作者：曹晖,邵鹏柱,毕培曦
出版社：人民卫生出版社
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中药分子鉴定技术与应用试读：
前言
为了建立中医药应用的健康体系，有必要加强对中药材原料和产品的品质监控。为此，我国在这方面一直不遗余力，而许多其他国家亦已开展实施对中药（尤其是进口中药）的品质标准规范管理。由于大多数中药来源自动植物，因此DNA分子鉴定方法顺理成章成为继四大经典鉴别方法（基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别）之后的第五大国家药典法定方法，2015年版《中国药典》已正式收载了乌梢蛇、蕲蛇和川贝母的DNA分子鉴别方法。相对于表型标记如形态、解剖组织、化学成分等鉴定方法，DNA分子鉴定技术具有更加准确、可靠的特点。由于基因组中DNA序列的排列多样性，细胞核、叶绿体以及线粒体DNA多态性和序列、条形码常常能够提供一个物种丰富的分子鉴定信息。
鉴于近年中药DNA分子鉴定研究的快速发展，这次组织《中药分子鉴定技术与应用》编写，是暨南大学中药与天然药物研究所、香港中文大学中医中药研究所与国家中药现代化工程技术研究中心三方“联合实验室”成立10周年之际，作为中药标准化合作项目的一个组成部分，由曹晖教授和邵鹏柱教授及毕培曦教授领衔编著，并且汇聚了在该领域顶级专家们的开拓性研究成果。另一方面，随着2010年版《中国药典》开始的DNA鉴别方法的法定实施，今后中药DNA分子鉴定技术在中药真伪鉴别中的实际应用将更加明确。故此，本书在编排上有必要为兼顾《中国药典》的未来发展而收载更多成熟的中药DNA分子鉴别技术和科学资料，并将书中章节划分为总论和各论上下两篇。
上篇总论部分共四章，第一章“中药分子鉴定概况”，着重介绍中药分子鉴定的技术发展和现状。第二章“中药分子鉴定常用技术”，简要介绍DNA提取关键技术，重点阐述实验步骤、问题解决方案及其应用范围，以及分子鉴定的常规方法和技术原理，如各种基于聚合酶链反应（PCR）技术开发的不需要预先了解生物个体DNA序列信息的背景资料的“DNA指纹鉴定技术”，包括RAPD、AP-PCR、DALP、RFLP、DAMD等；通过特异引物的“DNA测序和条形码鉴定技术”，包括线粒体基因组cyt b、12S rRNA、CO I，核基因组18S rRNA、ITS、5S rRNA间隔区，叶绿体基因组mat K、trn K、rbc L、trn H-psb A等；以及“分子组合鉴定技术”，包括PCR-RFLP、SCAR、AFLP、ARMS、DNA芯片等。第三章“中药分子鉴定生物信息学与技术专利知识”，着重介绍常用的数据库、在线分析工具和各类分析软件，讨论如何以生物信息学去选择与中药分子鉴定有关的合适的数据库及各类分析软件，简略介绍中美两国对中药分子鉴定技术专利申请与授权概况。第四章“中药分子鉴定展望”，重点评价各种DNA分子技术在中药鉴定领域的优势和局限性，并探讨分子鉴定新技术的发展趋势和应用前景。下篇各论部分，主要按照中药自然属性及药用部位分六章介绍110余种常用中药分子鉴定应用实例。附录部分，包括主要论文题录（截止于2015年底）、索引（中文名、拉丁名称等）
中药分子鉴定的研究依赖于先进的实验方法，而最好的方法又来源于反复的修改与验证。本书的一个特点和优势是书中介绍的诸多技术实验方法与结果均经具有实践经验的中外学者反复验证，因此结论比较可靠且重复性好。其中一些方法更是由作者及其实验室所创造或改进的，尤为本书添色不少。此外，需要指出的是，本书所有图、表除作者自己研究之外，部分引用他人研究成果出于时效的考虑并未向原作者取得图谱使用许可，但均列出参考文献。对于引用或翻译后整理的内容存在差错，请与作者联系。同时非常欢迎同行专家和读者对本书提出宝贵意见，以便于作者修订。
编写本书时，我们务求文句通俗易懂，内容适合一般读者的需要，主要对象是国内外从事中药分子鉴定研究和在校学习的大学生和研究生，以及应用中药DNA分子鉴定技术的执法及科研人员。然而，由于各位作者背景的差异，所述实验方案可能有特定用途，故此各论中药所述方法难免可能与其他方法重复，但是作者在每味中药后都列出了原始参考文献，相信不会影响每个独立方法的有效性。同时我们希望本书所介绍的DNA分子技术能够在中药鉴定应用中具有推广价值，并能够促进这一充满前景领域的研究发展。
我们要特别感谢每位作者，为本书提供了他们在中药DNA分子鉴定方面的第一手宝贵资料。其次，感谢为本书出版付出热情劳动的国家中药现代化工程技术研究中心巩凡女士、沈玲女士、胡娟女士、黄文漳先生以及丽珠集团高郎女士、广东食品药品职业技术学院杨桂玲博士。曹 晖（kovhuicao@aliyun.com）邵鹏柱（pcshaw@cuhk.edu.hk）毕培曦（paulbut@hotmail.com)2012年8月上篇 总论第一章 中药分子鉴定概况第一节 引言
中国医学源远流长，是人类文明的一个重要组成部分。由于中药作用的多靶点特征，中医药被认为特别适宜治疗慢性病等现代疾病，从中药里开发的各种保健食品正是顺应了人类“回归自然”的历史潮流。经数千年来的尝试及实践，具有药用价值的动植物和矿物已超过10 000种；2015年版《中国药典》就收载了约700个药用的动植物品种。正因为所采用的药材繁多，常有中药的偶然混淆使用或故意掺伪、制伪，以致常常干扰中医的治疗效果，甚至导致危及性命的中药中毒事故。1991年，比利时出现因广防己Aristolochia fangchi被误用作汉防己Stephania tetradra，而导致80多宗肾脏中毒事故；在国际社会掀起巨大风波的“中药马兜铃酸事件”，并出现了“中草药肾脏病变（Chinese Herb Nephropathy）”这个医学名词；2004年，香港发生混淆白英Solanum lyratum和含马兜铃酸药材寻骨风Aristolochia mollissima，导致一名港人患上肾纤维病变（Lo等，2005）；还有误将桃儿七（在香港称为鬼臼）当作龙胆草配售，导致神经系统受损，引发香港政府成立中医药工作小组，最终立法管制中医药（Ng等，1991）。凡此种种，均使人们对中医药的安全性和品质控制起了戒心，阻碍其现代化的进程。由此说明可靠的药材基原，无可置疑是发展中医药的最根本要求。第二节 传统鉴定方法
中药误用导致中毒的一个重要原因是中药品质检测系统的缺失。而传统的中药鉴定方法主要依靠外观性状特征，形态鉴定主要是形、色、气、味、质地等性状检测，该方法简便、直接，缺点是主观性强，其准确性完全取决于检测者的经验判断。近现代则从生物分类学（基原鉴定）、组织学（显微鉴定）、化学（理化鉴定）角度建立了比较客观的中药鉴定标准。同时，随着科学技术的发展，细胞学（染色体分析）、酶学（同工酶分析）、生物化学（蛋白质分析及效价评价）、血清学（免疫测定）、药理学（活性测定）等生物检测技术亦逐渐应用到中药鉴定中。一、组织学方法
显微鉴定常用于检测中药及其制成品的细胞或组织特征。由于组织特征的相似性问题，解剖学分析不能圆满提供解决相近种药材鉴定的手段，同时组织结构易受地理环境、生长期、储存条件等诸多因素的影响，从而影响鉴定的准确性。二、化学方法
中药的化学成分常常可以用来作为很好的鉴定指标，薄层色谱（TLC）和高效液相色谱分析（HPLC）技术已经成为中药鉴定的常规方法。毛细管电泳技术（CE）被开发用于中药材基原鉴定和品质评价。为了提高分析的灵敏性，许多仪器分析技术如超高效液相色谱（UPLC）、气相色谱（GC）与质谱（MS）分析和它们的联用手段如FD-MS、Q-TOF/MS、LC-MS等也被用于中药鉴定。
不管情况如何，化学分析方法有其局限性。因为中药活性成分的含量受到其生理条件、采收时间、储藏等诸多因素影响。同时，对化学成分相似的近缘种，光凭成分的有无或含量高低亦难以区分。三、生物化学方法
采用凝胶电泳技术进行蛋白质谱带数目、宽窄、位置、以及染色程度分析，可获得很多信息，从而达到中药鉴别的目的。但是蛋白质电泳图谱类型主要是依靠肉眼直观比较，人为区分的，在一定的程度上影响了结果的准确性。
同工酶的变异非常丰富，结构的差异直接来源于基因的差异，并能够稳定于种内遗传。因此，用它可以鉴定许多从外部形态上难以鉴别的遗传变异。其次，由于同工酶分析系采用酶活性染色和电泳检测，非酶类成分不被显示，电泳图谱往往比蛋白质电泳图谱简洁、清晰。20世纪60年代开始，同工酶分析常被用于农作物和动物的居群遗传变异、地理变异类型、物理遗传连锁作图和基因分型鉴别等。由于DNA链上平均只有30%碱基变异可以改变氨基酸电荷结构而产生差异，进而影响酶的电泳迁移率，这意味着同工酶多态性存在一定的局限性，这是为什么有些在形态上变异大的品种，其同工酶是单态性的。此外，其还有一个缺点，即为防止酶失活，条件比蛋白质分析要求高。取样与染色体分析一样，必须是新陈代谢活跃的部位，这也限制了同工酶分析在干燥药材鉴别上的应用。
中药有许多具有抗原决定簇结构的大分子如蛋白质等，用它们制成特异性抗体（抗血清）进行中药定性定量分析是一种高度选择性的血清学鉴定方法，使得血清学特征在中药复方制剂（成药）中特定的药材（如动物药）鉴定上具有极大的开发利用价值。而且，一个氨基酸链上的单个变异可以改变与野生型抗体的亲和力，所以抗体还可以用来鉴别种特异性（species-specific）和多态性蛋白质以及同工酶等。其缺点是免疫测定实验周期长，所需动物量大等。第三节 分子鉴定方法
脱氧核糖核酸（d eoxyribonucleic acid，DNA）是生物的设计蓝图，依据此建构细胞内的分子，例如各类核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白质（protein）等。DNA是一种聚合物，基本单位是核苷酸（nucleotide）。核苷酸由糖类、磷酸分子以及碱基组成。DNA有4种碱基，分别是腺嘌呤（adenine，A）、胞嘧啶（cytosine，C）、鸟嘌呤（guanine，G）与胸腺嘧啶（thymine，T）。每个核苷酸只含1个碱基，所以负责建构DNA分子的共有4种核苷酸。每种核苷酸依特定位置重复排列，其中的糖类分子与核苷酸的磷酸分子以化学键相连，组成长链骨架，而在这长链骨架分子里的核苷酸排列次序便是基因序列（sequence）。在细胞内，DNA大部分时间都是由两条互相配对的长链紧合，形成双螺旋结构，其中A配对T，而C配对G。
理论上，每一个生物个体的DNA序列都是独一无二的。分子鉴定技术是通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排列规律及其外在性状表现规律的技术。这些基因排列变化可大致归纳为①序列突变；②插入突变；③缺失突变；④重复单元数目突变；以及⑤单核苷酸突变。各类DNA鉴定技术就是针对这些基因排列差异而设计，并分析解读生物基因组数据，从而辨别或区分不同物种或个体。
由于DNA分子的信息量大，且不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，即每一个体的任一细胞都含有相同的遗传信息，这就使其在生物鉴定方面具备了准确性高、重现性好等特点。同时，DNA分子鉴定直接分析的是生物的基因型而非表现型，鉴别结果不受环境因素、样品形态（无论原品、粉状或片状）和材料来源的影响，因此，可为中药鉴定提供更加准确可靠的手段。分子鉴定技术的兴起和逐步成熟，使得中药材以形、色、味、质地为依据的传统质量评价方法和以形态组织学、解剖学、化学等客观指标为依托的现代质量评价方法得到了有益的补充，解决了上述方法所不能解决的问题，并呈现了长足发展的潜力和更广泛应用于中药材鉴别的趋势。
分子技术的发展使得分子鉴定成为动植物鉴定的一个大众化手段，因此也成为继四大经典鉴定方法（基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定）之后的第五大国家法定方法（2015年版《中国药典》）。
根据原理及所使用的核心技术，分子鉴定技术可分为三大类：①DNA指纹图谱技术；②DNA测序技术；及③基于PCR的高通量核酸杂交技术。本章简要概述分子鉴定技术及其分析方法在中药鉴定方面的研究现状与进展，而各种技术的原理，详见第二章。
近20年来，国内外学者在中药分子鉴定研究取得了许多新的进展。目前国内外应用分子鉴定技术对人参、石斛等植物类以及蛇类等动物类200余种中药材进行了鉴定研究，具体应用的代表性实例参见下篇各论。一、基于PCR的DNA指纹图谱技术
指纹（fingerprinting）是鉴证专业中的重要证据，理论上每一个人（或个体）的指纹都独一无二，通过比较嫌疑人和案件现场所搜集的指纹，便可确认是否由嫌疑人所留下。这个概念可延伸到鉴定生物品种范畴上。DNA指纹图谱是一个可反映基因组DNA特征的技术。物种在进化过程中，因环境或其他因素导致基因突变，会令物种间或个体间的DNA出现差异。通过DNA指纹图谱技术将基因组特征图像化，便可获得生物DNA的“指纹”。比较各物种的特异图谱，可了解它们的相似性或差异，从而作出鉴定。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是20世纪80年代中期发明的一种无细胞的基因扩增技术。该技术的问世为现代生命科学研究开创了一个新时代。PCR借着DNA重复变性（denaturing）、复性（annealing）、延伸（extension）约20～ 40次，能在2小时内将少量的靶DNA扩增数百万倍，从而方便检核；更理想的是相关的操作具有简单、快速、特异、灵敏的特点。自此，指纹图谱技术不再受中药材DNA数量不足所限，科研人员利用PCR，接连发明了各种DNA指纹技术。较之经典的限制性片段长度多态性（RFLP）技术，这些技术有以下优点：①无须使用同位素，不受同位素半衰期的限制，并减少实验室污染；②不需大量DNA；③较少受模板DNA质量影响。
基于PCR的指纹图谱受引物（primer）和DNA模板（DNA template）之间的互补程度所影响。如果引物和模板完全互补，那么退火时两者会紧密结合，从引物起开始延伸，得出扩增的指纹谱带。部分指纹图谱技术的扩增条件严格，引物和模板如果出现错配（mismatch），则可能会导致两者无法互补结合，谱带区域没被扩增，依这种思路设计的指纹图谱技术，主要是区分不同物种之间的序列差异，例如等位基因上的碱基突变。相反，某些指纹图谱技术故意将扩增条件降低，容许出现少许错配的引物跟模板结合，所以引物可以跟基因组上多个位置互补，从而反映整个基因组的特征。
1990年William等第一次证明用任意顺序的10个碱基的寡核苷酸作单引物，以未知序列的基因组DNA为模板，通过PCR扩增可获得一组不连续的DNA片段。这种以随机引物作扩增的技术称为随机扩增的多态性DNA标记（rapid amplified polymorphic DNA，RAPD）。几乎同时Welsh和McClelland用20～ 30个碱基的任意引物，成功获得DNA指纹图谱，并命名为任意引物聚合链式反应（arbitrarily primed-PCR，AP-PCR）。1994年Zietkiewicz等针对广泛存在于真核细胞内的简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），设计出简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）。1995年Vos等人发明了一种集PCR和RFLP优点于一身的扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。2001年Li和Quiros H发展了一种新型的相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP），该标记通过独特的引物设计对开放阅读框（open reading frames，ORFs）进行扩增。
DNA指纹技术具有操作简易、灵敏度高的优点，可为中药鉴定提供更加准确可靠的手段，尤其是它可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性，在目前绝大多数动、植物中药材DNA序列尚不清楚的情况下，在中药品种鉴定研究方面具有广阔的应用前景。
自我们研究小组在1994年初首次报告采用AP-PCR方法进行人参和西洋参基原鉴定以来，采用DNA指纹技术进行鉴定研究的有动物蛇类药材如乌梢蛇和金钱白花蛇、龟甲和鳖甲、海马，植物类如三七、甘草、黄芪、黄芩、枸杞、淫羊藿、贝母、石斛、黄连、苍术、山药、厚朴、金银花、西红花、金线莲等。
指纹图谱的另一长处是确认药材的来源地，即药材道地性分析。运用AP-PCR和RAPD指纹技术对中药居群、种质资源等道地性判别研究的有麻黄、厚朴、牛蒡子、苍术、泽泻、白芍、鱼腥草、党参、柴胡、麦冬、地黄、佛手、枸杞子等。二、DNA测序技术和条形码技术
与指纹图谱将种物间的DNA序列差异以图像方式间接地呈现到图谱不同，DNA测序（DNA sequencing）是将基因片段上每一个碱基序列直接展示。
生物中某些DNA区域的序列在品种之间差异大，但在相同品种的不同个体则表现保守，包括动物和昆虫的线粒体基因组、植物和菌类中核糖体的DNA内转录间隔区序列（internal transcribed spacer，ITS）以及植物叶绿体基因组。这些物种间的序列差异，比如生物的外型、化学等特征，可用作物种分类之用。为方便检索、比较及发表各项DNA序列数据，国际上建立了多个序列数据库，收录大量数据，具体参见第三章。
利用DNA测序获得的排序结果所建构的物种亲缘关系可以用于不知名物种的鉴定。方法是对样本及已鉴定标本进行测序，然后用计算机程序绘画出分子系统树，不知名样本会跟进化差异最小的物种组成一个散群（cluster），由此判断样本的真正身份。1992年在这个逻辑上发展了一套“法证信息核苷酸测序法”（Forensically informative nucleotide sequencing，FINS）（Bartlett等，1992）。1994年进行了FINS技术优化，主要在分析序列的算法方面大量改进。由于建构分子系统树的程序往往耗用计算机大量资源，以当时的运算能力，要花很长时间才能完成。新优化方案则采用较简单的算法，只分析序列间相似程度，大大缩短分析时间（Forrest和Carnegie，1994）。
早在1995年我们小组已对6种人参属Panax植物的ITS1和ITS2区进行了序列分析，结果显示凭其序列可将它们区分鉴别（Shaw和But，1995）。到目前我们小组利用cyt-b序列可将6种蛇类药材区分开，并成功将不知名蛇肉干样本鉴定，确认当中混杂蟒蛇Python molurus及网纹蟒P.reticulatus（Wong等，2004）。使用5S rRNA鉴定于香港市场收集的红党参饮片，证实是素花党参Codonopsis pilosula var.modesta混入赤石脂（Zhang等，2007）。结合ITS和5S rRNA间隔区序列将木香Saussurea lappa（Aucklandia lappa）和其他混淆品区别开来（Chen等，2008）。以5S rRNA间隔区序列鉴定22种淫羊藿属Epimedium、獐牙菜属Swertia植物基原（Sun等，2005；Yu等，2008）。凭ITS序列差异点，成功鉴定正品白花蛇舌草Hedyotis diffusa和其他伪品。用trn L-F和trn H-psb A序列区分含马兜铃酸的马兜铃属Aristolochia植物（Li等，2010a，2010b）。对19个乌头属Aconitum植物进行trn H-psb A测序，发现可分成10组，并成功区分正品川乌A.carm ichaelii与草乌A.kusnezoffii以及其他品种（He等，2010）。应用FINS技术鉴定中药具体例子详见文献（Li等，2011b）。
2003年一个国际组织“生命条形码联盟”Consortium for the Barcode of Life（CBOL）发表声明，认为线粒体的细胞色素C氧化酶亚单位1（cytochrome c oxidase subunit 1 mitochondrial region，COⅠ）是鉴定动物和昆虫的标准序列，此生物品种鉴定方法即为DNA条形码技术（DNA barcoding）。2008年该组织又确立了叶绿体的rbc L及mat K两组基因为植物的DNA条形码（CBOL Plant Working Group，2009）。
现在，DNA测序和基因条形码鉴定已变成一种常规技术。采用DNA测序和条形码技术进行鉴定研究的还有动物类药材如鸡内金、海马、哈蟆油、鹿茸、龟甲、鳖甲、紫河车、塞隆骨，植物类如人参、竹节参、西洋参、珠子参、假人参、当归、北沙参、柴胡、山药、三七、半夏、莪术、甘草、黄芪、肉苁蓉、黄芩、枸杞、淫羊藿、贝母、砂仁、石斛、大黄、黄连、苍术、山药、厚朴、金银花、西红花、肉桂、金线莲、太子参以及广东地方特色凉茶原料等（陈士林等，2007，2011，2012；赖小平等，2010；Li等，2011a，2012）。其中，根据动物线粒体cyt-b、12S rRNA基因DNA测序结果，分别设计一对特异性引物进行乌梢蛇Zoacys dhumnades和蕲蛇Agkisrrodon acutus的分子鉴别正式收入2010版《中国药典》一部。
如果DNA测序分析结合有关化学型分析数据，还可以为物种鉴定和道地性评价提供分子依据。三、基于PCR的高通量核酸杂交技术
生物芯片（如DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）是一种高通量的检测平台，在小小一块生物芯片上，同时进行海量的核酸杂交实验，观察基因数据。由于中药材的生物来源极广，此技术正好为高通量鉴定开辟一条新出路。
目前采用DNA芯片技术成功鉴定研究的仅有18S rRNA基因序列特异性探针对半夏Pinellia ternata及其伪品虎掌（掌叶半夏）P.pedatisecta、人参属植物与生药（Liu等，2001；Zhu等，2008），5S rRNA间隔区和26S rRNA基因D2、D3区特异性探针对贝母属Fritillaria（李邵平等，2000；Thoi等，2003），5S rRNA间隔区和ITS2特异性探针对石斛属Dendrobium（Zhang等，2003；Sze等，2008）等几例成功鉴定报道，表明DNA芯片技术可为植物种属鉴定提供快速、高通量的工具。【参考文献】
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分子鉴定技术成为一项常规手段，是近代分子生物学的重要发现。1984年，美国学者Mullis发明了一项划时代的新技术“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。在PCR反应中，DNA模板通过不断重复变性、复性、延伸3个程序，能够在2小时内将靶DNA扩增数百万倍。自此，以PCR为基础的各项技术，不再受样本模板量不足所限制，各国科学研究小组在此基础上相继发明了多种可靠实用的分子新技术。其中，我们小组于1994年率先发表利用基于AP-PCR方法的DNA指纹图谱技术成功鉴定商品人参和西洋参的基原（Cheung等，1994）。随着PCR技术成为国内外分析DNA的主要手段，2010年版《中国药典》首次记载蛇类药材（乌梢蛇和蕲蛇）的分子鉴别，将DNA技术的工作流程和实验条件纳入为一种国家法定标准。可以预见，分子鉴别中药材将有广阔的应用前景。
本章首先就分子鉴定技术的前处理关键技术“DNA提取”作简单介绍，其次着重介绍常用的分子技术，并就它们各自的优缺点、应用范围限制进行比较分析。第二节 DNA提取技术
基因组DNA的有效提取是进行任何DNA下游工作的前提和基础，有效提取指的是从生物组织中得到足够量的基因组DNA（或称总DNA），而且尽可能避免降解和含有影响下一步酶反应的杂质。中药按来源可分为植物类、动物类和真菌类，利用动物新鲜的或迅速冷冻储藏的血液和组织液中提取DNA是最早建立的DNA提取方法，任何核酸实验手册中均可查到；真菌的DNA提取可参考植物的方法，因为有些真菌材料含有较多的多糖；植物材料区别于动物材料的特殊性在于：①植物有细胞壁，所以在添加DNA提取液前，要有一个细胞壁破碎过程，一般用液氮冷冻粉碎，或加石英砂共研；②植物中含有纤维素、半纤维素、果胶等多糖类化合物，它们容易与DNA共沉淀，CTAB法即是针对植物中大多含有多糖而建立的DNA提取方法；③植物中含有大量的次生代谢产物，其中严重影响DNA质量的有酚类及鞣质，还有一般方法去除不掉的多糖类化合物。中药分子鉴定所涉及的研究对象可能是新鲜材料或专为DNA研究处理过的材料，如用硅胶快速干燥的植物材料；也可能是商品药材，或经一定加工炮制过的饮片，如炮制品或粉末等。商品药材或中药饮片对于DNA提取来说主要挑战是：①材料的干燥过程缓慢，储存时间长，或还有其他加工过程，其中的DNA降解十分严重，DNA含量低，且大多已成碎片，当然随着储存时间的增加，可提取出的DNA会变少；②材料中次生代谢产物含量高；③由微生物引起的外源DNA污染严重；④有些材料比较坚硬。
在此主要介绍DNA的常规提取方法、预处理方法、次生代谢产物及其去除方法。一、DNA的常规提取方法1.CTAB法（Doyle和Doyle，1987）
CTAB法是目前最常用的DNA提取方法。CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）是一种去污剂，它可与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7M NaCl）中可溶解并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3M NaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低，而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖类杂质仍溶于溶液中。
主要步骤包括：
①新鲜组织或干燥组织，先置液氮中速冻，再迅速研磨使成糊状或粉状；②将糊状或粉状物转入离心管后，加入预热的CTAB缓冲液，放入56℃水浴保温，不时缓慢振摇；③取出离心管，使恢复至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液，离心使分层；④重复第3步骤；⑤向离心管中加入1/10体积的10% CTAB溶液，再用氯仿/异戊醇再抽提一次；⑥向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置，离心去上清部分；⑦加TE缓冲液，混匀后加2/3体积冰冷的异丙醇，-20℃放置，离心收集沉淀，在室温下自然风干；⑧将此沉淀溶于合适体积的TE缓冲液，加入1/5体积的3M NaAc（pH 6.0）和2倍体积的冰冷乙醇，在-20℃放置，离心收集沉淀；⑨加入乙醇洗沉淀，离心去除残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无醇味，溶于适量的TE缓冲液；⑩标定DNA含量，然后放入-20℃储存或放入4℃待用。2.高盐低pH法（Guillemaut和Weil，1992）
高盐低pH法省去了一般用SDS（sodium dodecyl sulfate）去污剂提取时使用的水饱和酚抽提的繁琐步骤，除了可以去除多酚杂质外，在提取干药材DNA质量也较CTAB法为好。SDS是DNA提取最常用的去污剂，高盐低pH法的特点是使用pH 5.5的酸性介质，避免了多酚类物质的电离化和以后的进一步氧化，另外高浓度的KAc（potassium acetate）和低温处理可沉淀去除蛋白质和多糖，高盐低pH法去除多酚的效果较好，适用于多糖含量不高或其含量未超过一定限度而对进一步研究无影响的材料。
主要步骤包括：
①在新鲜叶片或干燥的叶片中加入少许65℃预热的提取缓冲液及石英砂迅速研磨后，用提取缓冲液将上述糊状物加入离心管；②放入65℃水浴保温，不时缓慢振摇；③在室温下离心，必要时上清液通过4层纱布过滤以去除固体杂质；④在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃，沉淀蛋白质；⑤在4℃下离心，弃蛋白沉淀；⑥上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）抽提，离心使分层，取出水相转入另一离心管；⑦如果中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿/异戊醇（24∶1）抽提一次；⑧在上清液中加入2/3体积的冰冷的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀核酸，沉淀溶于无菌水中，离心弃不溶物；⑨重复第8步骤，收集DNA，用70%乙醇洗沉淀，在空气中干燥；⑩将DNA沉淀溶解在合适体积的TE缓冲液中，测定DNA含量后，分装存放于-20℃或4℃冰箱中待用。3.硬质材料处理法（尿素法）（Grant等，1998）
对于根或根状茎等较硬的材料，在抽提液中加高浓度的尿素，在操作步骤中使用两步沉淀法使多糖和次生产物分步沉淀，而DNA留在上清液中，保证了DNA提取的数量和质量，效果很好。
主要步骤包括：
①洁净的干材料用刀削成小块，在研钵中加液氮研碎；②将材料粉末转移至离心管中，加抽提缓冲液，缓慢翻转混匀；③加SDS粉末至终浓度为1%（w/v），室温放置，不时混合；④添加PVP溶液至终浓度为6%，再加1/2体积的醋酸铵溶液，冰浴中放置；⑤离心2次；⑥上清液加等倍量的异丙醇混合，室温放置，离心；⑦沉淀用乙醇清洗，晾至无醇味，用TE缓冲液溶解。4.大数量样本的快速提取方法
目前中药分子鉴定用的主要是与PCR技术有关的DNA标记，即提取得到的DNA首先进行PCR反应，如果样本数量很多，快速的DNA提取方法显得很必要。目前文献记录的快速提取方法都是使用特殊的细胞裂解（提取）液，直接取裂解上清液进行PCR反应，当然这种方法仅限于幼嫩的材料。
方案Ⅰ主要步骤包括：
①取生长幼苗，放入96孔联板中，加蒸馏水，每孔中加入一枚微型转子（8mm×3mm）；②将联板置于-80℃冰箱中迅速取出放在特制搅拌器架上，开启电源，使孔内转子旋转，材料被充分打碎；③每孔中加提取缓冲液，搅拌；④吸出混合物到第二块板的孔中，再加缓冲液中和。
方案Ⅱ主要步骤包括：
①从叶片上取叶片材料，放在平底96孔联板中；②在每个孔中放玻璃珠和提取缓冲液，用96孔平板盖盖好；③使用与Eppendorf管适配的热混合器，65℃保温，不时振摇；④离心片刻。
方案Ⅲ主要步骤包括：
①取叶片，剪碎成小块。②将叶片碎块放在PCR薄壁管中，加MicroLYSIS去污混合液，用无菌小棒混匀。③将管子放在PCR仪上，按下列程序循环2次：65℃，5min；96℃，2min；65℃，4min和96℃，1min；65℃，1min；96℃，30s，存于-20℃。取上清液即可进行PCR反应。5.微量材料的提取方法
如果制备DNA的材料来之不易，直接在离心管内操作，不用液氮粉碎，可减少不必要的损失，在加有材料（干材料30～ 50mg，鲜材料100～ 200mg）的管中加少许石英砂，用特制加工的玻璃研锤（大小与离心管底适配，一端用金刚砂磨成毛面）研碎，之后依照上述一般提取步骤提取DNA。6.试剂盒提取与纯化方法
使用专门用于DNA提取的试剂盒，可令制备DNA变得简单、方便，既节省时间又保证质量，其中专用于制备植物DNA的试剂盒有德国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit（Cao等，1998；王艳等，2000），美国Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Nucleon Phytopure系列等，后者可以有效地去除植物和真菌的多糖。对已提得的DNA溶液，若采用试剂盒纯化，可选用QIAGEN公司的QIAGEN Genomic tip 500/G，或QIAquick PCR Purification Kit。使用试剂盒纯化实验步骤，一般按照有关公司说明书进行。二、实验材料的预处理方法
幼嫩的叶子和幼苗是DNA提取的最佳材料，因为植物代谢最旺盛时期的组织中核酸含量很高，其他杂质则含量少。由于缓慢死亡的组织中的DNA会被植物细胞自身释放的DNA酶所降解，而暴露在空气中的DNA也会被空气氧化而分解。新鲜的材料采好后迅速密封，尽快放在避光的冷环境中（如冰壶、冰袋），或立即放入-75℃超低温冰箱中保存。在不具备低温保持材料新鲜的情况下，如野外采样，可以用硅胶快速干燥方法，使用叶片10倍量的变色硅胶与叶片共同放入密封袋中，硅胶要保证干燥，如果发现硅胶已从深蓝色变为粉红色，要及时更换，回到实验室后要将干燥好的材料放在干燥器或超低温冰箱中（密封以防吸潮）。1.洁净
目的是去除任何可能的外源DNA污染，如细菌、真菌等。幼嫩的叶子和幼苗一般比较干净。如果是根、茎、果类材料，用蒸馏水清洗后，要用刀认真刮取干净部分，花、叶、种子等或小饮片等小材料则尽可能切去菌斑、菌块，然后，用乙醇（浸泡1min，再用蒸馏水清洗3次，用干净的滤纸吸干水分，晾干）浸洗，或用紫外灯照射消毒，有些植物有与细菌或真菌共生现象，菌丝深入到组织内部，则外来DNA不可能去除干净。而有些材料，如冬虫夏草，本身就是多种生物的复合体，研究时应予以注意。2.粉碎
材料经液氮速冻后粉碎是通用方法。对于新鲜材料，液氮处理可抑制DNase的活性，防止DNA的降解，但对干材料，液氮速冻可使材料变脆易磨，加玻璃砂或砂子共研则更经济，效果也很好，如果没有液氮，对于新鲜材料也可与砂子共研，只要同时加入提取缓冲液（可抑制DNase的活性）即可。对于根或木质茎等坚硬的材料，可以先用刀削成小块，再加液氮研碎。3.特殊材料的处理（1）孢子和花粉：
由于孢粉表面有一层含有孢粉素可以抗拒各种化学物质侵蚀的结构，从孢粉中提取DNA需要特殊的措施。具体方法如下：加孢粉粒到离心管中，加1微玻璃珠（直径为1mm），再酌量加提取缓冲液，液体刚好没过玻璃珠，在Mini-Beadbeater仪器上振动，37℃保温，再进行其后的抽提和DNA沉淀。（2）种子：
种子一般含有较多的油脂，可以用脂溶性的溶剂先处理种子脱脂，再用脱脂后的粉末进行DNA提取。（3）腊叶标本和植物药材：
使用上述的CTAB法和高盐低pH法都可以，由于DNA大多降解成小碎片，建议提取过程中加长沉降时间，具体方法如下：CTAB提取后，氯仿/异戊醇抽提时，离心；加异丙醇沉淀DNA时，4℃离心，-20℃放置，再4℃离心，弃去上清。（4）动物药材：
关键是清洗和消毒，具体方法如下：取样品置Eppendorf管中，加浸泡液，56℃烤箱中浸泡；取出管子，置旋涡混合仪上振摇，弃浸泡液，加三蒸水振荡2次，弃水液；加75%乙醇，用消毒过的剪刀将样品剪成碎片置旋涡混合仪上振荡，离心，弃乙醇，加三蒸水振荡，弃水液。（5）乙醇浸制植物标本：
浸制植物标本常用不同浓度的乙醇，95%的乙醇对材料中DNA的保存效果较好，在DNA提取过程中，初始抽提液中加一定量的蛋白酶E或K，因为乙醇浸制的情况下，蛋白质与DNA结合，必须用蛋白酶将蛋白质降解掉，从而把DNA释放出来。（6）福尔马林浸制的动物标本：
处理的关键是去除残余的福尔马林，否则会抑制DNA提取过程中用于组织蛋白消解的蛋白酶的活性。具体方法如下：先去掉标本的表层，切成小块，用新鲜的GTE缓冲液在摇床上振荡清洗。三、次生代谢产物的去除方法1.多糖类物质的去除
如果材料中有含有较多的多糖类成分，其提取液常比较黏稠，多糖会与DNA共沉淀而使沉淀物呈胶冻状。少量的多糖一般不影响DNA的限制性酶解或PCR扩增，但如果多糖过多无法进行下一步研究时，则要考虑在提取DNA过程中去除多糖。
主要步骤包括：
①清洗：材料粉碎之后，先不加细胞膜裂解液，因为DNA尚未溶出，用一些含Sorbital、PEG缓冲液清洗，可除去一些多糖；②沉淀：在从提取液沉淀DNA之前，先加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀；③多糖和DNA共沉淀物再分离：由于DNA的水溶解性大于多糖，用TE缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用醇沉淀DNA；或将沉淀物溶解后，经过琼脂糖电泳，切下DNA部分，再将胶回收；④使用可降解多糖或可与多糖反应的物质：采用多种果胶酶如Caylase M3、Sigma P2401、Sigma P4716、Worthington LS004297等可以分解多糖为寡糖或单糖。使用时将多糖与DNA的共沉淀物用含果胶酶的缓冲液消解，需要注意的是果胶酶中一般含有微
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