作者：何世伟
出版社：浙江大学出版社
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色谱仪器试读：
前言
随着科学技术的突飞猛进和社会经济的迅速发展，分析仪器和技术在科学研究和技术创新活动中、在应对各种食品安全、环境污染、质量控制等突发事件中扮演着越来越重要的角色，其不可替代的作用日益显现，其中色谱仪器和色谱技术是生命科学、材料科学、环境科学等必不可少的工具和手段之一。据统计，在全世界各类分析仪器中，色谱仪器占了30%以上的份额，足可见色谱仪器的重要性。
介绍色谱技术的各种著作国内外已经出版了许多，其中介绍单类色谱仪器比如气相色谱、液相色谱、离子色谱等色谱仪器的著作也有很多，但市面上缺少一本系统的全面介绍各种色谱仪器的书籍。作者长期从事色谱仪器的科研和管理工作，具有丰富的实践能力和管理能力，为此，作者组织并联合专家出版本著作，该书在理论上全面阐述色谱仪器的分离原理和仪器组成（包括进样系统、分离系统、检测系统和联用系统），系统介绍当前应用广泛的几类常用色谱仪器。
本书共分为七章，其中第一章绪论由何世伟、郭伟强编写；第二章气相色谱仪由郭伟强、何世伟编写；第三章高效液相色谱仪由何世伟、金米聪编写；第四章离子色谱仪由何世伟、朱岩编写；第五章超临界色谱仪由金米聪编写；第六章其他色谱仪器介绍由何世伟、吴晓玲编写；第七章色谱工作站由曾雪灵编写。
本书能够让读者较快地掌握色谱仪器的基本使用，可作为大专院校学生的教材和参考书。
本书的出版，得到了浙江省科技厅和浙江省科技信息研究院的多位领导的指导和支持，也得到了省科协育才工程项目的大力支持。在浙江大学化学系朱岩教授、郭伟强教授，宁波市疾病预防控制中心金米聪教授，浙江工商大学蔡美强副教授，赛默飞世尔科技公司曾雪灵工程师的帮助和共同努力下，本书才得以顺利完成。
本书非常荣幸地得到了中国科学院院士、中国分析测试协会副理事长、中国化学会色谱专业委员会主任张玉奎的肯定和题词。在此，对所有支持和帮助出版本书的领导、专家一并表示衷心的敬意和感谢！
在整理和编著本书过程中，难免有错误和疏漏，请有关专家和读者指正，作者表示衷心的敬意和感谢！何世伟2012年10月第一章绪论色谱法（chromatography）是一类针对复杂试样的分离技术的总称，是现代分离分析的重要方法之一，已经形成了气相色谱、液相色谱、薄层色谱、凝胶渗透色谱和纸色谱等系列；新的色谱方法，如离子色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳、亲合色谱等也仍在不断涌现，加上近十年来现代色谱分析在新型色谱固定相、色谱-质谱/色谱-红外光谱等联用技术、超高压液相色谱等方面取得的长足发展，使色谱法成为现代自然科学实验室应用最广泛的基本技术，在石油、化工、化学、医药卫生、食品、轻工、环境、刑侦、兴奋剂检测、生产在线控制，乃至空间探索的科研、生产、社会服务等众多领域发挥着越来越重要的作用。作为一种简单而有效的技术，色谱法还渗入到催化机理、吸附动力学、化学反应动力学、溶液理论和超分子化学理论研究等方面，揭示了物理化学领域内的某些基本现象和规律的微小差异，成为人们认识客观世界必不可少的工具，也是现代自然科学实验室应用最广泛的工具之一。第一节色谱发展简史
将一滴混合色素溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个不同颜色的同心圆环，古罗马人就是用这种简单方法来考察染料与染色效果。160多年前，德国化学家Runge对该方法进行了重大的改进，使其具有更好的重现性，并且进行了定量考察的探索。后人的继续努力使这项技术发展成今天的纸色谱分析。图1-1 M ikhail Semenovich Tswett
虽然Runge于1850年发表的色谱分离的报告是迄今为止所能查阅到的首篇色谱论文，虽然1905年Ramsey也曾用色谱法分离过气体混合物，但目前还是公认俄国植物学家Mikhail Semenovich Tswett（图1-1）为色谱法的创始人。1901年，Tswett以如下实验方法研究植物3叶色素成分：将CaCO填入玻璃管中，倒入植物叶的石油醚提取液，3然后用石油醚淋洗。由于不同色素与CaCO的作用力不同，随淋洗液的加入，混合色带逐渐下移并开始分离，最后，各色带完全分离，形成了一系列不同颜色的小段（谱带）。Tswett将柱内填充物取出，按色带分段切割，进行鉴别和测定。混合色素在碳酸钙柱上被分离成不同色带的现象，类似于一束白光被棱镜色散成七色色带的光谱现象，因而将其称为“色谱”, “chromatography”一词即是由希腊文“chroma”（颜色）和“graphein”（书写）两词组成。
该方法问世后，因分离速度慢、分离效率低，并未引起人们的重视。直到20世纪30年代初，R.Kuhn与Lederer参考了Tswett的工作，用碳酸钙粉末装柱，成功地从蛋黄中分离出了植物叶黄素。这一尝试不仅证明蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素的混合物，更证实了Tswett的色谱法可以用来进行制备分离。从此，色谱分离法真正引起各国科学工作者注意，迅速且广泛地用于各种天然有机化合物的分离与分析。自瑞典科学家Tiselius和Claesson创立了液相色谱的迎头法与顶替法后，液-固色谱法有了进一步的发展。
色谱学真正成为分析化学重要分支是以气相色谱法的发明、发展为标志的。1941年，英国生物化学家Martin和Synge设计了一套由40个容器组成的萃取装置，从水相中将蛋白质水解产物乙酰化氨基酸萃取进入有机相而成功分离出来。随后他们在硅胶色谱柱上用氯仿淋洗进行同样工作，成功地分离了样品中的各种氨基酸，奠定了液-液分配色谱的基础。在此基础上，他们提出色谱塔板理论，以“理论板数”表示分离效率，定量地描述、评价了色谱分离过程。同时，他们还提出了色谱法进一步发展的预言：“流动相可用气体替代，对分离更有好处”和“使用非常细颗粒的填料和增加柱压差可得到最小的理论板高。”两个预言分别预见了气相色谱法和高效液相色谱法的必然出现。1952年，他们首次用气体为流动相，涂渍在惰性载体上的高沸点液体为固定相，配合微量酸碱滴定池，发明了气相色谱仪（图1-2），正式提出了气相色谱法。在气-液色谱法中，以溶解分配原理代替了吸附分配原理，扩展了气相色谱法的应用范围，弥补了吸附剂种类不多的缺陷。因此，M artin他们的工作在分析化学界产生了巨大的影响，并获得了诺贝尔化学奖。
1954年N.Ray把热导池用在气相色谱仪上的同时对仪器进行了重大改进，扩大了气相色谱法的应用范围。1956年荷兰学者Van Deemter等人在总结各种色谱理论的基础上提出了气相色谱的速率理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1958年，美国工程师Golay提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法，使气相色谱技术得到了广泛应用。随后几年中，澳大利亚的I. McWilliam和英国的J.Lovelock等先后发明了氢火焰离子化、氩离子化、电子捕获等一系列高灵敏高选择性的检测器，把气相色谱法推上了一个新台阶，获得了迅速的发展。至1974年人们先后发明或发现了24种可用于气相色谱法的检测器，但由于种种原因，现在常用的还是热导池、氢焰、电子捕获、火焰光度和热离子这5种。图1-2 世界首台气相色谱仪示意图
1850年，英国化学家F.T.Way就发现了离子交换的现象，1953年， Adams和Holmes合成了离子交换剂，并将其用于色谱分离，从而形成了离子交换色谱法。1938年，Izmailov等将糊状氧化铝铺展在玻璃板上，形成2mm厚的薄层，用于分离药用植物的萃取物，开创了薄层色谱法。1944年，Consden、Cordon和Martin创立了纸色谱法：他们利用滤纸的毛细作用，让溶剂由下至上地渗透，结合混合物中各组分在两相中的溶解度的差异，使各组分以不同速率在滤纸上迁移而得到分离。1959年，Porath和Flodin提出了大小排阻色谱法，其原理是利用柱内多孔填料对不同尺寸的分子具有选择渗透作用。这一系列的工作推动了液相色谱法的迅猛拓展。
至此，所有液-固色谱法流动相都是受重力影响自然下行进行分离，被分离物的检测也大多依靠肉眼的观察或将吸附剂从柱管里面取出再行分析。到20世纪60年代，随着气相色谱技术的积累，人们在高效微粒填充剂研制和高压输液泵/光学检测器发展上取得了很好的进展，在大大提高液相色谱分离能力的同时，也加快了液相色谱的分析速度。70年代又出现了用自动电导检测器分析痕量正负离子的新式离子交换色谱法，这一系列改进使液相色谱无论是在技术上还是在仪器上，都产生了一个新的飞跃。
Klesper等人于1962年提出了超临界流体色谱（SFC）技术，以2超临界状态的CO作为流动相，对很多高沸点有机化合物有良好的溶解性，其本身也具有良好的渗透性，还可采用氢火焰离子化检测器检测，因此解决了一些低挥发性、高温下不稳定的复杂混合物的分离问题。80年代以后，毛细管柱应用于超临界流体色谱技术中，使得超临界色谱技术又前进了一大步，希望能成为填补气相色谱、液相色谱之间空白的主要手段。但近年来的深入研究发现SFC正处于尴尬的地位：虽然有其独特的用途，但毕竟是被“挤”在GC和HPLC之间的夹缝中，面临被“束之高阁”的可能。
20世纪80年代发展起来的毛细管电泳是利用在电场内移动速率的差异而进行分离分析的，虽然从本质上讲它不属于色谱法，但它结合了毛细管色谱技术（包括改性毛细管柱和微填充毛细管柱）及色谱微量检测技术，解决了DNA及其片段、单克隆抗体、蛋白质及多肽等一般色谱技术难以解决的分离分析问题，故毛细管电泳方法通常也归并于色谱范畴。现在已经派生出毛细管胶束电动色谱、毛细管等电聚焦、毛细管电泳离子分析法、微填充毛细管电泳法、芯片毛细管电泳等多个新分支。值得注意的是，毛细管区带电泳（CZE）和毛细管电色谱（CEC）的驱动原理都是电渗流，其流动速度的波动是造成其定量分析的主要误差来源，其偏差比HPLC法整整大一个数量级，克服这一困难是近期具有挑战意义的使命。
随着生物工程研究的进展，人们运用色谱法能够制备微量而贵重的生物活性化合物，从而发展了内径为∅200～400cm，厚度仅为10cm的高效制备色谱柱及径向制备色谱技术。所有这些色谱技术的发展，都为色谱方法开拓了全新的应用领域。目前，气相色谱与液相色谱的发展并驾齐驱，相辅相成，各有其驰骋的领域。事实上这些色谱方法已经成为化学工作者分离分析复杂混合物不可缺少的手段。
2000年6月26日，参加人类基因组工程项目的美、英、法、德、中、日6国科学家共同宣布，人类基因组草图的绘制工作已经完成。2006年5月18日美英科学家在《自然》杂志上发表了人类最后一个染色体——1号染色体的基因测序。31.647亿个碱基对组成的3万～3.5万个基因，这一庞大计划工程的提前完成得益于阵列毛细管电泳技术的发展。而分子量达2万～5万的蛋白质组成的确认仅仅依靠现在的体积排阻色谱和反向液相色谱是无法实现的，色谱分析方法的进一步开发面临着新的考验。
色谱仪器的发展也同样一日千里，自从20世纪50年代第一台色谱仪问世以后，60年代就有数台5kg重的色谱仪随阿波罗飞船同登月球，自动取样分析， 1970年更有一台100g重的色谱仪被带上了火星。1967年时全世界共有色谱仪7万台，1972年就发展到20万台。而目前只要有个“化”字的实验室几乎都配备了色谱仪。虽然在众多国际大品牌的强大攻势下，仅浙江省色谱仪的年生产量仍能超过千台，足见色谱分析技术的应用之广泛。因而，色谱法已经成为科研、生产中强有力的检测工具，极大地推动了国民经济的发展。
在今天，色谱仪器、色谱技术还在继续向前发展，新的色谱仪器与色谱方法不断涌现。研制具有人工智能的仪器也是当今分析仪器发展的方向，目前几乎所有厂家生产的高配置色谱仪均用专用单片机进行整机智能化控制同时配有专用的色谱工作站软件。同时，人们在对色谱法的广泛实践与理论深入研究的基础上概括出有关规律，并与计算机技术结合，创造了色谱专家系统，从而使计算机在解决色谱实际问题方面具有类似于人类专家的经验以及逻辑判断、推理的能力。色谱专家系统是人们对色谱理论的研究成果，是长期累积的丰富实践与计算机技术发展的结晶，它是先进的硬件与高水平的软件有机结合的产物。
各种新型色谱技术及其相应的仪器的开发和推广，进一步促进了色谱技术的发展．多维色谱，如全二维色谱、多维液相色谱、二维毛细管电泳等在复杂样品分析中发挥着越来越重要的作用。色谱联用系统的开发对整个色谱分析技术的提高起到了重要的作用。色谱-质谱联用、色谱-红外联用、色谱-原子光谱联用、色谱-核磁共振联用等多种联用方式不仅使色谱定性分析更为准确，也加快了色谱仪器的更新换代，更促进了色谱分析技术的突飞猛进。第二节色谱法的定义和分类一、色谱法的定义
色谱法是一种非自发、需耗能（由高压气体或液体提供）的分离方法。被检样品混合物中的不同组分与互不相溶的流动相（mobile phase）和固定相（stationary phase）之间的吸附、溶解、分配或离子交换等相互作用是存在着差异的，当流动相携带着多组分混合物流过固定相时，使得性质不同的各个组分随流动相移动的速度产生了差异，随着组分在两相之间持续发生反复多次的作用，原来微小的差异累加产生了很大的效果，从而使各组分在柱内移动的同时逐渐分离。
例如某含A、B两个组分的试样，已知A组分在固定相中的分配系数（即与固定相的作用力）大于B，当样品由流动相携带进入填充有固定相的色谱柱头时（如图1-3所示），组分A、B是完全相混的。由于A组分在固定相中的溶解能力比B大，故A组分的移动速度慢，经过多次反复分配后，分配系数较小的B组分首先被带出色谱柱，而分配系数较大的组分A则迟被带出色谱柱，从而实现了分离。
在经典色谱分离中，从色谱柱后流出的各组分用容器一一收集后，供进一步的分析或使用。而在现代色谱仪器分析中，从色谱柱流出的被分离了的组分被流动相“在线”导入检测器，将各组分的浓度变化用电压、电流信号记录下来，直接对每个组分进行定性和定量分析。图1-3 色谱分离分析原理的示意图（a）分配平衡的差异造成的 A、B两不同组分的差速迁移；（b）A和B在色谱125系统中的分离和检测过程；（c）所记录的色谱图（c图横坐标 t, t, …, t对应于各自上方b图中相应的4个分离阶段）二、色谱法的分类
色谱法可按固定相和流动相的状态、分离机理及固定相外形等不同因素分类，图1-4为大致的分类示意。1．按流动相与固定相聚集态分类
流动相为气体和液体的分别称为气相色谱和液相色谱。然后根据固定相是固定液（附着于惰性载体表面的一薄层特种有机化合物液体）还是固体吸附剂又可再细分为气液色谱（GLC）、气固色谱（GSC）、液液色谱（LLC）及液固色谱（LSC）。以超临界流体为流动相的则为超临界流体色谱（SFC）。如果固定相是以化学键合方式将固定液键合到载体表面的，则可称为“键合相色谱（chemically bonded phase chromatography, CBPC，常见反相高效液相色谱的固定相都是键合固定相）”。
从分离本质上讲，毛细管电泳不属于色谱法。但现代高效毛细管电泳运用了毛细管色谱技术及色谱微量检测技术，同时新型的改性毛细管柱和微填充毛细管柱都利用了色谱分离的基本原理，故毛细管电泳方法通常也归并于色谱范畴。图1-4 色谱法的基本分类比2．按所利用的物理化学原理分类（1）吸附色谱（adsorption chromatography）。吸附色谱包括气-固吸附色谱、液-固吸附色谱。超临界流体色谱基本上也归属此类。吸附色谱的作用原理是通过固体表现对物质的物理吸附作用的差异实现分离。许多气体的分离分析，目前还只能用吸附色谱来解释。键合固定相与交联固定相也可以看成是新型吸附固定相。在气相色谱过程中，这类固定相与组分的作用主要是在表面上进行的，故其作用过程可视为吸附分配过程，但在液相色谱过程中，由于键合的烷烃链具有刷形结构，被分离的分子有可能深入到刷状结构的内部，产生类似于溶解的作用，故在液相色谱过程中，键合相可视为独特的吸附剂。以吸附剂为固定相的特点是耐高温、不被溶剂抽提、构型分离选择性好，但吸附剂的制作重复性差。在选择性方面，由于吸附剂只有平面力场作用，被吸附分子构型不同，作用的距离就有区别，故吸附色谱保留值受构型的影响特别大，这有利于异构体分离。（2）分配色谱（partition chromatography）。分配色谱包括气-液分配色谱与液-液分配色谱。它是利用组分在两个不相混溶的相中分配系数的差别，达到彼此分离的目的。由于尚未发现绝对不相互溶而又适用于色谱应用的液-液体系，因而液-液分配色谱目前应用程度还十分有限。（3）按其他作用原理。除分配吸附原理之外，人们还采用了离子交换、凝胶渗透、形成络合物、亲合力及利用离子在电场内有不同迁移速度等不同原理，创造了离子交换色谱、凝胶渗透色谱、络合色谱、亲合色谱以及毛细管电泳等技术。3．按固定相的形状分类（1）柱色谱（column chromatography）。柱色谱是将固定相装在一根管子中，如果固定相装满色谱柱则称为填充柱；若在柱管中心留有流动相通过的通道则称为开管柱。毛细管色谱是一种开管柱色谱，它的固定相涂渍在毛细管内壁上。内径小于1.0mm的柱管一般都可称为毛细管柱。也有将极细的固定相填充于毛细管中进行分析，即为填充毛细管柱。采用柱管进行分离的色谱称为柱色谱。（2）纸色谱（paper chromatography）。利用含水的滤纸作为固定相，在滤纸上直接用溶剂展开实现混合物的分离。由于滤纸来源方便，且可直接采用化学显色法检测组分，因此至今仍在大量的实际工作中继续采用纸色谱进行分析。（3）薄层色谱（thin layer chromatography）。将吸附剂研成粉末，再均匀地涂在平板上，然后采取与纸色谱类似的操作进行分离。近年发展起来的对溶剂加压、离心强迫流动等技术，使薄层色谱样品处理能力达到制备色谱水平。（4）棒色谱（bar chromatography）。棒色谱是将吸附剂研碎后涂敷在石英棒上，速度快、定量较为可靠。
后三者的设备和操作都较简单，易于普及。4．按色谱动力学过程分类（1）冲洗法（elution chromatography）。这是色谱过程中最经典也最常用的方法：将试样加入色谱柱入口端，然后再用流动相冲洗柱子，由于各组分在固定相上的吸附（或溶解）能力不同，于是被流动相带出的时间也就不同，这种方法的分离效能高，除去流动相后可得到多种高纯度（99.99%以上）的物质，可用于纯物质的制备。但该方法要花费大量的流动相，同时组分也经历了高度的稀释，因此冲洗法用于制备是不经济的。（2）顶替法（displacement chromatography）。当试样加入色谱柱后，再将一种吸附能力比所有组分都强的物质加入柱中。此后各组分依次顶替流出，吸附能力最弱的组分将首先流出色谱柱。这种方法有利于族分离，而且可以得到比较大量的纯物质，但方法的局限性较大。（3）迎头法（frontal chromatography）。将样品连续不断地通入色谱柱中，在柱后可得到台阶形的浓度变化曲线。根据台阶的位置定性，根据台阶的高度进行各个组分的定量。这种方法很简单，但在分析组成复杂的样品时，不易获得准确的结果。
冲洗法是目前最常用的方法，而后两种方法已基本不用。图1-5 不同方法的流出曲线三、色谱法的特点
由于色谱法是先分离后检测，边分离边检测的分析方法，故对多组分混合物（如同系物、异构体等）可同时得到每一组分的定性、定量结果，结合色谱数据库与专家系统，这一切都是相当容易的。综合各种色谱分析方法，高选择性、高分离效能、高灵敏度、分析速度快、样品用量少与应用范围广都是它们的基本特点。
与液相色谱相比，气相色谱法的优点是物质在气相中输运速度快，流动相渗透性强，故可采用长柱，从而分离效率高，分析速度快。气相色谱要求样品在分离条件下有一定的挥发性及热稳定性。对于许多不稳定或沸点过高的化合物，只要它在溶液内有一定溶解度就可采用液相色谱技术进行分离分析。在对溶质的选择性方面，气相色谱与液相色谱各具特色。
在气相色谱过程中，气相内的分子位能场很小，可忽略不计。在固定相中分子间有一定的作用力场。物质分子从固定相迁移到流动相，是从一个有力场存在的环境转移到一个力场可以忽略不计的环境，故分子的大小的影响比较明显。在液相色谱中，分子无论是流动相或固定相内，都处于有力场的环境。对于体积较大的分子，在固定相上和流动相内的作用都较强，因此相互有所抵消，因而在固定相上某些官能团的特殊作用就被凸显，因此，在液相色谱中溶质分子的官能团类型对保留值起着决定性作用。相同官能团不同大小的分子有可能同时流出，利用液相色谱技术的这一特点可进行族分离。
超临界流体色谱技术的实用价值在于采用了近乎临界状态的稠密气体为流动相，在这种状态下，流动相对于多种物质具有良好的溶解性。因此许多在气相色谱过程中不稳定的以及在液相色谱上难分离的化合物可以采用超临界流体色谱技术分析。超临界流体色谱技术的出2现扩大了色谱分析的应用范围。采用超临界CO为流动相则有良好的2渗透性，因此可选用长柱实现高效分离。用CO为流动相，可利用氢火焰离子化检测器来检测信号，如果用低碳烃为流动相时，就可配用常用的紫外检测器或荧光检测器，以获得更高灵敏度。但流动相在超临界条件下分离强极性化合物时有一定的局限性，许多实际问题都有待解决。近年来的发展证明，用超临界色谱取代其他色谱技术的想法是不正确的。
综上所述，气相色谱与液相色谱相比，采用气体作流动相价格也比有机溶剂便宜。液相色谱的最大特点是可以分离不可发挥而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，而这类物质在已知化合物中占有相当大的比例。超临界流体色谱的特点是可分析较难挥发而成分较复杂的混合物。
色谱法的特点主要为：（1）分离效率高。可在很短的时间内分离多达二三百个组分的6复杂物质，柱效能可达10的理论板。HPLC的效率相对略低于GC。毛细管电泳的理论板数更可高达几百万甚至上千万（凝胶毛细管电泳）。-9-10（2）灵敏度高。可以检测出10～10g级的痕量组分，气相色-12谱法更能低至10g，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。（3）样品用量少。样品用量一般为微升级，少的为纳克级。（4）适用范围广。可分析气体、液体和部分固体，在450℃操作温度以下有0.2～10mmHg的蒸汽压及热稳定性良好的化合物原则上都可以直接用气相色谱法分析。而气相色谱不能分析的无机样品、热稳定性差及挥发性小的有机物则可用HPLC法测定。对于某些特殊物质，也可以通过柱前或柱后的衍生化反应转化后再进行色谱分析。而近年来发展起来的超压液相色谱（UPLC）使分析速度有了进一步提高。（5）色谱分析定性能力较差，色谱图本身不能直接给出定性结果，往往需要有已知纯样进行对照。虽然HPLC的紫外检测器能提供光谱信息，但其信息量太少，不足以准确定性。同时色谱法无法提供分子量和官能团信息。为此积极发展色谱-红外、色谱-质谱联用技术是十分必要和急迫的。利用色谱把复杂混合组分一个个分离开，然后由红外光谱确定官能团，由质谱确定分子量及分子结构，定性结果就很准确了。
几种色谱分析方法的性能比较见表1-1。表1-1 各种色谱分析方法的性能比较第三节色谱基本原理
在色谱分离过程中，不同组分为何能在柱内移动的同时被分离？组分谱带为什么会展宽？所得到的色谱信号又如何还原为样品中各组分的自身信息？这是色谱基本理论需要解决的问题。一、色谱流出曲线和色谱参数
在色谱分离分析过程中，所记录的检测器响应信号随时间变化的曲线叫色谱流出曲线，如图1-6所示。色谱流出曲线中包含着许多重要信息。1．基线（baseline）
没有组分进入检测器时记录仪所到的信号，如图1-6中O-C段（小峰P除外）。基线反映了检测器噪声随时间变化的情况，稳定的基线应该是一条直线。2．色谱峰（peak）
当试样组分进入检测器时记录仪所显示一个峰形信号，如图1-6中C-A-D部分。图1-6 色谱流出曲线3．保留参数
保留参数一般以分（min）和秒（s）表示。R（1）保留时间（retention time, t）。从进样到出现某组分色谱信号最大值（峰顶点）所需的时间，图1-6中O′-B段。保留时间为组分在色谱柱内的总滞留时间。M（2）死时间（dead time, t）。不被固定相吸附或溶解的组分从进样到出现该惰性组分色谱峰顶点的时间，图1-6中的O′-A′段。死时间反映了组分流经色谱柱内空隙所需要的时间。由于真正意义上不被色谱固定相保留的组分是不存在的，因而直接测量而得的死时间都是不确切的。但可以通过以下方法得到：取间隔相等的直链正构烷烃678（如C、C和C）在选定色谱条件下进样得到它们的保留时间，然后以下式进行计算得到死时间。（3）调整保留时间（adjusted retention time ,）。扣除死时间后组分的保留时间，即调整保留时间反映组分因被固定相溶解或吸附所保留的净时间，图1-6中的A′-B段。4．峰高（peak heigh, h）
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，图1-6中的A-B′段。峰高的单位为mV等检测器所给出的相应物理量。5．峰宽参数
色谱峰的峰宽有三种表示方式：（1）峰底宽（peak base width, W）。也称基线宽度，为通过色谱峰两侧拐点所作的切线与基线交点之间的距离，图1-6中I-J段。1/2（2）半峰宽（half peak width, W）。峰高一半处色谱峰的宽度，图1-6的GH段。色谱峰的半峰宽容易测量，所以一般都用它表示峰的宽度。（3）标准偏差（σ）。0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半，图1-6中EF的一半。
各峰宽参数的单位一般用分（min）或秒（s）表示，其相互关系为1/2W = 4σ= 1.7 W 1/2W = 2.354σ二、色谱分离的基本理论
色谱分离中，决定相邻组分分离好坏的因素有两个：一是两组分的保留值之差，即组分在色谱柱内迁移速率的差异，它取决于各组分与固定相、流动相的相互作用之差异；二是两组分的峰宽，它反映了组分区带在移动过程中的扩张程度，很大程度上取决于色谱的分离条件。图1-7表示了A、B两组分在分离过程中的不同时刻在色谱柱内的2相对位置和宽度（情况与图1-3所示相同）。当分离到t时A与B处于3柱子中间部位，两者谱带较窄但尚未完全分离；分离到t时，两组分已接近柱尾，已分离完全，但组分区带增宽不少。因而，色谱分离条件的优化就是要设法使相邻两组分区带迁移速率有较大的差异，但组分区带在移动过程中的扩张要尽量小，从而使两个组分区带在向柱下游移动时，区带分开的速度大于它们自身的扩张速度（图1-7的情况），这样当组分区带从柱后流经检测器时，可以得到完全分离的两个峰。以下分别从这两个方面展开讨论。图1-7 两组分体系的分离情况23（t和 t与图1-3相对应）1．决定组分保留值的因素——分配系数和分配比
组分的色谱保留特性决定于它们在色谱过程中的热力学性质，在分配色谱模型中，体现为分配系数和分配比。（1）分配系数K（partition coefficient）——在一定温度和压力下达到平衡状态时某组分在固定相和流动相中浓度的比值：
K值小的组分在固定相中浓度小，故易随流动相运动而较早出峰，而K值大的则相反。（2）分配比k（又称容量因子，capacity factor）——组分在固定相和流动相中分配量（质量或物质的量）之比：
分配比与组分的保留值及其他色谱参数有关：msms式中V和V分别为流动相和固定相的体积，β=V/V为两相的相比。理论推导可以得到组分分配比等于其调整保留时间与死时间之比：（3）选择性因子（selectivity factor α，又称相对保留值r）——后出峰的组分2的调整保留时间与组分1的调整保留时间的比值：只要α≠1时，两组分就有可能被分离。这说明两组分在选定色谱系统中分配系数（或分配比）的差异是色谱分离的关键。鉴于分配系数体现了组分的热力学性质，与组分、流动相、固定相的性质也有关，并受到分离温度的影响。所以，可以通过优化流动相和固定相的组成，或改变分离温度来要改善色谱系统对相邻组分的分离效果。2．谱带扩张和柱效
由图1-7所知，组分谱带在色谱柱内移动中会不可避免地逐步扩张，不利于相邻组分的分离，影响了色谱柱的分离效能，即柱效（column efficiency）。色谱理论对柱效及其影响因素进行了定量的描述。（1）塔板理论（plate theory）。为了阐述色谱的分离过程，在前人的基础上， M artin等人提出了塔板理论，形象地将色谱柱比拟为中间分为许多分馏塔板的精馏塔。精馏塔工作时，受热上行的回流蒸汽每经过一层塔板便与塔板上的液体组分进行一次气液平衡，经过一段时间的精馏，不同沸点的组分便被分离在不同的塔板上。显然，塔板数越多，气液平衡次数就越多，分离效果就越好，所得组分纯度也就越高。依此类推，他们认为在色谱柱内每一块虚拟的塔板上组分都能迅速在两相间达到分配平衡，分配比有所不同的相邻组分就有了些许的分离，然后随流动相进入下一块塔板再平衡一次，如此向柱末端推进，相邻组分便逐步得以分离。塔板数越多分离就越彻底，因而塔板数可以作为评价分离能力的指标。
以100ng某样品进入一根有6个塔板的色谱柱为例。该样品在柱内流动相和固定相间的分配系数为1.0,6块塔板上流动相中和固定相ms上的样品质量数（m和m）的变化情况见表1-2，出口处浓度变化情况见图1-8。表1-2 100ng样品在柱内的分布情况续表
长度为L的色谱柱上所具有的理论塔板数（number of theoretical plates, ）N为：式中的N相当于组分在色谱柱内经历的分配平衡总次数。色谱柱的分离效率（亦称柱效，column efficiency）随着塔板数N的增大（即塔板高度的减小）而增加。经过相应的演绎推导，塔板理论得到以下结论：
①当组分的理论塔板数N＞50，色谱峰基本对称；N＞1000，则流出曲线近乎于正态分布曲线。图1-8 流出曲线（N=6）
②不管组分间分配系数差别是多微小，只要色谱柱的塔板数足够多，便能获得良好的分离。
③理论塔板数N与色谱峰峰宽的实验参数有以下关系：R因而，在t一定时，色谱峰越窄，则N越大（H越小），说明理论塔板数N和理论塔板高度H可作为色谱柱效的量度。同时，不同组分的保留时间有所不同，即在相同色谱条件下，根据不同组分的保留参数求得的塔板数是不一样的，因而在表示柱效时必须标注评价物。这也说明色谱柱中实际上并不存在塔板这样的实体，但这并不妨碍以此来评价柱效。
塔板理论从热力学的角度描述了组分在色谱柱内的分配平衡和分离过程，解释了色谱流出曲线是峰状且不对称的，提出了计算和评价柱效的参数N。但因该理论的某些基本假设（如流动相携带组分脉冲式地依次流经各塔板、组分可在任一塔板的两相间快速平衡等）不完全符合柱内分离过程的实际情况，也没有涉及分离过程中各组分分子的扩散和在两相间的传质动力学等因素，因此它不能解释谱带扩张的原因，也无法说明色谱操作条件对理论塔板数的影响情况。（2）速率理论（rate theory）。在塔板理论基础上发展起来的速率理论依然采用理论塔板数来描述柱效，但速率理论还从动力学观点出发，探讨了塔板新意义和塔板高度的影响因素。
被分离组分开始时是以很窄的区带进入色谱柱的，在流动相的携带下向柱末端移动的过程中，各组分在两相中不断分配而逐渐分离开。而对同一组分的不同分子而言，由于在行走路径、扩散方向、溶入固定相深度等方面都具有一定的随机性，使它们不能同时到达柱出口，其在柱内的停留时间就将以保留时间为中心而具有一定的分布，即组分区带在移动过程中将不可避免地增宽。引入统计学概念，这种因分子随机运动导致谱带增宽的程度可用色谱峰标准偏差σ（或方差2σ）来量度。很明显，谱带增宽的程度除了与色谱柱的好坏等分离条件有关以外，还与组分谱带在色谱柱内的移动距离有关，移动的距离越长，σ越大，如图1-9所示。从这个角度出发，可以用单位柱长上色谱谱带的扩张程度来衡量柱效：图1-9 塔板高度的统计意义示意图
由此，荷兰科学家Van Deemter等人以气相色谱为对象探讨了引起组分区带扩张的原因，提出了速率理论表达式（即Van Deemter方程）：H= A+ B/U+ CU-1式中H为塔板高度，U为流动相在柱内的线速度（cm · min）, A、B、C为与填充色谱柱有关的实验参数。A、B/U、CU分别称为涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项，都对塔板高度有实际的影响。塔板高度实际上受到以下因素的影响：
①涡流扩散项（eddy diffusion）A，也称为多径项，来源于组分分子通过填充柱内长短不同的多种迁移路径而引起的扩张，见图1-10。在填充柱内，由于填料粒径不同、填充不均匀等原因，会形成无数粗细不同、弯曲程度不同的细小路径，流动相携带组分分子随机地沿不同路径向下游移动时形成紊乱的涡流流动，一些分子沿窄而直的路径运动，结果以较快的速度通过色谱柱，形成谱带中的超前部分（图1-10中的3），而另一些分子则因通过粗而弯曲的路径而滞后（图1-10中的1），造成色谱峰的展宽。A项与流动相的流速无关，只与载体粒P度（d）和载体填充的均匀性（λ）有关。小粒度载体容易填充均匀，就能减小A项（见表1-3）。
毛细管柱没有填料，因而不存在涡流扩散的影响。图1-10 填充柱内的涡流扩散对谱带扩张的影响表1-3 载体粒度与A值的关系
②分子扩散项（molecular diffusion）B/U，也称纵向扩散，由色谱柱内组分分子在浓度梯度的驱动下因组分谱带的中心沿着色谱柱径向发生扩散而引起的谱带增宽，与组分在色谱柱内的滞留时间成正比，越往柱末端移动，经历扩散的时间越长，谱带越宽（见图1-11）。而流动相移动速度越快则组分在柱内停留时间缩短，将缓减谱带扩张现象，即分子扩散项对塔板高度的贡献与流动相的线速成反比。图1-11 分子扩散对谱带扩张的影响g
同时，因扩散系数D近似地反比于载气分子量的平方根，因而在气相色谱分析时，宜选分子量大的载气。载体的均匀性参数γ通常都小于1，硅藻土载体在0.5～0.7之间，增加载体直径时γ将增大（极限值为1）。
③传质阻力项（mass transfer resistance）CU。色谱分离过程中，组分分子需在固定相和流动相之间进行质量传递。组分分子从流动相进入固定相再回到流动相的过程，需要经过溶解-挥发、吸附-脱附等过程，这些传质过程并不能在瞬间完成，而流动相却不停地在向柱末端运动。于是，有些组分分子未能进入固定相就随流动相前进，移动较快；而有些分子则因进入固定相深处（如孔隙中）未能及时解吸回到流动相而更为滞后。这种由于传质速率的限制而引起的谱带扩张如图1-12所示，它对塔板高度的贡献称为传质阻力项。显然，流动相的流速越快，流动相和固定相间组分的脱节程度就越明显，色谱峰扩张越严重，柱效也就越低。图1-12 传质阻力引起的谱带扩张（a）组分在两相间分配的某个时刻；（b）该时刻后的瞬间
在气相色谱过程中，物质从气相移动到固定相表面的过程叫做气相传质过程。在这一过程中，分子量小的载气及适当提高柱温可使gD加大，而选用小粒度载体更有助于提高柱效。
而物质从固定相的气液界面移动到液相内部发生质量交换，达分配平衡后又返回气液界面的传质过程称为液相传质过程。以下措施将明显影响柱效：2（1）选择液载比在1%～3%的薄涂柱将因减小膜厚d f而提高柱效；L（2）小分子量非极性固定液的液相扩散系数D大，传质阻力
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