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发布时间:2021-04-06 22:32:15

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作者:胡宇驰

出版社:河北科学技术出版社

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保健食品安全性实验方法实用操作手册

保健食品安全性实验方法实用操作手册试读:

前言

保健食品行业是朝阳产业,近几年来市场规模不断增长。随着生活水平的提高和人们对自己健康状况的重视,对保健食品的需要量大大增加,市场规模预计将达到万亿以上。与之对应的,保健食品的研究也不断深入,不仅仅是简单的验证功能试验,而是从原料收集、机制分析、产品生产方面出现了全方位的进步。保健食品的发展,就像我们的祖国一样,是全面而蓬勃的。因此,开展对保健食品的安全性、有效性的研究实验室不断增多,发表的论文数量也有明显增加。

虽然很多试验方法的基本原理相同,但是保健食品有其特殊性,处于食品和药品之间,它既是食品又具有一定的功效性,在试验方法、判断标准上也是明显不同于一般食品和治疗用药品,要同时兼顾食品的特性和作用的有效性。《保健食品检验与评价技术规范》2003年版发行以来,到2015年已经使用了十多年,其中的很多仪器、试剂等都有了很大的变化,其中的一些方法已经不再适用或者说已经有了更加简便的方法;国家食品药品监督管理局顺应科学的发展,也陆续发布了一些新的功能试验方法和评价标准来替代2003年版。随着方法的进展,有必要总结实验中的经验体会、注意事项和一些适用的技巧。

现在从事保健食品研究与检验的机构,以疾病预防控制中心毒理所、部分大学实验室、食品药品检验机构为主。他们以前的工作重点,是教学,科研,常规药品、食品、化妆品、农药和化学品等项目检测。在进行保健食品研究的时候,难免受到自身特点的影响,好的方面是扩宽了思路,但也容易忽略保健食品的特性,容易导致试验结果的差异和因此产生误差。而且不同的实验室,会在实验细节方面产生差异,有时候是巨大的差异,有时候是微小的差异,但都可能会导致结果的巨大差异。

中国食品药品检定研究院注意到这些方面的进展和差异,在2013年组织了中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国疾病预防控制中心环境与健康产品安全所、国家食品安全风险评估中心、北京市疾病预防控制中心毒理所、北京市药品检验所、江苏省食品药品检验所、广东省药品检验所、中国食品药品检定研究院等八家单位的技术人员进行讨论,大家认为有必要总结实验中的细节和注意事项,在国家食品药品监督管理局发布标准文件的基础上,写作一本适用的操作手册,让所有的实验人员能够避免一些不必要的错误,让不同的实验室和人员在操作手册的指导下能够得到相似的试验结果和相同的试验结论,从而起到促进各地实验室对保健食品检验与试验能力提高的作用。

自2013年以来,八家单位的技术专家认真负责地写作了手册,大家一起讨论,付出了巨大的努力。手册中,所有的技术专家都将自己的经验,甚至把自己工作中的教训也写在其中,只是希望能够为看到这本手册的人提供有价值的参考。林飞教授在这个手册的写作中进行了召集、组织,确定项目内容、编写格式,并承担了较多篇幅的撰写,后期全部文稿的审核校对。手册的成稿,是40位人员的心血和实际工作经验的总结!

值此手册出版之际,向所有参加编写的人员致以敬意,向北京市药品检验所药理室所有参加后期文稿的审核校对的人员致以敬意,感谢大家的努力!希望所有读到本书的实验操作人员,都能有所收益!

当然本书中肯定也有不少不当甚至是失误之处,希望大家能够谅解并给予提出,以便今后做得更好。同时真诚欢迎大家一起讨论!编委会2015年3月第一部分试验基本原则原始记录的规范化管理

原始记录是指试验过程中,根据实际情况直接记录或统计形成的各种数据、文字、图表、声像、票据等原始资料。原始记录是证明试验各种信息的依据,是试验可以重复再现的保证。原始记录的规范性,直接体现试验的科学性与结果的可信度。原始记录的规范化管理,是对原始记录的内容、格式和保存、检索等进行规定,保证记录的规范。一、基本原则

试验人员均需接受相关培训,具有训练有素、有实际试验经验,严格按照试验设计方案的要求进行操作和书写内容。

试验的原始记录应当用签字笔手写或填写表格中有关内容,必须做到真实、及时、准确和完整,并规范化和表格化。

原始记录不能只包括数据收集,还要证明所有程序都是按照要求在正确的时间并正确实施,做到规范记录,不得漏记和随意涂改,不得伪造、编造数据。如果数据缺失或没有完整的试验记录,其试验的正确性将受到质疑。二、基本内容

原始记录的内容通常包括试验名称、试验目的、试验设计或方案、试验时间、试验材料、试验方法、试验操作全过程、观察指标、试验结果和结果分析、试验操作人员等内容。(一)试验名称

每项试验开始前应首先注明试验名称,检品(试验)编号、收样日期等。(二)试验目的

试验记录中要注明该项试验的目的及试验依据。(三)试验设计或方案

各项试验,记录中均应有一份的试验设计或方案。如果是引用相关技术规范,应写清楚技术规范全称、试验项目,包括版本号或年号等,其检验方法的主要内容、主要操作过程和检测指标要明确写入。(四)试验时间

试验应记录试验日期和时间,具体的记录方式各实验室可以自行规定,建议日期按照年月日的方式进行记录,时间采用24 h制。(五)试验材料(1)记录受试样品和对照品的名称、缩写名、代号、生产单位、供样单位、批号、剂型、规格、有效期、数量、主要理化性质、生物特性、溶媒和最大溶解剂量等信息,尽量保留使用说明书、理化检验报告书、购置发票等相关材料,必要时可以照相并附上照片。(2)记录实验动物的种属、品系、年龄、性别、体重范围、来源、等级和数量等。保留生产许可证号、质量合格证号、购置证明等原件或复印件。(3)记录实验动物室的饲料、饮水、垫料名称、批号、来源,记录特殊饲料的配方;动物笼具的材料、大小;提供实验动物生产许可证号、实验动物使用许可证号、饲料审查合格证号、生产批号等购置证明等原件或复印件。(4)记录试验仪器设备名称、型号、生产厂家或产地;本单位仪器编号。(5)记录主要试剂的名称、生产厂家、规格、批号和有效期。对自行配制的溶液应注明配制方法、配制浓度、配制时间和保存条件等信息。(6)记录细菌或细胞系的名称、来源等,记录其传代情况和保存使用情况,记录鉴别或活性测定情况,尽量保留购置证明。(7)毒麻药品、诱变剂等用于试验应有详细记录并严格管理。参照国家相关管理规定建立严格的管理和使用记录。(六)试验环境

记录试验地点、温度及湿度,对环境条件敏感的试验,应详细具体记录当天的天气和环境,光照、通风、洁净度、噪声等。(七)试验方法

应详细记录试验步骤和操作细节。(八)试验过程

应详细记录研究过程中的操作及观察到的现象、异常现象的处理及其产生原因、影响因素的分析等。(九)试验结果

准确记录定量观察指标的试验数据和定性观察指标的试验变化,肉眼观察的试验结果,可附照片作为说明材料。

采用仪器测定的结果,应打印出数据,标注日期、组别、编号、重复测定编号等,并由试验人员签名。(十)试验结果分析

每项试验结果应作必要的数据处理和分析,参考本实验室的正常值范围,采用的统计学方法、p值,并附明确的文字小结。(十一)试验人员

记录中应详细记录所有参加试验的人员,并由参加人签名;修改内容须加盖试验的人员名章,但一页记录中不能超过3处错误的修改。三、原始记录的书写(一)试验记录用纸(1)试验记录应使用本实验单位抬头的原始记录专用纸。(2)仪器自动记录并打印的图表和数据资料等应按顺序粘在记录纸上的相应位置,粘贴处盖齐缝实验者名章,并在相应处注明详细信息。不宜粘贴的,要另行装订并加以编号和说明、加盖实验者名章,同时在记录纸的相应位置处注明,以便查对。对于热敏纸记录的数据(容易自行消失)应将结果制作复印件,并将原打印记录及复印记录附在相应的位置。(3)试验记录用纸写有记录后,应编上页码,建议每页均有试验名称或试验代码以避免混淆并便于检索。(二)试验记录的书写(1)试验记录必须使用钢笔或签字笔记录,不得使用铅笔或圆珠笔。(2)试验记录中常用的外文缩写首次出现时必须用中文加以注释。(3)试验记录中使用规范的专业术语,计量单位采用国际标准计量单位。(4)试验记录的修改应清晰,可辨识修改前与修改后的内容。建议在修改处由左上向右下画一斜线(杠改),旁白部位写修改后内容,并由修改人加盖名章。严禁使用修正液、墨水将内容全部覆盖或使用小刀挂掉字迹。(5)试验记录过程中尽可能采用提前准备的固定格式的表格,试验结束时,应将未填写内容的部分画一斜线,表示不能再次使用,避免补记。(6)试验记录中采用代码或图形符号时,如1,2,3或A,B,C等,必须有备注说明代码的具体内容;代码或图形符号在一页中不得有多种含义,避免不同解释。

记录中提前编制的备选选择项,应有明确的选择说明,例如可采用“√”表示该项目被选择。(7)采用统计软件进行结果统计时,应当对输入数据和输出数据均进行打印保存,便于核对。(8)采用显微镜进行观察的结果,对照片或载玻片可进行纵、横坐标数码记录。(9)计算机保存的电子数据,必须进行备份。电子数据的外包装或文件名称,必须具有明确和唯一的标识。(10)试验记录中无论什么情况都要避免重复记录。四、试验记录的签署、检查和存档(1)试验结束后,记录人在记录上签名,核对人员、审核人员在核对和审核后也应在记录上签名。(2)试验结束后,试验负责人应将记录整理归档,一般按照页码进行排列,并尽量与试验报告顺序一致。原始记录内容及页码很多的,要编制目录。(3)进行归档管理时。原始记录应排列在实验报告、检品卡、委托书或合同书之后,最后应是提供的资料和文献资料。(4)试验完成后,记录应按照档案资料要求进行归档保存管理。记录应保存在具有防止损坏、变质、丢失的环境中。(5)试验记录可检索,并可按规定进行查阅。(起草:北京市药品检验所胡宇驰)(修改复核:中国食品药品检定研究院林飞)五、规程与文献

[1]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S],2003:2,168,199.

[2]范玉明,等.安全性评价标准操作规程指南[M].成都:电子科技大学出版社,2009:16-17.

[3]袁伯俊,等.新药临床前安全性评价与实践[M].北京:军事医学科学出版社,1997:226-232.对受试物的预处理方法一、基本要求

尽可能提供受试物的完整配方、工艺流程、理化性质(包括纯度、稳定性、溶媒、溶解度、贮存条件及时间等)、临床人每日拟用量、拟用疗程、使用说明书等与实际产品相同的资料。如提供的受试物与实际产品不相同,应提供盖有公章的文字证明,详细说明不同原因及不同内容。二、体内动物试验的预处理方法(一)溶媒的选择

应根据试验的特点和受试物的理化性质选择溶媒(溶剂、助悬剂或乳化剂),受试物配制后可以是溶液,也可以是悬浮在溶媒中的混悬液。常用溶媒为:纯化水、生理盐水、食用植物油、4%淀粉糊、1%明胶、0.5%~1.0%羧甲基纤维素钠和2%吐温80等,水溶性受试物首选纯化水、脂溶性受试物首选食用植物油。如使用其他溶媒应说明理由。所选用的溶媒本身应不产生毒性作用;与受试物各成分之间不发生化学反应,且保持其稳定性;无特殊刺激性或气味。

需注明所用溶媒的生产厂家、批号、装量大小等。(二)可溶受试物

能够完全溶解在水或植物油中的受试物,应找到最大溶解浓度,使用相同的溶媒稀释较高浓度。(三)不溶受试物

不能溶解在水或植物油中的受试物,应将受试物进一步粉碎、研磨,过80目标准筛(筛孔内径180μm),在乳钵中边研磨边加入助悬剂,使受试物充分、均匀地悬浮在溶媒中。使用相同的助溶剂并充分搅拌均匀来稀释较高浓度。(四)摄入量较大的受试物

对人体推荐量较大的受试物,如最大溶解(混悬)浓度(以动物灌胃针头小鼠12号,大鼠16号能够顺利抽吸到注射器中为准)、最大灌胃体积(每只小鼠0.8 ml、0.2 ml/10g BW,每只大鼠6 ml、2 ml/100g BW)或掺入饲料中的限量(10%w/w)不能达到试验设计的高剂量时,可允许去除既无功效作用又无安全问题的辅料部分进行试验,并在试验报告中详细说明。(五)摄入量较小的受试物

对人体推荐量较小的受试物,在按其推荐量设计试验高剂量时,如未超过动物的正常灌胃量(小鼠0.2 ml/10 g BW,大鼠1 ml/100 g BW)应通过灌胃方式进行试验,最好不用掺入饲料中的给予方式,避免掺入饲料中不均匀、摄入量不足或个体摄入量不一致而影响试验结果。(六)袋泡茶类受试物

提取方法应与产品推荐饮用的方法相同,可用该受试物的水提取物进行试验。如果产品无特殊推荐饮用方法,水提取物可采用以下提取条件进行:常压、温度80~90℃,浸泡时间30 min,水量为受试物重量的10倍或以上,提取2次,将提取液合并煮沸浓缩或减压蒸发浓缩至所需浓度,并标明该浓缩液与原料的比例关系。如产品有特殊推荐服用方法(如推荐食用浸泡后的产品),在试验时予以考虑。(七)吸水膨胀率较高的受试物

应考虑受试物的吸水膨胀对受试物给予剂量和实验动物的影响,以此来选择合适的受试物给予方式(灌胃或掺入饲料)。如采用灌胃方式给予,应选择水为溶媒。(八)液体受试物

一般用原液进行试验,如原液满足不了高剂量组设计要求,需要进行浓缩处理时,应采用不破坏其中有效成分的方法。可使用温度60~70℃减压或常压蒸发浓缩、冷冻干燥等方法。液体受试物最大浓缩浓度以动物灌胃针头(小鼠12号针头,大鼠16号针头)能够顺利在注射器中抽吸为准。(九)不易粉碎的固体受试物

可用冻干粉碎的方式进行,其他需参考不溶受试物的制备方法,并在试验报告中详细说明。(十)含乙醇的受试物

推荐量较大的含乙醇的受试物,在按其推荐量设计试验剂量时,如超过动物最大灌胃容量,可以进行浓缩。在调整受试物的乙醇浓度时,原则上应使用生产该受试物的酒基。

乙醇浓度低于15%的受试物,浓缩后的乙醇应恢复至受试物定型产品原来的浓度。

乙醇浓度高于15%的受试物,浓缩后应将乙醇浓度调整至15%,并将各剂量组的乙醇浓度调整一致。

不需要浓缩的受试物,其乙醇浓度>15%时,应将各剂量组的乙醇浓度调整至15%。(十一)含有人体必需营养素或已知存在安全问题等物质的受试物

如产品配方中含有某一过量摄入,容易产生安全性问题的人体必需营养素等物质(如维生素A、硒等)或已知存在安全问题物质(如咖啡因等),在按其推荐量设计试验剂量时,如该物质的剂量达到已知的毒作用剂量,在原有剂量设计的基础上,应考虑增设去除该物质或降低该物质剂量(如降至最大无毒性反应剂量NOAEL)的受试物剂量组,以便对受试物中其他成分的毒性作用及该物质与其他成分的联合毒性作用做出评价。(十二)受试物掺入饲料

掺入饲料中的受试物超过5%(w/w)时,应按动物的营养饲料配方调整各组饲料蛋白质(酪蛋白)量,一致后进行试验,并说明具体调整的方法。原则上添加的受试物最高不超过饲料的10%(w/w)。三、体外细菌、细胞试验的预处理方法(一)溶媒的选择

应根据试验的特点和受试物的理化性质选择溶媒(溶剂、有机溶剂或乳化剂),受试物配制后可以是溶液,也可以是乳化液或混悬液。常用溶媒为:生理盐水、0.2M磷酸缓冲液(pH 7.4)、细胞培养液、二甲基亚砜、95%乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、四氢呋喃和醋酸乙酯等,首选生理盐水、磷酸缓冲液、细胞培养液、二甲基亚砜及95%乙醇。如使用其他溶媒应说明理由。

有机溶媒最好使用光谱纯或分析纯;加入量越少越好,以能够溶解受试物,满足试验设计高剂量组浓度为准;少量加入对试验不应产生轻、中度毒性作用;必须增设有机溶媒对照组。(二)可溶受试物

能够完全溶解在某些有机溶媒中的受试物,在加入到培养基或培养液(即与水相关物质混合)中时,可能出现絮状物或重新凝聚,应找到最小凝聚浓度作为高剂量组,使用相同的溶媒或首选溶媒来稀释较高浓度。(三)不溶受试物

常用溶媒均不能溶解的受试物,应反复将受试物粉碎、研磨,过400目标准筛(筛孔内径34μm)或200目标准筛(筛孔内径75μm),其细粉末在乳钵中边研磨边加入首选溶媒,使受试物充分、均匀地悬浮在溶媒中。使用相同的首选溶媒并充分搅拌均匀来稀释较高浓度。(四)不易粉碎的固体受试物

首选冻干粉碎的方式;如不能研磨成细粉或不能通过≥200目标准筛,其粗粉(过10目标准筛,筛孔内径2 000μm)或颗粒(>2 mm)以0.2 g/ml的比例悬浮在首选溶媒中,121℃保温1 h或70℃保温24 h或37℃保温72 h,放置期间需搅拌1~3次,其浸出液用于试验。在试验报告中需详细说明。(五)含益生菌、真菌、细菌、毒素或抗生素的受试物

应将微生物灭活,可参考以下方法,需在试验报告中详细说明具体灭活方法。(1)加热到62~65℃,保持30min。灭菌效率可达97.3%~99.9%,经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等。(2)加热到75~90℃,保温15~16s。能将病原菌杀死,不会有较多的营养损失。(3)在100℃煮沸20 min(有少量芽孢菌存活)或113℃高压保持10 min(各种菌均杀灭)。(六)需要灭菌处理的受试物

受试物应是溶液或混悬液,溶媒首选生理盐水、磷酸缓冲液、细胞培养液、二甲基亚砜等不宜加热挥发的,在灭菌处理后需二次定容。根据受试物的具体情况选择合适的灭菌方法。应在无菌环境下打开灭菌物或进行过滤操作。

1.湿热灭菌法

是在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性或凝固而杀灭微生物的方法。用于遇高温与湿热不发生变化或损坏的受试物。常用湿热灭菌法:煮沸灭菌法、巴氏消毒法、流通蒸汽灭菌法和高压蒸汽灭菌法。(1)煮沸灭菌法:将水煮沸至100℃,保持5~10 min可杀死细菌,保持1~3 h可杀死芽孢。(2)巴氏消毒法:适用于食品的消毒。一是低温维持法:62℃保持30 min;二是高温瞬时法:75℃保持15~30 s。(3)流通蒸汽灭菌法:利用常压下的流通蒸汽进行灭菌。(4)高压蒸汽灭菌法:103千帕蒸汽压温度达121℃,保持15~20 min。(表1)表1 饱和蒸汽压力与温度对照表

2.过滤除菌法

是利用细菌不能通过致密孔具滤材的原理,物理阻留的方法将液体中的微生物除去,达到无菌目的。除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作为过滤材料,常用的滤菌器有薄膜滤菌器(混合纤维树脂滤膜0.45μm和0.22μm孔径)、陶瓷滤菌器(G6)、石棉滤菌器(Seitz滤菌器)、烧结玻璃滤菌器等。(表2)表2 微孔滤膜的孔径与用途(1)微孔滤膜0.22μm孔径:能去除受试物溶液中极细颗粒,滤除99.9%的微生物。(2)微孔滤膜0.45μm孔径:能去除受试物溶液中细小颗粒,能滤除大部分微生物。(3)微孔滤膜1~5μm孔径:预处理过滤较大颗粒的杂质,再用相应滤膜进行过滤。(起草:中国食品药品检定研究院林飞)(修改复核:国家食品安全风险评估中心高芃)四、规程与文献

[1]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S],2003:2-3,168-169.

[2]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准受试物处理方法(征求意见稿),2011.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[4]中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价(GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12:2002)》:第十二部分:样品制备与参照样品

[5]郑钧镛,王光宝.药品微生物学及检验技术[M].北京:人民卫生出版社,1989:116-119.常用部分致突变物、致畸物和致癌物的灭活处理方法一、原理及目的

多数致突变物、致畸物和致癌物可以利用一些化学反应、物理反应或生物作用破坏或改变该类物质中引起致突变、致畸和致癌作用的某些化学结构或官能团,从而达到无害化或降低其有害作用。

致突变物、致畸物和致癌物及其在实验中接触到上述物质的物品,废弃前需要进行灭活处理,减少对实验室以外环境及人类损害作用。二、试验材料(一)仪器、器具和物品

负压通风橱、100℃电烤箱、5 000 ml广口瓶、5 000 ml玻璃缸、玻璃试管、平皿、细胞培养瓶、吸管、吸头等,被处理物。(二)试剂及制备

硫酸、盐酸、次氯酸钠、焦亚硫酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸氢钠、重铬酸钾、高锰酸钾、硫代硫酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨基磺酸、铝镍合金、丙酮、甲醇、乙腈等工业用化学试剂。三、处理方法

根据本实验室条件,对不同被处理物,选用不同灭活处理方法。灭活处理实验全过程必须在开启的负压通风橱中进行,被处理物和用于被处理物的仪器或器具均应放置到开启的负压通风橱中,不得在密闭的实验室中操作。(一)丝裂霉素C(1)被处理物溶液1 ml+5.25%次氯酸钠溶液1.5 ml;+1%亚硫酸氢钠1.5 ml,除去多余的次氯酸钠后废弃。(2)1%高锰酸钾水溶液100℃浸泡0.5 h。(二)环磷酰胺(1)被处理物250 mg+1 mol/L盐酸10 ml,保持1 h;

+0.2 g/ml氢氧化钠溶液至pH 6,冷却至室温;

+硫代硫酸钠1.5 g及0.2 g/ml氢氧化钠呈强碱性,>1 h,水稀释。(2)0.2 mol/L氢氧化钾甲醇溶液室温浸泡1 d。(三)叠氮化钠

被处理物1.0 g+水20 ml+20%亚硝酸钠溶液10 ml;4 mol/L硫酸5 ml持续搅拌1 h,有酸雾产生,需在通风橱中进行。(四)杂环芳烃(4硝基喹啉-N-氧化物、ICR-170、ICR-191)(1)锰酸钾硫酸溶液:3 mol/L硫酸100 ml+4.74 g高锰酸钾。

被处理物5 mg+乙腈3 ml;

+高锰酸钾硫酸溶液10 ml,反应1 h以上;

+焦亚硫酸钠0.8 g脱色;

+10 mol/L氢氧化钾8 ml呈强碱性(pH>12)放热;

+水100 ml,过滤含锰化合物,中和滤液后丢弃。(2)0.2 mol/L氢氧化钾甲醇溶液室温浸泡1 d。(五)甲基硝基亚硝基胍、N-亚硝基甲基脲、乙基亚硝基脲(1)被处理物3 g+甲醇100 ml;

+6 mol/L盐酸100 ml;

+氨基磺酸7 g,反应24 h。(2)2%硫代硫酸钠磷酸盐缓冲液室温浸泡1 h。(六)联苯胺、β-萘胺(1)被处理物10 ml+0.2 mol/L高锰酸钾溶液5 ml及2 mol/L硫酸溶液5 ml,保持≥10 h;

+焦亚硫酸钠1.6 g使其脱色;

+10 mol/L氢氧化钾16 ml呈强碱性(pH>12),此反应过程放热;

+水100 ml稀释,过滤掉含锰化合物,中和滤液后丢弃。(2)1.5%高锰酸钾丙酮饱和溶液室温浸泡24 h。(七)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯(1)被处理物(甲磺酸甲酯)1 ml+1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml,保持6 h。

被处理物(甲磺酸乙酯)1 ml+1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml,保持48 h。(2)10%硫代硫酸钠水溶液室温浸泡1 d(甲磺酸甲酯)或20 h(甲磺酸乙酯)。(八)N-二甲基亚硝胺(1)被处理物5 ml+1 mol/L氢氧化钾溶液5 ml;

+铝镍合金0.5 g,放热后封闭24 h。(2)重铬酸钾+硫酸溶液室温浸泡1 d。(九)多环芳烃类

包括:苯并(a)芘、7,12-二甲基苯蒽、3-甲基胆蒽、2-氨基芴、2,7-二氨基芴、2-乙酰氨基芴、苯并(a)蒽。(1)高锰酸钾硫酸溶液:3 mol/L硫酸溶液1 000 ml+47.4 g高锰酸钾搅拌;现用现配。

被处理物5 mg+丙酮2 ml溶解;

+高锰酸钾硫酸溶液10 ml,反应1 h以上;

+焦亚硫酸钠1.0 g使其脱色;

+10 mol/L氢氧化钾10 ml呈强碱性(pH>12),此反应过程放热;

+水100 ml,过滤掉含锰化合物,中和滤液后丢弃。(2)重铬酸钾+硫酸溶液室温浸泡2 d[苯并(a)芘、苯蒽、甲基胆蒽]。(3)1.5%高锰酸钾丙酮饱和溶液室温浸泡24 h(2,7-二氨基芴、2-乙酰氨基芴)。1(十)黄曲霉毒素B (1)被处理物1 mg+5.25%次氯酸钠溶液2 ml,放置过夜;

+水6 ml;

+丙酮0.5 ml,反应≥30 min。(2)3%~5%次氯酸钠溶液室温浸泡5 min。(起草:中国食品药品检定研究院林飞)(修改复核:国家食品安全风险评估中心高芃)四、规程与文献

[1]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S],2003:242.

[2]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准致突变物、致畸物和致癌物的处理方法(征求意见稿),2011.第二部分功能学检验方法增强免疫力功能检验方法一、原理及目的

增强免疫力功能的检测试验包含了细胞免疫功能测定(小鼠脾淋巴细胞转换试验、迟发型变态反应试验)、体液免疫功能测定(抗体生成细胞检测、血清溶血素测定)单核—巨噬细胞功能测定(小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验)和NK细胞活性测定。通过以上试验,综合判定保健食品是否具有增强免疫力的功能。二、试验材料

分度值(d)为0.1 g的动物电子天平,100 ml乳钵,50 ml和500 ml烧杯,1 ml和10 ml一次性注射器,小鼠解剖板,止血钳,医用剪刀和镊子等。

其他见各试验方法详述。(一)受试物的制备

1.对受试物处理的要求(1)受试物推荐量较大,超过实验动物的灌胃量、掺入饲料的承受量等情况时,可适当减少受试物中的非功效成分的含量。(2)对于含乙醇的受试物,原则上应使用其定性的产品进行功能试验,且实验中三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。如受试物的推荐量较大,超过动物最大灌胃量时,允许将其进行浓缩,但最终的浓缩液体积应恢复原乙醇含量。如乙醇含量超过15%,允许将其含量降至15%。调整受试物乙醇含量应使用原产品的酒基。(3)液体受试物需要浓缩时,应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择60~70℃减压进行浓缩。浓缩的倍数依具体试验要求而定。(4)对于以冲泡形式饮用的受试物(如袋泡剂),可使用该受试物的水提取物进行功能试验,提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式,则采用下述提取条件:常压,温度80~90℃,时间30~60 min,水量为受试物体积的10倍以上,提取2次,将其合并浓缩至所需浓度。

2.受试物的配制方法

对于水溶性的受试物,可以选择去离子水(蒸馏水)作为溶媒配制受试物。对于非水溶性的受试物,可选用羧甲基纤维素钠(一般使用浓度为0.5%)、阿拉伯胶(使用浓度为5%~15%)、食用油等作为混悬介质。

用于配制受试物的溶剂、乳化剂或助悬剂本身应不具有功效作用,与受试物各成分之间不发生化学反应,且保持其稳定性。(二)对照剂的制备

阴性对照剂:一般为去离子水(蒸馏水)。

溶媒对照剂:如果受试物中含有乙醇成分,则应以原产品的酒基作为溶媒对照剂。

阳性对照剂:可选用已知的具有增强免疫力功能的保健食品作为阳性对照剂。

以载体和功效成分(或原料)组成的物质,当载体本身可能具有相同功能时,应将该载体作为对照。(三)动物

选择清洁级或SPF级实验动物,推荐使用近交系小鼠,提供实验动物来源、实验动物生产许可证号。(四)实验动物室

选择屏障环境动物房,提供实验动物使用许可证号,实验动物饲料名称及饲料生产企业审查合格证号。动物饮用水应是灭菌水、纯化水或酸化水,注明鼠笼体积[长(cm)×宽(cm)×高(cm)],鼠笼材料(塑料、不锈钢丝),灭菌垫料物在笼内还是笼外。三、试验设计(一)动物数量及分组

选用单一性别的近交系小鼠,体重18~22 g,每组10~15只。按照体重随机分成阴性对照组、受试物高剂量组、中剂量组、低剂量组,必要时设阳性对照组。(二)受试物剂量设定

按要求,试验需要“以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组,另设两个剂量组”。通常以人体推荐量的10倍作为试验的中剂量组,在其上、下各设定一个剂量组。例如:

受试物高剂量组:人体推荐量的30倍或20倍。

受试物中剂量组:人体推荐量的10倍。

受试物低剂量组:人体推荐量的5倍。(三)给予受试物的方法

必须经口(PO),首选灌胃(ig)。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中,计算受试物的给予量。

试验时每天给受试物1次,连续给予30 d,必要时可延长至45 d。

末次给予受试物1~2 h后,进行各种指标的测定。(四)对动物体重变化的观察

每周对受试动物称体重一次,计算各组小鼠每周体重平均值与标准差,观察体重变化情况。(五)脏器/体重比值测定

小鼠称体重并记录后,脱颈椎处死,剖腹取完整脾脏和胸腺,去除筋膜及脂肪,置电子天平称湿重。

计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。四、增强免疫力功能结果判定

增强免疫力功能判定:在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性,可判定该受试物具有增强免疫力功能作用。

其中细胞免疫功能测定项目中的两个试验结果均为阳性,或任一个试验的两个剂量组结果阳性,可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个试验结果均为阳性,或任一个试验的两个剂量组结果阳性,可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个试验结果均为阳性,或任一个试验的两个剂量组结果阳性,可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定试验的一个以上剂量组结果阳性,可判定NK细胞活性结果阳性。ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)一、原理及目的

当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应,活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为蓝紫色结晶,其光密度值能反应细胞的增殖情况。

用于检测T淋巴细胞的增殖功能。二、试验材料(一)主要仪器、器具和物品

1.主要仪器

二氧化碳培养箱、酶标仪或紫外—可见光分光光度计、超净工作台、倒置显微镜、离心机、高压灭菌器、-20℃冰箱、普通冰箱。

2.器具和物品

200目筛网或纱布、24孔培养板、96孔培养板(平底)、培养皿、血细胞计数板、滤器(孔径为0.2μm)、精密试纸、0.1 ml和5 ml移液器、烧杯、三角瓶、手术器械。(二)试剂及制备

1.RPMI 1640完全培养液(1)2-巯基乙醇(2-ME)。-2

储备液(5×10 mol/L):取20μl的2-ME加入5 ml 0.9%氯化钠注射液中(1:250倍稀释),此溶液应在4℃下避光、密闭保存。

培养液中的2-ME:使用前,取2-ME储备液用0.9%氯化钠注射液-3做10倍稀释(5×10 mol/L)。然后按照1%加入培养液中,终浓度为-55×10 mol/L。(2)配制完全培养液。RPMI 1640培养基(含有1%谷氨酰胺)按照说明书以双蒸水溶解后过滤除菌,用前加入10%小牛血清,青-5霉素(100 U/ml),链霉素(100μg/ml)及5×10 mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1 mol/L的HCl或1 mol/L NaOH调pH至7.0~7.2,即完全培养液。

2.ConA液

用双蒸水配制成100μg/ml的溶液,过滤除菌,在-20℃保存。

3.无菌Hank's液

氯化钠(NaCl)8.00 g;

氯化钾(KCl)0.40 g;2

氯化钙(CaCl )0.14 g;42

硫酸镁(MgSO ·7H O)0.20 g;242

磷酸氢二钠(Na HPO ·H O)0.06 g;24

磷酸二氢钾(KH PO )0.06 g;

葡萄糖 1.00 g;

酚红 0.02 g。2

将CaCl先溶解在100 ml水中,其他成分依次溶解在750 ml水中,待前一种试剂完全溶解,再溶解下一种试剂。酚红先用35.6%NaHCO溶解后再加入。上述溶液加双蒸水至1 000 ml,0.2μm无菌滤膜抽滤灭菌,4℃保存备用。

4.无菌PBS液(pH 7.2~7.4)

氯化钠(NaCl)8.00 g;24

磷酸二氢钾(KH PO )0.02 g;

氯化钾(KCl)0.02 g;242

磷酸氢二钠(Na HPO ·12H O)2.80 g。

将上述试剂依次溶解后,加双蒸水至1 000 ml,121℃灭菌30 min,分装后4℃保存备用。

5.MTT液

用pH 7.2~7.4的PBS配制成5 mg/ml,0.2μm无菌滤膜抽滤灭菌,现用现配。

6.酸性异丙醇

96 ml的异丙醇中加入4 ml 1 mol/L的HCl,临用前配制。三、观察指标

MTT法测定淋巴细胞的增殖能力。四、操作程序(一)制备脾细胞悬液(1)脱颈椎处死小鼠,并放入盛有75%乙醇的烧杯中,使小鼠全身浸湿,这样可以避免毛和皮屑到处飞散。(2)无菌环境中取出小鼠放在滤纸上,使其侧卧,鼠腹部与操作者相对。用剪刀和镊子在小鼠左侧腹部皮肤横切一小口,两手的手指握住切口两边,撕开皮肤,直到腹壁完全暴露为止。(3)镊子挑起覆盖在脾脏侧的腹肌,用剪刀剪开,将脾脏与其血管和结缔组织剥离后离体,立刻放入盛有Hank's液的培养皿中。(4)将200目不锈钢细胞筛置于适量Hank's液体中,将现取的无菌脾脏放在筛网上,用1 ml塑料注射器芯研磨脾脏,使其成单个细胞悬液。(5)将脾细胞悬液转移至离心管中。用Hank's液洗2~3次,每次1 000 r/min离心10 min。(6)将细胞悬浮于1 ml的完全培养液中,用胎酚兰染色计数活细6胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为3×10个/ml。(二)淋巴细胞增殖反应(1)将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1 ml,2一孔加75μl ConA液(终浓度7.5μg/ml),另一孔作为对照,置5%CO培养箱中培养72 h。(2)培养结束前4 h,每孔轻轻吸去上清液0.7 ml,加入0.7 ml不含血清的RPMI 1640培养液,同时加入MTT(5 mg/ml)50μl/孔,继续培养4 h。(3)培养结束后,每孔加入1 ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。(4)将溶解液分装到96孔板上,每个孔做3个平行孔。用酶标仪,在570 nm波长处测定吸光度值。也可将溶解液直接移入2 ml比色杯中,在紫外—可见光分光光度计上,于570 nm波长处测定吸光度(ABS)值。五、结果的评价标准

受试物组的吸光度差值显著高于对照组的吸光度差值,可判定该项试验结果阳性。六、结果分析及统计学处理

用加ConA孔的吸光度(ABS)值减去不加ConA孔的吸光度(ABS)值代表淋巴细胞的增殖能力。受试物各剂量组与阴性对照组进行比较。

一般采用方差分析,但需要按方差分析的程序先进方差齐性检0.05验,方差齐,计算F值,F<F,结论:各组均数间差异无显著性;

0.05F≥F ,P≤0.05,用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。七、操作要点及注意事项(1)浓2-ME有剧毒,并有恶臭味,操作时应在通风橱中进行。(2)试验中ConA的浓度过低不能刺激足够的细胞增殖,过高会抑制细胞的增殖,不同批号ConA在试验前要进行预试,以找到最佳浓度。(3)建议受试物最好当天配制当天使用,除非有明确的研究资料表明受试物的配制物有很好的稳定性。如果是供注射用的受试物还要注意在无菌的条件下进行配制。(4)制备无菌细胞悬液时,所用器械均应事先消毒灭菌。研磨脾脏时尽量使脾脏完全浸润在缓冲液环境中,动作要轻,避免损伤细胞。(5)用胎酚兰染细胞,可测出白细胞中活细胞的数目或百分率。活细胞不着色,而死细胞则摄取染料,因此,可分别计数不着色的活细胞和蓝染的死细胞。用胎酚兰染色后,必须在3 min内计数细胞;3 min以后活细胞亦开始摄取染料。同时,胎酚兰对蛋白质有很大的亲和力,所以用不含血清的细胞稀释液会使测定结果更精确。胎酚兰经常使用的浓度为0.5%~1.0%。(6)试验中小牛血清不同的来源或批号,在支持淋巴细胞生长和转化上有很大差别,试验前应选择合格的小牛血清。(7)加MTT试剂前应换上无小牛血清的培养液,否则在加入异丙醇时会形成沉淀影响比色。(起草:北京市药品检验所金鑫,胡宇驰)(修改复核:北京市疾病预防控制中心马玲)迟发型变态反应(DTH)二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)一、原理及目的

二硝基氟苯(DNFB)稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合完成抗原,由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7 d后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击,一般在抗原攻击后24~48 h达高峰,其肿胀度可以反映迟发型变态反应强度。二、试验材料(一)仪器、器具和物品

分度值(d)为0.001 g的电子天平、分度值(d)为0.1 g的动物天平、电推子、10μl、50μl移液器及吸头、直径8 mm打孔器(或眼科角膜环钻)、小鼠解剖板、医用剪刀和镊子。(二)试剂及制备(1)10%DNFB溶液:试验前称取DNFB 50 mg,置清洁干燥带盖小瓶中,加入丙酮油溶液[丙酮:麻油(植物油)=1:1] 5 ml,瓶盖密闭,防止丙酮挥发。充分混匀后用50μl移液器吸取。(2)3%脱毛剂:可溶淀粉3 g加蒸馏水100 ml混匀,加热呈糊状,趁热加入硫化钡3 g,其混悬液充分混匀,晾凉后使用。三、观察指标

称取小鼠左、右各耳片重量。四、操作程序(1)脱毛:正式测定(取小鼠耳片)前7 d,各组小鼠腹部被毛用温水涂湿,再用3%硫化钡涂擦脱毛(可先用电推子剃毛),去毛范围3 cm×3 cm,最后用温水清洗。(2)致敏:次日,各受试物组和对照组用移液器取DNFB溶液50μl均匀涂抹到脱毛处致敏。必要时24 h再强化涂抹一次。(3)DTH的产生与测定:致敏5 d后,各受试物组和对照组用移液器取DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24 h称体重(g)后脱颈椎处死小鼠,沿耳郭基线剪下左、右两耳壳,用打孔器在左、右两耳相同部位打下直径8 mm的耳片,称重。(4)同时解剖小鼠剪取完整胸腺和脾脏,称取湿重(mg)。计算脏/体比值。五、结果的评价标准

受试物组的重量差值显著高于对照组的重量差值,可判定该项试验结果阳性。六、结果分析及统计学处理(1)左、右耳重量之差作为肿胀度(表示DTH的程度)。受试物各剂量组的重量差值与阴性对照组进行比较。(2)以每10 g小鼠的脾脏湿重(mg)和胸腺湿重(mg)计算脏/体比值。

一般采用方差分析,但需要按方差分析的程序先进方差齐性检0.05验,方差齐,计算F值,F<F,结论:各组均数间差异无显著性;

0.05F≥F ,P≤0.05,用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。七、操作要点及注意事项(1)在致敏及攻击的时候仍然给以受试物。(2)DNFB为剧毒试剂,配制的时候应做好防护,避免与皮肤接触。并且溶液应根据试验实际用量新鲜配制。(3)硫化钡是微溶于水物质,用做脱毛剂可配置成3%~5%,用淀粉糊充分混悬混匀后使用。由于有一定的皮肤刺激性,其浓度不要过高,去毛后用温水擦洗干净,建议次日开始致敏涂抹。(4)10%DNFB溶液:是由丙酮等配制的,容易挥发,需密闭保存及操作。(5)DNFB可与皮毛结合影响抗原致敏,故腹壁去毛尽量干净,不要损伤皮肤。(6)耳片打孔器可选用眼科角膜环钻或橡胶塞打孔器,直径为8~9 cm。(7)取耳片的时候尽量在相同的部位,避免因所取耳片位置不同,薄厚不同而造成的误差。(8)在小鼠背部脱毛处用移液器取DNFB溶液于24 h再次强化涂抹一次,其致敏效果更佳。(起草:北京市药品检验所金鑫,胡宇驰)(修改复核:中国食品药品检定研究院林飞)迟发型变态反应(DTH)绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)一、原理及目的

SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞,4 d后,当在以SRBC攻击时,攻击部位出现肿胀,其肿胀度可以反映迟发型变态反应强度。二、试验材料(一)仪器、器具和物品

游标卡尺(精密度0.02 mm)、20μl微量注射器、1 ml注射器。(二)试剂及制备

SRBC:以0.9%氯化钠注射液配制,致敏浓度2%(v/v),攻击浓度20%(v/v)。三、观察指标

游标卡尺测定小鼠足跖厚度。四、操作程序(1)致敏:正式测定前5 d,受试组每只小鼠腹部腹腔或静脉注8射2%(v/v)SRBC(约1×10/ml)0.2 ml。(2)DTH的产生与测定:免疫后4 d,测量小鼠左后足跖部厚度并记录,然后在测量部位皮下注射20%SRBC,每只鼠20μl(约1×810/ml),于注射后24 h再次测量左后足跖部厚度,同一部位测量3次,取平均值。五、结果的评价标准

受试物组的厚度差值显著高于对照组的厚度差值,可判定该项试验结果阳性。六、结果分析及统计学处理

用攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试物各剂量组的差值与阴性对照组进行比较。

一般采用方差分析,但需要按方差分析的程序先进方差齐性检0.05验,方差齐,计算F值,F<F ,结论:各组均数间差异无显著0.05性;F≥F ,P≤0.05,用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。七、操作要点及注意事项(1)测量足跖厚度时,最好两人配合进行。卡尺紧贴足趾部,但不要加压,否则会影响测量结果。(2)攻击时所用的SRBC要新鲜(4℃保存期不超过1周)。(3)致敏和攻击致敏时所用SRBC最好同批,如系两次取血所得,应保证采自同一只羊。(4)也可使用千分尺或使用容积测量法进行测量。(起草:北京市药品检验所金鑫,胡宇驰)(修改复核:北京市疾病预防控制中心马玲)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)一、原理及目的

经过绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合,在补体参与下,使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解,形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。二、试验材料(一)仪器、器具和物品

生化培养箱、恒温水浴、离心机、旋涡混合器、血细胞计数板、玻片架、玻片、10ml刻度离心管、试管、200目筛网、三角瓶、玻璃珠、手术器械。(二)试剂及制备

1.RPMI 1640培养液

RPMI 1640培养基按照说明书以双蒸水溶解后过滤除菌备用。

2.Hank's液

配制方法见ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)。

3.SRBC

绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向转动5 min,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。(1)免疫浓度:2%(v/v)SRBC液,以生理盐水配制。(2)试验浓度:10%(v/v)SRBC液,以SA缓冲液配制,配制方法见5(1)。

4.制备补体

采集豚鼠血,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1 ml SRBC加入到5 ml豚鼠血清中,混匀后放置4℃保存30 min,放置期间再混匀几次,到时经2 000 r/min离心10 min,取上清液分装,-70℃保存。

5.SA缓冲液(1)储备液(5×):

巴比妥酸2.3 g;22

氯化镁(MgCl ·6H O)0.5 g;22

氯化钙(CaCl ·6H O)1.0 g;

氯化钠(NaCl)41.9 g;3

碳酸氢钠(NaHCO )12.6 g;

巴比妥钠1.5 g。

将上述试剂按顺序依次在800 ml双蒸水中加热溶解(45℃),待冷却后,再加双蒸水至1 000 ml,4℃冰箱保存备用。(2)应用液:使用前,将储备液做5倍稀释(取1份储备液加4份双蒸水)即可。

6.琼脂糖(1)0.5%琼脂糖(玻片涂膜):0.5 g琼脂糖加双蒸水100 ml,加热溶解。(2)1%琼脂糖(表层培养基):1 g琼脂糖加双蒸水100 ml,加热溶解。三、观察指标

计数溶血空斑数量。四、操作程序(一)制备脾细胞悬液(1)免疫动物。正式测定前4~5 d,取脱纤维的羊血置10 ml刻度离心管中,用生理盐水洗涤3次,每次2 000 r/min离心10 min,计78数细胞,每只小鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×10~2×10个。也可将SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只小鼠腹腔注射0.2 ml。(2)将SRBC免疫4~5 d后的小鼠用脱颈椎处死,并放入盛有75%乙醇的烧杯中浸湿消毒,并避免毛和皮屑飞散。(3)按ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)中方法,取小鼠脾脏,并制备脾细胞悬液。(4)将脾细胞悬液转移至离心管中。用Hank's液洗2次,每次1 000 r/min离心10 min。(5)将细胞悬浮于5 ml的RPMI 1640培养液(或8 ml Hank's液)6中,血细胞计数板计数细胞,并将细胞浓度调整为5×10/ml。(二)空斑的测定(1)试验用玻片的预处理:在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5%),干后可长期保存备用。(2)分装表层培养基:将表层培养基在水浴中加热溶解,与等量2倍浓度的Hank's液混合,分装在小管中,每管0.5 ml,放45~50℃水浴中保温。(3)涂片:向管中加入10%(v/v)的绵羊红细胞50μl,脾细胞6悬液20μl(5×10/ml)或25μl脾细胞悬液,充分混匀(避免气泡产生),迅速倾倒在事先用琼脂糖涂膜的玻片上,每个样本做2张片子。(4)孵育:待琼脂凝固后,将玻片扣放在片架上,将装有玻片的架子小心放入片盒内,在37℃生化培养箱孵育1~1.5 h。(5)加补体:取经处理的补体,加SA缓冲液按照1:10稀释。将稀释后的补体加入到玻片架凹槽内,继续孵育1~1.5 h。(6)计数空斑数:孵育结束后,计数每张玻片上肉眼可见的溶血空斑数。五、结果的评价标准

受试物组的空斑数显著高于对照组的空斑数,可判定该项试验结果阳性。六、结果分析及统计学处理6

结果以PFC数/10脾细胞或PFC数/全脾细胞。受试物各剂量组与阴性对照组进行比较。

A:计数的PFC数量,每个样本平行2张玻片V:加样体积数(ml)

C:脾细胞悬液浓度(以个/ml)

A:计数的PFC数量,每个样本平行2张玻片1

V :定溶体积数(ml)2

V :加样体积数(ml)

一般采用方差分析,但需要按方差分析的程序先进方差齐性检0.05验,方差齐,计算F值,F<F ,结论:各组均数间差异无显著0.05性;F≥F ,P≤0.05,用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。七、操作要点及注意事项(1)稀释绵羊红细胞的SA缓冲液应在45℃水浴中预热;向保温的琼脂中加入脾细胞后要充分混匀;倾倒玻片时,动作要迅速,以免发声凝集,给观察结果带来困难。(2)补体的量以用SA缓冲液稀释1:10,无需事先经过滴定。不可将补体反复冻融,应确保补体活性。(3)脾细胞悬液的定溶体积和加入体积可适当调整,应根据SRBC及补体的情况而定。可事先进行预试,选择合适的定溶体积和加入体积,以免生成的空斑数量过多造成计数困难。如果以PFC6数/10脾细胞表示试验结果,则应在制备好脾细胞悬液后进行细胞计数,将细胞数量调整到适宜浓度。(4)结果判读时注意区别假空斑,如气泡、组织残片所形成的空斑容易辨认,实在有困难可借助解剖显微镜。(5)玻片处理应保证绝对无油,这是挂膜的关键。玻片先用去污剂洗净,然后将玻片放入新配制的洗液中浸泡一夜,取出玻片洗净后放在干净的片盒内保存。(起草:北京市药品检验所金鑫,胡宇驰)(修改复核:北京市疾病预防控制中心马玲)血清溶血素的测定(血凝法)一、原理及目的

用SRBC免疫小鼠后,淋巴细胞可产生抗SRBC抗体(溶血素)并释放到外周血。利用体外血清对其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。二、试验材料(一)仪器、器具和物品

37℃培养箱、56℃恒温水箱、低速离心机、实体显微镜、4℃冰箱、微量血凝实验板(8×12孔)5块、三角瓶、玻璃珠、10 ml刻度离心管、1 ml塑料离心管×43支、100μl移液器及吸头、100μl八道移液器、5 ml连续加样器、1 ml注射器、1 ml毛细吸管、眼科手术刀或毛细玻璃管、手术器械。(二)试剂及制备

SRBC:绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动5 min,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。

免疫浓度:2%(v/v)SRBC液,以生理盐水配制。

试验浓度:0.5%(v/v)SRBC液,以生理盐水配制。

0.9%生理盐水500 ml。三、观察指标

根据血清凝集程度测定动物的抗体水平。四、操作程序(一)配制2%SRBC免疫动物

正式测定前5 d,取脱纤维的羊血1~2 ml于10 ml刻度离心管中,用生理盐水洗涤3次,每次用1 ml毛细吸管充分混悬,离心机2 000 r/min×10。用生理盐水配成2%(v/v)SRBC悬液10 ml,每只小鼠腹腔注射0.2 ml进行免疫。(二)取血

5 d后,小鼠眼眶静脉丛取血0.3 ml于0.5 ml塑料离心管中,放置1 h,用针头将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,离心机2 000 r/min×10。分别取每只小鼠血清100μl,置微量血凝实验板第1个孔内,加盖在56℃水浴灭活30 min。(三)配制0.5%SRBC

取脱纤维的羊血1~2 ml于10 ml刻度离心管中,用生理盐水洗涤

试读结束[说明:试读内容隐藏了图片]

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