作者：丁军颖、崔澂 主编
出版社：化学工业出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
医学免疫学检测技术及临床应用试读：
前言
免疫学检测技术是现代医学检测技术的核心组成部分。因其较强的理论性而被广泛用于医学基础科研工作，同时也是临床疾病诊断惯用的检测手段。近年医学信息学的蓬勃发展，又赋予了免疫学检测技术新的发展空间。所以，有必要系统学习并熟练掌握免疫学检测技术。
本书系统介绍了免疫学检测技术的原理和方法，并结合相关疾病阐述了其临床应用。第一篇从抗原抗体反应原理入手，先就传统蛋白和基因等层面的免疫学检测技术进行相关阐述，而后结合现代生物信息学技术进一步叙述免疫学交叉学科技术的发展。第二篇则着眼于不同疾病，包括自身免疫病、免疫缺陷病、免疫增殖病、感染及传染性疾病、血液病、遗传病、肿瘤生殖免疫学和超敏反应的免疫学等，详述其相关的免疫学临床诊治技术。
在本书完成过程中，得到了首都医科大学附属北京中医医院刘清泉教授的悉心指导和全力支持，得到了河北医科大学张征峥和邓玉青老师的热情帮助，在此一并表示感谢。
本书适用于医学院校临床医学、卫生检验和医学检验专业的学生、老师及科研工作者作为教材使用；同时也可供医院检验科和病理科等相关人员参考。
由于作者水平有限，如有不足之处，敬请读者批评指正。编者2018年12月第一篇 医学免疫学检测技术
第一章 抗原抗体反应及免疫分子检测技术第一节 凝集反应一、直接凝集反应
在适当电解质参与下，细菌、红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象，称为直接凝集反应（direct agglutination reactions），包括玻片凝集试验和试管凝集试验两种。（一）玻片凝集试验1.原理
以已知抗体作为诊断血清，与菌液或红细胞悬液等待检颗粒抗原在玻片上进行直接反应。2.应用
玻片凝集试验为定性试验方法，方法特异、简便、快速，主要用于人类ABO血型鉴定，菌种鉴定和血清学分型。（二）试管凝集试验1.原理
将待检血清在试管中进行系列稀释，加入已知颗粒抗原温育后，观察每个试管内的凝集现象，通常以产生明显凝集现象的最高血清稀释度为该血清的抗体效价。2.应用
试管凝集试验为半定量试验方法，主要用已知抗原测定待检者血清中有无某种特异性抗体及其效价，以辅助诊断疾病或进行流行病学调查。例如：诊断伤寒和副伤寒的肥达试验、诊断布鲁菌病的瑞特试验、诊断立克次体病的外斐反应等。二、间接凝集反应
间接凝集反应（indirect agglutination reactions）是将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免疫无关的颗粒表面，在适宜电解质存在的条件下与相应抗体（或抗原）作用，出现特异性凝集现象。与免疫无关的颗粒称为载体，常用载体包括红细胞、聚苯乙烯胶乳颗粒、活性炭粉、明胶颗粒、细菌等。（一）胶乳凝集试验1.原理
胶乳凝集试验（latex agglutination test，LAT）的原理是使用抗原（或抗体）致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，直接与待测标本中的抗体（或抗原）作用，出现肉眼可见的白色凝集物。2.应用
具有简便、快速、特异等特点，是某些疾病诊断较为理想的初筛试验，可用于检测抗链球菌溶血素O抗体（ASO）、类风湿因子（RF）等。（二）明胶凝集试验1.原理
明胶凝集试验（gelatin agglutination test，GAT）的原理是使用粉红色明胶颗粒吸附抗原，再与待检血清作用，出现肉眼可见的粉红色凝集现象。2.应用
由于其灵敏度高、简便、快速，常用于抗HIV-1抗体和抗精子抗体检测等。（三）协同凝集试验1.原理
葡萄球菌蛋白A（SPA）具有与IgG Fc段结合的特性，当葡萄球菌与IgG抗体连接时，暴露的Fab段可与相应抗原结合，出现特异凝集（coagglutination）现象。2.应用
特异、灵敏、简便、快速，应用范围广，可用于肺炎球菌、乙型溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌以及腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、白喉病毒等的快速鉴定，还可检测脑脊液、血液和尿液中的病原菌，也可用于免疫复合物中特异性抗原的鉴定和淋巴细胞亚群的鉴定。三、抗球蛋白试验
抗球蛋白试验是抗球蛋白参与的间接血凝试验，由Coombs建立，故又称Coombs试验，用于检测抗红细胞不完全抗体。不完全抗体多数为7S的IgG类抗体，虽能与相应抗原结合，但因其分子量小、体积小，不能发挥桥联作用，在一般条件下不能出现肉眼可见反应。Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体发挥桥联作用，连接与红细胞表面抗原结合的特异性抗体，使出现肉眼可见凝集现象。（一）直接抗球蛋白试验1.原理
将抗球蛋白抗体直接加入患者待检红细胞悬液中，若红细胞已结合不完全抗体，即可出现红细胞凝集现象。2.应用
常用于检测新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血、医源性溶血等患者红细胞上的不完全抗体。（二）间接抗球蛋白试验1.原理
将携带不完全抗体相应抗原的红细胞加入待检血清中予以反应，再加入抗球蛋白抗体，若待检血清中含有红细胞不完全抗体，即可出现肉眼可见的红细胞凝集现象。2.应用
用于检测血清中游离的红细胞不完全抗体，多用于母体Rh（D）抗体和因红细胞不相容输血所产生的血型抗体检测。第二节 沉淀反应一、免疫浊度测定（一）原理
可溶性抗原与相应抗体在特定电解质溶液中反应，通过增浊剂（聚乙二醇等）作用可迅速形成免疫复合物微粒，使反应液出现浊度。在抗体稍过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应液浊度呈正相关，可计算出标本中待测抗原含量。现使用自动化免疫浊度分析仪进行检测，根据检测器的位置及其所检测光信号性质不同，可分为免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法。1.免疫透射比浊法
可溶性抗原与相应抗体结合形成复合物，使反应液介质浓度发生改变；光线通过反应液时，被其中的免疫复合物微粒吸收。在保持抗体过量的情况下，吸光度与免疫复合物量成正比。通过与标准曲线比较，即可确定标本中待测抗原含量。2.免疫散射比浊法
抗原、抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的免疫复合物，当一定波长的光通过该溶液遇到免疫复合物时光线发生散射现象，散射光的强度与免疫复合物的含量和散射夹角成正比，与入射光波长成反比。当散射夹角和入射光波长一定时，散射光的强度与免疫复合物量成正比；而当反应体系保持抗体过剩时，形成的免疫复合物量又与抗原成正比，通过检测散射光强度可计算出待测抗原含量。根据散射光检测时间及检测方式的不同，分为定时散射比浊法、速率散射比浊法，后者最常用。（1）定时散射比浊法 在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始。在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，据此获取的信号经计算所得结果会产生一定误差。定时散射比浊法避开抗原抗体反应的不稳定阶段（散射光信号在开始反应7.5～120s内的第一次读数），而在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，可将检测误差降到最低。（2）速率散射比浊法 是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率，是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量）。连续测定各单位时间内复合物形成的速率，分析与其产生散射光信号之间的关系，形成动态速率散射比浊法，每项检测1～2min即可完成。
抗原与抗体混合后的瞬间便引发反应，在抗体过量的前提下，抗原抗体反应速度由慢至快，单位时间内形成的免疫复合物不断增多，随后逐渐减慢。连续动态监测此过程，可发现在某一时间段内抗原抗体反应速率最快，单位时间内免疫复合物形成量最多，散射光强度变化最大，即为速率峰。随着抗原抗体反应时间的延长，免疫复合物总量逐渐增加，而速率的变化则由慢到快再由快逐渐变慢，在20～25s这个单位时间内抗原抗体反应的速率达到高峰，即出现速率峰，该峰值大小与抗原浓度呈正相关。选取速率最大，且与被测物浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机运算即可获得被测物浓度。3.胶乳增强免疫比浊法
将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚。分散的单个胶乳颗粒直径位于入射光波长之内，不阻碍光线通过，当两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，透射光和散射光即出现显著变化。采用透射比浊法或散射比浊法测定抗原抗体反应后溶液的吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关。（二）应用
免疫浊度测定方法灵敏度高、快速、简便、易于自动化，已广泛应用于临床各种微量物质的定量检测。主要用于检测血液、尿液等标本中特定蛋白质及药物浓度，例如：IgG、IgM、IgA、C3、C4、超敏C反应蛋白等。二、免疫电泳技术（一）火箭电泳1.原理
火箭电泳（rocket electrophoresis）是单向免疫扩散试验与定向加速电泳技术的结合。将抗体混合于琼脂中，电泳时抗原由负极向正极泳动，在抗原、抗体比例适当时形成不溶性免疫复合物沉淀线。泳动过程中随着抗原量的减少，沉淀线越来越窄，最终形成火箭状沉淀峰，峰高度与抗原量呈正相关。2.应用
火箭电泳只能测定微克每毫升（μg/mL）数量级以上的抗原含125量。若加入少量I标记的标准抗原进行共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的放射自显影；经X光胶片显影，根据自显影火箭峰高度可计算出抗原浓度。此种与放射免疫自显影技术相结合的火箭电泳可检测纳克每毫升（ng/mL）数量级的抗原浓度。（二）对流免疫电泳1.原理
对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis， CIE）是双向免疫扩散试验与定向加速电泳技术的结合。在pH 8.6的琼脂凝胶中，抗体泳向负极，置入正极侧孔；抗原泳向正极，置入负极侧孔。抗原、抗体相对泳动，在两孔间相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。2.应用
对流免疫电泳可检测微克每毫升（μg/mL）数量级浓度的蛋白质，常用于抗原或抗体性质、效价和纯度测定。此方法不适合于抗原为免疫球蛋白或迁移率接近的抗原、抗体检测，否则会导致抗原、抗体朝同一个方向泳动。（三）免疫电泳1.原理
先将蛋白质抗原置入琼脂板内进行区带电泳，不同抗原成分由于所带电荷、分子量及分子构型的不同，被分成不同区带。在与电泳方向平行的侧边开槽，并加入相应的抗血清进行双向扩散，在抗原、抗体比例合适处形成弧形沉淀线。通过对沉淀线数量、位置和形态与已知标准抗原抗体沉淀线比较，可对待测标本中所含成分的种类和性质进行分析。2.应用
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）样品用量少、分辨力强，可用于分析纯化抗原、抗体的成分，进行正常、异常免疫球蛋白的识别与鉴定。（四）免疫固定电泳1.原理
免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳和沉淀反应相结合的免疫化学分析技术。先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清置入凝胶表面的泳道上；经温育后，固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散，抗原、抗体直接发生沉淀反应。洗脱游离的抗体，抗原抗体复合物则保留在凝胶中，经染色后可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。2.应用
免疫固定电泳分辨率强、敏感度高、操作周期短、结果易分析。常用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白、免疫球蛋白轻链、尿液及脑脊液等标本中的微量蛋白、游离轻链、补体裂解产物等，最常用于M蛋白的鉴定与分型。（五）交叉免疫电泳1.原理
交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis，CIEP）是将琼脂平板电泳和火箭电泳相结合的免疫电泳分析技术。先将抗原样品在琼脂凝胶中进行电泳分离，然后使已分开的各抗原成分与原泳动方向呈90°的方向泳向含抗体的琼脂凝胶中，则该抗原样品中的各个抗原成分与相对应的抗体依次形成若干锥形沉淀线，根据沉淀线位置及面积（或高度）可确定该抗原的种类和浓度。2.应用
交叉免疫电泳分辨率较高，一次可对多种抗原定性定量。适用于比较各种蛋白组分，分析蛋白质遗传多态性、微小异质性、裂解产物和不正常片段等。第三节 免疫标记技术
免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，用标记物标记已知抗原或抗体，通过检测标记物间接测定抗原抗体复合物的一种技术。常用标记物包括酶、荧光物质、胶体金、化学发光剂、放射性核素等。免疫标记技术极大地提高了检测灵敏度，能对抗原或抗体进行定性和精确定量测定。一、酶免疫技术
酶免疫技术是以酶作为标记物，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种常用免疫标记技术。将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗原或抗体，在酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶作用的相应底物，通过酶催化底物产生显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量测定。（一）酶联免疫吸附试验1.原理
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的原理是将抗原或抗体结合至某种固相载体表面，再将抗体或抗原与酶连接成酶标记抗体或抗原。测定时，将待测标本（含待测抗原或抗体）和酶标记抗体或抗原按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应，形成固相抗原抗体-酶复合物；用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体-酶复合物与其他成分分离，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例；加入底物后，底物被固相载体上的酶催化生成有色产物，根据显色反应程度对标本中的抗原或抗体进行定性或定量分析。
ELISA常用的固相载体是聚苯乙烯塑料制成的微量反应板，常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）。HRP最常用的底物为四甲基联苯胺（TMB），TMB经HRP作用后呈蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。
根据其检测抗原和抗体的不同，采取不同的ELISA测定方法。在测定抗原时，蛋白大分子抗原检测大多采用双抗体夹心法，而对于只有单个抗原决定簇的小分子抗原，则采用抗原竞争法。测定抗体通常采用间接法、双抗原夹心法、抗体竞争法、捕获法等，其中捕获法常用于检测IgM型抗体。2.应用
ELISA广泛应用于多种传染病的实验室诊断，在病毒学检测中常应用于病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒测定；在细菌检测中常应用于结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等的测定。ELISA也可用于蛋白检测，例如：各种免疫球蛋白、补体、细胞因子、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）等。（二）斑点酶免疫吸附试验1.原理
斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）的实验原理与常规ELISA相同，不同之处在于dot-ELISA所用载体为对蛋白质具有较强吸附力的硝酸纤维素（NC）膜，酶作用于底物后形成有色沉淀物，使硝酸纤维素膜染色。2.应用
灵敏度较ELISA高6～8倍，试剂用量少、不需特殊设备，实验结果可以长期保存，但操作较烦琐。常用于各种蛋白质、激素、药物和抗生素的定量测定。（三）免疫印迹试验1.原理
免疫印迹试验（immunoblot test，IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotrasfer blot，EITB）或Western blot，是将蛋白质电泳分离与酶免疫测定相结合形成的蛋白检测技术。
免疫印迹法分为三个基本步骤：①十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，从负极向正极泳动，分子量越小，泳动速度越快，将蛋白质按分子质量大小和所带电荷多少进行分离，此时分离效果肉眼不可见。②电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移到硝酸纤维素膜上，此时肉眼仍不能观察到蛋白质分离条带。③酶免疫定位测定。将带有蛋白条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体、酶标记抗体反应后，加入反应底物使区带染色。常用的HRP底物为3，3-二氨基联苯胺（呈棕色）、4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色），阳性反应条带清晰可辨，并可根据电泳时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。2.应用
免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病诊断。此法已用于艾滋病病毒感染的确诊试验。（四）生物素-亲和素系统酶联免疫吸附试验1.原理
生物素-亲和素系统（biotin avidin system，BAS）酶联免疫吸附试验（biotin avidin system-ELISA，BAS-ELISA），是BAS与ELISA的组合应用技术。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其结合力远远超过抗原抗体反应，且结合后极稳定。1个亲和素分子可与4个生物素分子结合形成一种类似晶体的复合体，且具有多级放大作用，可极大提高检测方法的灵敏度。BAS-ELISA可分为桥联亲和素-生物素法（BAB法）、酶标记亲和素-生物素法（BA法）两种类型。BAB法是以游离的亲和素分别桥联生物素化抗体和生物素化酶的检测方法，BA法是直接以酶标亲和素联结生物素化抗体以检测抗原的方法。2.应用
BAS-ELISA灵敏度高、特异性高、稳定性高，但操作步骤较多。可用于检测可溶性抗原及其相应抗体，例如：链球菌、肺炎链球菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等及其抗体。（五）酶免疫组织化学技术1.原理
在一定条件下，应用酶标记抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体）的定位、分布和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。酶免疫组织化学技术（enzyme labeled immunohistochemical method）中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用底物包括二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物呈橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。2.应用
酶免疫组织化学技术可提高病理诊断准确性，可对癌基因蛋白进行定位和定量检测，可对肿瘤细胞增生抗原进行定位、定量，以判断肿瘤增生程度，有助于发现微小转移灶、临床判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管、淋巴转移，还可用于指导肿瘤靶向治疗等。二、荧光免疫技术
荧光免疫技术是以荧光物质作为标记物，将抗原抗体反应与荧光技术相结合的一种免疫标记技术，是最早出现的免疫标记技术。常用的荧光物质包括异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、3+藻红蛋白（PE）、镧系螯合物铕（Eu）、荧光底物等。（一）荧光显微镜技术1.原理
荧光显微镜技术又称荧光抗体技术（fluorescence antibody technique，FAT），采用荧光物质标记抗体与标本片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测、对自身抗体进行定性和效价测定。2.应用
常用于检测病原体、自身抗体、细胞表面抗原和受体等。（二）流式细胞术1.原理
流式细胞术（flow cytometry， FCM）需采用流式细胞仪进行检测分析。流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统、信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，采用激光作为激发光源，利用荧光染料与单克隆抗体相结合的标记技术，借助计算机系统对流动的细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。2.应用
可用于淋巴细胞及其亚群分析、免疫细胞分选及功能分析、细胞分化抗原及白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析以及艾滋病检测、移植免疫和自身免疫性疾病等相关人类白细胞抗原分析，应用范围非常广泛。（三）时间分辨荧光免疫测定1.原理
时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）的原理是以镧系螯合物标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系发生后，用时间分辨荧光免疫检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物浓度，从而进行定量分析。2.应用
灵敏度高、分析范围广、标记结合物稳定、有效期长、测量快速、易于自动化、无放射性污染，适用于体液中极微量生物活性物质的定量检测，可用于蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标记物、病原体抗原或抗体等检测。（四）荧光偏振免疫测定1.原理
荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay， FPIA）常用异硫氰酸荧光素（FITC）标记小分子抗原，利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原抗体复合物之间荧光偏振强度的差异，测定体液中小分子抗原物质含量。在反应体系F中，荧光素标记的小分子抗原（Ag）转动速度快、偏振荧光弱；与F抗体结合后，荧光素标记抗原抗体复合物（Ag-Ab）分子增大、转动速度减慢，受偏振光激发后发射出的偏振荧光明显增强。当待检抗FF原浓度增高时，由于竞争性结合导致形成Ag-Ab减少，游离Ag较多，受偏振荧光激发后发射出的偏振荧光弱，即待检抗原含量与偏振荧光强度呈负相关，通过标准曲线即可推算出待检抗原含量。2.应用
样品用量少、荧光素标记结合物稳定、方法重复性好、快速、易于自动化，但仪器设备昂贵、药品试剂盒专属性强、灵敏度稍低，常用于血清或尿液中小分子抗原物质（特别是药物浓度）的测定，不适用于大分子物质测定。目前已有数十种药物（例如：环孢素、卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥等）、维生素、激素、毒品等使用此方法进行定量检测。（五）荧光酶免疫测定1.原理
荧光酶免疫测定（fluorescent-enzyme immunoassay， FEIA）的原理是利用酶标记抗体（或抗原）与待检抗原（或抗体）反应，借助酶催化荧光底物，经酶促反应生成稳定而高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。采用碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），以4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）为ALP反应荧光底物；ALP分解4-MUP脱磷酸根基团后形成4-甲基伞形酮（4-MU），4-MU经360nm激发光照射发出450nm的荧光，通过荧光检测仪测定荧光强度，并推算出待检抗原或抗体含量。2.应用
灵敏度较高、标记物稳定、有效期长、操作简单，但荧光测定时应考虑血清和其他生物样品背景荧光的干扰。可用于多种抗原抗体的检测，例如：细菌及毒素抗原、病毒抗体、激素、肿瘤标志物、过敏原、凝血因子等。三、胶体金免疫技术
胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术，主要有胶体金免疫测定技术、胶体金免疫组织化学技术。由于胶体金有不同大小的颗粒，且电子密度高，故胶体金免疫技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。（一）胶体金免疫测定技术
胶体金免疫测定技术主要包括斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA）、斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）。1.原理（1）斑点金免疫渗滤试验 在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金、洗涤液。因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的。阳性反应在膜上呈现红色斑点。（2）斑点金免疫层析试验 将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合、以硝酸纤维素膜为载体的快速固相酶免疫分析技术。滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如色谱一般，在移动过程中待检物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带进行结果判读。2.应用
不能准确定量，只能作为定性或半定量试验。目前主要限于检测正常体液中不存在的物质，以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质，例如：传染病病原体抗原及抗体、毒品类药物、激素和某些肿瘤标志物。（二）胶体金免疫组织化学技术1.原理
胶体金是指由直径1～100nm的金颗粒所组成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶，其颜色与粒子大小有关，例如：15nm的胶体金为红色、95nm的胶体金则为蓝色。一般用于免疫组织化学的胶体金颗粒直径范围5～60nm，均呈红色，颗粒越小，红色越深。胶体金可在相当长的时间内保持溶胶不变，其稳定性受多种因素影响，最主要的是电解质，其次还与浓度、温度等有关。胶体金制备应用最多的是化学还原法，在氯金酸水溶液中加入一定量还原剂，使金离子还原为金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷。其中，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，为15～150nm；白磷还原制备的金颗粒直径较小，为3～12nm。
胶体金作为金的水溶胶，能迅速稳定吸附蛋白，对蛋白的生物学活性无明显影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白等）作为探针，就能对组织或细胞内抗原进行定性、定位甚至定量研究。2.应用（1）免疫金法（immunogold staining，IGS）
①直接法：将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色，然后在光镜或电镜下进行观察。方法非常简单，但由于一种探针只能研究一种抗原，所以比较受局限。用胶体金标记的单克隆探针，进行双重或多重染色效果比较好。
②间接法：先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后用金标二抗与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原分布进行定位研究。一般多采用间接法。（2）免疫金-银染色法（immunogold sliver staining，IGSS）
①原理：是1983年Holgate等人将IGS与银显影方法相结合建立的方法。金颗粒标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）特异性结合后，形成金标记免疫复合物；在银显色剂作用下，标记物上的金颗粒起液化作用，用对苯二酚还原剂使显影液中的硝酸银离子还原成银原子沉淀，被还原的银原子在抗原抗体复合物的金颗粒周围形成一个逐步增大的黑色“银壳”。由于金颗粒的液化催化作用，且“银壳”一旦形成本身也具有催化作用，因此更多的银离子被还原，最后使“银壳”显示的抗原位置清楚扩大，从而提高镜下可见度。
②应用：操作简单、特异性强、敏感性高，光镜、扫描电镜、透射电镜等均能检测，特别适用于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。（3）免疫金-银染色双PAG法
①原理：葡萄球菌A蛋白（SPA）与许多哺乳动物IgG具有亲和性，且两者连接不干扰抗原抗体结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，可结合更多胶体金颗粒，再通过银增强，可使原始信号得到几何级放大。
②应用：较免疫金-银染色法敏感性提高5～8倍，使用试剂单一、第一抗体用量少，减少了非特异性染色，更适用于检测抗原性较弱或抗原丢失严重的组织细胞。四、化学发光免疫分析技术（一）原理1.直接化学发光免疫分析
以化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗原（或抗体），与待测标本中相应的抗体（或抗原）发生反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-标记抗体复合物。加入氧化剂（HO）和碱性溶液（NaOH）使22反应系统呈碱性，则发光剂发光，通过检测发光强度可进行定性或定量分析。2.化学发光酶免疫分析
以参与催化某一化学发光反应的酶标记抗体或抗原，与待测标本中相应抗原或抗体发生反应后，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物；经洗涤后加入发光底物，酶催化和分解底物发光，通过测定发光信号可对待测抗原或抗体进行定量分析。3.电化学发光免疫分析
以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗原或抗体，以磁性微粒作为固相载体。常用双抗体夹心法，待测标本与相应已知抗体结合，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，启动电化学发光，光强度与待测抗原浓度成正比。4.鲁米诺氧途径免疫分析
鲁米诺氧途径免疫分析技术使用的是均相化学发光检测技术。参与反应的一个抗体包被感光珠，内含酞菁；另一个抗体包被发光珠，内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物。在目标抗原存在的情况下，可形成双抗体夹心免疫复合物，目标抗体可使两个抗体上标记的感光珠和发光珠紧密连接在一起。感光珠在波长680nm激发光照射下，使周围氧分子激发变成单线态氧，单线态氧扩散至发光珠并传递能量；发光珠发射520～620nm荧光信号并被单光子计数器检测。单线态氧在反应体系中只能扩散大约200nm，因此，只有结合态发光珠才能获得单线态氧的能量并发光；非结合态发光珠由于距离较远，无法获得能量而不发光。（二）应用
化学发光免疫分析技术标记物为非放射性物质，操作实现了自动化，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、标记物稳定、试剂有效期长等特点，已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、心脏标志物、感染性疾病、治疗药物等各种抗原、抗体和半抗原的检测。五、放射免疫技术
放射免疫技术是以放射性核素作为标记物的一种免疫标记技术，125用于定量检测受检标本中的微量物质。最常用的放射性核素是I，用γ计数器测定其放射性。根据放射性核素标记对象不同和检测方法不同，可分为放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）。（一）原理1.放射免疫分析*
用放射性核素标记抗原（Ag），使其与待检标本中的抗原（Ag）竞争结合限量的特异性抗体（Ab），并形成可溶性抗原抗体复合物*Ag-Ab和Ag-Ab，直至达到平衡状态。若Ag量多，则形成的Ag-Ab多，***Ag-Ab复合物（B）就少，游离的Ag（F）多，即待测Ag量与Ag-Ab*复合物（B）成反比关系，与游离的Ag（F）成正比关系。用已知不同浓度的抗原标准品得到相应B和F值，绘制标准曲线，待测标本在相同条件下进行反应，可在标准曲线上分析待测标本中抗原量。2.免疫放射分析
以双抗体夹心法最为常用，是用放射性核素标记特异性抗体。测定时待测抗原先与过量的固相抗体反应，形成固相抗体-待测抗原复合物于固相载体表面；洗涤除去未结合物质，再加标记抗体，形成固相抗体-待测抗原-标记抗体复合物，未结合的标记抗体通过洗涤去除。用已知抗原浓度的系列标准品进行反应获取标准曲线，将待测标本进行相同条件反应，即可从标准曲线上分析标本中抗原浓度。（二）应用
灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于激素、维生素、药物、肿瘤标志物、病原体抗原或抗体的定量分析。但存在放射性污染、试剂盒有效期短、检测设备特殊等缺陷，正面临逐渐被其他免疫标记技术取代的趋势。第四节 免疫球蛋白、循环免疫复合物与补体检测技术一、免疫球蛋白检测技术（一）IgG、IgM和IgA检测1.检测方法
对人体的血液、尿液、脑脊液等样本中IgG、IgM、IgA进行定量检测，常用速率散射免疫比浊法，原理参见本章第二节。2.临床意义（1）血液标本检测的临床意义
①年龄与性别：不同年龄下，机体血液中免疫球蛋白含量有一定变化，新生儿接近成人水平，婴幼儿低于成人水平，女性稍高于男性。
②血清Ig增高：多克隆性增高常见于肝脏疾病（慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化等）、结缔组织病、各种急慢性感染、某些自身免疫病等。单克隆性增高见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等单克隆Ig增殖病。
③血清Ig降低：低免疫球蛋白血症包括原发性降低、继发性降低两种类型。原发性降低见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。继发性降低见于大量蛋白丢失的疾病（烧伤、剥脱性皮炎、胃病综合征等）、淋巴系统肿瘤（白血病、淋巴肉瘤、霍奇金病等）、重症传染病、血液性疾病、肾脏疾病、中毒性骨髓疾病、长期使用免疫抑制剂等。其中，以肾脏疾病、慢性淋巴细胞性白血病、感染性疾病最多见。（2）尿液标本检测的临床意义 正常人尿液中的免疫球蛋白含量极微，当机体免疫功能出现异常或由炎症反应引起肾脏疾病时，可导致尿液中含量增多。（3）脑脊液标本检测的临床意义 神经系统疾病可导致脑脊液中免疫球蛋白含量升高，例如：化脓性脑膜炎、单纯疱疹性脑炎、结核性脑膜炎、急性神经疏螺旋体病、条件致病性脑膜炎、急性病毒感染、多发性硬化、神经梅毒、带状疱疹性神经节炎、脑萎缩等。（二）IgD检测1.检测方法
正常人血液中IgD含量极低，一般采用ELISA双抗体夹心法进行检测：先将抗人IgD抗体包被于聚苯乙烯反应板微孔内，加入待测血清或标准品后，再加入酶标记抗人IgD抗体，在固相微孔上形成抗体-待测抗原（IgD）-酶标记抗体复合物，洗涤除去未结合物，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，根据呈色强度定量检测血清中IgD水平。2.临床意义
IgD含量升高主要见于IgD型多发性骨髓瘤、高IgD血症以及周期性发热、慢性感染、大量吸烟者、妊娠末期、某些超敏反应等。IgD降低常见于先天性无丙种球蛋白血症、硅沉着病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。（三）IgE检测
IgE是血清中含量最低的免疫球蛋白，包括血清中总IgE检测及特异性IgE检测，前者作为初筛试验，后者可用于确定特异性过敏原。1.总IgE检测（1）检测方法 常用ELISA双抗体夹心法、免疫比浊法。（2）临床意义 总IgE升高常见于Ⅰ型超敏反应性疾病（过敏性哮喘、过敏性肠炎、花粉症、变应性皮炎和荨麻疹等），也可见于寄生虫感染、IgE型骨髓瘤、高IgE血症、系统性红斑狼疮、胶原病等非超敏反应性疾病。总IgE降低见于艾滋病、原发性无丙种球蛋白血症、免疫抑制剂治疗后。2.特异性IgE检测（1）检测方法
①放射性过敏原吸附试验法：将纯化的过敏原吸附于固相载体上，加入待测血清，若血清中含有针对该过敏原的特异性IgE，则可125与之形成抗原-抗体复合物；再与放射性核素（如I）标记的抗人IgE抗体反应，形成“过敏原-固相载体-特异性IgE-放射性核素标记的抗人IgE抗体”复合物，最后以γ计数仪检测放射活性，放射活性与特异性IgE含量呈正相关。
②免疫印迹法：将多种纯化的过敏原吸附于纤维素膜条上，加入待测血清，若血清中含有针对过敏原的特异性IgE，则可与之形成免疫复合物；用酶标记抗人IgE抗体作为示踪二抗，最后加入酶底物溶液使区带呈色，参比标准膜条即可判断过敏原种类，还可通过过敏原检测仪读取检测结果。
③ELISA：先将纯化的过敏原包被于聚苯乙烯反应板微孔内，加入待测血清，若血清中含有针对该过敏原的特异性IgE，即可形成抗原抗体复合物；再与酶标记的抗人IgE抗体反应，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，根据呈色强度定性或定量检测血清中特异性IgE水平。
④酶联荧光免疫分析：其固相载体为一内置有多孔性、弹性以及亲水性纤维素微粒的帽状塑料。将多种纯化的过敏原吸附于纤维素微粒上，加入待测血清或参考标准品，若血清中含有针对过敏原的特异性IgE，即可形成抗原抗体复合物；冲洗除去未结合物，再与β-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体反应，形成“过敏原-固相载体-特异性IgE-β-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体”复合物，加入4-甲基伞酮-β-半乳糖苷荧光底物，使之产生荧光，最后用荧光分光光度计测量荧光强度，荧光强度与特异性IgE含量呈正相关。（2）临床意义 血清特异性IgE检测有助于寻找特定过敏原，进行脱敏疗法的疗效监测。（四）游离轻链检测
Ig轻链根据其恒定区差异分为κ和λ两个型别。正常人血清κ与λ的比例约为2∶1。1.检测方法
临床常用速率散射免疫比浊法检测游离轻链。2.临床意义（1）κ和λ值均增高 见于多克隆免疫球蛋白血症，例如：自身免疫性疾病、肾脏疾病、慢性感染等。（2）κ或λ值增高 见于单克隆免疫球蛋白血症，例如：多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、轻链病、浆细胞瘤等。（3）κ或（和）λ值降低 见于低免疫球蛋白血症。（4）对单克隆免疫球蛋白增殖病的敏感性为88%～98%；对非分泌型骨髓瘤的敏感性为65%～70%。有助于单克隆轻链病、原发性系统性淀粉样变性的早期诊断，也可用于化疗或自身外周血干细胞移植后是否复发的监测。（五）冷球蛋白检测
冷球蛋白即冷免疫球蛋白，是血清中一种在37℃以下（一般0～4℃）易发生沉淀、37℃时可再溶解的病理性免疫球蛋白，在血清和血浆中均能发生沉淀，可分为1、2、3三型。1.检测方法
可采用穿刺组织进行电镜病理观察，亦可根据冷球蛋白37℃溶解、4℃时发生可逆性沉淀的物理性质进行血清标本中冷球蛋白的分离提取，再采用紫外分光光度仪检测A，计算蛋白含量；还可采用280免疫印迹、双向电泳法准确分析低浓度冷球蛋白。蛋白含量>0.05g/L血清时，即可诊断为冷球蛋白血症。2.临床意义
冷球蛋白可直接堵塞血管并通过形成的免疫复合物激活补体系统，导致炎症反应及肾损害，常引起全身性血管炎，最常见小动脉炎或静脉炎。1型冷球蛋白血症多见于恶性B细胞疾病，例如：Waldenström巨球蛋白血症、浆细胞瘤等；2型与3型冷球蛋白血症常见于慢性丙型病毒性肝炎。（六）M蛋白检测
M蛋白即单克隆免疫球蛋白，是单克隆B淋巴细胞或浆细胞异常增殖而产生的大量均一、具有相同氨基酸序列以及空间构象和电泳特性的Ig。1.检测方法（1）多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症患者M蛋白的检测与鉴定
①血清总蛋白定量：约90%患者血清总蛋白含量升高（70%患者>100g/L），约10%患者含量正常或偏低（如轻链病时）。
②血清蛋白区带电泳：血清（或尿液）标本中不同性质的蛋白质在一定条件下电泳，形成不同的蛋白区带，与正常电泳图谱进行比较分析，很容易发现异常的蛋白区带。将这些区带电泳图谱扫描，可计算出异常蛋白总量和百分比。依据单克隆Ig种类不同，M蛋白可以在α～γ区形成深染区带，以β、γ区多见。2
③血清Ig定量：为初筛试验，一般M蛋白所属Ig均明显升高，其他Ig则正常或显著降低。
④血清游离轻链定量：κ型或λ型游离轻链含量升高，κ与γ的比值异常。
⑤免疫电泳：是一种定性方法，可确定M蛋白的类别（IgG、IgA、IgM）和型别（轻链）。M蛋白可与相应的抗重链血清、抗轻链血清形成迁移范围十分局限的致密沉淀弧，据此排除或鉴别M蛋白血症。
⑥免疫固定电泳：灵敏度高，是临床最常用的方法。血清或尿液先进行区带电泳，形成不同的蛋白区带，再加入特异性抗重链或抗轻链血清，抗血清即可与相应的蛋白区带形成抗原抗体复合物；洗去未结合蛋白，最后经染料（氨基黑、丽春红）染色，并对比正常人抗血清参考泳道，即可对M蛋白进行鉴定。
⑦尿游离轻链检测：免疫球蛋白过剩的轻链自尿液排出，即本周蛋白，分为定性和定量两种方法。定量检测一般采用免疫比浊法进行。定性试验时，初筛可用热沉淀反应法或对甲苯磺酸法，确诊可用免疫电泳分析法。免疫电泳定性试验可采用轻链-清蛋白-戊二醛免疫电泳法，在戊二醛存在时，尿游离轻链能与牛血清蛋白结合，与抗轻链血清进行对流免疫电泳，轻链与抗κ、λ血清反应产生白色沉淀线；也可采用免疫固定电泳进行检测和分型。（2）重链病时的M蛋白检测与鉴定 与多发性骨髓瘤相同，但尚需采用选择性免疫电泳予以证实。将抗Fab或多价抗轻链血清与融化琼脂混匀制成琼脂板，常规打孔、加样、电泳。抗体槽中可加相应的抗Ig血清（例如：检测γ重链病加抗IgG血清，检测α重链病加抗IgA血清等）。电泳时，血清中正常Ig被琼脂中抗Fab或抗轻链血清选择性阻留，重链则继续向阳极移动，形成单一沉淀弧。（3）7S IgM病的M蛋白检测与鉴定 除上述方法外，还需证实7S IgM的存在。IgM通常为五聚体，沉降系数为19S，而7S IgM病患者IgM为单体，沉降系数为7S。证实7S IgM的存在有两种方法：①在测定总IgM含量后，将1～2mL待测血清过Sepharose 6B柱，再根据洗脱峰面积计算7S IgM占总IgM的百分比，IgM总量乘以百分比即得7S IgM含量。②采用植物血凝素（PHA）选择性电泳，五聚体IgM可与PHA结合，而单体IgM不与PHA结合。制备含PHA的琼脂，常规制板、打孔、加样、电泳。五聚体IgM被琼脂中PHA选择性阻留，7S IgM则继续向阳极移动，并可与随后加于抗体槽中的抗IgM血清反应，形成单一沉淀弧。（4）半分子病的M蛋白检测与鉴定 半分子是指由一条重链和一条轻链组成的M蛋白。检测与鉴定方法与多发性骨髓瘤相同，但尚需对“半分子”进行鉴定。
①免疫电泳法鉴定半分子M蛋白的迁移率。与Ig相比，半分子M蛋白泳向正极，可达α区。2
②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）推算M蛋白的分子量。
③超速离心法测定M蛋白的沉淀系数。
④Fc抗原决定簇的确定：用正常人抗重链血清判断半分子病患者M蛋白相应的Ig类别。2.临床意义
M蛋白可分为恶性M蛋白血症、意义不明的M蛋白血症两类。恶性M蛋白血症多见于多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、7S IgM病、半分子病、慢性淋巴细胞白血病、不完全骨髓瘤蛋白病等。意义不明的M蛋白血症又可分为两种，一种继发于其他恶性肿瘤（如恶性淋巴瘤），另一种为良性M蛋白血症，较多见于老年人。二、循环免疫复合物检测技术
抗原与其相应抗体形成免疫复合物（immunocomplex， IC），循环在血液里的免疫复合物即循环免疫复合物（circulating immunocomplex，CIC）。（一）检测方法1.聚乙二醇（PEG）沉淀比浊法
PEG能非特异性沉淀蛋白质，低浓度的PEG可使大分子量CIC自液相析出。PEG还可抑制CIC解离，促进CIC进一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。利用免疫比浊法即可确定CIC的存在与含量。2.ELISA法
补体第一成分C1q能与IgG或IgM类抗体的Fc段结合，因此可根据C1q来检测CIC含量。以IgG为例：先将C1q包被于聚苯乙烯反应板微孔，加入待测血清使CIC与C1q结合，洗涤后再加入酶标记的抗人IgG抗体，在固相上形成C1q-CIC-酶标记抗人IgG复合物；洗涤除去未结合物，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，呈色强度反映待测血清中CIC含量。（二）临床意义
CIC升高最常见于感染性疾病和自身免疫性疾病。CIC检测主要用于诊断与循环免疫复合物相关的疾病、监测疗效和评估病情。低浓度CIC可散见于正常人，亦可在无明显疾病时一过性出现。持续增高的免疫复合物提示有慢性原发性疾病存在，包括各种风湿病、肿瘤和慢性感染等。三、补体检测技术（一）补体经典途径溶血活性（CH）检测501.检测方法
补体最主要的生物学活性是免疫溶细胞作用。抗体（溶血素）致敏的绵羊红细胞（SRBC）可通过活化补体（C1～C9）激活经典途径，导致SRBC溶解。在一定范围（20%～80%溶血率）内，溶血程度与补体活性呈正相关，常以50%溶血率（50% complement hemolysis，CH）作为判断指标。502.临床意义
CH 活性增高见于急性炎症、肿瘤（骨髓瘤、肝癌等）、组织50损伤与感染、自身免疫性疾病（类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等）等。
CH 活性降低见于先天性补体缺陷症、各种肝病患者（肝炎、50肝硬化、肝癌等）、免疫功能不全、急性肾小球肾炎、全身性红斑狼疮活动期、大面积烧伤、肾病综合征等。（二）补体旁路途径溶血活性（AH）检测501.检测方法
先用乙二醇双（α-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）螯合血清中的2+Ca，封闭C1作用，以阻断经典活化途径。再用可使B因子活化的未致敏兔红细胞（RE）激活补体旁路途径，导致RE溶血，其溶血率与补体旁路途径的活性呈正相关，以50%溶血素为判别指标，即AH。502.临床意义
补体C3、C5～C9、P因子、D因子、B因子等成分参与补体旁路活化，任何成分的异常均可引起旁路溶血活性的改变。AH 增高多50见于甲状旁腺功能亢进、感染、某些自身免疫病、肾病综合征、慢性肾炎、肿瘤等。降低则见于慢性活动性肝炎、肝硬化、急性肾炎等。（三）补体C3、C4含量检测1.检测方法
一般采用速率散射比浊法。2.临床意义
C3、C4属急性时相反应蛋白，含量增高见于急性炎症、全身性感染、风湿热急性期、皮肌炎、心肌梗死、Reiter综合征、严重创伤、恶性肿瘤、妊娠等，对疾病的诊断意义不大。
C3、C4含量降低见于肝炎、肝硬化、活动期系统性红斑狼疮、各类免疫复合物病（类风湿关节炎、冷球蛋白血症、血清病等）、大面积烧伤以及遗传性C3、C4缺乏症等。
在自身免疫性溶血性贫血、遗传性神经血管瘤时，C3一般正常，而C4常下降。在系统性红斑狼疮时，C4的降低常早于C3。（四）补体C1q含量检测1.检测方法
多采用速率散射比浊法。2.临床意义
C1q是补体C1的重要组成成分，主要参与补体的经典激活途径。其增高见于血管炎、骨髓炎、类风湿关节炎、痛风、硬皮病等；降低见于系统性红斑狼疮、活动性混合性结缔组织病等。第五节 细胞因子及其受体与黏附分子的检测技术一、细胞因子及其受体检测技术（一）细胞因子检测
细胞因子检测的方法主要有生物学、免疫学和分子生物学测定法。分子生物学测定法检测细胞因子生物学活性，其结果以活性单位（U/mL）表示；免疫学测定法检测细胞因子蛋白质含量，其结果以纳克每毫升（ng/mL）或皮克每毫升（pg/mL）表示；分子生物学测定法是从细胞因子基因水平检测DNA和mRNA。各种检测方法不能相互替代，联合使用三种检测方法分析细胞因子才能更加全面、科学。1.生物学检测法
应用一定的指示系统（例如细胞）与已知活性的细胞因子标准品或待测标本相互作用。以指示系统的变化（细胞增殖、死亡或分泌蛋白等）来显示细胞因子功能，将待测标本与标准品进行比较，分析待检标本中的细胞因子水平。根据指示系统的表现不同，生物学检测法可分为细胞增殖法、靶细胞杀伤或抑制法、细胞病变抑制法、趋化活性测定法等。（1）细胞增殖法 为最常用的细胞因子生物学活性测定方法，可用于白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）等多种白细胞介素的测定。细胞增殖法是利用某一细胞因子可促进相应指示细胞分裂、增殖的特性而建立的。将不同浓度的细胞因子（标准品或待检样品）与指示细胞共同孵育一定时间，检测细胞增殖情况（例如：细胞涂片3染色镜下形态学观察、MTT比色法、H-TdR掺入法等），细胞增殖程度与细胞因子活性成正比。（2）靶细胞杀伤或抑制法 主要用于肿瘤坏死因子的测定。肿瘤坏死因子（TNF-α、TNF-β）具有杀伤肿瘤细胞的作用，检测TNF活性可采用靶细胞杀伤法。选择对TNF敏感的细胞株作为靶细胞，使其与不同稀释度的标准品或待测样品共同培养一定时间，检测细胞毒性反应的程度，细胞毒性反应程度与TNF活性成正比关系。（3）细胞病变抑制法 主要用于检测干扰素。干扰素（IFN）可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶类，保护宿主细胞免受病毒感染，从而抑制细胞病变。将指示细胞、病毒和IFN标准品或待测样品置同一反应体系中，培养一段时间后，检测细胞的病变程度，细胞病变程度与IFN活性成反比关系。（4）趋化活性测定法 主要用于趋化性细胞因子的测定，如白细胞介素8（IL-8）等，以Boyden小室法最为常用。Boyden小室由上、下两室组成，下室为一盲端，两室间用一层硝酸纤维素膜分隔。当下室加入IL-8或待测样品、上室加入细胞时，IL-8在膜的两侧形成浓度梯度，细胞在趋化因子作用下向下室移动。根据迁移细胞的多少和细胞类型判断趋化活性的强弱和性质。2.免疫学测定法
细胞因子的化学本质是蛋白质或多肽，很容易制备相应的抗体，用已知抗体便可以检测未知的细胞因子（抗原）。（1）体液中细胞因子的检测
①生物素-亲和素系统的双抗体夹心ELISA法：制备两种识别同一细胞因子不同表位的单克隆抗体，其中一种作为包被抗体，另一种作为标记抗体进行双抗体夹心ELISA。但体液中细胞因子的含量很低，常规ELISA的敏感度不能达到要求，实际工作中常用生物素标记一种抗体、亲和素标记的辣根过氧化物酶来实现抗原抗体反应系统与酶-底物显色系统的偶联，使抗原抗体反应的信号得以放大。以白细胞介素-2（IL-2）检测为例：以抗人IL-2单克隆抗体包被于聚苯乙烯反应板上，加入待测抗原（血清、体液标本）或标准品与固相抗IL-2单抗结合，再加入生物素化抗IL-2抗体，最后形成抗IL-2抗体-IL-2-生物素化抗IL-2抗体复合物，依次加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉素亲和素、酶底物/色原溶液后呈色，显色（吸光度）强度与待测标本中IL-2水平在一定范围内呈正相关。
②放射免疫分析：将特异性细胞因子抗体包被于放射免疫分析试125管中，用I标记在细胞因子上。检测时，先加入标准品或待测样品，反应一段时间后再加入标记的细胞因子，如样品中有细胞因子存在，即可竞争性抑制标记的细胞因子与包被抗体结合。样品中细胞因子水平与抑制程度相关，最后通过标准曲线得到样品中细胞因子的含量。
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