作者：陈蔚青
出版社：浙江大学出版社
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高等院校生物类专业系列教材：基因工程实验试读：
前言
基因工程作为现代生物技术和生命科学的基础与核心技术，已经渗透到与生命科学相关的各个领域，在基础研究和生产实践中发挥着重要作用。基因工程及其实验技术成为高等院校生物工程、生物技术及相关专业的基本教学内容。基因工程作为一门理论性与实践性并重的学科，基因工程实验是其必不可少的教学组成部分。
本教材由浙江树人大学、浙江中医药大学和嘉兴学院等高校的教师联合编写。教材本着实用、可行的原则进行内容设计，涵盖了基因工程的常用实验方法和技术，并吸收了近年发展起来的新技术和新方法，内容具有普及性与连贯性。教材主要面向生物工程、生物技术专业应用型本科专业学生，因此具有重点明确、简明扼要、基础与综合能力培养兼顾的特点。教材将基因工程的基本实验方法与最新研究方法有机结合， 融入教师多年实验教学经验。通过本实验课程的学习，可使学生掌握基因工程的基本实验方法，并培养研究设计能力和综合应用能力。
本教材分为六章，第1～5章为基础性实验篇，第6章为综合性实验篇。基础性实验篇内容包括基因组DNA的提取，质粒DNA的提取，总RNA和mRNA的分离提取，核酸和蛋白质的凝胶电泳，DNA扩增和cDNA文库的构建，限制性内切酶的酶切反应，重组质粒的连接、转化及鉴定，大肠杆菌感受态细胞的制备，Southern印迹杂交，Western印迹杂交，外源基因在大肠杆菌中的诱导表达，基因表达产物的检测分析和分离纯化等实验技术和手段。第6章内容为工程菌的构建、培养与目的产物的分离纯化，是综合性应用基因工程实验技术的系列实验。通过该章实验教学，使学生能够将基因工程基本实验技术融会贯通，同时也培养了学生思考问题的系统性和全面性，锻炼学生实验设计的能力。
对于本教材中的实验，使用者可以根据各自的实验条件和课时数进行选择。在实际教学时，针对不同层次、不同学时数的要求，既可以集中时间连续进行，也可以分成多次实验阶段性完成。本教材的部分实验提供了多种可供选择的实验方法，以便各高校根据自身情况安排。本教材强调了实验中的注意事项，还对与实验相关的内容进行评述。为了便于读者进行基因工程实验操作及查阅相关资料，本教材将常规培养基与试剂的配制、常用抗生素、常用缩略语、常用实验仪器设备等资料在附录中列出。
本教材由浙江树人大学陈蔚青主编，参与本教材编写工作的有浙江中医药大学柴惠、金波、张林老师，嘉兴学院刘晓侠老师和浙江树人大学陈虹老师，最后由陈蔚青统稿。
本教材得到浙江省“十一五”重点教材建设项目资金资助；本教材的出版得到浙江大学出版社和浙江树人大学的大力支持；陈旭博士在教材的文字校对、图片拍摄等工作中作出了积极贡献。在此一并表示衷心的感谢。
由于我们水平有限，遗漏、缺点和错误在所难免，恳望批评指正。编者2014年3月基础性实验篇第1章核酸的分离与纯化技术
核酸的分离与纯化技术是基因工程的一项基本技术。核酸的分离主要是指将核酸与细胞中的蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循的基本原则是：保证核酸分子一级结构的完整性，去除其他分子的污染。实验1.1 基因组DNA的提取【实验目的】
掌握基因组DNA的提取方法，制备高质量的植物、动物或微生物基因组DNA，用于PCR扩增和构建基因组文库、Southern印迹杂交等基因工程实验操作。【实验原理】
生物体的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或拟核区，主要与蛋白质共存。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
一般而言，提取基因组DNA可分两步：首先是裂解细胞，释放出基因组DNA；然后是去除蛋白质、RNA以及其他的生物大分子杂质。
基因组DNA在体内通常都与蛋白质相结合，蛋白质对基因组DNA的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此需要把蛋白质除去。一般采用苯酚/氯仿抽提和加蛋白酶的方法去除。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。用苯酚/氯仿抽提这一方法对于去除核酸（无论是DNA或RNA）中大量的蛋白质杂质是行之有效的。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质可用蛋白酶予以去除。基因组DNA中也会有RNA杂质，因RNA极易降解，少量的RNA对DNA的操作无大影响，一般无需处理，必要时可加入不含DNA酶的RNA酶以去除RNA的污染。
随着现代分子生物学的发展，DNA分离技术也层出不穷，DNA已经可以从化石、木乃伊等极端材料中分离出来，也可以从痕量材料中获得。无论是什么材料，针对不同的材料来源和特点，调整、设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。提取缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化；缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。目前许多公司有针对不同材料的试剂盒出售，使用方便，其中一些的使用效果好，如Roche Applied Science公司的Plant DNA Isolation Kit试剂盒。本节分别介绍实验室常用的植物、动物和细菌的总基因组DNA的提取方法。其中，用植物DNA的CTAB（cetyl triethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）改进提取法提取的DNA的质量与一些较好的试剂盒相当，不经RNA酶消化及后续步骤即可用于PCR反应和Southern印迹杂交。1.1.1 植物基因组DNA的提取
植物组织材料的采集与保存对提取的DNA的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料。采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常可使组织材料在3～5d内仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO的瓶子分别保存，使其迅速干燥，利用这种方4法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA的提取工作。那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织；此外，最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA提取。
从植物组织样品中分离DNA的方法，根据提取缓冲液（extraction buffer）中主要化学物质的不同，通常分为CTAB法和SDS（sodium dodecyl-sulfate，十二烷基磺酸钠）法；根据DNA使用要求和研究目标的不同，分为DNA大量制备法和DNA微量制备法。DNA大量制备法适用于Southern印迹杂交和基因组文库构建等对DNA质量和数量有较高要求的实验，但当需要对大群体或大样本进行快速的PCR检测或筛选时，DNA微量制备法则成为首选。植物DNA的提取程序应包括以下几项：（1）破碎（或消化）细胞壁，释放出细胞内容物。
许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此采用任何方法均需在DNA的完整性和产量这两方面之间综合考虑。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离细胞核DNA或细胞器DNA时则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统。这种情况下通常采用在含有渗透剂的缓冲液中（4℃）匀浆的方法来破壁。（2）破坏细胞膜，使DNA释放到提取缓冲液中。
这一步骤通常利用SDS或CTAB之类的去污剂来完成。SDS是一种阳离子型表面活性剂，它的主要功能有：溶解细胞壁上的脂质与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；与蛋白+质结合形成R—O—SO-…R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀3下来。但是，SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止下一步的操作（如用RNA酶去除RNA）受干扰。CTAB是一种在高盐浓度下能与核酸结合形成可溶的稳定的络合物、低盐浓度下可形成沉淀的表面活性剂。在高盐浓度条件下，核酸以稳定形式与去污剂CTAB络合于溶液中；将盐（NaCl）浓度降至0.4mol/L以下可引起CTAB-核酸络合物沉淀，从而将大部分多糖物质留在溶液中。因此，CTAB缓冲液应当更适合于含有多糖或多酚类物质的植物材料的提取。去污剂还可以保护DNA免受胞内核酸酶的降解。通常提取液中还包含螯合剂（chelating agents），如乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）。EDTA可用于抑制金属离子依赖性的酶的活性，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。提取缓冲液的pH值，应以避开降解酶的最适pH值为原则。植物及微生物体内各种酶作用的最适pH值在4.5～6.5。但也有例外的，如脂类物质降解酶及氧化酶的最适pH值为5.0～6.0；而DNase的最适pH值为7.0。因此大多提取缓冲液的pH值选为8.0，有的甚至高达9.0，但也有例外的。中药材大多为干品，而中药材加工和贮藏的整个过程，如日晒、高温烘干等都不利于DNA完整性的保持，一般选用高盐浓度、低pH值的提取缓冲液［100mmol/L乙酸钠，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2.5% PVP（聚乙烯吡咯烷酮），3% SDS，1% β-巯基乙醇，pH5.5］可以获得较好的提取效果。（3）DNA粗提液进一步纯化，操作过程中DNA剪切破坏的程度必须降到最低。
这是因为剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到长度为50～100kb的DNA。不过，分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分，因为在DNA粗提取物中往往含有大量的RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。因此，DNA粗提液还需进一步纯化。大多数蛋白质可通过氯仿或苯酚处理后变性，沉淀除去；绝大部分RNA则可用RNase A经过热处理除去；但多数糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常使DNA提取物呈胶状。更为重要的是，即使在低浓度的情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶（如限制性内切酶）的活性，从而阻碍Southern印迹杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。在氯仿/异戊醇（24:1）抽提后的水相中加入1/2体积的5mol/L的NaCl，然后再加入2倍体积的乙醇使DNA沉淀，此时大部分多糖仍在上清液中。这种简单、迅速的方法可有效地去除植物DNA中的多糖。实验证明，在DNA的水溶液中，NaCl终浓度为0.5～3.0mol/L时都能除去多糖杂质。也可以在常规提取步骤后再将提取物通过离子交换进行纯化，一些离子交换柱已商品化，对去除多糖有很好的效果。
植物细胞具有加厚的次生壁和硕大的液泡，因此植物细胞中贮存了大量种类繁多的次生物质，例如多酚、乳汁、树脂等。酚氧化酶存在于细胞质基质中，当细胞受到轻微破坏或组织衰老时，细胞结构（如液泡）解体，释放其中的酚类物质，酚氧化酶则和底物起反应，将酚类氧化成棕褐色的醌类物质。这些次生物质在提取DNA的过程中可与DNA共沉淀，形成黏稠的胶状物，难以溶解或产生褐变，如此质量的DNA既不能用于酶切位点分析，又不能用于PCR扩增。因为上述次生物质的存在严重抑制限制性内切酶和TaqDNA聚合酶的活性，所以去除多酚等次生物质成为提取与纯化植物DNA的关键步骤。为了去除多酚类次生物质，在提取介质中必须加入抗氧化剂（antioxidants），最常用的有β-巯基乙醇、抗坏血酸钠、半胱氨酸和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等。它们共同的作用是提供—SH（巯基），使其与多酚类物质竞争氧，因而有效地防止了酚类氧化成醌类，避免了褐变。所用抗氧化剂的种类与用量依植物的类群而定，最常用的是β-巯基乙醇，其最终含量范围是0.1%～2%（体积分数）。PVP是一种聚合物，其加入也可减少酚类、醌类及单宁类物质的影响。常用的是PVP 40，可以去除色素，它与多酚类物质结合形成一种不溶的络合物，因此也能有效去除酚类，常与抗氧化剂一起使用，终浓度为20～60g/L。而对于棉花、荔枝等含有大量酚类、醌类及其他次生代谢物的植物，提取缓冲液中常会添加一些诸如葡萄糖和DIECA（diethyl dithiocarbamic acid）钠盐的物质或在提取过程中增加苯酚/氯仿抽提的次数。还有其他一些非通用添加物，如抗坏血酸（维生素C）可用于降低醌类物质的影响，精胺及其他多胺可用于降低核酶的影响，氰化物可用于降低重金属氧化酶的影响。【实验材料】
水稻或其他禾本科植物幼苗，李子或苹果幼嫩叶子等。【实验器材】
研钵，高速冷冻离心机，水浴锅，100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，核酸电泳仪，烧杯，三角瓶，容量瓶，1.5ml无菌离心管等。【实验试剂】
1.2%（V/V）2-巯基乙醇。
2.CTAB抽提液：2%（m/V）CTAB，100mmol/L Tris•Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mol/L NaCl。室温保存，使用前加入2%（V/V）2-巯基乙醇。
3.CTAB沉淀液：1%（m/V）CTAB，50mmol/L Tris•Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），室温保存。
4.高盐TE缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1mol/L NaCl，室温保存。
5.异丙醇。
6.70%（V/V）乙醇。
7.CTAB/NaCl溶液：在80ml HO中溶解4.1g NaCl，缓慢加入10g 2CTAB并搅拌，如果需要，可加热至65℃溶解，定容终体积至100ml。
8.氯仿/异戊醇（24:1）。【实验步骤】
1.将10g新鲜的植物组织洗净、吸干，放入研钵，添加液氮，研成细粉。
2.取0.2g细粉置1.5ml离心管中，加入0.8ml预热的CTAB抽提缓冲液和2%（V/V）巯基乙醇，混合，于65℃温育10～60min，其间不断搅拌混匀。
3.加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒使充分混合，于4℃，7500r/min离心5min，回收上层相。
4.在回收的上层相中加入1/10体积的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒使充分混合，于4℃，7500r/min离心5min。
5.回收上层相，重复步骤4。
6.将上清液转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入1倍体积的1×CTAB沉淀液，颠倒混匀。于65℃温育30min，观察沉淀生成，若无明显的沉淀生成，延长放置时间，使沉淀量增加。
7.于4℃，5000r/min离心5min，用0.2ml高盐TE缓冲液重悬沉淀，若沉淀难以重悬，于65℃温育30min，重复直至所有或大部分的沉淀溶解。
8.加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，于4℃，7500r/min离心15min，用70%冰乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用TE缓冲液溶解，于4℃保存备用。
9.沉淀进一步经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1-1所示。图1-1 植物基因组DNA电泳图谱M-DNA相对分子质量标准；1，2，3-核桃叶片提取物1.1.2 动物基因组DNA的提取
从动物组织或细胞中分离总基因组DNA一般是在EDTA及SDS这类去污剂存在的条件下，用蛋白酶K消化细胞，再用苯酚抽提实现的。若对DNA质量要求较高，通常除了通过增加氯仿/异戊醇（24:1）抽提次数、彻底去除蛋白质使DNA纯化外，还可采用CsCl密度梯度离心法进行纯化。较纯的DNA溶液可通过测定其紫外吸收光谱来进行定量。若DNA不够纯，由于RNA或非核酸类杂质的干扰，通过紫外吸收光谱测算的数据可能会有误差。这种情况下，可通过琼脂糖凝胶电泳的方法来定量测定。在低浓度琼脂糖凝胶（6.5g/L）中加入约50～100ng样品DNA，并依次加入25～200ng未经酶解的λDNA作标准。高相对分子质量DNA（长度大于50kb）应为一条靠近λDNA的清晰条带。该条带以下的片状模糊是机械或化学降解产物，更为靠近胶底部的模糊条带则是样品DNA中混杂的RNA。比较样品DNA条带与λDNA标准条带的亮度即可对样品DNA进行定量。通过肉眼比较条带的强度可对DNA含量进行粗略估计（±10ng），但若用图像处理设备和凝胶分析软件，例如UVP（Cambridge）软件包SW2000可进行更高精度的分析。这种设备对条带的强度均赋予数值，利用λDNA标准条带绘制出DNA量与条带亮度的标准曲线，这样就可以更精确地估算出未知样品中的DNA含量。【实验材料】
哺乳动物新鲜组织。【实验器材】
组织匀浆器，100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，高速冷冻离心机，振荡水浴锅，核酸电泳仪，烧杯，三角瓶，容量瓶，1.5ml无菌离心管等。【实验试剂】
1.消化缓冲液：100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），25mmol/L EDTA（pH8.0）。
2.0.5%（m/V）SDS：室温保存。
3.100mg/ml蛋白酶K：临用前加入。
4.磷酸缓冲液（PBS）10×PBS：80g NaCl（1.37mol/L），2g KCl（27mmol/L），11.5g NaHPO•7HO（43mmol/L），2g 242KHPO（14mmol/L），加水至1L，室温可长期保存。24
5.3mol/L NaAc（pH5.2）：80ml水溶解40.81g的NaAc•3HO，用2冰醋酸调pH至5.2，加ddHO定容至100ml。2
6.7.5mol/L乙酸铵。
7.100%（V/V）乙醇及70%乙醇。
8.TE缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA。
9.苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）：按苯酚:氯仿/异戊醇=1:1的比例混合饱和苯酚与氯仿，即得苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。
10.氯仿/异戊醇（24:1）。【实验步骤】
1.切下组织，剔除结缔组织，立即剪成小块，置于液氮中冻结。取0.2g组织用2ml消化缓冲液悬浮，用组织匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。
2.将组织细胞的匀浆液转移至1.5ml离心管中，4℃，5000r/min离心5min，弃上清。
3.取细胞沉淀添加1～10ml冰PBS悬浮洗涤，4℃，5000r/min离心5min，如此洗涤2次。
4.用细胞沉淀的10～40倍体积的消化缓冲液（约0.4ml）悬浮细胞，50～55℃振荡温育12～18h。
5.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提（轻柔混匀），室温下，7500r/min离心10min。
6.用剪掉吸头前端的扩口的吸头，小心吸出上清液，移至新的离心管中，然后加入等体积氯仿/异戊醇，以7000r/min离心10min，如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复步骤5、6。
7.将上层（水溶液）转移至一个新管中，加入1/2体积7.5mol/L乙酸铵和2体积100%乙醇，10000r/min离心2min。
8.沉淀用70%的乙醇清洗、空气干燥，再用TE缓冲液溶解，于4℃保存备用。
9.沉淀进一步经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1-2所示。图1-2 动物基因组DNA电泳图谱M-DNA相对分子质量标准；1，2，3-绵羊耳组织DNA1.1.3 细菌基因组DNA的提取【实验材料】
细菌培养物。【实验器材】
恒温培养箱，100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，高速冷冻离心机，漩涡混合器，恒温水浴锅，核酸电泳仪，烧杯，三角瓶，容量瓶等。【实验试剂】
1.LB（Luria Broth）培养基：1%蛋白胨（typtone），0.5%酵母提取物（yeast extract），1% NaCl，pH7.0，121℃灭菌20min备用。若用固体培养基，则在LB培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌备用。
2.溶液Ⅰ（GTE溶液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris•Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。
3.100mg/ml溶菌酶。
4.10mg/ml蛋白酶K：用灭菌的去离子水配制，在-20℃条件下保存。
5.氯仿/异戊醇：按氯仿:异戊醇=24:1的比例加入异戊醇。
6.饱和苯酚：分析纯的苯酚溶化后经160℃重蒸，加入0.1%的抗氧化剂8-羟基喹啉，再加等体积的0.1mol/L Tris•Cl（pH8.0）、1mmol/L EDTA。
7.苯酚/氯仿/异戊醇：按苯酚:氯仿/异戊醇=1:1的比例混合饱和苯酚与氯仿，即得苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。
8.TE缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA。
9.2mg/ml RNase A：10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），15mmol/L NaCl，在100℃保温15min，然后室温条件下缓慢冷却。
10.无水乙醇，预冷的70%乙醇，80%甘油。【实验步骤】
1.挑取单菌落接种至5ml的液体LB培养基中，适当温度条件下，振荡培养过夜。
2.取菌液0.5～1ml，7500r/min离心1min，弃上清液。
3.加入100μl溶液Ⅰ，在漩涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散。
4.再加入650μl溶液Ⅰ，振荡混匀（注意不要残留细小菌块）。
5.向悬液中加入7.5μl的100mg/ml溶菌酶至终浓度为1mg/ml，混匀，37℃温浴30min。
6.再向悬液中加入7.5μl蛋白酶K（10mg/ml）至终浓度为0.1mg/ml，混匀，55℃继续温浴1h，中间轻缓颠倒离心管数次。
7.温浴结束后，向溶液中加入等体积（约750μl）的苯酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒充分混匀，7500r/min离心5min。将上清液移至新的离心管中，用苯酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。
8.取上清液用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。
9.取上清液至新的离心管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）、2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃静置5min沉淀DNA，4℃，7500r/min离心5min。
10.小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，于4℃，7500r/min离心5min。再用70%乙醇洗涤一次，自然干燥，用TE缓冲液重悬，于4℃保存备用。
11.沉淀经电泳鉴定，结果如图1-3所示。图1-3 细菌基因组DNA电泳图谱M-DNA相对分子质量标准；1-单增李斯特菌基因组DNA【注意事项】
1.配好的苯酚/氯仿/异戊醇溶液上面覆盖一层异戊醇溶液，以隔绝空气，在使用苯酚/氯仿/异戊醇时应注意取下面的有机层。
2.加入苯酚/氯仿/异戊醇后应采用上下颠倒的方法，充分混匀。如发现苯酚已氧化变成红色，应弃之不用。
3.制备DNA时应避免污染，所有制备质粒或噬菌体的材料都必须与基因组DNA材料分开。
4.在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时，从细胞裂解后，应尽量在温和的条件下操作。【思考题】
1.提取基因组DNA的基本原理是什么？在操作中应注意什么？
2.在使用苯酚操作时，应注意什么？实验1.2 质粒DNA的提取与纯化【实验目的】
学习质粒DNA提取的基本原理，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程实验提供载体原料。【实验原理】
质粒（plasmid）是一种独立于染色体的自主复制的遗传成分。在细胞内，它们常以共价闭环的超螺旋状态存在。如果两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子被称为开环DNA。如果两条链均断开，即为线性DNA。质粒主要存在于细菌、放线菌中，大小为1～200kb。质粒的存在使宿主细胞具有一些新的特性，如对抗生素的抗性等。常见的天然质粒有F质粒（又称F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（产大肠杆菌素因子）等。
由于天然质粒用作基因克隆载体存在一些缺点，如相对分子质量大，单一限制性内切酶识别位点不唯一，无合适的抗性标记等。研究者在天然质粒基础上进行了改造，开发出了一批低相对分子质量、高拷贝数、多选择性标记的商业化质粒载体，便于基因工程实验操作。
利用质粒作为基因克隆的载体，一个重要的条件是要获得一定量的纯化质粒DNA分子。带有质粒的宿主菌，如大肠杆菌，其细胞中除了质粒外，还有基因组DNA、各种RNA及蛋白质、脂质等存在。从这些混合物中提取质粒DNA包括三个基本步骤：①培养细胞使质粒大量扩增；②收集和分裂细菌并除去蛋白质和基因组DNA；③分离和纯化质粒DNA。
利用环状质粒DNA分子具有相对分子质量小、易于复性的特点，可提取细菌质粒DNA。在热或碱性条件下DNA分子的双链打开，若此时将溶液置于复性条件，变性质粒DNA分子能在较短时间内复性，而基因组DNA不能。如碱变性质粒提取，就是利用离子型表面活性剂SDS溶解细胞膜上的脂蛋白，在pH高达12.6的碱性条件下基因组DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。而相对分子质量较小的质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链分离不完全，当pH值为4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。而基因组DNA不能恢复，形成缠绕的网状结构与菌体的蛋白质凝聚成块。经过离心，除去变性的基因组DNA和蛋白质沉淀物，而质粒DNA分子存在于上清液中。用苯酚等进行处理，除去上清液中的蛋白质，后利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。在用乙醇沉淀时，与DNA有相似性质的RNA也一起被沉淀下来。利用RNA酶除去残余的RNA。最后，可采用苯酚使RNA酶失活。【实验材料】
含质粒的大肠杆菌菌株，如pUC19/DH5α、pET28/BL21。【实验器材】
恒温培养箱，100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，高速冷冻离心机，漩涡混合器，恒温水浴锅，核酸电泳仪，烧杯，三角瓶，容量瓶，1.5ml、50ml离心管等。【实验试剂】
1.LB（Luria Broth）培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，调pH值至7.0。
2.氨苄青霉素（ampicillin，Amp）：母液100mg/ml，工作浓度100μg/ml。
3.卡那霉素（kanamycin，Kan）：母液 50mg/ml，工作浓度 50μg/ml。
4.溶液Ⅰ（GTE溶液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris•Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。
5.溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1% SDS。
6.溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾 60ml，冰醋酸 11.5ml，定容至100ml。
7.RTE：含RNase A（20μg/ml）的TE缓冲液。
8.冰冷的95%乙醇，70%乙醇。
9. 25mg/ml溶菌酶。1.2.1 微量质粒的提取和纯化【实验步骤】
1.接种单菌落于5ml含相应抗生素的LB培养液中，37℃培养过夜（约10～14h）。
2.取约1.5ml培养液于离心管中，在4℃下低速离心收集菌体（3000r/min，10min），弃上清。
3.菌体悬浮于150μl 溶液Ⅰ中，充分涡旋。
4.加入150μl溶液Ⅱ，来回轻轻颠倒3次，冰浴5min。
5.加入200μl溶液Ⅲ，来回轻轻颠倒3次，充分扩散，冰浴5min。
6.4℃下13000r/min离心10min，小心吸取上清，置于新的1.5ml离心管中。
7.加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀，4℃下13000r/min离心10min。
8.吸取上层水相，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，4℃下放置10min。
9.4℃下13000r/min离心15min，弃上清（于回收缸中）。
10.沉淀用200μl 70%乙醇洗一次，短暂离心后，小心吸除残留溶液。
11.倒置于滤纸上吸尽液体，沉淀于室温下（或真空干燥器上）自然干燥。
12.沉淀悬浮于20μl RTE（含RNA酶的TE）中。
13.37℃保温30min，充分降解RNA。
14.提纯质粒保存于-20℃。
15.琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1-4所示。图1-4 质粒DNA电泳图谱M-DNA相对分子质量标准；1-质粒DNA1.2.2 大量质粒的提取和纯化【实验步骤】
1.单菌落接种于含有适当的抗生素（50～100μg/ml）的5ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2.1%的接种量（2.5ml）接种于含250ml的LB培养基的1L摇瓶中，添加终浓度为50～100μg/ml（250μl）的相应的抗生素，37℃振荡培养10～14h（OD≈0.4）。600
3.于4℃，6000r/min离心10min，弃上清。
4.沉淀用2ml溶液Ⅰ，旋涡混合器上使菌体重悬，加入0.5ml新配的含25mg/ml溶菌酶的溶液Ⅰ（终浓度5mg/ml），彻底重悬，于室温放置10min。
5.加入新配制的5ml的溶液Ⅱ，加盖轻轻倒置数次混匀，于冰上放置10min。
6.加入4ml的溶液Ⅲ，加盖轻轻倒置数次混匀，于冰上放置10min。
7.于4℃，最大转速离心15min，将上清液移至另一干净的50ml离心管中。
8.加入0.6倍体积的异戊醇，颠倒混匀，室温下放置5～15min。
9.4℃，13000r/min离心10min，弃上清，加1ml 70%的冰乙醇轻轻洗涤沉淀。
10.4℃，13000r/min快速离心1min，吸去乙醇，自然风干或真空干燥。
11.用1～1.5ml TE（pH8.0）溶解沉淀，于4℃短期保存，于-20℃或-70℃长期保存备用。【注意事项】
1.在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ混合后，操作一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。
2.采用有机溶剂（苯酚/氯仿/异戊醇）抽提时，应充分混匀。经苯酚/氯仿抽提后，吸取上清液时注意不要把中间层的白色蛋白质等杂质吸入。
3.苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚，应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。【思考题】
1.简述抽提质粒的基本原理。
2.在提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？
3.溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在质粒抽提中各有什么作用？实验1.3 总RNA和mRNA的制备1.3.1 总RNA的制备【实验目的】
掌握利用异硫氰胍变性液从各种不同生物中提取RNA的基本原理和方法。提取的RNA可用于RT-PCR以及Northern印迹分析。【实验原理】
分离纯化完整的RNA是进行基因克隆表达分析的基础。从生物细胞中分离RNA要比分离DNA难得多。成功提取生物细胞中的RNA，尽可能完全抑制或除去RNA酶（ribonuclease，RNase）的活性是分离获得全长RNA最关键的环节。RNA酶很稳定、耐热，且在较宽的pH范围内都有活性，一般无需任何辅助因子。加上RNA酶广泛存在，所有的组织中均存在RNA酶，操作者的手、唾液等含有较丰富的RNA酶。因此，在所有与RNA有关的操作中，操作者必须戴手套操作并经常更换（一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中300℃干烤4h（高压不能完全灭活RNA酶）。塑料容器等不耐高温的材料均需用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑反应而抑制酶的活性。所有RNA提取中所用的溶液和水一般都先用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再经高温灭菌，并尽可能使用未曾开封的试剂。除此之外，也可用矾氧核苷酸复合物、异硫氰酸胍、RNA酶抑制蛋白等。
细胞在变性剂异硫氰酸胍作用下被裂解，同时核糖体上的蛋白质变性，核酸释放。释放出来的DNA和RNA由于在特定的pH条件下的溶解性不同，而分别位于整个体系的中间相和水相，从而得以分离，经有机溶剂抽提、沉淀，得到纯化的RNA。【实验材料】
动植物组织。【实验器材】
恒温培养箱，100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，高速冷冻离心机，漩涡混合器，恒温水浴锅，核酸电泳仪，烧杯，三角瓶，容量瓶等。【实验试剂】
1.经DEPC处理的水：在100ml去离子水中加入0.1ml DEPC，剧烈振荡使DEPC溶于水中，高压灭菌以消除残留的DEPC。将这样处理的水与其他溶液分开放置，并确保“脏”的吸头不伸入其中。注：使用DEPC时应戴手套并在通风橱中操作，因为DEPC是一种致癌剂。
2.异硫氰酸胍变性液的贮存液（变性溶液）。（1）储备液：将17.6ml的0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）、26.4ml的10%（m/V）N-十二烷基肌氨酸钠溶于293ml水中，再加入250g异硫氰酸胍，加热至60～65℃并持续搅拌使之充分溶解。室温可保存3个月。（2）工作液：4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠（pH7.0），0.5% N-十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇（即在50ml贮存液中加入0.35ml的β-巯基乙醇）。工作液于室温可保存1个月。
3.水饱和酚：在60～65℃的水中溶解重蒸酚。抽吸掉上层水相，4℃可保存1个月。
4.2mol/L 乙酸钠：将16.24g乙酸钠加入40ml水和35ml冰醋酸中。用冰醋酸调节pH值至4。加水至100ml（钠离子的终浓度为2mol/L）。室温可保存1年。
5.100%异丙醇。
6.75%（V/V）乙醇（用DEPC处理水制备）。
7.4mol/L LiCl：24.164g LiCl，加DEPC处理水定容至100ml，高压灭菌，室温放置备用。
8.氯仿/异戊醇（49:1）。
9.原生质体缓冲液：15mmol/L Tris•Cl（pH8.0），8mmol/L EDTA，0.45mol/L蔗糖，4℃保存。
10.革兰氏阴性菌裂解缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），10mmol/L NaCl，1mmol/L柠檬酸钠，1.5%（m/V）SDS，室温保存。
11.50mg/ml溶菌酶。
12.焦磷酸二乙酯。
13.饱和NaCl溶液：于100ml DEPC处理水中加入40g NaCl。【实验步骤】
一、从组织或细胞中分离RNA
1a. 对于组织：每100mg加入100ml变性液，在匀浆器中匀浆数次。
1b. 对于培养细胞：10ml悬浮细胞于离心管中4℃离心，弃上7清；每10个细胞中加入1ml变性液，用吸头吸打裂解液7～10次。注：在实验之前，检测试管是否能耐受10000r/min离心变性液和酚/氯仿的混合物。
2.转移匀浆液至5ml离心管中，加入0.1ml 2mol/L乙酸钠（pH4.0）、1ml水饱和酚和0.2ml氯仿/异戊醇（49:1），每加入一种试剂都需轻轻彻底混匀，试剂加完后将离心管盖拧紧，倒转几次混匀，冰浴15min。
3.于4℃，41000r/min离心25min，将上层水相转移到另一干净的离心管中。
4.加入1倍体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱中放置30min。
注：对于糖原含量高的组织，如肝，在4mol/L LiCl中剧烈振荡，从RNA团块中洗出糖原，然后5000r/min离心10min沉淀不溶的RNA，用变性液溶解沉淀。
5.在0.3ml变性液中溶解沉淀，转移至1.5ml微量离心管，重复步骤4。
6.重悬沉淀于75%乙醇中，涡旋振荡，室温放置10～15min以溶解沉淀中残留的胍盐。
7.于4℃，10000r/min离心5min，弃上清，真空干燥沉淀。
8.用100～200μl DEPC处理水溶解沉淀。55～60℃温育10～15min。保存于-70℃备用。
二、从革兰氏阴性菌中快速分离RNA
1.从平板上接种单菌落到15ml液体培养基中，过夜培养至细菌的对数生长期。
2.于4℃，12000r/min离心10min，从10ml革兰氏阴性菌培养液中回收菌体，悬浮于10ml原生质体缓冲液，加入80μl的50mg/ml溶菌酶，冰浴15min。
3.于4℃，5000r/min离心5min，沉淀用0.5ml革兰氏阴性裂解缓冲液重悬，加入15μl DEPC处理水，轻轻混匀。移至微量离心管中，37℃温育5min。
4.在冰浴中冷却，加入250μl饱和NaCl，混匀，冰浴10min。
5.于4℃或室温用微量离心机高速离心10min，将上清液移至两个干净的1.5ml离心管中，各加入1ml预冷无水乙醇，-20℃过夜。
6.于4℃，微量离心机高速离心15min。
7.沉淀用500μl预冷70%乙醇洗沉淀，晾干。用100μl DEPC处理水溶解，保存于-70℃冰箱中待用。【注意事项】
1.进行RNA的操作时，所用的一切实验器材和溶液都要进行无RNA酶处理，应该专门配备进行RNA的操作的超净工作台以及其他设备。
2.DEPC是一种致癌剂，使用DEPC时操作人员应戴上手套和口罩，并在通风橱中操作。【思考题】
1.实验过程中应该采取怎样的措施才能尽可能避免RNA酶的污染？
2.如何检测提取RNA的质量？1.3.2 mRNA的制备【实验目的】
掌握利用寡聚脱氧胸苷［oligo（dT）］纤维素从总RNA中分离mRNA的方法。【实验原理】
细胞内主要有三种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。mRNA只占RNA总量的1%～5%，其相对分子质量大小不一，由几百至几千个核苷酸组成，并且大部分mRNA均与蛋白质结合在一起形成核蛋白体。且真核生物与原核生物不同，真核生物在基因内含有内含子，需要通过RNA的拼接加工，才能变成成熟的mRNA。
提取mRNA一般有两种方法：其一是先提取多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开。即利用抗原抗体的反应，可以将含量极微、特异的mRNA提取出来。因为没有合成完的蛋白质还停留在多聚核糖体上，这些新生肽链能与完整蛋白质的抗体发生抗体-抗原反应。因此，可以选择性沉淀特异的mRNA。其二是提取细胞总RNA，经过蛋白酶K的处理。如果要进一步获得mRNA，可以利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸oligo（dT）纤维素柱层析，把mRNA与其他的RNA，如tRNA、rRNA分开。因为几乎所有的mRNA的3’端都具有一串可长至200个腺苷酸的poly（A）序列，而tRNA和rRNA上都没有这样的结构，利用这一点为mRNA的分离纯化提供了便捷的条件。【实验材料】
RNA溶液，oligo（dT）纤维素干粉等。【实验器材】
100～1000μl、20～200μl、0.5～10μl移液枪，层析柱，核酸电泳仪，烧杯，容量瓶等。【实验试剂】
1.5mol/L NaOH。
2.寡聚脱氧胸苷［oligo（dT）］纤维素。
3.0.1mol/L NaOH。
4.poly（A）样品缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH7.5），1mmol/L EDTA，0.5mol/L LiCl，0.1%（m/V）SDS。
5.10mol/L LiCl。
6.中度洗脱缓冲液：10mmol/L Tris•Cl（pH7.5），1mmol/L EDTA，0.15mol/L LiCl，0.1%（m/V）SDS。
7.2mmol/L EDTA。
8.3mol/L乙酸钠。
9.100%乙醇。
10.0.1% SDS。
11.无RNA酶的TE缓冲液。
12.柱子：用硅烷化玻璃纤维填充的硅烷化的玻璃巴斯德吸管或一次性小柱（2ml容积）。
注：水、10mol/L LiCl和3mol/L乙酸钠应当用DEPC处理以抑制RNA酶活性，纯化柱和离心管应当硅烷化过。【实验步骤】
1.先用10ml 5mol/L NaOH清洗硅烷化的层析柱，然后用水冲洗。
2.取0.5g oligo（dT）纤维素干粉加于1ml 0.1mol/L NaOH中，倒入柱内，用约10ml水冲洗。
3.用10～20ml poly（A）加样缓冲液平衡柱子，至流出液pH值约为7.5。
4.于70℃加热2mg总RNA的水溶液10min，再用10mol/L LiCl调节溶液中LiCl至终浓度0.5mol/L。
5.加RNA溶液至oligo（dT）柱，并以1ml poly（A）加样缓冲液洗涤，将流出液重新上柱2次以保证所有poly（A）+RNA已经结合到oligo（dT）上。
6.用2ml中度洗脱缓冲液洗柱子。
7.用2ml 2mmol/L EDTA/0.1% SDS洗脱RNA至一根新的试管。
8.按步骤3重新平衡柱子，用洗脱出的RNA重复步骤4～7。
9.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2.5倍体积乙醇至收集的RNA溶液，移至2根硅烷化的离心管中，-20℃放置过夜或干冰/乙醇中放30min。
10.于4℃高速离心30min。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150μl无RNA酶的TE缓冲液，合并样品。
11.取5μl在70℃加热5min后，1%琼脂凝胶电泳中检查RNA质量。【注意事项】
1.在提取过程中要严格防止RNA酶的攻击，加上RNA酶广泛存在且极为稳定，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。
2.对所选择的RNA量不要使用太大的柱，否则最终的mRNA会被过度稀释，使得样品沉淀和操作的效率较低，通常5～10mg RNA用1ml oligo（dT）纤维素已经足够。【思考题】
1.影响mRNA提取和纯化的主要因素有哪些？
2.mRNA分离纯化的原理是什么？【参考文献】
［1］朱旭芬.基因工程实验指导［M］.第二版.北京：高等教育出版社，2010.
［2］静国忠.基因工程及其分子生物学基础［M］.北京：北京大学出版社，2001.
［3］陈宏.基因工程实验技术［M］.北京：中国农业出版社，2005.
［4］周俊宜.分子生物学基本技能和策略［M］.北京：科学出版社，2003.第2章电泳技术
电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。电泳的种类多，应用非常广泛，已成为基因工程技术中分离与分析生物大分子的重要手段。核酸、蛋白质等生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动，此时移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。
琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）由于具有操作简单、快速、灵敏等优点，是分离和鉴定核酸的常用方法；聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）则是蛋白纯度和浓度分析分析等实验中的最常用方法。实验2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳【实验目的】
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作技术。【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法，可以在很窄的范围内获得高纯度的某种DNA片段，或是大小相近的DNA片段。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在pH高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同、但构型不同的DNA分子。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于六个因素：①样品DNA分子的大小；②DNA分子的构象；③琼脂糖浓度；④电场强度；⑤缓冲液离子强度；⑥温度。
电泳样品的物理性质是影响电泳迁移率的首要因素，包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说，颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力愈大，泳动速率愈小。即泳动率与颗粒的分子大小、介质黏度成反比；与颗粒所带电荷成正比。
电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大，带电颗粒的泳动率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时，线性DNA分子的泳动率与电压成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。
缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影-响电泳的效率。Tris•Cl缓冲体系中，由于Cl的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常用TAE、TBE、TPE三种缓冲体系。缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度，缓冲液pH值与核酸样品的等电点相距越远，样品所携带电荷量越多，泳动速度越快。核酸电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件，使核酸分子带负电荷，向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度呈反比，电泳的最适离子强度一般在0.02～0.2。
核酸经过染色才能显示带型。多年来，观察琼脂糖凝胶电泳中DNA的最简便方法是利用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）进行染色。EB是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常，在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法用于一般性的核酸检测。单链DNA、RNA分子常存在自身配对的双链区，也可以嵌入EB分子，但嵌入量少，因而荧光较低，其最低检测量为0.1μg。
由于EB见光易分解，故应存棕色瓶中，于4℃条件下保存。EB为较强的诱变剂，操作时要戴一次性手套，避免含EB物品与皮肤直接接触。
近年来，国内外各公司陆续推出了可替代EB的新型荧光染料，其中SYBR Green Ⅰ核酸染料就是其中较为优秀的一种。图2-1 SYBR Green Ⅰ荧光染料与DNA双链结合
SYBR Green Ⅰ是高灵敏的DNA 荧光染料（图2-1），适用于各种电泳分析，操作简单，无需脱色或冲洗；至少可检出 20pg DNA，灵敏度高于EB染色法25～100倍。SYBR Green Ⅰ与dsDNA 结合，荧光信号会增强 800～1000倍。用SYBR Green Ⅰ染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，可适用于多种凝胶电泳方法，如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。
SYBR Green Ⅰ与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶，如Taq酶、反转录酶、内切酶、T4连接酶等没有抑制作用；尤为重要的是，SYBR Green Ⅰ无明显诱变能力。
下面我们对电泳用SYBR Green Ⅰ的使用方法进行简单介绍。一、SYBR Green Ⅰ预染色方法
该方法适于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳。
1.工作液的配制
用电泳缓冲液将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2～8℃冷藏1个月以上。
2.制胶
按常规方法制胶，不含任何染料。
3.样品染色
向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和上样缓冲液，室温放置10min，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。
4.DNA相对分子质量标准染色
将5μl DNA 相对分子质量标准和1μl SYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5min，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。
5.上样、电泳
按常规操作。二、SYBR Green Ⅰ后染方法
1.按照常规方法进行电泳。
2.用 pH7.0～8.5的缓冲液，如TAE、TBE或TE，按照 10000:1的比例稀释 SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。
3.将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色 10～30min，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30min。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。图2-2 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱M-DNA相对分子质量标准；1，2-不同相对分子质量的DNA样品
本实验采用SYBR Green Ⅰ预染色方法对核酸样品进行染色。用缓冲液TE（pH8.0）将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。将SYBR GreenⅠ工作液与6×DNA上样缓冲液等体积混匀，保存于-20℃下。使用时将上述混合液与核酸样品按体积比1:2混匀，反应10min后即可上样。DNA相对分子质量标准染色：将5μl DNA相对分子质量标准和1μl SYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5min，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。
图2-2为琼脂糖凝胶电泳的效果图。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]