL-2R持续性的表达。三、白细胞介素-2及其受体的信号传导

IL-2的信号传导主要依赖于胞浆内IL-2Rβ和γc链的尾部结构域,当二者相互靠近,JAK分子被激活并与受体相结合,其中JAK-1对应IL-2Rβ链,JAK-3对应γc链,磷酸化的JAK使受体的酪氨酸残基发生磷酸化,并招募接头蛋白Shc,或诱导STAT5或STAT3的结合。Shc为细胞生长或生存相关的MAPK通路的激活提供了一个重要的平台,而磷酸化的STAT5蛋白能够调控IL-2诱导的相关基因的表达。除此之外,IL-2还可激活PI3K-AKT-p70S6激酶信号传导通路,这一通路的激活也促进了细胞的生长与存活(图2-2)。图2-2 IL-2及其受体的信号转导途径四、白细胞介素-2的生物学功能(一)IL-2和辅助性T细胞的分化+

CD4T细胞在抗原刺激下可分化为多种功能性的辅助T细胞亚群,包括Th1、Th2、Th9、Th17以及Tfh等。IL-12的作用可促进Th0向Th1的分化,并分泌细胞因子IFN-γ;IL-4的作用促进Th2的分化,分泌细胞因子IL-4、IL-5以及IL-13;IL-4和TGF-β可促进Th9的分化,并产生IL-9;IL-6和TGF-β可促进Th17细胞的分化,分泌细胞因子IL-17A、IL-17F以及IL-22;而IL-6和IL-21的共同作用可促进Tfh细胞分化。然而这些分化通路并不是他们的终端路径,一定条件下,不同的辅助T细胞间可以相互进行转化,并分泌与之不同的辅助T细胞特异性的细胞因子。1.Th1细胞的分化

Th1细胞在对抗病毒和胞内菌的防御过程中发挥重要作用,由于Th1分泌IFN-γ,导致病理性的炎性损伤。IL-12是Th1细胞分化过程中不可或缺的细胞因子,T-bet可以特异性增加IL-12Rβ2的表达,从而促进Th1的存活与增殖。IL-2在Th1细胞分化过程中可以诱导IFN-γ的产生,更为重要的是,IL-2还可通过STAT5通路迅速诱导IL-12Rβ2的表达,从而扩大对IL-12的反应性。研究发现,在IL-2敲除的T细胞中,使用逆转录病毒转入IL-12Rβ2,Th1细胞生长抑制的现象会被部分逆转,因此IL-2诱导的IL-12Rβ2表达对于Th1细胞分化具有重要作用。研究同样证实了IL-2对于Th1细胞分化的重要性。在IL-27受体敲除小鼠模型中检测出高浓度的IL-2,且将小鼠感染弓形虫后,高水平的IFN-γ分泌导致致死性的炎性疾病,但当应用IL-2阻断剂后,疾病严重

试读结束[说明:试读内容隐藏了图片]

下载完整电子书

若在网站上没有找合适的书籍,可联系网站客服获取,各类电子版图书资料皆有。

客服微信:xzh432

登入/注册
卧槽~你还有脸回来
没有账号? 忘记密码?