作者：代淑娟、周东琴、魏德洲、刘长风 著
出版社：化学工业出版社
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重金属污染废水的微生物修复技术试读：
前言
重金属是对生态环境危害极大的一类污染物，含重金属离子废水的处理一直受到人们的关注，当重金属离子的浓度很小时，传统的处理方法处理效率较低且操作费用和原材料的成本相对过高。重金属污染废水的微生物修复技术是近30年来发展起来的新技术，因微生物成本低、来源广且适合处理低浓度的重金属废水而受到广泛关注。
本书介绍了微生物的基础知识，重金属污染废水的微生物修复概述，适宜修复重金属染污废水的吸附微生物——苦味诺卡菌、草分枝杆菌、沟戈登菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、工业废菌和水洗工业废菌的特性和重金属离子的物理化学性质，利用生物吸附过程各种参数的变化。对含铅、镉、铜等重金属废水的生物吸附过程进行了系统的分析和探讨，完善了吸附重金属微生物与废水的固液分离处理工艺，并对微生物与废水中重金属的作用机理，吸附剂再生及吸附剂综合利用技术等作用机理做了较详细研究。
本书写作过程中，得到了东北大学朱一民教授、刘文刚副教授的鼓励和帮助，得到了辽宁科技大学研究生院、矿业工程学院的大力支持，作者在此表示衷心感谢！
由于作者代淑娟(辽宁科技大学)、周东琴(北京矿冶研究总院)、魏德洲(东北大学)和刘长风(沈阳化工大学)水平有限，时间较仓促，书中疏漏之处在所难免，恳请读者批评指正。作者2014年12月第1章 微生物基础知识1.1 微生物概述
微生物是一个总称，特点是个体小、分布广、繁殖快。个体一般只有零点几微米到几微米，需要借助显微镜才能看得见。
全部生物按照细胞核结构和细胞器分化的差异，分为原核生物和真核生物。
原核生物是具有原核细胞的生物。原核细胞的核发育不完全，只有一个核物质高度集中的核区，不具核膜，核物质裸露，与细胞质没有明显的界限，没有分化的特异的细胞器，只有膜体系的不规则泡沫结构，不进行有丝分裂。原核生物包括细菌、放线菌、蓝绿细菌、立克次体、黏细菌、螺旋体、支原体以及衣原体。
真核生物是具有真核细胞的生物。真核细胞内有发育完好的细胞核，具有核膜，并且细胞核和细胞质具有明显的界限。真核细胞具有高度分化的特异细胞器，进行有丝分裂。真核生物包括酵母菌、霉菌、除了蓝藻以外的藻类、原生动物、高等和低等动物以及高等和低等植物。
在环境工业上采用的修复微生物主要是原核生物——细菌，有时也用藻类。1.2 微生物的分类等级
微生物分类是十分复杂的，关于微生物的知识也是在科学技术的发展过程中逐渐认识的。关于生物分类的演化存在有多重方案和观点。[1]代表观点主要有五界系统和最近提出的三域系统。1969年Whittaker提出了五界分类系统的观点。这五界是：原核生物界、原生生物界、真菌界、动物界和植物界。细菌是原核生物界的下一级的细菌门，见图1.1。为了研究各种微生物客观存在的生物属性及其亲缘关系，按照次序排列分类系统，从大到小分为界、门、纲、目、科、属、种七个级别。在两个分类单位之间可以有亚界、亚门、亚纲、亚目、亚科、亚属、亚种及其变种等次要的分类单位。图1.1 生物学的五界分类系统
CarlWoese及其合作者经过研究提出了生物分为三个不同类群，即细菌、古生菌和真核生物的观点。这三个基本类群构成三个域，即细菌域、古生菌域和真核生物域。域是放在门和界水平之上，而Whittaker提出的界分布在域之中，见图1.2。图1.2 普遍性系统发育树
在这样的分类系统中，它们的亲缘关系有次序地分门别类排成一个从大到小的系统：界Kingdom>门Division(亚门)>纲Class(亚纲)>目Order(亚目)>科Family(亚科)>属Genus(亚属)>种Species(亚种、变种、株)。种是分类系统中最小的单位。
微生物学家采用双名系统命名微生物，即用两个拉丁文命名一个微生物的种。这个种的第一部分要求首写字母大写，是属名，第二部分要求字母小写，是种名。同时要求写种名时，采用斜体的拉丁文来表示。细菌如果只鉴定到属，没有鉴定到种，则该细菌的名称只有属名，没有种名，在属名后面加上sp.(单数)或spp.(复数)，sp.和spp.代表种的缩写，例如Bacillussp.(spp.)等。1.2.1 微生物的化学组成
微生物细胞的化学元素都是由碳、氧、氮、磷、硫、钾、钙、镁、钠和铁等主要元素组成。微生物细胞中含量最多的是水分，约占菌体鲜体重的70%～90%。除去水分的干物质部分，碳、氢、氧和氮4种元素占全部干重的90%～97%，其余的3%～10%为矿物质元素，亦称无机元素。
各种微生物细胞干物质的含碳量比较稳定，约占干重的50%±5%。氮元素含量在各类微生物中差别较大，约为干重的5%～13%。在矿物质元素中以磷的含量为最高，约占全矿物质含量的50%，占细胞干物质总量的3%～5%；其次为钾、镁、钙、硫、铁及钠等。
微生物细胞中的绝大部分元素组成了细胞的各种有机物质，主要的有机物是蛋白质、核酸、碳水化合物及脂类等，其含量见表1.1。表1.1 微生物细胞中主要有机物的含量(占细胞干重/%)1.2.2 微生物的营养物质
微生物生长过程中需要从外界环境中摄取营养物质，经过一系列生物化学反应，转变成细胞的组分，同时产生废物排泄到体外，这一过程称为代谢。营养物是指能够满足微生物生长、繁殖和完成各种生命活动所需的物质。当这些物质被微生物吸收后，可参与微生物细胞的组成、构成酶的活性成分和提供微生物各种生命活动所需的能量。营养物质不充分，供应不足，微生物的生长将受到限制。微生物的营养物质可以分为大量营养物质、微量营养物质和特殊营养物质。大量营养物质是微生物需求量相对较大的元素，主要用于合成糖、脂类、蛋白质、核酸、酶和辅助因子。主要由C、O、H、N、S、P、K、Ca、Mg和Fe组成微生物细胞，C、H、N、S和P是合成糖、脂类、蛋白质及核酸的主要部分，而K、Ca、Mg和Fe则是以离子的形式存在于微生物的细胞中，它们起着不同的生理功能作用。微生物的新陈代谢还需要微量营养物质，例如Mn、Zn、Co、Mo、Ni和Cu，它们可作为酶或辅助因子的组分辅助催化反应，维护蛋白质结构的稳定。除了大量元素和微量元素外，有些微生物需要特殊营养物质。微生物需要的主要营养物质分别介绍如下。
(1)碳 碳一方面作为细胞的组成部分，是构成所有有机分子骨架或主链所必需的。另一方面，对有些微生物来说，碳源提供了能源。不同的微生物利用不同的碳源。例如光能自养微生物和化能自养微生物利用无机碳源，如CO；所有化能异养微生物利用有机碳源。有机2碳源较为广泛，其中糖类是微生物最容易利用的碳源，有机碳源有糖与糖的衍生物：脂类、醇类、有机酸、烃类化合物、芳香族化合物及各种含氮物质。
(2)氮 凡是能够提供给微生物含氮物质的营养物称为氮源。氮源一般作为合成细胞物质中蛋白质、核酸等重要生物分子的原料，氮一般不作为能源。少数自养菌利用铵盐、硝酸盐作为菌体生长的氮源和能源。氮源有N、NH、尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠、23氨基酸和蛋白质等。氮的主要作用是合成氨基酸、嘌呤、嘧啶、某些糖和脂类、酶的辅助因子及其他物质。许多微生物以氨基酸为氮源，而氨可以在谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶的作用下加以利用。
(3)磷 所有的微生物都需要磷酸盐，它对微生物的生长、繁殖、代谢起着极其重要的作用。磷主要存在于核酸、磷脂、核苷酸(如ATP)、一些辅助因子、某些蛋白质和其他细胞组分中。磷是微生物细胞合成核酸、核蛋白、磷脂和其他含磷化合物的重要元素，也是许多重要辅酶的元素，几乎所有微生物可将无机磷酸盐作为磷源直接利用，当微生物的磷供应不足时，造成微生物的磷酸盐饥饿，生长受到抑制。
(4)硫 硫主要用于合成蛋白质中的半胱氨酸、甲硫氨酸、某些碳水化合物和硫胺素。硫胺素、生物素、谷胱甘肽等都含有巯基(—SH，也称为硫氢基)。硫是在代谢过程中起重要作用的物质，硫或硫化物是某些自养微生物的能源。
(5)镁 镁是异糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、肽酶、羧化酶等的活化剂。镁是有机体中一些重要酶的组成成分。此外，镁在细胞中还起着稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用。因此，微生物生长需要一定量的镁，如果缺乏镁，细胞的生长就会停止，而首先遭到破坏的是核糖体和细胞膜。不同的微生物对镁的需求量不同，革兰阳性菌对镁的需求量比革兰阴性菌的需求量大10倍。微生物需要的镁源有硫酸镁及其他镁盐。
(6)铁 铁是细胞中过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、细胞色素酶的组成成分。缺铁会使这些酶的合成受到阻碍，并使生长受到影响。铁在细胞色素和铁氧还原蛋白的氧化还原反应中作为一种必不可少的电子载体。铁是铁细菌的能源，在氧化铁的过程中获取能量。
(7)钾 钾是细胞中的重要阳离子，它是许多酶的激活剂。钾离子对磷的传递、ATP的水解、苹果酸的脱羧作用等起到重要作用。钾源有各种无机钾盐，特别是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。
(8)钙 钙也是细胞内的重要阳离子，它是某些酶(例如蛋白酶)的激活剂。钙离子能够起到稳定细胞壁的作用。
(9)铜 铜是一些酶的组成成分。
微量元素有钼、锌、锰、钴、镍、铜、碘、溴、钒等，它们是维持微生物正常生长发育所必需的物质，往往非常强烈地刺激微生物的生命活动。这是由于许多微量元素参与酶蛋白的组成或者很多酶受它-7们的活化。一般在培养基中含有1×10mol/L或更少就可满足需要。过量的微量元素反而会引起毒害作用，特别是一种过量微量元素单独存在时更为严重。微量元素之间有协同作用，也有拮抗作用。铁、锌、锰可促进铜的作用，锰却抵消锌的促进作用。1.3 微生物的营养类型
微生物种类繁多，营养条件各异。按照微生物所需的营养碳源、能源、电子来源，可将其分为不同的营养类型，见表1.2。表1.2 碳源、能源和电子来源
根据碳素来源不同，可将微生物分为自养型(利用CO)及异养型2(利用有机物)两大类；根据能量来源的不同，也可将其分为光能营养型(利用日光能)及化能营养型(利用无机或有机物氧化作用所产生的化学能)两大类。尽管微生物代谢类型多种多样，但根据它们对碳源、能源、电子的最初来源，并兼及电子供体的不同情况，将微生物分作光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型、化能有机异养型4种营养类型，见表1.3。表1.3 微生物的营养类型
在微生物中光能无机自养型或化能有机异养型占大多数。尽管某一特定微生物通常属于上述四种营养类型中的一类，但微生物有时在代谢方面会表现出很强的灵活性，会随着环境条件的改变而使其代谢类型发生改变。这些微生物有时被称为兼养型(mixotrophic)，因为它们兼有化能无机自养型和异养的代谢过程。1.3.1 化能无机自养型微生物
化能无机自养型微生物生长需要无机物，在氧化无机物的过程中获取能源，同时，无机物又作为电子供体，使二氧化碳还原为有机碳化物。化能无机自养型微生物不具有色素，不能进行光合作用，合成有机物需要的能源无机物有及H2等，通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)。
化能营养型的一般通式如下：(1.1)
几乎全部化能自养型菌为专性需氧菌。自然界中此类菌种虽少，仅30余种，但其专性很强，一种菌只能氧化一种特定的无机物，它们在自然界物质循环中的作用至关重要。化能无机自养菌的主要生理性状见表1.4。表1.4 化能无机自养型细菌主要生理性状1.3.2 光能自养型微生物
光能自养型微生物体内含有光合色素。这类微生物需要阳光作为能源，依靠体内光合作用色素(例如细菌叶绿素、类胡萝卜素、藻蓝素、藻红素、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c、叶绿素d等)，以CO作2为碳源，以无机物作为电子供体使CO还原并合成菌体细胞有机物。2藻类、蓝细菌、红硫菌、绿硫菌等属于此类。
光能自养型微生物根据供氢体不同分两大类。一类的供氢体为HO，从HO的光解中获得H，通常称为植物的光合作用。例如：222(有机物的代表式)+O2(1.2)
这一类微生物有蓝绿细菌和真菌类。
另一类为细菌光合作用，它的供氢体为HS和H(见表1.5)。光合22细菌(绿硫菌)反应如下：(有机物的代表式)+O2(1.3)表1.5 植物和细菌光合作用的比较1.3.3 化能异养型微生物
化能异养型是微生物最普遍的代谢方式。这类微生物的碳源与能源均来自有机物，微生物依靠氧化有机物产生化学能而获得能量，利用这部分能量供给微生物合成作用之需。这类微生物有细菌、放线菌、全部真菌。1.3.4 光能异养型微生物
光能异养型微生物利用光作为能源，以有机质作为电子供体，其碳源来自有机物，也可利用二氧化碳。然而，营养物质如何进入细胞的问题至今并未全部弄清。细菌经过染色后，即可在光学显微镜下观察微生物的形状和结构。观察细菌的形态可用简单染色法或革兰染色法。1.4 细菌形态特征1.4.1 细菌的形态
细菌的形态有多种多样，在正常情况下细菌的形态是相对稳定的，当改变培养基的化学成分、浓度、pH值、培养时间以及培养温度[2]时，会引起细胞形态的改变，或者导致细菌死亡，或者出现畸变。尽管细菌的形态有多种多样，但其基本形态有三种，即球状、杆状、螺旋状，分别称为球菌、杆菌、螺旋菌。1.4.1.1 球菌
球菌形态上为球状或橄榄状。按照其排列的方式，可分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌及其葡萄状的葡萄球菌,见表1.6。表1.6 球菌形态和排列方式1.4.1.2 杆菌
杆状细菌的细胞呈杆状。按照细菌细胞的排列方式可以有单杆状、链杆状,见表1.7。杆菌的长宽比差别比较大，不同种之间杆状端部的形态常变化多端，可以是扁平的，也可以是圆形、雪茄状的或分叉状的。表1.7 杆菌的形态1.4.1.3 螺旋球菌(弧菌)
螺旋菌为螺旋卷曲形状。细菌个体的长度、螺旋的数目和螺距随菌的不同而不同。螺纹不满一周的为弧菌，弧菌可以互相连接成为螺旋菌,见表1.8。表1.8 螺旋菌的形态1.4.2 细菌的大小
细菌的个体是十分细小的，要用微米为单位进行测量。一般来说，细菌个体有零点几微米到几微米，要借助显微镜才能观察。不同的细菌其大小并不相同，球菌为0.5～2.0μm，杆菌为(2.0～3.0)μm×(0.5～1)μm，螺旋菌为(0.3～2)μm×(1～20)μm。细菌的大小变化多端，甚至报道有更小的细菌，即为纳米细菌或超微细菌。它们的直径范围只有0.5～0.02μm。在细菌发育的过程中，刚分裂的新生细菌小，而随着细菌的发育个体渐渐长大，到老龄细菌则菌体又会变小。1.5 细菌的细胞结构
细菌是单细胞的微生物，其细胞中有各种各样复杂的结构，有一般结构和特殊结构。一般结构包括细胞壁、细胞质、内含物、细胞核物质，为所有细胞具有。而芽孢、荚膜和鞭毛等为特殊结构，为某些细菌所特有，也是细胞分类的特征，其功能不同。细菌的细胞结构见图1.3，功能见表1.9。应当指出并非所有的结构在每一属种的原核细菌中都同时出现。图1.3 细菌细胞结构的示意图表1.9 细菌细胞结构的功能1.5.1 细胞壁
细胞壁是细胞结构中最重要的结构之一，通常相当坚硬，位于细胞表面、内侧紧贴细胞膜的较为坚韧，略具弹性的外壁。细胞壁又是多孔性的，水和某些化学物质可以通过而进入细胞内。1884年丹麦的ChristianGram发明了革兰染色技术之后，按照革兰染色结果将细菌分为两大类群，即为革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。这两类细菌在其细胞膜的化学成分和结构上有极大的区别,见表1.10。革兰阳性菌的细胞壁是约为20～80nm厚的肽聚糖多层结构，含磷壁酸及少量蛋白质和脂肪。革兰阴性菌的细胞壁很薄，约为10nm厚的多层结构，由肽聚糖和外壁层组成。肽聚糖层约2～3nm厚，紧贴近细胞质膜，在它的外侧，其表面不规则，呈波浪形，由脂多糖、脂蛋白和脂类等组成，见图1.4。表1.10 革兰阴性菌和革兰阳性菌的比较注：+表示有；-表示无。图1.4 细菌细胞壁的结构
采用革兰染色技术可将细菌分为革兰阴性和革兰阳性两类，其方法是：先将结晶紫染料溶液加到已经固定在载玻片上的细胞上，然后用碘溶液处理。碘与结晶紫生成一种不溶于水的络合物，它溶解于乙醇，用乙醇处理细胞，最后用复染液(沙黄或番红)复染，显微镜下呈-红色者为革兰反应阴性细菌(G)，呈深紫色者为革兰反应阳性细菌(G+)。1.5.2 细胞膜
细胞膜对任何生物体来说都是绝对必要的。细胞不仅能够获得营养和排出废物，而且在面临外部环境变化时还应能维持其内部结构处于稳定且高度有序状态。细胞膜又称原生质膜或质膜，是外侧紧贴于柔软而又富有弹性的半透明薄膜，控制着物质输送入细胞质及从细胞质内向外输出。细胞膜是很薄的结构，厚度在5～10nm，质量占菌体干重的10%，其中含有60%～70%的蛋白质，30%～40%的脂类，约2%的多糖。所含的蛋白质与膜的透性和酶活性有关，脂类是磷脂，与磷酸、甘油、脂肪酸和含氮碱有关。细胞膜是具有可以选择性渗透功能的屏障，它允许特定的离子和分子进入细胞，并且阻止其他物质的穿行。营养物质的吸收、废物排出以及蛋白质分泌等都是膜上运输系统的任务。
细胞膜的结构十分复杂，它具有“膜单位”结构，上下两层致密的着色层被一不着色区域分开；由具有正、负电荷，有极性的磷脂分子组成，大多数的脂类在结构上是不对称的，具有极性端和非极性端，称为亲水疏水两重性的分子，形成双层结构。极性端(X部分)与水相互作用，为亲水性，分布于外表面。非极性端(R部分)不溶于水，并趋向于互相结合，为疏水性。
有的蛋白质主要由外侧深入膜的中部，有的甚至穿过两层磷脂分子，膜表面的蛋白质还带有多糖。有些蛋白质在膜内的位置不固定，有活动性，能转动和扩散。
细胞膜具有多种生理功能，它可以维持渗透压梯度和溶质的转移。在细胞膜上有合成细胞壁和形成横膈膜组分的酶，细胞壁在膜表面合成。由于细胞膜上具有多种酶，细胞膜也是氧化代谢和能量产生的部位。鞭毛基粒在细胞膜上为鞭毛提供附着部位。1.5.3 细胞质
细胞质是细胞膜以内，除核物质以外的无色透明、黏稠的复杂胶体。细胞质pH值为7，由蛋白质、核酸、脂类、多糖、无机盐和水组成。细胞质内还含有某些结构和内含物，例如核糖体、载色体、气泡和各种颗粒。不同发育阶段菌的细胞质的内含物和结构不同。幼龄菌的细胞质周密、均匀，富含核糖核酸，嗜碱性强。成熟细胞的细胞质中形成各种贮藏颗粒，有的还产生气泡。老龄菌的细胞质因缺乏营养，核糖核酸被细菌作为氮源和磷源利用而含量降低，故细菌着色不均匀，所以利用这一特点，通过染色均匀与否来判断细菌的生长阶段。
核糖体是分散在细胞质中的亚微颗粒，是合成蛋白质的部位。核糖体是由核糖核酸和蛋白质组成，前者占60%，后者占40%。内含颗粒是在细菌生长期间的成熟阶段，由于营养物过剩形成一些颗粒贮藏物，如异染粒、聚β-羟基丁酸(PHS)、硫粒、肝糖粒和淀粉粒等。这些内含物主要是在细胞缺乏营养时，可以作为能源被加以利用。通常，还原过剩时，细胞积累大量的内含颗粒，有时可占单细胞干重50%，当聚β-羟基丁酸异常增多时会导致细菌死亡。气泡用于调整细菌细胞的浮力，气泡使得细菌跑至水表面接触空气，以便吸收氧气。1.5.4 拟核
细菌的核没有核膜和核仁，由脱氧核糖核酸(DNA)纤维组成，由一条环状双链DNA分子高度折叠缠绕而成。由于它比较原始，故称为拟核结构，也称为细菌染色体。它携带着细菌的全部遗传信息，具有决定遗传和传递遗传性状的功能，是重要的遗传物质。1.5.5 鞭毛
鞭毛是细菌的运动器官，它是生长在细菌细胞表面一条或多条的细长、波曲、毛发状的线状体结构。鞭毛是由细胞质膜上的鞭毛基粒生长出，其长度往往超过菌体的若干倍，最长可达70μm，一般10～20nm，直径很细，鞭毛的运动引起细菌的运动。鞭毛的着生部位、数目和排列方式是种的鉴定特征，为分类鉴定的依据之一。有单根鞭毛(一端或两端着生)、束生鞭毛(一端或两端着生)及周生鞭毛，见图1.5。一般杆菌和螺旋菌多可以生长鞭毛，球菌的鞭毛少，仅有芽孢八叠球菌属生长鞭毛。鞭毛的微细结构可以通过特殊染色的方法后，在电子显微镜下进行观察。图1.5 细菌鞭毛着生位置1.5.6 菌毛
许多革兰阴性细菌具有短、细、直、硬的丝状物，类似毛发的附属物，它们比鞭毛细，通常称为菌毛。有的细胞表面可覆盖多达1000根以上的菌毛，由于个体小，只能在电子显微镜下观察到。菌毛的结构为细管状，直径为3～10nm，长度可达数微米，不参与运动，它们具有使得菌体附着于物体表面的功能。1.5.7 荚膜、菌胶团和黏液膜
有些细菌的细胞壁外分泌出一层黏性物质，完全包裹封住细胞壁,与外界有明显的边界，这层黏性物质排列有序且不易被水冲洗掉，称为荚膜，又称胞外聚合层或胞外多糖层。荚膜物质被认为对细菌吸附在固体物表面具有十分重要的作用，荚膜成分为：
有的细菌之间按照一定的排列方式互相黏聚，由公共荚膜包围形成一定的形态的细菌集团，可以称为菌胶团。若结构松散、排列无序且易被清除则称为黏液膜(slimelayer)。黏液膜也是一种多糖黏稠物质，与外界环境没有明显的边缘，这些物质容易被冲刷掉。
荚膜的作用很大，在自然环境下为细菌提供生存的优势条件，可以帮助细菌抵抗寄主吞噬细胞的吞噬作用，还可隔绝有毒物质的侵害。另外荚膜内含有大量的水，可以使得细菌免受干燥的威胁。1.5.8 芽孢
在有些细菌体内可以形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的内生孢子，称为芽孢。芽孢厚而且致密，不易透水，含水率低。含有大量的2，6-吡啶二羟酸和耐热性酶，使得芽孢具有耐热性。芽孢壁分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质；中层为皮层，由肽聚糖构成(含大量的吡啶二羟酸)；里层为芽孢壁，由肽聚糖构成，较薄，包围芽孢细胞质和核质。有的细菌是在其生长过程的某一阶段必然生长芽孢，而有些细菌是在某一特定的环境下才生长芽孢。芽孢生长的位置、形状和大小是相对稳定的，可作为细菌分类鉴定的依据之一。芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物等有很强的抵抗力，细菌的营养细胞在70～80℃时煮10min就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时。芽孢内的大多数酶处于不活动的休眠状态，使得芽孢对不良环境有很强的抵抗力，所以称芽孢为抵抗恶劣环境的休眠体。1.6 细菌的生长1.6.1 细菌的生长曲线
细菌细胞个体生长的过程是极其复杂的生化过程，实际上是细胞为下一次分裂积极准备的过程。当生长完成时细胞就开始分裂了，一个细胞分裂成为两个细胞，新生长的细胞就开始了下一个生长周期。由于细菌个体微小，对于研究细菌个体生长和繁殖困难较大，往往研究群体的数量的变化。对于细菌群体生长规律的研究是通过分析细菌培养物的生长曲线进行的。通常将细菌置于一个封闭系统中，在液体培养基中进行分批培养。如果以培养时间为横坐标，以菌量的对数值或生长速度为纵坐标作图，就可以作出一条曲线，称为生长曲线，见图1.6。测定细菌的生长曲线对于掌握细菌生长规律很重要。生长曲线反映出了细菌单细胞在单次培养条件下从生长繁殖开始到衰老死亡全过程的动态变化规律。通过生长曲线可以知道细菌在哪个时期生长代谢活跃，哪个时期衰老而濒于死亡。这样可根据不同的需要，选择不同时期的菌种。细菌的生长曲线可以划分为四个阶段：延滞期、对数期、恒定期和衰亡期。图1.6 封闭系统中微生物生长曲线1.6.1.1 延滞期
延滞期又称调整期、停迟期或延缓期。当细菌被接种到新鲜的培养基时，细胞的数量通常不立即增加，在这一时期内生长速度近乎于零，细菌数几乎不变，这一阶段称为延滞期。在延滞期尽管细胞没有立即分裂而导致数量的净增加，但细胞代谢活跃，一直在合成新的细胞成分，表现为胞内RNA含量增高，原生质嗜碱性加强，对氧的吸收、CO释放以及脱氨作用也很强，容易产生各种诱导酶，此时的细胞对2外界不利因素的影响较敏感。延滞期出现的原因有以下几个方面：
①细胞老化，细胞体内缺乏ATP、必要的辅助因子及核糖体；
②新的培养基与原来的培养基成分不同，细胞需要一定的时间来合成新的酶；
③细菌细胞受损，需要一定时间恢复。
另外，延滞期的长短还受到菌种的遗传特性、菌龄等因素的影响。延滞期短的只有几分钟，长的达几个小时，甚至数十小时。延滞期太长不利于工业生产，因此应尽量缩短延滞期。常用的措施有增加接种量、采用最适菌龄(即处于对数期的种子)或在培养基中加入某些成分，从而缩短细菌的延滞期。1.6.1.2 对数期
对数期又称指数期，此生长期最显著的特点是细菌细胞数目以稳定的速率按几何级数增加。在此阶段，细胞代谢活跃，细菌以最快的速度进行生长和分裂，生长速度不变，细胞繁殖一代所需时间保持恒定，生长曲线是平滑的。在对数期，细菌的生长是均衡生长，即所有细胞组分彼此以相对稳定速度合成。1.6.1.3 恒定期
恒定期又称稳定期或最高生长期，经过对数生长期，群体的生长最终会停止，活细胞总数处于动态平衡，即新增殖的细胞与死去的老细胞数几乎相等，生长曲线趋于平稳，因此外表看上去这时的生长速度趋于零。恒定期的细菌在数量上达到了最高峰，细菌细胞浓度通常9在10个/mL左右。恒定期细菌细胞总数量保持恒定，可能是分裂产生的新细胞与死亡细胞数量相等，或者是细胞停止分裂而保持代谢活性。恒定期细菌细胞浓度受到营养条件、细菌种类及其他因素的影响。在分批培养过程中，细菌细胞不能按对数期的高速度无限地生长，细菌生长进入恒定期可能是由多种因素共同决定的。细菌进入恒定期的原因有以下几个方面：
①营养物有限，如果一种必需的营养物质严重缺乏，细菌的生长速度就会减慢；
②溶液中有害产物累积；
③溶液pH值、氧化还原电位等物化条件不适宜；
④好氧菌受氧浓度的限制，溶液中可溶性O的含量消耗或降2低，使得细菌细胞可能由于缺氧而不能生长，对于厌氧细菌来说，细菌可以发酵糖类产生大量的乳酸和其他有机酸，致使培养基呈酸性，从而抑制细菌生长。1.6.1.4 衰亡期
继恒定期之后，细胞死亡速度超过繁殖速度，群体中活菌总数逐渐下降，出现“负生长”。到了最后一段时间，活菌按几何级数下降，有人称它为“对数死亡”阶段。在衰亡期营养物质的消耗和有害废物的积累引起环境条件恶化，导致活细胞数量下降，细胞内含颗粒更明显，液泡出现，有的菌体开始自溶，并释放出一些产物，如氨基酸、醇或抗生素等。衰亡期里活细胞与死细胞总数保持恒定。
尽管大多数细菌以对数方式死亡，但当细胞数量突然减少后，某些抗性特别强的个体继续存活，所以衰亡期曲线可能是复杂的。1.6.2 细菌生长的计算
研究细菌在对数期的生长速度是十分必要的。在对数期细胞数量n以2的指数(2)方式增加，细胞增加一倍所需时间称为代时或倍增时间。细胞数量以对数方式增加。nN=N×2t0(1.4)
式中,N为起始细胞数；N为t时间细胞数；n为世代数。0t
式(1.4)经过变化，得到式(1.5)：lgN=lgN+nlg2t0(1.5)(1.6)
如果用k表示分批培养时细菌细胞平均生长速度常数：(1.7)
细胞总数增加一倍所需时间为平均代时，或平均倍增时间g，此时t=g，而N=2N，代入式(1.4)得：0(1.8)
因而平均代时是平均生长速度常数的倒数。(1.9)39
例如，某细菌数量在10h内由10个增加到10个时，平均代时g和平均生长速度k为：(1.10)=0.5h/代或30min/代(1.11)1.6.2.1 测量生长量的方法
(1)细胞体积的测定 将一定体积的菌悬液放在刻度离心管中，离心后观察沉淀细胞的体积。
(2)称重法 将一定量的菌液离心或过滤，得到菌体，经洗涤后即可称其湿重或干重。
(3)比浊法 使用光电比色计测菌液的透光度，或自行制作比浊管进行目测。
(4)含氮量测定 蛋白质是细胞的主要物质，含量一般比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组分。细菌的含氮量约为原生质干重的14%，含氮量与蛋白质的关系如下：蛋白质总量=6.25×含氮量(%)。先用克氏定氮法测出细胞含氮量，然后根据公式算出细胞生长量。
(5)DNA含量测定 DNA与20%的3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液能显示特殊的荧光，根据这一原理测出DNA的含量，即可推算出细菌的-14总量。每个细菌平均含DNA为8.4×10g。
(6)生理指标测定法 有些生理指标如耗氧量或CO等代谢产物的2量在一定条件下与群体生长量成正比，故可作测定生长量的指标。1.6.2.2 测量细胞数的方法
(1)直接计数法 菌液样品置于血球计数器内，在显微镜下直接观察计数，也可以将待测样品与已知浓度的菌液或红细胞等量混合后，固定并染色，然后参照已知浓度的样品，按比例计数出未知样品的菌数。
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