相容性溶质基础研究与应用开发(txt+pdf+epub+mobi电子书下载)


发布时间:2020-05-30 11:02:30

点击下载

作者:厉保秋

出版社:人民卫生出版社

格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT

相容性溶质基础研究与应用开发

相容性溶质基础研究与应用开发试读:

前言

相容性溶质是生物体内广泛存在的一类小分子物质,最初在极端微生物体内发现,至今在自然界发现的相容性溶质已多达数十种。由于相容性溶质是提高生物环境适应性不可或缺的一类重要物质,因此,引起了国内外医药化妆品行业及研究者的高度关注。

国内外早期研究发现,相容性溶质具有良好的生物相容性,可通过优先排阻机制发挥对生物大分子的稳定和保护作用,微摩尔浓度的相容性溶质即可降低高温、低温、辐射等对生物大分子的损伤作用。在此基础上,国内外研究者进一步对相容性溶质在DNA技术、农业、化工、医药及化妆品领域的用途进行了广泛研究;与此同时,关于相容性溶质制备工艺研究也取得了不断突破。上述研究为相容性溶质的产业化应用奠定了坚实的基础。

在已发现的诸多相容性溶质中,甘油、海藻糖、甘露醇、甜菜碱等已经实现产业化应用,在食品、医药、化工等领域用途尤为广泛,如作为化妆品保湿剂、食品保鲜剂、代替血浆蛋白作为生物制品稳定剂、药物冻干保护剂等。仅就海藻糖而言,截至2015年底,全球海藻糖使用量每年近15万吨;而全球两家主要原料供应商日本林原生化公司和美国凯尔高公司年产能仅为10万吨左右,远不能满足市场的巨大需求。

四氢嘧啶类相容性溶质虽属氨基酸类物质,但其分子内π电子离域化,不表现出氨基酸分子的特征,因此在很长时间内未被发现。尽管是一类被较晚发现的相容性溶质,但现也已知晓四氢嘧啶类相容性溶质具有良好的保湿、防紫外损伤、抗皮肤老化、抗炎等作用,国外多家著名化妆品公司的主打产品中已添加四氢嘧啶作为有效成分。与此同时,德国Bitop AG公司自20世纪90年代已开展四氢嘧啶的药物研究,迄今已完成四氢嘧啶治疗鼻炎、结膜炎、慢性阻塞性肺疾病等多种疾病的Ⅱ期临床试验。因此本书在对相容性溶质的天然来源、分类、生物合成途径、生物学功能进行综述,并对海藻糖、甜菜碱、甘露醇的理化性质、制备工艺、产业应用研究进行系统介绍后,着重对四氢嘧啶类相容性溶质的基础研究和应用开发进行了介绍。

鉴于新产品研发中有专利侵权风险的存在,本书对国内外四氢嘧啶相关专利也进行了汇总,以供读者作为技术参考和专利风险评估参考;其中,大部分国内专利申请均未获得授权,授权专利主要由本书主编获得。

新产品研发尤其是医药产品的研发,其难度和风险已众所周知。随着研发的不断深入,有关文献和信息会不断增多,但限于著者专业水平,时间仓促,纰漏之处在所难免,恳请同行及读者不吝指正。厉保秋2017年3月于山东大学趵突泉校区上篇 总 论第一章 极端环境和极端生物概述第一节 极端环境和极端生物一、极端环境

环境是特定生物(或生物群)赖以生存的外界条件的总和,包括一定的空间,以及其中直接或间接影响生物生存的各种因素,如温度、pH、光照、空气、液态水等。

地球上多数生物适于生存在温和的环境条件下。温和环境条件通5常是指温度在20~40℃之间,pH接近中性,大气压为1.01×10Pa,以及具有足够可利用的水分、营养成分和盐分。

超出温和环境条件之外的环境条件通常被认为不适宜生物生存。其中部分环境因存在高温、高寒、高旱、高酸、高碱、高压、高辐射等极端恶劣条件一度被认为是生命的禁区,这类环境被称为极端环境(extreme environments)。自然界中存在的高温热泉、盐湖、碱湖、沙漠、极地、深海海底、火山口等即属于典型的极端环境。极端环境[1]的环境参数及边界条件见表1-1。表1-1 极端环境的环境参数及边界条件二、极端生物(一)极端生物的概念

地球的生物圈可以分为三大领域:古菌、细菌和包括人类在内的真核生物(真菌、动物、植物等)。其中,古菌和细菌均属于原核微生物。绝大多数古菌和少部分细菌都能够在极端环境中生存,属于生物圈极限的开拓者和各项生存记录的保持者。这些微生物为地球的生物圈界定了环境极限的边界条件。

部分植物和动物在不适宜生存的条件下(如盐分胁迫、水分胁迫等)或某些极端环境条件下(如高压、高寒等)也具有生存能力。这些能够在极端环境条件下生存的生物被称为极端生物。其中在极端环境条件下生存的微生物称为极端微生物(extremophiles);能够在一种以上极端环境条件下生存的微生物称为多重嗜极微生物(polyextremophiles)。(二)极端生物的环境耐受极限

生物的环境耐受范围一般由低限、高限和最适点组成。低限和高限为生物的环境耐受极限;低限和高限之间的范围称为耐受范围。随着环境范围从最适点向低限和高限延伸,生物的生命活动逐渐减弱。最适点附近较窄的环境范围适合生物的生殖活动;最适点附近较宽的环境范围适合生物的生长活动;接近低限和高限的环境条件仅适合生物的存活。

目前,科学界已发现的支持极端生物生长的最高温度极限为122℃,最高pH极限为12、最低pH极限为0,最高盐度极限为饱和浓度。而随着研究的不断深入,极端生物生存的各种环境极限还将会不[2]断刷新。不同生物的pH耐受极限和温度耐受极限分别见图1-1和[2]图1-2。三、极端生物的研究和应用价值

极端生物是人类丰富、潜在的生物资源,也是非常珍贵的科研素材。极端生物生存于特殊的环境条件下,形成了能够适应极端环境的特殊机制,如细胞渗透压调节机制、生物大分子保护机制等。其环境适应机制往往与其体内存在的特殊化学物质有关,包括特殊的小分子化学物质和特殊的酶类。

在对极端生物环境适应机制的研究中,科学家们已发现众多的新化学物质。其中部分化学物质已在医药、化工、农业、食品、石油开采等领域得到广泛应用,如近20年来迅速发展起来的生物高分子材料-聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA),即为极端环境下生存的微生物体内合成的一种细胞内聚酯。图1-1 不同生物的pH耐受极限图1-2 不同生物的温度耐受极限

生存于极端低温或高温环境下的微生物体内存在低温酶或嗜热酶。低温酶参与的催化反应的最适温度较低,在卫生要求较高的食品、药品加工等领域具有潜在的应用价值;而嗜热酶具有酶制剂制备成本低、动力学反应快、能耗低、产物纯度高等优点,已广泛应用于分子生物学、环境保护、能源利用等领域。其中,高温DNA聚合酶和一些洗涤用品用极端酶已实现大规模产业化生产,全球年产值高达数亿美元。

自1982年以来,欧盟已持续为极端微生物的研究及商业化提供长期资助,1996~1999年,欧盟建立了“极端微生物细胞工厂”(extremophiles as cell factories)项目,该项目目前已进入产业转化

[2]阶段。

我国极端微生物研究起步较晚。2004年,由中国科学院微生物研究所东秀珠研究员主持的“极端微生物及其功能利用的基础研究”课题获得“973”项目支持。目前该项目已筛选到了产新型酯酶的新嗜热菌和产酸性植酸酶的微生物菌株,建立了高温酶突变库。第二节 极端微生物及环境适应机制一、极端微生物的分类及环境适应机制

根据极端微生物的生存环境和生理特点可将其分为嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜酸微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜压微生物和抗辐射微生物等。其中在一种以上极端环境生存的微生物成为多重嗜[3,4]极微生物。部分多重嗜极微生物及其环境耐受极限见表1-2。表1-2 部分多重嗜极微生物及其环境耐受极限(一)嗜冷微生物

1.嗜冷微生物的分类

嗜冷微生物(psychrophiles)也称低温微生物,最早由Forster于1887年在冷冻保存的鱼中发现。此后,先后出现了几种嗜冷微生物的定义和分类:

1902年,Schmidt-Nielso将能够在0℃以下生长的微生物命名为嗜冷微生物。

1962年,Ingraham和Stokes给出了更准确的定义。他们将在0℃以下、一周或两周内能够生长出肉眼可见菌落的微生物称为嗜冷微生物,并分为专性嗜冷微生物(obligate psychrophiles)和兼性嗜冷微[5]生物(facultative psychrophiles)。专性嗜冷微生物适于在20℃以下的环境中生存,高于20℃即死亡;兼性嗜冷微生物可在低温下生长,也可以在20℃以上的环境生长。[6]

1975年,Morita等将嗜冷微生物分成两大类:嗜冷微生物和耐冷微生物(psychrotrophs)。嗜冷微生物是指最适生长温度不高于15℃,最高生长温度不高于20℃,最低生长温度不高于0℃的微生物;耐冷微生物是指在0℃下能够生长繁殖,最适生长温度为20~25℃的微生物。

然而,也有学者认为温度的限定标准是主观确定的,这一标准并不适用于多数真核生物;用生长速率的标准定义最适生长温度,不能[7,8]如实反映微生物的生长状态,因此不赞成Morita的标准。目前,关于嗜冷微生物的定义尚未达成共识。

2.嗜冷微生物的多样性

寒冷环境在地球上非常普遍。覆盖地球三分之二以上的海洋深水温度大多在5℃以下;在两极地区,低温环境更是占据统治地位;除此以外,还有许多人造低温环境,如冷库等。

在已知的嗜冷微生物中,细菌是数量和种类最多的一类。目前,已从各种土壤、砂岩、湖泊和海洋中分离到大约100多种革兰阴性和阳性细菌,分别来自产碱杆菌属(Alcaligenes)、别单胞菌属(Alteromonas)、水螺菌属(Aquaspirillum)、节杆菌属(Arthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、短杆菌属(Brevibacterium)、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、甲烷类球菌属(Methanococcoides)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、细杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Moritella菌属、Octandecabacter菌属、胶鞘藻属(Phormidium)、发光杆菌属(Photobacterium)、极地杆菌属(Polaribacter)、极胞菌属(Polaromonas)、Psychroserpens 菌属、希瓦菌属(Shewanella)和[9]弧菌属(Vibrio)。Moritella菌属物种几乎均为嗜冷微生物。除细菌外,科学家已在南极土壤和湖泊中发现有放线菌、霉菌、酵母菌生[10]存,并在冰雪、海冰中发现低温藻类。

最近对南极土壤中微生物群落的研究表明(土壤温度在-0.5~3.8℃),极端寒冷环境可能存在着高密度的微生物群落。Cowan等[11]以微生物群落的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)69含量为基础,推测每克土壤中含活细菌细胞的数量为3×10~2×10[12]14个。Rivkina等以吸收进细胞脂质内的C乙酸为标记,测量永久冻土中非自养微生物的生存能力。结果显示,非自养微生物群落的倍增时间在5℃时为1天,在-10℃时为20天,-20℃时仍可检测到存活的非自养微生物(推算的倍增时间为160天)。文献报道,迄今为止发现的最嗜冷微生物为Polaromonas vacuolata(一种从南极海水中分离得到的γ-变形菌门成员),其最适生长温度为4℃,最低0℃,最高[13]12℃。

3.嗜冷微生物的环境适应机制

嗜冷微生物对于低温的适应性依赖于多种存活策略。与常温菌不同,嗜冷微生物细胞膜中脂类含量较高,有助于其在低温条件下吸收[15]环境中的营养物质;其细胞膜含有较高水平的不饱和脂肪酸,并且能随温度降低而进一步升高,使细胞膜在低温条件下保持良好的[14]流动性,这是其适应寒冷环境的重要策略。嗜冷微生物中的低温酶一般具有良好的柔性,在低温条件下能快速进行构象调整以适应催化反应的需要,减少能量消耗;对底物的亲和力较强,提高对底物的利用效率。此外,嗜冷微生物(如Trichosporon pullulans、Bacillus psychrophilus、Aquaspirillum arcticum 和Arthrobacter globiformis)在环境温度突变(低温冲击)时会合成冷休克蛋白和冷驯化蛋白,作为转录增强子和RNA结合蛋白来发挥作用。

然而,即便是最嗜冷的微生物,其活性仍然依赖于细胞内存在的液态水。当细胞质冻结时,细胞可能保留其生存能力,但无法进行代谢活动。因此可通过细胞内水的凝固点确定允许嗜冷微生物生长的最低温度界限。细胞内累积某些有机和无机溶质(作为“抗凝”因子起[3]作用),可在一定程度上降低嗜冷微生物生长的最低温度界限。(二)嗜热微生物

1.嗜热微生物的分类

根据最高生长温度可将嗜热微生物划分为三类:最高生长温度为55~60℃的微生物属于嗜热微生物(thermophile),80~85℃属于极端嗜热微生物(extremely thermophile),85℃以上属于超嗜热微生物(hyperthermophile)。所有已知的嗜热细菌均属于嗜热微生物和极端[15]嗜热微生物,而绝大多数嗜热古菌属于超嗜热微生物。

2.嗜热微生物的多样性

地球上存在多种适于嗜热微生物生存的天然热环境,这些环境多数与火山活动有关,如温泉、火山和深海热泉等。此外,嗜热微生物也可在堆肥和煤矸石堆、家用或工业热水系统及高温工业过程(如纸[11]加工和食品加工)等环境中生存。

目前已从堆肥、土壤、鸟巢材料、木屑及其他环境分离到一些嗜热真菌,分别属于接合菌(如Rhizomucor miehei,R.pusillus)、子囊菌(如Chaetomium thermophile,Thermoascus aurantiacus)和丝状菌类(如Acremonium alabamensis,A.thermophilum)。某些藻类(如Achanthes exigua,Mougeotia sp.)和原生动物(如Cothuria [16]sp.Oxytricha falla)也能在高温下生长。[21]

Kashefi等报道从摩斯拉深海热泉(北太平洋)水样中分离3+2+到一种称为Strain 121的嗜热古菌,其可将Fe还原到Fe,在85~121℃温度下维持生长。以黄石国家公园和其他热环境放大的16SrRNA基因序列为基础的分子生态学研究表明,在高温环境下嗜热微生物的真实多样性远高于培养物种的多样性。这些环境中生存着至今未被培养出来的微生物,根据微生物分类学,它们属于新的科、目、[17,18]纲,甚至界。

3.嗜热微生物的环境适应机制

脂质、核酸和蛋白质等生物大分子本身不具备热稳定性,因此对于嗜热微生物而言,任何单一的保护机制均无法使其适应高温环境。嗜热微生物的环境适应机制包括以下几种:(1)嗜热微生物的膜脂质含有更多的饱和脂肪酸及直链脂肪酸,使得嗜热微生物细胞膜具有更高的流动性。(2)许多古菌拥有带蛋白质或糖蛋白的类结晶表面层(S层),能发挥外部保护屏障的作用。(3)在某些极端嗜热菌中已发现了与DNA结合的组蛋白样蛋白质,能够保护DNA。(4)极端嗜热菌含有一种反向促旋酶(一种Ⅰ型DNA拓扑异构酶),能引起DNA正超螺旋并稳定DNA。(5)热休克蛋白可通过自身的变性在蛋白质稳定和再折叠中发挥作用。(6)嗜热菌中的蛋白质也有一些特点,如疏水核心中结构级别较高,氢键和盐桥数量增加以及嗜热氨基酸(如自由度较少的脯氨酸残基)的比例较高。有报道称热稳定性高的蛋白质中精氨酸含量较高而丝氨酸含量较低。+(7)相容性溶质(如多胺类化合物)、细胞内K以及某些细胞内[19]溶质(如2,3-二磷酸甘油酸)累积可能有助于维持蛋白质稳定。(三)嗜酸微生物

1.嗜酸微生物的定义及生存环境

通常将最适生长pH低于3的微生物称为嗜酸菌(acidophiles)。它们广泛分布于各种酸性环境中,如含硫热泉、泥温泉等。这些环境通常与火山活动有关。另一种类型的酸性环境由微生物活动引起,化能自养菌可将环境中硫化物、硫元素和其他还原态硫化合物氧化生成硫酸,使周围介质酸化,此类微生物最佳生长pH范围大多较低;当富硫矿石露出表面时,化能自养菌对黄铁矿的氧化常导致形成高度酸3+[3]化并载有Fe的废水。

嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)在高于4~6的[19]pH范围内不能生长,在低至pH 0.5时仍可生长。古菌Picrophilus的最适生长pH为0.5,是目前已知最嗜酸的微生物,在pH [20]4以上会出现细胞溶解,且具嗜热特性(最适生长温度60℃)。真核生物Dunaliella acidophila是从高度酸性水和土壤中分离到的一种单细胞绿藻,是已知的最嗜酸生物之一,在pH 0~3范围内可以生长,[21]最适生长pH为1;另一种极端嗜酸且具嗜热特性的藻类是Cyanidium caldarium(Rhodophyta,红藻门),最适生长pH为2~3,[22,23]最低适生长pH 为0.2,最适生长温度57℃。

2.嗜酸微生物的环境适应机制

研究已证实,尽管嗜酸菌的生长介质是酸性,但其细胞内pH近于中性,细胞的酶和代谢过程通常与中性细菌相同。

嗜酸微生物适应外部酸性环境的机制一般有“屏蔽说”、“泵说”和“道南平衡说”3种解释。其中“屏蔽说”占主导地位。该理+-论认为,细胞质膜是两种环境的渗透屏蔽物,使外部H和OH不能进入细胞内进而维持胞内pH近中性。(四)嗜碱微生物

1.嗜碱微生物的分类

一般将最适生长pH高于9的微生物称为嗜碱微生物(alkaliphiles),其可耐受pH可高达10~12。中性条件或以下不能生长的嗜碱微生物称为专性嗜碱微生物(obligate alkaliphiles);在pH中性或以下可以生长的嗜碱微生物称为兼性嗜碱菌(facultative alkaliphiles)。在高pH条件下能生长,但最适值不在碱性pH范围内的[24]微生物称为耐碱微生物(alkalitolerant microorganism)。

2.嗜碱微生物的多样性

嗜碱微生物在自然界分布广泛,生存的自然环境包括热泉、南极、碳酸盐湖及碳酸盐荒漠、极端碱性湖等;人为碱性环境有石灰水、碱[20]性污水等。古菌、细菌和真菌均存在嗜碱微生物。

3.嗜碱微生物的环境适应机制+

嗜碱微生物能够维持细胞质pH在中性和弱碱性范围内。Na-H++反向运输是嗜碱菌细胞质碱化的基本原因。嗜碱微生物通过Na—H+++反向运输将Na向周围介质排出,并将H运输至胞内。除了调控H++++运输外,细胞还需重新吸收Na。Na偶合的同向转运和Na驱动的+[25]15鞭毛旋转可维持Na平衡。目前已从嗜碱菌Bacillus C中得到++++嗜碱微生物Na—H反向运输相关基因。除Na—H反向运输外,细胞外被作为胞内中性环境与胞外碱性环境的分隔,也是嗜碱微生物适应环境的原因之一。(五)嗜盐微生物

1.嗜盐微生物的定义及分类

嗜盐微生物(halophiles)是指生长最适盐浓度大于0.2mol/L(氯化物)的微生物。根据其生长的最适盐度,可将微生物分为以下6类(表1-3):表1-3 嗜盐微生物的分类及特征

2.嗜盐微生物的多样性

嗜盐微生物通常生存于盐湖、盐碱地、海水、晒盐池和盐渍食物等高盐环境中。目前从高盐环境中分离到杜氏盐藻、皮盐杆菌、盐沼盐杆菌、鳕盐球菌等。高盐海水及湖水具有粉色、红紫色即与有色嗜盐微生物(如杜氏盐藻)有关。

3.嗜盐微生物的环境适应机制

对于嗜盐微生物的环境适应机制,目前认为主要存在两种机制。

某些微生物(如Halobacteriales和Salinibacter)通过在细胞质内累积高浓度渗透调节剂(主要是KCl)维持渗透平衡,这种机制称为“内盐策略(the salt-in-cytopim strategy)”;多数极端嗜盐微生物包括古菌、细菌采用此种机制。利用内盐机制的微生物,细胞内蛋白质通常含有大量酸性氨基酸,有利于蛋白质形成水合外层,维持正常的构型和功能,且这些微生物的蛋白质通常需要内盐才具备活性和稳定性。

另外一些微生物(如杜氏藻属和其他真核生物)则通过累积相容性溶质维持渗透平衡,这种机制称为“相容性溶质策略(compatible solutes strategy)”。这种情况下,细胞内大分子等活性物质不需要[26]特殊适应机制。(六)嗜压微生物

1.嗜压微生物的分类

从深海中分离到的微生物通常无法在正常大气压下生存,需要加压环境维持生长,这些微生物被称作嗜压微生物(barophiles)。最适生长压力为正常压力,但能耐受高压的微生物称为耐压微生物。大[25]部分嗜盐微生物和耐压微生物属于γ-变形菌纲。

嗜压微生物必须生活在高静水压条件下,仅分布在深海底部和深8油井等少数环境。目前已从深海底部压强10Pa处分离到嗜压菌7Pseudomonas bathycetes;从油井深部约4×10Pa处分离到耐压的硫酸盐还原菌;在太平洋水深4000m处,已发现有4种酵母菌;在6000m深海中,已发现Micrococcus(微球菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)、Vibrio(弧菌属)和Spirillum(螺菌属)等细菌。

2.嗜压微生物的环境适应机制

嗜压微生物的耐压机制目前尚不清楚,部分学者认为其与微生物在高压下所产生的高分子量外壁蛋白有关;也有学者认为,海底微生物的孢子是嗜压微生物生存的基础。目前已进行了压力对细胞膜、蛋白质和基因表达影响的相关研究,结果表明,在高压环境中,嗜压微生物膜内单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的相对量会增加。不饱和度增加使膜更具流动性,可抵消高压导致的黏性增加;中度嗜压菌希瓦菌(Shewanella sp.)拥有压力调节操纵子,能在不同压力下产生[27]不同的DNA结合蛋白;光细菌SS9在不同压力下可表达两种外[28]膜蛋白质(孔蛋白)。这些细胞质膜蛋白被认为是受膜流动性控制的压力传感器。

由于实验室中嗜压菌培养的方法学问题,目前对微生物耐压、嗜压分子机制的了解远落后于对其他应激机制的了解。(七)抗辐射微生物

1.抗辐射微生物的定义及多样性

某些微生物可以耐受极高水平的伽马射线辐射,因此成为抗辐射微生物(radiation-resistant microorganisms)。抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)接触>25kGy(2.5Mrad)的伽马辐射后[3]仍能保持生存能力,而人类的伽马辐射致死剂量是5Gy;红色杆[29~31]菌属(Rubrobacter)也能够在高水平伽马辐射中存活;细菌域中一些其他种属也显示出较低的抗辐射能力,包括不动杆菌属[32][33](Acinetobacte)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、薄[34][35]层菌属(Hymenobacter)、动球菌属(Kineococcus)、[36][37]库克菌属(Kocuria)和甲基杆菌属(Methylobacterium)的一些物种。此外,一些古菌物种也具备抗辐射能力,包括强烈火球[38][39]菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcus abyssi、[40][41]Thermococcus gam matolerans、Thermococcus marinus[42]和 Thermococcus radiotolerans。

地球上的自然放射源的辐射水平非常低,但这些原核生物却能抵抗高剂量辐射,其原因尚不清楚。部分研究表明,抗辐射微生物的DNA修复能力可能是对长期干燥环境的适应性响应,而非对离子辐射[42]的适应性结果。环境证据也支持这种观点,大部分抗辐射细菌均发现于干土环境,仅从一个荒漠土壤样本中就已分离到9种奇异球[43]菌属(Deinococcus)抗辐射新物种。

2.抗辐射微生物的环境适应机制

抗辐射微生物自身保护机制之一是通过色素方式屏蔽辐射。暴露在高水平光照下的微生物一般含有类胡萝卜素和其他吸收波长在400[44]~500nm范围的色素以及可以吸收UV的色素。蓝藻细菌在细胞外鞘内累积吸收UV的化合物伪枝藻素(scytonemin)可有效过滤辐射;另一种在蓝藻细菌中广泛分布的UV保护性化合物为类菌胞素氨基酸(mycosporine-like amino acids)。这些 UV吸收性物质大多溶解[45]在细胞质中。

抗辐射微生物最重要的抗辐射机制是DNA修复机制。奇异球菌属拥有一套独特的DNA修复系统,能利用原核生物中都含有的正常DNA修复酶快速修复损伤DNA,并可采用多重染色体进行同源重组[46]。最近已在奇异球菌属中发现另一特殊的DNA修复途径,可促[47]进DNA单链及双链的断裂修复。奇异球菌属这种特殊DNA修复模式也存在于芽孢杆菌属的休眠内孢子中,后者也可抵抗极度干燥环境,这从另一方面对抗辐射和抗干燥之间的关联性提供了支持[48]。(八)其他极端微生物

寡营养细菌是一种能在每升含0.2~16.8mg溶解有机碳的介质中生长的微生物。在自然生态系统下,寡营养细菌和富营养细菌共存,其比例取决于特定微生物在特定环境中占据优势的能力。寡营养细菌3个体微小(细胞体积0.02~0.12μm),俗称超微细菌(ultramicrobacteria,UMB),通常生存于低营养的海水、淡水及土壤中,其环境适应机制因种属而异。寡营养细菌特别是海水中的寡营养细菌在低营养环境下呈球形,以增加表面面积与体积的比例,提高营养吸收能力。在此状态下,寡营养细菌往往停止生长,但仍保持存活。寡营养细菌具有极强的从大气中摄取营养物质的能力。氢气、氮气、一氧化碳等气体在任何环境中都微量存在,因此可能被寡营养细菌作为营养储备。

产甲烷古菌通常被认为是极端微生物,在多种盐度范围、低温及高温环境下已分离到产甲烷古菌,如从南极分离得到了Methanococcoides burtonii和Methanogenium frigidum,从热泉分离得到了Methanopyrus kandleri、Methanococcus jannaschii和Methanotorris igneus,从锡瓦什湖分离得到了Methanohalobium evestigatum。

耐毒素菌(可耐受有机溶剂、烃类和重金属)、嗜旱、耐旱菌(可在极低水活度下存活,如真菌Xeromyces bisporus和生存在岩石[49]中的石内微生物)也属于极端微生物。Inoue等从日本土壤中分离到耐甲苯的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)IH-2000;Later[50][51]等和 Nakajima等也分离得到几种耐甲苯的微生物;[52]Sardesai等从果阿邦曼多维河口沉积物和水样中分离到可耐受多种有机溶剂的Bacillus sp.SB1。这种菌株可在浓度为2%的正丁醇中生长,但在3%浓度下生长严重减缓。

革兰阴性菌通常比革兰阳性菌对有机溶剂耐受性更强。假单胞菌(P.putida、P.chlorophilus和P.syringe)对有机溶剂耐受性较高,可能[53]与其细胞表面特性有关。脂蛋白含量增加可能从物理上增强外部膜结构,有助于提高有机溶剂耐受。二、极端微生物的产业应用

极端微生物具有独特的生理特征和适应机制,存在巨大的生物技术应用潜力,是非常重要的生物资源。20世纪90年代以来,极端微生物及其相关产物的应用价值逐渐引起人们的广泛关注,成为新的研究热点。其产业应用主要包括化学物质(主要为活性物质)的应用和极端微生物本身的产业应用。

极端酶是极端微生物产生的特殊酶类,又称嗜极菌,能够在极端温度、pH、压力和离子强度下表现出生物学活性,因此能够较好的解决工业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾,在生物催化剂领域就有广阔的应用前景。目前极端酶已被应用于洗涤剂、食品工业、环境保护及有机固相酶催化合成。洗涤剂中的碱性蛋白酶即为极端酶,已占全世界洗涤剂产量的30%。从Thermococcus littoralis、Thermus aquaticus、Thermotoga maritime、Pyrococcus woesii和P.furiosus中得到的DNA聚合酶已被用于聚合酶链式反应。理想的淀粉糖化过程需2+要使用热稳定性酶,如无需Ca维持活性和稳定性的α-淀粉酶、淀粉普鲁南糖酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶,此类极端酶可在有限的[54~59]pH范围内发挥有效的淀粉水解作用。耐碱和耐热木聚糖酶[60~63]在纸浆预漂白可以降低氯的用量。

据报道,极端嗜热古生菌Thermococcus kodakaraensis KOD1的[64]固定化耐热伴侣蛋白CpkA和CpkB对酶具有稳定化作用。从嗜盐古菌中制得的myc致癌基因的真核同源基因已被用于检测癌症患者的血清,古菌同源产物比E.coli表达的重组蛋白质产生更多的阳性反应。

除蛋白质、酶类等生物大分子外,在极端微生物中发现的一些小分子物质如不饱和脂肪酸、抗生素及相容性溶质也已被应用于医药产业,作为溶剂或活性成分。其中相容性溶质也已通过转基因技术用于植物品种改良,以提高植物对水分胁迫和盐分胁迫的耐受能力。

绿藻Dunaliella bardawii被用于生产β-胡萝卜素。一种耐盐菌Marinobacter hydrocarbonoclasticus可降解多种脂肪烃和芳香烃[65][66]。最近,Nicholson和Fathepure开发出一种高度浓缩的嗜盐培养菌,能在1~2周内降解苯、甲苯、乙苯和二甲苯。奇异球菌属的重组菌株能在放射性混合的废弃环境中降解有机污染物。表达甲苯加双氧酶的重组菌株能使高度放射(60Gy/h)环境中的甲苯、氯苯、2,3-二氯-1-丁烯和吲哚氧化。即使甲苯和三氯乙烯的水平比许多放射性废弃场所高,它们仍能维持对溶剂的耐受性,表明此类基因重组的极端微生物在被多种有机污染物并存在放射性核素及重金属污[67]染的废弃场所中有潜在的生物修复作用。极端微生物中部分生[51]物分子的产业应用见表1-4。表1-4 极端微生物中部分生物分子的产业应用续表第三节 植物环境胁迫及其适应机制

自然界诸多环境因素如低温、干旱、盐渍等都会限制或影响植物的正常生长发育,其中干旱和盐渍是最普遍的两种胁迫因素。

干旱和荒漠化是目前的全球性问题,据联合国统计,农业土地中52%的土地受中度或严重的退化影响。由于干旱和荒漠化,全球每年失去1200万公顷的土地,相当于每分钟损失23公顷。盐渍化是导致土地退化的另一重要因素,土壤盐渍化是农作物生产中最严重的非生物逆境之一,目前全世界至少有20%的耕地遭受不同程度的盐渍化威胁。同时,我国耕地由于灌溉和施肥不当引起的次生盐渍化问题日益[68]恶化,对农业生产的影响逐年加重。一、水分胁迫及盐胁迫对植物的影响(一)水分胁迫对植物的影响

1.水分胁迫对植物外部形态的影响

植物生长过程对缺水最为敏感,轻微的水分胁迫即可导致生长缓慢或停止。受干旱危害的植物外形明显矮小,茎生长受抑制,降低了茎和根之间正常生长比例,根冠比增大。

干旱也影响植物叶片的正常生长,抗旱性不同的作物在叶片茸毛、蜡质、角质层厚度、气孔数目和开度以及栅栏细胞的排列上都存在着差异。叶形、叶色取向亦与抗旱性有关,淡绿、黄绿色叶比深绿色叶反射更多的光,维持较低的叶温而减少水分散失。

2.水分胁迫对植物生理生化的影响

水分胁迫对植物的光合作用、呼吸作用以及细胞内蛋白质、激素等活性物质的合成和活性均有影响:(1)对光合作用的影响:

干旱胁迫下,植物的光合作用迅速下降。水是光合作用的原料,当叶片接近水分饱和时,光合作用最适宜。当叶面缺水达植株正常含水量的10%~12%时,光合作用降低;当缺水达20%时,光合作用显著被抑制。(2)对呼吸作用的影响:

干旱对呼吸作用的影响比较复杂,大多数植物受到严重干旱胁迫时,呼吸强度下降。但某些植物在干旱时呼吸强度增高,如洋常春藤增加34%~67%,小麦增加6%等。出现这种现象的原因可能是由于植物线粒体膜受到破坏,阻碍了呼吸链电子传递过程,有氧呼吸被抑制,因巴斯德效应而增加了无氧呼吸的结果。(3)对渗透调节能力的影响:

植物在干旱胁迫下,细胞除失水浓缩外,还能通过代谢活动增加细胞内的溶质浓度,降低渗透势,从而使细胞保持一定的膨压以维持正常的生命活动。小米、高粱、小麦、棉花等作物已被发现抗旱品种比不抗旱品种的渗透调节能力更强,植株在维持膨压的情况下渗透势更低。(4)对质膜透性的影响:

植物在干旱胁迫下的膜伤害与质膜透性的增加是干旱伤害的本质之一。植物在干旱条件下所积累的生物自由基及其所诱导的过氧化氢等有毒物质,直接或间接启动膜脂的过氧化作用,导致膜的损伤,电解质大量外渗,质膜透性增加。(5)对蛋白质的影响:

干旱条件下,植物发生脱水,细胞内蛋白质合成减弱而分解作用加强,使植物体内蛋白氮减少而游离的氨基酸增多。(6)对激素的影响:

干旱条件下,萎蔫对植物体内源激素的影响,总的规律是促进生长的激素减少而抑制生长的激素增多,其中最明显的是脱落酸含量增加。(7)对酶活力的影响:

干旱胁迫可以影响植物体内多种酶的活力。抗旱性强的植物在干旱条件下有较低的核糖核酸酶和磷脂酶的活性,抗旱性弱的植物则表现相反。过氧化物酶活性与大豆抗旱呈负相关,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)对植物的抗旱性影响很大,小麦幼苗SOD活性与幼苗抗旱性呈正相关,因此,SOD活性可以作为抗旱评价指标。[69,70](二)盐分胁迫对植物的影响

1.盐分胁迫对植物外部形态的影响

盐分胁迫造成植物发育迟缓,抑制植物组织和器官的生长和分化,使发育进程提前。植物被转移到盐逆境中几分钟后,生长速率即有所下降,其下降程度与根际渗透压呈正比。

盐胁迫下,植物根系最早感受逆境胁迫信号,并产生相应的生理反应,继而影响地上部生长,盐胁迫常导致植物根系生长受抑制。

盐分会增加豆类、棉花叶片的表皮厚度、叶肉厚度、栅栏细胞长度、栅栏细胞直径和海绵细胞的直径。相反,红树植物小花鬼针草叶片中,表皮和叶肉的厚度及细胞间隙会随NaCl处理水平的升高而迅速减小。

2.盐分胁迫对植物生理生化的影响

盐分胁迫与水分胁迫存在关联,对植物的光合作用及细胞内蛋白质等活性物质的合成、活性及代谢均有影响。(1)对植物光合作用的影响:

盐胁迫显著降低植物的光合作用。原因主要有四个方面:影响CO扩散到结合部位;改变负责光反应的细胞器的结构和功能;改变2暗反应的化学过程;抑制同化产物转移。(2)对脂类的影响:

包括蓝藻在内的很多生物中,脂类对于很多生理胁迫的耐受有重要的作用。不饱和脂肪酸可以消除水胁迫和盐胁迫的危害。盐分胁迫下,盐沼草根部质膜中脂类的成分会发生改变,而且固醇和磷脂的摩尔比会随着盐分的增加而降低,但固醇/磷脂不受影响。(3)对离子水平的影响:

盐分胁迫下,植物吸收矿物元素的过程中,盐离子与各种营养元素相互竞争而造成矿质营养胁迫,打破离子平衡,严重影响植物正常+++生长。高浓度Na严重阻碍植物对K的吸收和运输,导致K缺失。(4)对抗氧化酶及抗氧化剂的影响:

盐分胁迫影响植物体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等抗氧化酶的活性。通常盐分胁迫下,植物体内抗氧化酶活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关。(5)对氮代谢的影响:

硝酸还原酶具有催化到的还原作用,这种酶对盐分胁迫较敏感。盐胁迫下植物叶片内硝酸还原酶活性不同程度的降低,引起其反应底物的累积,使含氮化合物的代谢紊乱,叶片总氮含量下降,叶片DNA,RNA含量及RNA/DNA值下降。二、植物的水分胁迫及盐胁迫适应机制

水分胁迫及盐胁迫下植物具有多重适应机制,如活性氧清除机[71,72]制、离子稳态调节机制及渗透调节机制等。其中渗透调节机制是植物在水分胁迫及盐胁迫下均存在的适应机制。

植物的渗透压调节机制主要是通过吸收和合成无机离子及有机渗透调节物质,维持较高的细胞质渗透压,保证细胞的正常生理功能。部分植物在水分胁迫及盐胁迫下同时存在吸收无机离子和合成有机渗透调节物质两种渗透调节机制。(一)无机离子的吸收

水分胁迫及盐胁迫下,盐生植物可从土壤或细胞外界溶液中吸收积累各种无机离子,提高细胞内盐分浓度。盐生植物碱蓬(Suaeda glauca)、星星草(Puccinellia tenuiflora)、獐茅(Aeluropus littoralis)+-+体内以无机离子 Na、Cl、K作为主要渗透调节物质。而非盐生植+物高粱、芦苇则主要以K和有机渗透调节物质为主。(二)有机渗透调节剂的积累

水分胁迫及盐胁迫下植物合成和积累的有机渗透调节物质主要为小分子有机渗透调节物质,如脯氨酸(proline)、甜菜碱(betaine)、游离氨基酸(free amino acids)和多元醇(polyols)等。

1.脯氨酸的积累

脯氨酸是水溶性最强的氨基酸,是组成植物蛋白质的主要氨基酸之一。水分胁迫及盐胁迫下,许多植物都积累高水平的脯氨酸。自Kemple等于1954年首次发现受旱的多年生黑麦草(Lolium poreve)叶片中存在游离脯氨酸积累后,脯氨酸积累与水分胁迫及盐分胁迫的关系得到了广泛的研究和证实。

水分胁迫及盐胁迫下,植物体内蛋白质合成受抑制而分解被促进,使氨基酸含量上升,其中最突出的就是脯氨酸含量的上升,而且脯氨酸含量的上升与胁迫程度呈正相关。

脯氨酸在植物水分胁迫及盐分胁迫中的作用主要有以下几个方面:在胁迫条件下的植物特别是真盐生植物,细胞中吸收和积累大量的盐分,其中的大部分盐离子被区隔化在液泡中,液泡水势较低,造成细胞质脱水。此时,细胞质合成一定数量的脯氨酸和其他可溶性有机物质,增大细胞质浓度,以防止液泡从细胞质中吸水,避免细胞质受到影响。盐分胁迫下细胞内正常氮代谢受到干扰,使之趋向积累渗透质,特别是脯氨酸的生物合成被明显激活。

游离脯氨酸的积累对于降低细胞内溶质的渗透势、均衡原生质体内外的渗透强度、维持细胞内酶正常的结构和构象、减少细胞内可溶[73]性蛋白的沉淀等具有重要的作用。Delauney和Verma认为,植物体内脯氨酸合成主要有两条途径:谷氨酸途径和鸟氨酸途径,其合成途径的主要区别在于初始底物的不同,分别为谷氨酸和鸟氨酸。在胁迫和氮素缺乏的情况下,谷氨酸途径是主要途径;而在氮素供应充足的情况下,鸟氨酸途径占主导地位。不同植物品种、不同生长阶段、[74]不同部位,胁迫条件下脯氨酸的积累均存在差异。彭志红等认为,脯氨酸积累的原初部位主要是叶,其次是茎,其他部位的脯氨酸来自叶片。在离体叶片、茎和根经受同样程度的缺水时,离体叶和茎均可积累脯氨酸,而离体根没有脯氨酸的积累。

2.甜菜碱的积累

甜菜碱是一类季铵化合物,植物中的甜菜碱有12种,最简单的、研究最多的是甘氨酸甜菜碱。许多高等植物,尤其是藜科和禾本科植物,在受到水分胁迫和盐分胁迫时积累大量甜菜碱;其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。甜菜碱作为无毒害的渗透调节剂能够维持细胞膨压,并稳定酶和细胞膜结构,清除自由基。离体试验结果表明,甜菜碱对许多酶的活性均无抑制作用,但能解除高盐对酶的伤害或保护酶的活性。

3.非结构性碳水化合物的积累

非结构性碳水化合物(如多元醇、蔗糖、果聚糖、海藻糖葡萄糖、果糖等)是参与植株生命代谢的重要物质,但不参与植物体的形态构建。参与植物体渗透调节的非结构性碳水化合物主要为可溶性糖类。“糖信号”的研究目前已成为植物学领域的一个热点。胁迫条件下植物体内碳水化合物的代谢发生变化,总的趋势皆为淀粉的积累下降,而可溶性糖积累增多,并伴有有机酸、多元醇、甜菜碱、游离氨++-基酸和K、Na、Cl、等矿质元素的变化,从而维持胁迫下植物生长发育所需的膨压,减轻胁迫对植物的伤害。水分胁迫下,蔷薇科木本果树(叶片)中积累的非结构性碳水化合物主要是山梨醇。(1)多元醇的积累:

多元醇包括开链式代谢物,如甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)和环多元醇,如肌醇(inositol)、松醇(pinitol)。多元醇的积累与植物对干旱和盐分的耐受性有关。甘露醇和肌醇生物合成所需酶基因Inol和Imtl已从冰草中成功克隆,在冰草发育的任何阶段都受到严格的控制,只在盐胁迫下或低温下才被诱导表达。(2)蔗糖的积累:

植物体内蔗糖代谢水平常用于衡量环境对植物胁迫的程度及植物对环境的适应性。蔗糖合成途径中,FBPase(果糖-1,6-二磷酸酯酶)是重要的限速酶,受叶绿体光合碳同化中间产物磷酸丙糖的调控。由于不同植物叶绿素含量、光合作用受抑制程度与植物抗性呈负相关,所以抗性强的植物,磷酸丙糖浓度相对较高,蔗糖合成受阻小,降幅也小,反之降幅大。(3)果聚糖的积累:

果聚糖是植物营养组织碳水化合物的主要暂贮形式。它是细胞中的可溶性组分,因而可参与植物的渗透调节。在水分胁迫及盐分胁迫下植物体内果聚糖含量也有增加。(4)海藻糖的积累:[75]+

Garcia等发现水稻在盐分胁迫下可积累海藻糖,减少Na积累,防止叶绿素降解,保护根的完整性并促进其生长。参考文献

[1]方金瑞,黄维真.海洋极端微生物的分离及其开发研究:Ⅰ嗜碱、嗜冷微生物的分离及其产生的活性物质.中国海洋药物,1996,15(1):5-10.

[2]Rothschild LJ,Mancinelli RL.Life in extreme environments.Nature,2001,409(6823):1092-1101.

[3]Rainey FA,Oren A.Extremophiles.Methods in microbiology.New York:Academic Press,2006.st

[4]Seckbach J,Oren A.Introduction to the extremophiles.1 edition.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,2004.

[5]陈秀兰,张玉忠,高培基.适冷微生物及其适冷机制研究进展.中国生物工程杂志,2003,23(2):86-90.

[6]Morita RY.Psychrophilic bacteria.Bacteriological Reviews,1975,39(2):144-167.

[7]Cavicchioli R.Cold-adapted archaea.Nature Reviews Microbiology,2006,4(5):331-343.

[8]Feller G,Gerday C.Psychrophilic enzymes:hot topics in cold adaptation.NatureReviews Microbiology,2003,1(12):200-208.

[9]Morita RY,Moyer CL.Origin of psychrophiles,in stEncyclopedia of Biodiversity.1 edition.New York:Academic Press,2001.

[10]唐兵,唐晓峰,彭珍荣.嗜冷菌研究进展.微生物学杂志,2002,2(1):51-53.

[11]Cowan DA,Russell NJ,Mamais A,et al.Antarctic Dry Valley mineral soils contain unexpectedly high levels of microbial biomass.Extremophiles,2002,6(5):431-436.

[12]Rivkina EM.Friedmann EI,McKay CP,et al.Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point.Applied and Environmental Microbiology,2000,66(8):3230-3233.

[13]Irgens RL,Gosink JJ,Staley JT.Polaromonas vacuolata gen.nov.,sp.nov.,a Psychrophilic,Marine,Gas Vacuolate Bacterium from Antarctica.International ournal of Systematic Bacteriology,1996,46(3):822-826.

[14]Satyanarayana T,Raghukumar C,Shivaji S.Extremophilic microbes:diversity and Perspectives.Current Science,2005,89(1):78-90.

[15]周璟,盛红梅,安黎哲.极端微生物的多样性及应用.冰川冻土,2007,29(2):286-291.

[16]Kashefi K,Lovely DR.Extending the upper temperature limit for life.Science,2003,301(5635):934.

[17]Barns SM,Delwiche CF,Palmer JD,et al.Perspectives on archaeal diversity,thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences.Proceedings of the National A-cademy of Sciences,1996,93(17):9188-9193.

[18]Hugenholtz P,Pitulle C,Hershberger KL,et al.Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring.Journal of Bacteriology,1998,180(2):366-376.

[19]Kelly DP,Wood AP.Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen.nov.,Halothiobacillus gen.nov.and Thermithiobacillus gen.nov.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2000,50(2):511-516.

[20]Schleper C,Puhler G,Holz I,et al.Picrophilus gen.nov.,fam.nov.:a novel aerobic,heterotrophic,thermoacidophilic genus and family comprising archaea capable of growth around pH 0.Journal of Bacteriology,1995,177(24):7050-7059.

[21]Pick U.Dunaliella acidophila-a most extreme acidophilic alga,in Enigmatic Microorganisms and Life in Extreme Environmental stHabitats.1 editon.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,1999.

[22]Seckbach J.Evolutionary Pathways and Enigmatic Algae:stCyanidium caldarium(Rhodophyta)and Related Cells.1 editon.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,1994.

[23]Seckbach J.Enigmatic Microorganisms and Life in Extreme stEnvironmental Habitats.1 editon.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,1999.

试读结束[说明:试读内容隐藏了图片]

下载完整电子书


相关推荐

最新文章


© 2020 txtepub下载