作者：毛相朝 主编
出版社：化学工业出版社
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海洋食品酶工程试读：
前言
前 言海洋面积辽阔、生物资源丰富，为人类提供了大量的鱼、虾、贝、藻等食物，海洋食品已逐渐成为人们赖以生存的重要食物来源，国内外都将开发利用海洋资源作为经济发展的重要内容。我国海洋经济近年来蓬勃发展，2017年我国海洋水产品产量已达3300余万吨，占全国渔业总产量的51.5%。2017年全国海洋经济生产总值7.76万亿元，占国内生产总值的9.4%，已成为国民经济中的一个崭新亮点。
近年来，我国海洋食品加工技术水平有了长足的发展，但海洋食品加工业的发展空间依然较大。酶工程技术因其高效可控、反应温和、绿色节能等优点，在食品、医药、化工和能源等产业发挥着越来越重要的作用，加速了传统产业向绿色生物制造产业的变革。然而，海洋生物资源中的多糖、脂质和蛋白质等营养成分的结构特殊、组分复杂，现有酶工程技术应用到海洋生物资源的加工过程仍然面临着较多的困难和挑战。因此，针对海洋食品资源的结构和组分特点，开发适用于海洋食品加工的酶工程技术，是解决这些问题的关键。
为此，我们编写了《海洋食品酶工程》一书，以满足科研、教学和生产的需要。本书除了涵盖酶的生产、酶的分子修饰技术、酶的固定化技术等酶的基本应用理论知识之外，重点归纳了现阶段酶工程在水产品保鲜、海藻加工、ω-3型多不饱和脂肪酸制备、水产调味料加工、甲壳素加工、水产蛋白加工和水产食品分析检测等领域的应用情况。全面系统地介绍了海洋食品的酶工程加工技术，并对海洋水产加工专用酶的研究进展和应用前景进行了展望，力求保证本书的专业性、科学性和实用性，使之更适宜于教学和科研的需要。
本书编写分工如下：第一～三章由毛相朝和孙建安编写；第四章与第八章由解万翠、李银平和刘振编写；第五章由董平编写；第六章与第十一章由倪辉、朱艳冰和黄文灿编写；第七章由马磊编写；第九章由刘炳杰编写；第十章由侯虎编写；第十二章由孙慧慧编写。全书由毛相朝负责统稿。
本书在编写过程中得到了中国海洋大学教材建设基金和重点教材建设项目的资助，作者在此表示衷心的感谢。
本书适用于高等院校食品科学与工程、水产品加工与贮藏工程、生物工程等专业的学生使用，也可作为从事海洋食品加工的科技人员及相关研究人员的参考书。
本书涉及内容较广，加之编者水平与能力有限，书中难免存在不足和疏漏之处，敬请广大读者批评指正。毛相朝中国海洋大学2019年4月第一章 绪论
酶（enzyme）是活细胞产生的一类具有专一性生物催化作用的生物大分子。本书主要从酶的基本性质开始入手，包括分类与命名、结构与性质、催化反应动力学、酶活测定、分离纯化、表达与发酵等，并综合了分子修饰技术和固定化技术，介绍了酶在水产品加工中的应用。第一节 酶的分类与命名
国际酶学委员会（International ;Enzyme ;Commission，IEC）经历多次修改、补充，规定按照酶促反应的性质，将酶分为六大类。每个酶的命名用四个圆点隔开的数字编号，编号前冠以酶学委员会的缩写符号（EC）。一、酶的分类
根据编号的第一个数字代表，酶的六大类分别如下。1.氧化还原酶
氧化还原酶（oxido-reductases）是催化底物进行氧化还原反应的一类酶。如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。2.转移酶
转移酶（transferases）是催化底物之间某些基团的转移或交换的一类酶。如甲基转移酶、氨基转移酶、磷酸化酶等，基团包括乙酰基、甲基、氨基等。3.水解酶
水解酶（hydrolases）是催化底物发生水解反应的一类酶。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。4.裂解酶
裂解酶（lyases）是催化底物（非水解）裂解或移去基团（形成双键的反应或其逆反应）的一类酶。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。5.异构酶
异构酶（isomerases）是催化各种同分异构体之间相互转化的一类酶。如磷酸丙糖异构酶、消旋酶、表构酶等。6.合成酶
合成酶（ligases）是催化两分子底物合成一分子化合物的一类酶，同时偶联有ATP的断裂释能的一类酶。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-tRNA连接酶等。二、酶的命名
系统编号中的第一位数字代表酶的六大类型。第二位数字代表亚类（作用的基团或键的特点），对于氧化还原酶，第二位数字表示氧化反应供体基团的类型；对于转移酶，表示被转移基团的性质；对于水解酶，表示被水解键的类型；对于裂解酶，表示被裂解键的类型；对于异构酶，表示异构作用的类型；对于合成酶，表示生成键的类型。第三位数字代表亚亚类（精确表示底物/产物的性质）。第四位数字表示在亚亚类中的序号。1.氧化还原酶2.转移酶
第三位数字则对转移基团和相应受体进行进一步分类，如：3.水解酶
第三位数字将水解键进一步细分，例如当第二位数字为1时：4.裂解酶
第三位数字表示移去基团的类型，以裂解C-C键的裂解酶为例：5.异构酶6.合成酶
第三位数字对合成的键进行进一步说明，例：
除了上述的系统命名法，还有一种常见的方法——习惯命名法：①根据酶作用的底物命名，如蛋白酶、脂肪酶；②根据酶催化的反应命名，如脱氢酶、转氨酶；③在底物、反应基础上加上酶的来源或其他性质命名，如胰蛋白酶、碱性磷酸酶。
例如参与催化反应：α-酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸
按系统命名法：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶；
按习惯命名法：谷丙转氨酶。第二节 酶的结构与性质
按照化学组成可将酶分为单纯酶和结合酶两类。单纯酶分子中只含有氨基酸残基组成的肽链，结合酶分子中除多肽链组成的蛋白质，还有非蛋白质成分（如金属离子、铁卟啉或含B族维生素的小分子有机物）。结合酶又分为两部分，蛋白质部分称为酶蛋白（apoenzyme），非蛋白质部分统称为辅助因子（cofactor），两部分组合称全酶（holoenzyme）。仅全酶有催化活性，如果两者分开则酶活力消失。非蛋白质部分如铁卟啉或含B族维生素的化合物若与酶蛋白以共价键相连为辅基（prosthetic ;group），用透析或超滤等方法皆不能使之与酶蛋白分开；反之两者以非共价键相连的称为辅酶（coenzyme），用上述方法可把两者分开。
酶为生物大分子，分子量大的可达百万。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整，酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。酶的活性中心（active ;center）只是酶分子中很小一部分，酶蛋白中大部分氨基酸残基并不与底物接触。组成酶活性中心的氨基酸残基侧链存在不同的功能基团，如—NH、—COOH、—2SH、—OH和咪唑基等。某些基团在与底物结合时起结合基团（binding ;group）的作用；某些在催化反应中起催化基团（catalytic ;group）的作用；某些基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，因此常将活性部位的功能基团统称为必需基团（essential ;group）。必需基团通过多肽链的盘曲折叠，组成一个在酶分子表面且具有三维空间结构的孔穴或裂隙，以容纳进入的底物与之结合并催化底物转变为产物，这个区域即为酶的活性中心。酶活性中心以外的功能基团在形成并维持酶空间构象上也是必需的，故称为活性中心以外的必需基团。对需要辅助因子的酶来说，辅助因子也是活性中心的组成部分。酶催化反应的特异性实际上决定于酶活性中心的结合基团、催化基团及其空间结构。酶分子结构的基础是其氨基酸的序列，它决定着酶的空间结构和活性中心的形成以及酶催化的专一性。
酶主要有以下特性：①具有高效催化能力，效率是一般无机催化713剂的10～10倍。非酶催化反应速率和在相同pH值及温度条件下的酶催化反应速率可直接比较的例子较少，因为非酶催化速率过低，不易观察，对比之下，酶催化反应速率明显增大。酶的最适催化条件一般为温和的温度和非极端的pH值，某些时候需要金属离子参与催化。②大部分酶具有绝对的专一性（每一种酶只能催化一种或一类化学反应），此外酶的另一个专一性为催化反应的立体专一性。③每一次反应后，酶本身的性质和数量不会发生改变（与催化剂相似）。④酶的作用条件较温和。第三节 酶催化反应动力学
酶催化反应动力学也称酶促反应动力学（kinetics ;of ;enzyme-catalyzed ;reactions），是研究酶促反应速率及其影响因素的科学。在研究酶结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要酶催化反应动力学提供相关的实验证据。
酶催化反应动力学通过对酶促反应速率的测定来讨论底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等因素对酶促反应速率的影响。酶促反应不但需要最适温度和最适pH，还要选择合适的激活剂，即研究酶促反应速率及测定酶活力时，皆应选择相关酶的最适反应条件。一、Michaelis-Menten方程
1913年，Michaelis和Menten两位科学家在前人研究基础上，根据酶促反应的中间络合物学说，推导出相关的数学方程式，用来表示底物浓度与酶反应速率之间的量化关系，这个数学方程式称为米氏方程，即 （1-1）
式中，v表示反应初速率；v表示酶完全被底物饱和时的最大max反应速率；［S］表示底物浓度；K表示ES的解离常数（底物常数）。x
该数学方程式是推导得出的，当只有一个底物结合位点的单底物酶催化反应时，最简单的反应方程式为： （1-2）
其中，根据式（1-2）可得。
当酶、底物、酶-底物复合物之间达到平衡态，底物浓度很高且远远高于酶浓度，即方程式的前部分迅速建立平衡，此时酶-底物复合物ES分解产生的产物P浓度极低，对前半部分的平衡影响较小；底物浓度很高时，所有的酶都以酶-底物复合物形式存在，初速率v便达到v。max
应注意的是，米氏方程具有局限性，可以解释一些实验现象，但不具有普遍适用性，因为存在酶促反应速率极快的情况，这破坏了米氏方程假定的平衡条件。二、Briggs-Haldane修饰Michaelis-Menten方程
Briggs和Haldane对米氏方程做出的修正在于他们指出了酶-底物复合物ES量不仅与形成ES复合物的平衡有关，除此之外还与ES复合物分解的平衡有关，用稳态代替平衡态。而稳态是指反应进行一段时间后，酶-底物复合物ES的浓度由零级逐渐增加到一定数值，即除底物浓度和产物浓度不断发生变化之外，酶-底物复合物ES也在不断生成和分解，当酶-底物复合物ES的生成速率与分解速率相等时，即酶-底物复合物ES浓度保持不变，这种反应状态称为稳态。酶促反应过程中各种物质浓度与时间关系如图1-1（虚线之间为稳态）。图1-1 酶促反应过程中各种物质浓度与时间关系
在方程（1-2）中，取，则最终方程变为 （1-3）
K定义为米氏常数，当k≫k时，K=K。其中，v对［S］作图m-12mx所得曲线与很多酶促反应结果一致（图1-2）。图1-2 米氏方程曲线三、米氏方程中K、v的测定mmax
在实际酶促反应过程中，即使底物浓度达到很高，也只能得到趋近于v的酶促反应速率，却不能真实达到v，即不能得到真实的maxmaxK与v值。因此为了简便计算出近乎准确的K与v值，可以将mmaxmmax米氏方程曲线变为直线，转变为直线方程，用图解法求出K与vmmax值。1.Lineweaver-Burk双倒数图
1924年，Lineweaver和Burk对米氏方程进行两侧取倒数，化为以下形式： （1-4）
以1/v对1/［S］作图，得一直线，斜率为K/v，纵轴截距为1/mmaxv，横轴截距为1/K，根据直线可得K、v，如图1-3。maxmmmax图1-3 Lineweaver-Burk双倒数图
此方法虽然根据数据作图可得最终K、v值，但实验点往往mmax在直线的左下方呈现过度集中的趋势，而低浓度底物的实验点因取倒数后而误差较大，往往偏离直线较远，因此选择底物浓度应从低到高皆有覆盖。除此之外，此种作图方法与其他方法相比很少有线性偏离，因此不适合用来观察酶的作用机制。2.Hanes-Woolfs作图
将方程（1-4）两侧同时乘以［S］，得到以下方程： （1-5）
以［S］/v对［S］作图，得一直线，直线斜率为1/v，横轴截max距为-K，如图1-4。m图1-4 Hanes-Woolfs图3.Eadie-Hofstee作图
将方程（1-4）两侧同时乘以（v×v），得到以下方程：max （1-6）
以v对v/［S］作图，得一直线，直线斜率为-K，纵轴截距为mv，如图1-5。max图1-5 Eadie-Hofstee图4.Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图
以上几种方法较为常见，但根据上述方法可知，即使有软件处理，对于正确的K、v值也较难得到。因此Eisenthal和Cornish-mmaxBowden基于米氏方程提出了另一种作图法，将方程改为以下形式： （1-7）
以v对K作图，每一组相应的v标记在纵轴，［S］标记在横maxm轴，连接作图（图1-6），得不同直线，这些直线会相交于一点，该点横坐标为K，纵坐标为v。mmax图1-6 Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图
该方法不需要计算便可直观得出K、v值，同时还可以识别mmax出不正确的观测结果；不过由于实验误差，图像中的直线并不能完全交于同一点，因此在没有偏离线性关系的前提下，对K、v值取mmax其平均值。第四节 酶活力及其测定
酶活力（enzyme ;activity）又称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可在一定条件下，酶催化某一化学反应的速率来表示。酶催化反应速率愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。换言之，测定酶活力实际就是测定酶促反应的速率。酶促反应速率可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速率时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。图1-7 酶促反应进程曲线
以产物生成量对反应时间作图，可得到图1-7。曲线斜率表示单位时间内产物生成量的变化，从而间接表示该时间点上的反应速率，用来表示酶活力。用于测定酶活力时，可以看出在反应最开始的一段时间，曲线斜率几乎保持不变，随着时间增长，曲线趋于平坦，斜率减小，即反应速率降低，此时所测的反应速率便不能代表真实酶活力。导致其速率降低的原因可能是产物浓度增加、底物浓度降低导致逆反应的加速进行，长时间的反应导致酶自身发生失活等。因此为避免以上影响因素，在测定酶活力时，应测定酶促反应的初速率（以底物浓度的变化在起始浓度的5%之内的速率定为初速率），以此来判定酶活。除此之外，还要保证底物浓度足够大（一般在10K以上），使整m个酶促反应对底物而言是零级反应，对酶来说是一级反应。测定酶活时，需用到酶活力单位，即酶单位（U）。酶单位是衡量酶活力的大小即酶含量多少的指标，1961年，国际生物化学协会酶学委员会及国际纯粹化学和应用化学联合会临床化学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶活力，其定义为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（1μmol）的底物转化为产物所需的酶量，即1IU=1μmol/min。1972年，又有一种新的酶活力国际单位，即Katal（简称Kat）单位，其定义为：在最适反应条件下，每秒钟能催化1摩尔（1mol）底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat单位，即1Kat=1mol/s。Kat单位和IU单位之间的换算关系为：61Kat=60×10IU-91IU=16.67×10Kat
测定酶活力的方法本质即测定底物减少量或是产物增加量，常用
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