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作者：汪多仁

出版社：科学技术文献出版社

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绿色发酵与生物化学品试读：

生物发酵产品是利用生物体如酶、微生物等进行化学品加工与环境治理的一门科学。它属于生物技术与化工技术相互融合、交叉发展的领域，是生物技术产业化的关键，也是化工技术的主要前沿领域。生物化学品的开发是生物化工产业的主要支撑和重要组成部分，将推动生物技术和化工技术的变革和进步，产生巨大的经济效益和社会效益。

在当今生物技术迅速发展转化为商品的新生物技术时代，生物发酵产业的发展十分迅猛，在化工领域20％～30％的化学工艺过程中将会被生物技术过程所取代，生物发酵产业将成为21世纪的重大化工产业。

随着基因重组、细胞融合、酶的固定化等技术的发展，生物发酵技术将革新某些化工产品的传统工艺，出现少污染、省能源的新工艺，甚至一些不为人所知的性能优异的化合物也将被生物催化所合成。

我国生物发酵清洁工艺开发已取得了许多重大的科技成果，在有机酸中，柠檬酸的产量居世界前列，乳酸、苹果酸的新工艺也已开发成功；氨基酸中赖氨酸和谷氨酸的生产工艺和产量在世界上都有一定的优势；微生物法生产丙烯酰胺已建成万吨级的工业化生产装置，达到国际先进水平；发酵法甘油生产发酵水平不断提高，后提取工艺也有很大进展；黄原胶生产在发酵设备、分离及成本等已取得了突破性的进展；酶制剂、果葡糖浆、单细胞蛋白、纤维素酶、胡萝卜素等产品的清洁生产工艺开发也日益成熟。

在能源方面，纤维素发酵连续制乙醇已开发成功；利用高效分离精制技术、高选择性精制技术、超临界气体萃取技术和高效双水相分离技术开发高纯度生物发酵化学品制造技术不断完善；反应器的研究在向多样化、大型化、高度自动化方面发展。

近年来，生物发酵产品正向专业化、高科技含量、高附加值方向发展，高价位产品如生化药物、保健品、生化催化剂等则备受青睐。

特别是发酵工业蓬勃发展，发酵工业的收率和纯度都比过去有了极大的提高。酶工程技术有了长足的进步，包括酶源开发、酶制剂生产、酶分离提纯和固定化技术、酶反应器与酶的应用。

现代生物技术的发展离不开化学工程，如生物反应器以及目的产物的分离、提纯技术和设备都要靠化学工程来解决。生物化学品工业已成为当今世界高新科技技术竞争的重要焦点之一和新的经济增长点。

生物化工是生物技术的重要分支，与传统工业相比，生物化工有其突出特点：①可利用再生资源为主要原料；②反应条件温和，多为常温、常压，因此能耗低、选择性好，效率高；③环境污染较少；④投资较少。

生物发酵技术是在维持生物体生存的温度与常压下，按照一定的程序准确、快速进行的反应，它由不断产生的多种酶控制，这些酶能对特定的物质发生特异的作用。反应的能量供给方式也是独特的，从能量的转换方式看，只是一种化学能转换，也就是说仅是把某种物质中积累的化学能转变为其他物质进行化学反应所需要的化学能，几乎没有能量损耗。已开发的工业用生物反应器是用微生物或酶代替金属类催化剂，由于不需要高温、高压，并且改变了供能形式，可以达到节能、省资源、无公害，因此可说是一种清洁生产工艺。

酶催化或微生物转化具有专一性高，条件温和的特点，已成为化学合成的重要支柱。由于化学生产中酶的新用途被不断开发，促使工业用酶需求量增长，美国工业用酶和专用酶的市场在以10％以上的增长率扩大。工业用酶将在21世纪日益广泛地应用于化学工业、医药农药工业、食品业等方面。

近年，生物过程已向设备大型化、过程连续化、自动化、高效率方向发展，生物化工将在化工产业结构调整和培育新的经济增长点方面发挥重要作用。

生物化工是基于生物转化生产化学品的高新技术，是生物技术的重要组成部分，具有选择性高的特点，是现代绿色化学加工业的重要组成部分。生物化工是21世纪化学工业最富生命力的技术。对于促进化学工业技术进步和产业结构调整、促进绿色化学工业的发展起着至关重要的作用。

选择重点领域开发清洁化学技术，发展清洁生物化工技术包括微生物发酵技术、酶工程技术、基因工程技术和细胞工程技术。我国每年农作物秸秆就有10多亿吨，但是利用率不到5％（主要用于造纸）。若利用绿色生物化工技术将其转化为有机化工原料，则至少可创造数百亿元的价值。因此，生物质资源的转化和利用，清洁化学和技术将是大有作为的。目前，生物催化技术、微波化学技术、超声化学技术、膜分离技术等引起人们的极大关注，并且有的已投入工业应用，展示了广阔的发展前景。

21世纪将是“生物技术的时代”。生物化工技术是当今世界高技术竞争的主要焦点之一。生物化工将成为21世纪的重大化工产业。目前，应选择市场适应能力强的有机化工产品为开发的突破口，使我国生物化工产业水平赶上并超过世界先进水平。

为适应现代化学工业快速发展的要求，作者编著了此书，全书提供的最新资料内容准确翔实，更好的体现出综述性、专用性、实用性、普及性、代表性，对促进生物发酵化工产品的应用、开发与环境保护和节约能源，具有积极和进步的意义。

本书是应广大读者需求完成的，涉及产品品种广泛，但限于编者水平，错误之处在所难免，敬请广大读者指正。2007年第一单元甲壳胺与下游产品一、纳米生物低聚糖甲壳胺

21世纪是“生物技术的时代”。随着生物技术的发展而诞生的生物化工技术，是当今世界高技术竞争的主要焦点之一。生物化工将成为21世纪的重大化工产业。

现代生物技术是当今高新技术的重要领域之一，化学工程和生物工程结合的生物化工工程是化工发展的新方向。与传统的化学方法相比，生物技术具有能耗低、污染少、可利用再生资源等优点。

生物酶催化是催化科学的前沿，它已被应用数千年。酶催化与一般催化剂催化相比，具有反应条件不苛刻，一般在常温、常压、合适的pH值条件下进行、高催化效率、对反应的专一性、节约资源和能源、对环境友好、是一种无废或少废反应过程、产物可生物降解等优点。

纳米生物低聚糖甲壳胺可以采用酶法生产。酶法包括使用专一性的甲壳胺酶降解，以及利用非专一性的其他酶，与化学降解法、物理降解法和合成法相比，酶解法反应过程易于控制，易于得到所需分子量范围的产品，不需要化学试剂，无副产物生成，对设备要求低，是生产低聚甲壳胺的更为理想的方法。

来源于天然甲壳的甲壳胺与脱乙酰甲壳胺市售价格平均为3000～4000日元／kg，而用微生物培养法生产的甲壳胺、脱乙酰甲壳胺可能以1000日元／kg的价格供应。1　理化性质

甲壳素化学上命名为（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖或β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。天然甲壳素分子的直链上有15％～20％脱乙酰氨基葡糖链结。

由于甲壳素在一般溶剂下难溶，使它在提纯、加工、化学反应等过程中都比较困难，应用受到限制。在碱性条件下将其水解，脱去分子中的部分乙酰基，就转变为甲壳胺。甲壳胺的溶解性能大为改善，故也常称之为可溶性甲壳素，或称为脱乙酰甲壳素、脱乙酰壳多糖、聚甲壳糖、聚氨基葡糖、黏性甲壳素等，化学名为聚（2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖）。

甲壳胺的急性毒性实验经口腔、皮下和腹腔给药，大黑鼠、老鼠试验证明毒性极低。亚急性毒性实验连续投药三个月未发现病理异常。对人类皮肤几乎无刺激、无过敏反应，不经皮肤吸收。其他实验表明不溶血、无热源性、无致突变性、抗原性很低。2　工艺开发

国内有多种改进的制备方法，但大多采用虾蟹壳为原料。

目前随着发酵技术进展的开发，利用发酵工业的大量菌丝体提取方法极有前途，不仅能变废为宝，且产品纯度高、原料来源丰富，不受地点、季节的限制。综合利用，降低了生产的成本。

2.1　操作过程

例1　生物法制备甲壳胺是用易得的抗生素生产废弃物或柠檬酸菌丝体为原料，经粉碎处理后，按常规方法进行提取，经处理、干燥得甲壳胺，产品收率为菌体干重的4％，灰分小于5％，脱乙酰度为85％。

使真菌菌丝体在115℃下于2％氢氧化钠溶液内除去碱不溶物后，再在2％乙酸作用下经过滤滤渣后得甲壳素及其他多糖。清液用碱处理可得低聚甲壳胺。

在用柠檬酸发酵的黑曲霉菌丝体中，甲壳素占细胞壁干重的20％～42％，另外还有24％的蛋白质，73.4％的葡聚糖，3.7％的半乳甘露聚糖、半乳糖胺及少量脂类。从黑曲霉体制备甲壳素的关键是适当破壁后，除去蛋白质和其他糖类。脱蛋白质有酸法、碱法和酸碱交替法，采用酸碱交替脱蛋白质。在保证蛋白质、氨基酸充分溶出后，以成品含氮量（％）为主要指标。

黑曲霉细胞壁中主要含壳质和蛋白质，蛋白质具有可电离的基团，在溶液中能形成带电荷的阳离子和阴离子，在电场中向一方迁移，从而把蛋白质分离。

黑曲霉为菌种，选用适宜的培养液，电泳仪控制电压为30V，相对电流强度15mA，反应液为2％的NaOH溶液。反应时间视菌体多少而定。电解后固体物质经洗涤并干燥得到白色半透明片状固体，得率为20.6％。

将捣碎的黑曲霉湿菌体在5％NaOH溶液中，100℃处理6h。或用45％NaOH溶液126℃处理2～3h，或用10％醋酸，95～100℃处理3h，离心后得到的醋酸抽提液用NaOH溶液调pH值为10，出现白色絮状甲壳胺，抽滤洗涤，60～70℃干燥至恒重得脱乙度为93.76％的甲壳胺。

甲壳胺的制备方法不同、制备目的不同，分离纯化方法也不同，但通常都包括调节体系；pH值、过滤（或离心）、真空（或冷冻）干燥等操作，必要时可进行脱色和重结晶。例如，由酸法水解甲壳素得到的甲壳胺经活性炭-硅藻土色谱柱吸附后，用乙醇梯度洗脱可得到不同聚合度（通常为1～7）的寡聚糖，然后在甲醇中结晶，可精制得高纯度的产物。采用凝胶过滤法处理快速，可获得较大量的产物。

用离子交换膜法是以离子交换膜将剩余的盐酸去除，这样可高效回收生成的甲壳素低聚糖和单糖，从而使得工业化成为可能。用盐酸梯度洗脱可得到不同聚合度的寡聚糖。此法可分离自由氨基葡萄糖，分离较有效，可进行大规模色谱分离。高压液相色谱法也是分离和纯化甲壳胺的有效方法。此外，也可采用膜法进行甲壳胺的分离。

例2　甲壳胺和脱乙酰甲壳胺有生物降解性、生物相容性和各种生理活性与机能，研究难分解性物质的微生物分解过程中发现在菌体外制造高分子化合物的微生物，此高分子化合物为甲壳胺和脱乙酰甲壳胺，可进行培养技术的开发。该菌株能以醋酸为原料进行培养，在菌体外制造甲壳胺和脱乙酰甲壳胺。通过研究原料供给量和原料浓度、pH值与营养盐类等培养条件，确立可自动控制的培养方法，生产速度能提高30倍，培养时间由5天缩短至3天。因是在菌体外产生甲壳胺和脱乙酰甲壳胺，用离心分离等简单的分离精制方法就可回收高纯度的甲壳胺和脱乙酰甲壳胺。

通常的甲壳素／甲壳胺是以微纤维的形式存在的，而微纤维又主要由微晶粒和非晶区两部分组成。原料预先用球磨机粉碎成40目粉末，将0.7g粉末原料加入到50mL 10％NaOH溶液和60mL异丙醇的混合溶液中，于80℃下，搅拌回流4.5h，然后过滤，用蒸馏水洗至中性得到甲壳素／甲壳胺溶胀体，将这一溶胀体与50mL40％混合酸（浓硫酸与浓盐酸体积比为2∶1）溶液混合、在110℃下搅拌回流2h，接着在超声波清洗器（50Hz，100W）中，用超声波处理2h，再重复以上回流反应和超声波处理3次，最后得一悬浊液。

在这一制备过程中，以异丙醇为分散剂，甲壳素／甲壳胺经碱处理后，形成溶胀体，晶体结构疏松，使溶剂易于渗入，而后加入的酸使部分聚合物链断键，逐步降解甲壳素／甲壳胺，从而得到纳米尺寸的甲壳素／甲壳胺微粒。

用超声波降解甲壳胺，反应温和，可以在低温下进行，且在降解过程中不会发生NH基被缔合的反应。2

例3　取200mL液体培养基置于500mL三角瓶中，按2％的接种量接入液体菌种，于25℃下恒温摇床（120r/min）培养。

在培养基中，分别加入酵母膏、牛肉膏、玉米浆、酪蛋白、（NH）SO、NHNO、NaNO、NHCl和尿素替代原培养基中的蛋

4244334白胨作为氮源，分别以胶体甲壳胺、乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘油和N-乙酰氨基葡萄糖替代培养基中的碳源，并以0.5％的蛋白胨作为氮源，进行发酵培养，测定发酵液的酶活力。

在最佳氮源和碳源条件下，试验培养基起始pH值分别为5.0～8.5，对产酶的影响。

上述优化条件下，试验培养基盐度分别为1％～40％，培养温度分别为15～40℃，培养时间分别为24～72h，可以获得最优菌株。

水解甲壳胺K-值为2.88mg/mL。酶反应的最适温度为55℃，最适pH值为6.0，生物法制备甲壳胺是用易得的抗生素生产废弃物或柠檬酸菌丝体为原料，经粉碎处理后，再按常规方法进行提取，经处理、干燥得甲壳胺，产品收率为菌体干重的4％，灰分小于5％，脱乙酰度为85％。

例4　青霉素菌株发酵液经离心去除菌体后，往上清液内先加入20％～70％饱和度的硫酸铵，静置8h后冷冻离心，分出蛋白后再向生成的上清液内加入硫酸铵至70％饱和度，4℃下静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀置于透析袋内水透析15h，再用聚乙二醇浓缩。将所得的甲壳胺酶经离心交换层析后再用凝胶过滤层析，使活性提高为1020U/mg。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的专一性很强的生物酶生产甲壳胺。

用此活性酶生产甲壳胺控制生成温度为50℃，在pH值为5时，可得最高产率。

例5　将3g甲壳胺溶于120mL10％的醋酸溶液中，加入乙醇60mL后，室温下搅拌30min内逐渐滴加苯甲醛15.8g，继续搅拌1h后将胶状物于烘箱（55～60℃）中放置20h，加稀NaOH溶液调pH值至中性，析出沉淀、过滤，固体用甲醇多次洗涤，除去未反应的苯甲醛，得纤维状浅黄色N-苯亚甲基甲壳胺固体，产率69％。

例6　在加热糊化的土豆淀粉中混合1％～150％甲壳胺（脱乙酰度为99％，以乙酸溶液加入）；在此混合液中加入淀粉量75％的甘油。将混合物在不锈钢上流延成形，在70℃热风干燥，可制成薄膜。

如在玉米淀粉中固定壳降糖含量（20％），改变甘油添加量，则可改善薄膜的柔软性和强度，复合材料中甲壳胺含量20％（以乳酸溶液加入），甘油含量为60％，淀粉的粒度在1μm以下。这种甲壳胺-淀粉薄膜材料埋入土中10个月即完全分解。

纳米甲壳素／甲壳胺可以进行酰基化、羧甲基化、季铵化、硫酸酯化。通过这些化学修饰作用在甲壳素／甲壳胺分子结构中引入了各种功能团，改善了甲壳素／甲壳胺的物化性质，从而使其各自具有不同的功能及功效，可应用于各种领域，为我国的国民经济发展作出贡献。

2.2　酶降解法

到目前为止，有很多有关酶法制备的报道，如直接利用能生产甲壳胺酶的微生物开发简便的酶解法。即在含有胶体状甲壳胺的液体培养基中培养出从海水中分离出来的鳝弧3菌E-383，可获得较高收率和选择性的N-乙酰基壳二糖。用芽孢杆菌属SP-7-M株得到甲壳胺降解酶，可以获得由二糖到五糖的低聚甲壳胺。用芽孢杆菌属R-4生产的脱乙酰基甲壳胺酶以高效率获得的是四糖的低聚糖。目前已能用许多的甲壳胺酶生产甲壳胺。可以制备由二至六的壳低聚糖。在长时间反应后。生成的二糖、三糖的比率增加。可以利用脱乙酰基甲壳胺酶容易地制备甲壳胺，但生产高聚合度的甲壳胺较难。

采用单纯的酶反应合成较高聚合度的低聚糖是困难的，可以利用某些甲壳胺酶所具有的糖转移活性，成功地以较好的收率合成具有生理活性的N-乙酰基六糖与N-乙酰基七糖，即使用来自诺卡氏放线菌或木霉属具有高的糖基转移能力的甲壳胺酶，在醋酸缓冲液中使二糖链发生链接反应，从而得到六糖的白色沉淀。同样，以五糖为基质合成七糖。这种转移反应一般要受基质浓度、反应温度及pH值的影响。

利用糖转移反应的低聚糖合成法，不仅可调节聚合度，而且可通过精心设计基质也可合成特殊结构的甲壳胺低聚糖衍生物。

利用单纯的酶生产甲壳胺可以利用糖转移反应的甲壳胺合成法来调节聚合度，在经精心设计基质后可以合成具有特殊结构的甲壳胺低聚糖的衍生物。

目前制备低聚糖的主要方法有化学法和酶降解法，采用化学法降解得率低，分离困难，对环境污染严重；而酶降解法具有反应条件温和，糖得率高，不造成环境污染等优点，是目前甲壳胺降解发展的方向。

采用几种酶复合作用降解甲壳胺是将纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶共同作用于甲壳胺，并利用膜分离技术将反应中产生的低聚甲壳胺及时分离出来，获得3～10糖的最大产率。某些非专一性酶类水解甲壳胺具有协同作用，采用这些酶组成复合酶，水解作用比单一酶要强。在适当的条件下，用这些酶水解甲壳胺可以得到相对分子质量低于3000的低聚糖。

酶降解法是用专一性酶或非专一性酶，对甲壳胺进行生物降解而得到分子量较低的低聚甲壳胺。这些降解酶广泛分布于细菌、放线菌和霉菌等微生物中。酶降解法过程通常优于化学反应的降解过程，这是由于酶降解过程和降解产物的分子量分布更容易被控制，从而可以便利地得到一定分子量范围的低聚甲壳胺。用微生物以工业规模制造甲壳胺的技术，可以低成本进行生产。酶法降解是用专一性酶或非专一性酶对甲壳素和甲壳胺进行生物降解而得到均相对分子质量较低的甲壳胺和单糖。酶法降解条件温和，降解过程及降解产物相对分子质量分布都易于控制，酶降解法不需加入大量的反应试剂，且不对环境造成污染，是最理想的降解方法。已发现有30余种酶可用于甲壳胺降解反应，这些酶包括专一性降解酶，如甲壳胺酶和脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶等。

①甲壳胺酶

甲壳胺酶主要存在于真菌细胞中。控制一定的条件，利用甲壳胺酶对甲壳胺大分子进行降解，可以方便地得到2～7糖的水溶性甲壳胺，甚至单糖。可见，甲壳胺酶是降解甲壳胺很好的方法，特别是在制备聚合度比较小的低聚甲壳胺时，更显示出优越性。

②甲壳素酶

利用甲壳素酶降解甲壳胺也能得到甲壳胺的低聚物。自然界中真菌和无脊椎动物（主要成分为甲壳胺）的年产量估计高达数十亿吨，它们的降解就是由细菌和真菌分泌的甲壳素酶来完成的。据报道，使用芽孢杆菌7-M得到的甲壳素酶和链酶素的抗菌素得到的甲壳素酶对甲壳胺进行降解反应得到的是分子量低的甲壳胺。

③脂肪酶

脂肪酶是作用于水-有机界面上不溶性物的脂肪酶。近年来，脂肪酶对于甲壳胺的降解反应结果表明，这种酶的降解效率很高，能在几分钟之内快速降低甲壳胺的黏度，使甲壳胺的平均分子量降低。

④溶菌酶

溶菌酶广泛存在于鸡蛋蛋白及人的唾液中，其中从鸡蛋蛋白中提取的溶菌酶的转糖苷化能力较强，从人的唾液中提取的溶菌酶裂解β-（1，4）糖苷键的能力也较强。溶菌酶在一定条件下可有效地降解甲壳胺，初始速度很快，反应10min黏度降解百分率即可达55％。溶菌酶在一定条件下对甲壳胺的降解，为低聚甲壳胺作为口服保健品提供了有力的保证，人体口腔唾液中所含的大量溶菌酶，可使甲壳胺口服液很快发生生物降解，有利于人体吸收。

⑤蛋白酶

根据对中性蛋白酶降解甲壳胺的研究结果表明，在水解初期中性蛋白酶能够使分子量迅速降低，而后下降缓慢。降解10min后，甲壳胺溶液的分子量下降可达50％左右。使用木瓜蛋白酶降解甲壳胺，乙酰化度高的甲壳胺更易被降解，这与使用溶菌酶观察到的现象正好相反。

酶降解法可以以较好的收率得到具有生理活性的低聚糖，且酶法的成本较低。虽然酶法在技术上尚未成熟，却是今后研究的主要方向。现在用虾、蟹类甲壳类制备低聚糖成本较高，所以开发低成本的非虾、蟹类原料，由微生物和酶法制备低聚糖势在必行。

甲壳素酶、甲壳胺酶、溶菌酶和N-乙酰葡糖胺酶等能水解甲壳素和甲壳胺分子中的β-（1，4）糖苷键，生成一系列甲壳胺和乙酰氨基或氨基葡萄糖。除了这些专一性水解酶外，目前已发现包括糖酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶和里氏木酶等在内的30多种水解酶对甲壳素和甲壳胺有部分或完全非专一性水解作用。

酶作用糖链成为高聚合度的寡糖，具有糖基转移反应能力。糖基转移反应受温度、pH值、底物浓度和反应时间等因素影响。利用扩链转移反应合成低聚糖，不仅可以调节聚合度，而且可以通过精心设计基质以合成特殊结构的甲壳胺衍生物。

生物酶的催化作用主要取决于酶的活性中心和底物的相互作用。为了保持酶的催化活力，除严格控制反应条件外，还千方百计地使酶固定化，以增强其稳定性，延长其寿命，便于分离，以反复使用，使工艺过程连续化。研究酶的固定化和生物反应器是酶催化要解决的重要课题。3　应用拓展

甲壳胺分子中的活性侧基为氨基，可酸化成盐。导入羧基官能团，取代合成侧链铵盐、混合醚、聚氧乙烯醚等，制备具有水溶性、醇溶性、有机溶剂溶解性、表面活性以及纤维性等各种衍生物。

甲壳胺为乙酰氨基葡糖聚合物，是一种直链高分子多糖。甲壳胺广泛存在于节肢动物（虾、蟹等）、昆虫的体表以及真菌的细胞壁中。

甲壳胺主要从虾蟹壳中提取纯化制得，近几年也有真菌发酵生产的报道。甲壳胺用碱水解可制得脱乙酰甲壳胺，水溶性高于甲壳胺。

甲壳胺和脱乙酰甲壳胺具有良好的生物相容性，能促进创伤皮肤的再生和愈合，可制成用于烧伤治疗的人工皮肤和可吸收的手术缝合线等生物医学材料，具有免疫促进活性，能提高机体的非特异免疫功能。

口服制剂可以治疗细菌感染，预防和辅助治疗肿瘤，口服液可在胃黏膜表面形成一层保护膜，中和胃酸，治疗胃溃疡。还可作为药用辅料，如在片剂中作为填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等。

甲壳胺是生产氨基葡糖的原料，两者均可用于提高免疫功能的保健食品。目前欧美和日本市场有多种甲壳胺和氨基葡糖的保健食品。

甲壳四聚糖与硝基苯酚反应，产生发色基，可作为临床诊断试剂，快速而简便，可在医学、畜牧中应用。

甲壳胺用硫酸酐、氯磺酸、浓硫酸等处理变成硫酸酯。甲壳胺的二硫酸酯具有比肝素更强的抗血凝作用。和甲壳胺一样，可利用脱乙酰甲壳胺的羟基制造衍生物，但也可利用其活性氨基进行化学改性。脱乙酰甲壳胺用羧酸酐处理生成N-酰基衍生物。

甲壳素通过变性制成活性纤维或新型接技共聚物，可用于化工医药产品的分离和精制。如将其织成传动带，将有机酸青霉素培养液通过此种传动带，青霉素可吸附在传动带上面，再用稀碱溶液洗涤交换而得到青霉素纯品。这将有助于青霉素生产的自动化和连续化。

将甲壳素水解成氨基葡萄糖，可再进一步合成一种新的水溶性抗癌药物氯脲霉素；它们还可用作烧伤创面的覆盖材料、人工血管、代用肝素、抗辐射制品、某些药物的载体及隐形眼镜材料等；甲壳素硫酸酯可用作抗凝血药；脂肪族酰化甲壳素可用作生物相溶性材料，形成膜时，其表面湿润作用和凝血作用均强于硅玻璃。

在决定生命活动规律的问题上，生物多糖必不可缺，糖缀合物研究成了生命科学研究领域的新前沿，作为自然界惟一大量存在的甲壳胺，具有不同于其他多糖的独特作用。相比之下，我国在甲壳素化学领域已有一定基础，而糖生物学和糖工程技术则远远落后，要把研究糖化学、糖生物学的方法论和基本技术，以及把基础研究获得的知识进一步转化为生产技能即所谓糖工程。为此，从事化学科学的人们必须密切关注生物工程技术的研究与进展，让化学与生物学、医药工程技术结合起来，加强学科间的渗透融合，不断拓展自身学科范围，增强综合应用能力，才能把研发工作做深做好。

值得提出的是各种小分子在调控生理和病理过程中的显著作用，在自然界中还有更多的其他生物体中发现的小分子，其中有的已作为药物使用，有的已发现它们能影响生理、病理过程，但是更多的却还没有放到调控生命过程这个角度上作深入研究。最近在“自然”、“科学”、互联网上和一些基金委评选优先支持的学科领域中频频出现了单分子物理、单分子化学、单分子生物学的新学科，已激发起人们探索的热情。不少病例说明，人体内平衡失调、血管内积瘀、血液循环不良、机体老化，会导致新陈代谢能力降低，人体对药物、营养物吸收能力下降；而单分子活化氨基葡萄糖，由于分子特别小，极其活泼，具有很强的渗透力和亲合力，很容易透过人体的细胞膜，疏通人体血管内的积瘀，特别能促使毛细血管正常有序地工作，从而改善微循环，从根本上改善和恢复人体的生理机能，从而发挥其防病和辅助治病的保健功效。因此，应将单分子氨基葡萄糖的研究与开发提到重要的位置上来。

甲壳素、甲壳胺其衍生物在医学具有的奇妙作用，甲壳胺不但能对抗癌细胞的作用，抑制癌细胞增殖，还能阻止癌细胞进入血管内，并能将进入血管内的癌细胞赶出血管之外。因此，甲壳胺对癌症、肿瘤、肉状瘤、白血球减少症有显著疗效。

甲壳胺能调节胆固醇使之正常化，由此不仅能防止动脉硬化，还可调整因动脉硬化的改善而变化的体内环境，减少因动脉硬化而引发的脑溢血、脑血栓、脑梗死及心肌梗死、动脉瘤等并发症的发生。

用甲壳胺制成降压剂，可治疗高血压、头昏眼花、便秘等复合症状。

甲壳胺可用于治疗B型肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝瘤、酒精性肝炎，可恢复肝功能细胞活力，使之保持正常运行，具有显著的治疗效果。

甲壳胺对于一般人体表皮存在的皮肤细菌，如表皮葡萄球菌、肠细菌如大肠杆菌和人体真菌如热带白色念珠菌等具有显著的抑菌作用，相对低分子质量水溶性甲壳胺的杀菌作用是相对高分子质量水溶性甲壳胺的杀菌作用的1倍以上，而且对于口腔细菌的杀菌作用更为明显。

甲壳胺及其衍生物葡萄糖胶盐酸盐有杀菌性，是一种抗菌消炎药物，在肺炎、肠炎、肾炎、结肠炎等治疗方面，疗效显著。

甲壳胺对人体有五大功能：强化免疫力、抗老化、预防疾病、恢复健康、调节生物体活动的多种功能。作用于人体内可治疗脑神经系统、肝脏、糖尿病及并发症、动脉硬化、各种皮肤病、心脏病、癌症等。作为生物保健品对人体有诸多有益疗效，可使高龄化社会充满年轻的朝气，被欧美各国誉为除蛋白质、脂肪、糖类、纤维素和矿物质之外的第六生命要素，在医药和生物保健品领域很有发展潜力。

甲壳胺所具的有良好的生物官能性、生物相容性等对细胞组织不产生毒性影响，无溶血效应，无热源性物质，其极佳的安全性在医学领域的应用具有重要意义。

由于甲壳胺本身的游离胺基带有大量的正电荷，而微生物细胞表面带负电荷，因此甲壳胺很容易被微生物吸附。甲壳胺被吸附后，干扰了微生物细胞表面的带电状态，导致细胞通透性增加，胞内物质外泄，使微生物死亡。

甲壳低聚糖、糖缀合物的化学研究，包括从分离、检出、结构鉴定、顺序测定以至合成都缺乏有效手段，远不如对核酸、蛋白质的研究水平。加强对不同分子量甲壳低聚糖与生物活性的构效关系的研究，了解其生物功能所对应的最佳分子量范围，这些境况都给甲壳素化学工作者提供了巨大的发展机会。4　市场展望

甲壳胺是由甲壳素脱乙酰基得到的重要衍生物。甲壳素来源于甲壳类动物，在我国，尤其在沿海、沿江、大河湖泊地区，虾蟹壳资源丰富，其中虾壳中甲壳素含量为20％～50％，蟹壳中约为17.1％～18.2％。甲壳素每年地球上自然生成量高达百亿吨，产量可与纤维素匹敌，储量十分巨大，用来开发生产甲壳胺具有广阔的余地。

2006年，国内对甲壳胺的需求量可达到4500吨／年，全世界的总需求量达2万吨／年，因而，在我国加速发展甲壳胺产业。使之产业化、系列化、规模化，早日成为国民经济的支柱产业。尤其是我国的氯碱企业富有甲壳胺生产过程中需用的大量盐酸和烧碱（NaOH）资源，开发生产高附加值的高科技精化品种甲壳胺具有相当诱人的市场发展前景。

在不久的将来，在我国会出现甲壳胺的全盛发展时期。参　考　文　献

1　Motogame, Akikyo. Crustaceous chitin and chitosan and their manufacture. JP 03277601

2　kAGE, Tsuguhei. Improved method for manufacture of low molecular-wieght chitosans and chitooligomers. JP09311043

3　De Lucca. High strength chitosan fibers and fabrics. EP 328050二、甲壳胺微球1　理化性质

甲壳胺是甲壳素脱乙酰衍生物，是一种富含游离氨基的带正电荷的直链多糖，具有生物黏附性和生物相容性好、毒性低，化学性质稳定，耐热性好以及使酶免受金属离子抑制等优点。甲壳胺可用于修饰脂质体、微球、微胶囊等递药系统。

甲壳糖胺微球，可控制药物的释放，改善易降解物质（如蛋白）的生物利用度，增强亲水性药物通过上皮层的渗透性。2　工艺开发

2.1　交联法

2.1.1　离子交联法

常用的阴离子交联剂可分为三类：低分子质量反离子交联剂（如焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、八聚磷酸盐和六聚磷酸盐）、疏水性反离子交联剂（如海藻酸钠等）和高分子阴离子交联剂（辛基硫酸盐、十二烷基硫酸盐、十六烷基硫酸盐等）。基本操作过程是：在磁力搅拌状态下，通过针头将甲壳胺醋酸溶液滴入不同浓度的三聚磷酸盐或其他阴离子水溶液中，形成的微球再通过过滤器从反离子溶液中取出，用蒸馏水洗涤，干燥，得甲壳胺微球。

用钼酸盐作为交联剂制备甲壳胺凝胶微球，与碱性条件下制得的微球具有不同的结构，在pH值为6，钼酸盐浓度为7g/L最佳条件下制得的这种凝胶粒子是由一个非常薄的外层和含有小孔的内层构成，而不具有形态学上的大孔特性。

2.1.2　乳化-离子凝胶法

将甲壳胺水溶液作为分散相，加入到非水连续相（异辛烷和乳化剂）中形成W/O型乳剂，然后在不同的时间间隔，加入1mol/L的NaOH，形成离子凝胶微球，通过过滤器取出、洗涤、干燥，即得甲壳胺微球。

此法可制得直径为几十微米的球形微粒，关键步骤是凝胶的引入和甲壳胺／凝胶乳剂的离子交联过程。硫酸钠和柠檬酸钠交联的甲壳胺凝胶微球表面都非常光滑，但是在三聚磷酸盐交联的甲壳胺凝胶微球表面可观察到较大缝隙；提高搅拌速度可减小微球粒径及其分布范围。

2.1.3　离子沉淀-化学交联法

搅拌状态下，在含有Tween-80的甲壳胺溶液中逐滴加入20％硫酸钠，滴毕，继续搅拌几小时，老化，离心沉降，用去离子水洗两次，再加入9.5％乙二醛，室温下交联1h，离心，洗涤，低压冻干，即得甲壳胺微球。

2.1.4　乳化-化学交联法

将甲壳胺溶液加入含有表面活剂的液体石蜡中形成W/O型乳剂，再根据所需交联密度，加入不同剂量的交联剂，形成的微球经过滤，并用适当的溶剂洗涤，干燥，即得甲壳胺微球。

甲壳胺微球具有非常好的的吸附性能。以甲壳胺为原料，采用逆相乳化-交联法制备甲壳胺微球，再进行羟丙基氯化及胺基化，可以制备一系列新型甲壳胺胺基衍生物微球，对血清白蛋白的吸附量可达7mg/g。采用乳化-交联法可制得性能优良的甲壳胺微球，对胆固醇和甘油三酯的吸附率可达37％。

2.1.5　复乳交联法

该法原理是，将水不溶性药物分散在甲壳胺溶液中，并在乳剂交联过程中被包封。基本操作过程是，先制备O/W初乳（药物的非水溶液／甲壳胺溶液），然后将初乳加入油相中形成O/W/O型乳剂，再加入戊二醛（交联剂），除去有机溶剂，即得甲壳胺微球。

柠檬酸通过热交联制备甲壳胺微球。首先制备甲壳胺和柠檬酸摩尔比恒定的不同浓度的甲壳胺溶液，将其冷却到0℃，再加入玉米油，然后在120℃热交联即可。

2.1.6　滴入法

取适量甲壳胺溶于1％醋酸配成5％甲壳胺溶液，用9号注射器注入凝结液（20％NaOH，30％CHOH水溶液）中，得粒度均匀、形状3规整甲壳胺微球，水洗至中性，湿态保存。

将甲壳胺微球置于6％戊二醛溶液中，30℃下恒温振荡2h，用大量水反复洗涤，以去除残存戊二醛溶液，即得甲壳胺微球载体。

在静电脉冲液滴发生器产生的静电场作用下，将2％（质量百分浓度）的羧甲基甲壳胺溶液通过微量注射泵的注射器针孔形成微滴并高速滴入14％CaCl溶液（为质量百分浓度）中，微滴迅速凝胶化，2凝胶化时间2h。工艺参数为：电压2kV、频率50Hz。制得羧甲基甲壳胺离子配位微球。用蒸馏水反复洗涤微球数次，除去表面残留物。改变溶液浓度、金属离子种类及其浓度等制备因素，获得不同条件下的微球。50℃下干燥湿球12h至恒重，得干球。

2.1.7　凝聚法

在甲壳胺溶液中加入某溶液，形成不溶性的甲壳胺衍生物而沉淀为甲壳胺微球。该法避免了在其他制备甲壳胺微球方法中使用的有毒的有机溶剂和戊二醛；采用硫酸钠作为沉淀剂制备强的松龙磷酸钠甲壳胺微球，即将硫酸钠加入甲壳胺的醋酸溶液中，使甲壳胺的溶解度降低，从而析出甲壳胺沉淀。

用复合凝聚法，即通过甲壳胺与带相反电荷的多聚体的离子间相互作用制备微球。常用的材料为海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酸钠。甲壳胺-海藻酸钠微球可用于调节药物的释放特性和理化特性。

在凝聚前的甲壳胺溶液中持续存在海藻酸钠和充足的阳离子聚合物以形成纳米球，海藻酸钠、CaCl和阳离子聚合物（聚赖氨酸或甲2壳胺）的最佳质量比为100∶17∶10，阳离子聚合物在低浓度下不能形成纳米粒，而在高浓度下可形成。

将甲壳胺和海藻酸钠先进行偶联，再将蛋白酶抑制剂通过海藻酸钠偶联成复合物。该复合物有较好的酶抑制作用，酶抑制作用随酶抑制剂在复合物中的比例增加而增强，可作为肽类药物口服给药的载体，有利于提高生物利用度。

2.1.8　乳化-溶剂蒸发法

这种方法涉及聚合物溶液和非连续相间形成O/W或W/O乳剂。用液体石蜡／丙酮通过溶剂蒸发法制备微球，将药物的丙酮溶液分散在甲壳胺溶液中，然后加入液体石蜡中乳化，搅拌，混悬微球滤过，洗涤，干燥，再加入凝聚抑制剂硬脂酸镁即可。

在制备微球时，随着硬脂酸镁加入量的增多平均粒径下降。用轻质矿物油、Span 80和甲壳胺通过乳化-溶剂蒸发法制备的微球具有生物黏附性和缓释效果。采用复乳-溶剂蒸发法制备微球，将含有Eudragit P4135F的二氯甲烷与甲壳胺溶液乳化形成W/O乳剂，再与1％的聚乙烯醇溶液混合，强力搅拌形成W/O/W复乳，室温下搅拌至二氯甲烷蒸发即可。该微球具有结肠靶向性。

2.1.9　甲壳胺微球乙酰化法

将甲壳胺微球与醋酐进行乙酰化，并用甲壳胺和戊二醛进行包衣。采用该法制备阿莫西林和甲硝唑甲壳胺微球，以控制药物的释放，乙酰化甲壳胺微球具有吸水膨胀容量可控和酸性环境中易凝胶化的特点，进而延长包封药物的释放，其中乙酰化的时间为关键因素，不仅可影响药物的释放，也能影响包封率和所包封抗生素的活性。

为了提高甲壳胺微球（M-CS）固定化酶的分离效果，通过制备磁性甲壳胺微球固定化酶，可以达到比较好的分离效果。利用反相悬浮交联法制备磁性甲壳胺微球，并对海藻酸酶进行固定化开发。M-CS呈规则圆球型，具有较好的磁响应性，可稳定地保存在弱酸和弱碱中。M-CS容易吸附海藻酸酶，但吸附酶量受载体与酶的比例、溶液的离子浓度、交联剂的用量、溶液pH值的影响明显，而温度对吸附酶量的影响则相对较弱。

2.2　操作过程

例1　取甲壳素浸泡于3倍的47％NaOH溶液中，充分润湿后，在110℃下反应4h，白色甲壳素变成土色，用水洗至中性，再用丙酮洗涤脱水，50℃下真空干燥得白色甲壳胺，脱乙酰化度85％。将所制得的甲壳胺溶于20％HCl中，于25℃下降解至所需的黏度后用碱终止反应，沉淀甲壳胺，水洗至中性，丙酮洗涤脱水，真空干燥。

取平均分子量为25万的甲壳胺溶于1％HCl中制成25％甲壳胺盐酸溶液，用针形注射器在上方一定距离注入含20％NaOH，30％CHOH水溶液凝结液得粒度均匀、形状规整、内有空心的白色3球形甲壳胺，水洗至中性，丙酮洗涤脱水，真空干燥。

将球形甲壳胺置于交联剂溶液中，30℃下电磁搅拌4h，用水和丙酮反复洗涤，洗去交联剂，50℃真空干燥。

将采用不同交联剂和交联方法制得的球形交联甲壳胺分别投入水中、15％NaOH水溶液中和10％HCl溶液中浸泡48h。

将球形甲壳胺放入5％甲苯二异氰酸酯的丙酮溶液中，控制甲苯二异氰酸酯量和交联时间，使其部分交联，用丙酮洗去交联剂，50℃真空干燥。

通过选择不同交联剂及两种交联剂不同使用比例，可制得具备不同机械性能的交联球。使用两种不同的交联剂重复交联比使用单一的交联剂制得的交联球化学稳定性好。

例2　在1000mL的大烧杯中，分别加入150mL氯苯、50mL甲苯和5mLSpan-80试剂，开动搅拌，在强烈搅拌下，用滴管缓慢滴加入50mL3％的甲壳胺醋酸水溶液。滴完后，持续反应4h，以形成均匀细小颗粒。造粒结束后，紧接着将颗粒连同悬浮剂一起倒入500mL的三口烧瓶内，加入3mL戊二醛进行交联，在40℃下反应，接着升温在60～70℃下反应3h。反应结束后，静置、冷却，进行抽滤，用去离子水洗涤，然后用乙醇进行反复洗涤至中性，产品在60℃下烘干。

称取微球型的CS（干态）2g，加入一定量的去离子水进行充分溶胀后置于100mL的三口烧瓶中，将三口烧瓶置于60℃的恒温水浴锅中，缓慢滴加10mL的高氯酸，使CS微球进行取代反应。反应4h结束后，静置、抽滤，用丙酮洗涤，再用去离子水洗，最后用丙酮洗涤几次直至中性，将其在60℃下烘干，得羟丙基氯化甲壳胺微球。

将羟丙基氯化甲壳胺微球进行充分溶胀后放入100mL的三口烧瓶中，加20mL去离子水与胺化试剂三乙胺后置入60℃的恒温水浴锅内，在搅拌条件下进行胺化反应4.5h，反应结束后，静置、冷却、抽滤，用去离子水洗涤至中性，在60℃下烘干，得甲壳胺微球的胺基化衍生物。

微球型的CS具有强度高、装柱通量大等优点正成为新型载体。甲壳胺的碱性与使用效果密切相关。为进一步增强甲壳胺的碱性，制备新型固定化酶载体及生化分离材料，在甲壳胺微球的分子结构中可分别引入羟丙基和不同种类的胺基，使结构中胺基的含量上升，碱性增强，成为新型甲壳胺胺基衍生物微球。

在甲壳胺微球上同时引入羟丙基和不同胺基，可获得胺基化的羟丙基甲壳胺衍生物微球，如三乙胺基-羟丙基甲壳胺微球二乙胺基-羟丙基甲壳胺微球和乙二胺基-羟丙基甲壳胺微球等，为新型的胺基衍生物微球。甲壳胺的游离氨基的邻位对各种蛋白质的亲合力非常高，可作为酶、抗原、抗体等生理活性物质的固定化载体。甲壳胺可用于多种酶解固定，可以重复使用、长期保存。

例3　将10g甲壳胺-丝心蛋白共混液与0.1g非诺洛芬钙的冰醋酸溶液混合搅拌30min，然后加液体石蜡、Span-20，搅拌30min后加戊二醛反应2h，产物用丙酮洗涤、过滤并干燥，得甲壳胺-非诺洛芬钙微球。

例4　将05％甲壳胺溶液40mL、2.0mL磁流体、Span-804.0g及苯甲酸乙酯160mL投入反应瓶内，开动搅拌，于恒温40℃下，滴加50％戊二醛与甲苯的混合液，30min后升温至60℃，反应30min后停止。磁性粒子经分离后分别用乙醇、丙酮、重蒸水洗涤多次后备用。

例5　于100mL锥形瓶中加入5.0mL甲壳胺包裹后的磁性粒子，加入重蒸水40mL，08gNaCl及0.1033g Cibacmn Blue F3GA（一种染料的商品名），于45℃水浴振荡30min后加入NaCO·10HO 1.3g继232续反应24h后，磁场分离，分别用蒸馏水、25％乙醇、NaCl水溶液、缓冲液洗涤，直到检测不出染料为止，制成磁性微球。

一般甲壳胺可溶解于稀酸，为增强甲壳胺的耐酸性能，制备新型胺基衍生物载体，需对它进行交联。在强烈搅拌下，将甲壳胺的醋酸水溶液分散于适当的有机介质中，在乳化剂存在下，可形成细小的甲壳胺微粒。在戊二醛作用下，甲壳胺微粒可进一步交联形成微球。交联后的甲壳胺微球，不溶于稀酸，具有较高的强度。

交联后的甲壳胺微球，分子中还含有大部分氨基和羟基，具有较强活性，在酸性条件下，与环氧氯丙烷反应、可引入羟丙基氯基团，形成羟丙基氯化甲壳胺微球。

磁性微球作为纳米级磁性颗粒，能高效固定化酶和细胞的原因很多：纳米颗粒的表面效应和体积效应引起颗粒比表面激增，微球官能团密度和选择吸附能力增大，颗粒稳定性提高：一些纳米颗粒是带有电荷的，纳米颗粒能够导致酶的整体电荷分布发生改变；从而使酶微观构象变化，引起催化活性或稳定性的改变；纳米颗粒能够与一些特定的基团结合，影响酶的空间构象；磁性FeO纳米粒子的超顺磁性34使微球能在外加磁场中进行磁性导向而不被永久磁化等。

甲壳胺与黏土、活性炭等天然吸附类材料耦合制备凝胶可以克服单一甲壳胺凝胶密度小，易漂浮于底物表面，影响传质的缺点，且能增大凝胶机械强度，使结构更加紧密有序。黏土是天然无机吸附类材料中的一种，广泛分布于地球表面，颗粒极细，结构紧密，成晶体状，与水混合后容易分散成直径1～2μm的细粒。故甲壳胺与其耦合制得的凝胶密度增大，结构更为紧密坚固。

将甲壳胺与天然黏土耦合使用，并用中和法制备得到甲壳胺微球固定化。淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，有效地提高了酶的热稳定性和酶活。

固定化酶是指利用物理吸附或化学结合法将自由酶固定到载体上以提高酶的操作稳定性和反复回收利用酶的技术。磁性微球用于固定化酶，利于固定化酶从反应体系中分离和回收，操作简便。同时利用外部的磁场可控制固定化的运动方式和方向，可替代传统的机械搅拌，提高酶的催化效率。

用于固定化酶的磁性甲壳胺微球。首先用化学共沉淀法制备磁流体，随后在磁流体存在下进行甲壳胺和戊二醛的共聚反应。该微球具有良好的磁响应性，在外加磁场下可被快速地从溶液中分离出来。

固定化酶对载体材料的要求是极其严格的。也正因为如此；目前载体材料还没有很好地与酶相融合。

甲壳素对蛋白质的大部分羟基和氨基具有较好的亲和性，并有较高的固定化效率。由于它还具有生物相容、安全无毒、价廉易得等特点，故成为一种极具潜力的固定化酶载体。

甲壳胺作为固定化酶载体，因其原料易得，价格低廉，机械性能较好，化学性能稳定，且具有可生物降解、固定化酶效率高等诸多优点而在固定化酶技术的发展中越来越受到人们的重视。以甲壳胺载体固定化假丝酵母玫瑰酶的情况。采用碳化二亚酰胺活化后甲壳胺微球固定化玫瑰酶具有很高的酶的负载量，同时也保持了单体酶的很高的活性。

用甲壳胺为固定化菌体法酶载体，加以交联架桥为固定组成的络合物，可实现发酵株的循环使用及被作用物的分离。利用其配位螯合功能，可用于有害金属离子的螯　合剂增加酶的产量，可形成具有表面活性的产酶促进剂。

以甲壳胺—丙烯腈为载体固定化木瓜蛋白酶，所制得的固定化酶的最适宜温度为70℃。70℃下9h后固定化酶的活力仍可保持91％。该载体材料可以较好地吸附、结合木瓜蛋白酶，固定化酶的酶活力较高，且稳定性得到提高。用固定化酶处理啤酒，低温冷藏（4℃）后，无浑浊现象出现。

为了解决甲壳胺凝胶长期操作容易裂解，酶和细胞易脱落的问题，可将甲壳胺固定化方法与生物膜固定化技术耦合使用。如将絮凝固定化技术与膜生物反应器技术耦合使用，该体系中，不仅两种技术的优点均得以发挥，而且由于生物催化剂（尤其是小分子酶）在固定化后体积增大，这样即使增大了膜的选择范围，仍可以使生物催化剂得到有效截留，这使得生物催化剂在得到截留的同时还可以提高底物和产物（尤其是大分子底物和产物）的透膜传输速率。生物膜的选择要求对酶和细胞无毒，具有生物相容性，机械强度高，传质阻力小，能保护固定后的酶和细胞长期使用不易裂解，目前研究得较多的是肠衣膜。

2.3　磁性高分子微球

目前制备的磁性高分子微球主要有核-壳式结构和壳-壳-核结构。在核-壳式结构中，核既可为磁性材料，也可由聚合物组成，壳则相应为聚合物或无机物，通过单体共聚可以在磁性微球表面载上一定的功能团，实现磁性微球的表面功能化。如果单体共聚反应困难或表面无功能团，则可通过功能团的转化得到所需的功能团。

制备磁性微球通常应用的磁性物质有：纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、正铁酸盐、铁钴合金等，尤以FeO磁流体居多。与磁性材料结合的34高分子材料中天然高分子材料有甲壳胺、明胶、纤维素等，合成高分子材料最常用的是聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）。其中天然高分子材料因具有价廉易得、生物相容性好、可被生物降解等优点，得到了广泛的研究和应用。

磁性高分子微球的制备方法主要有包埋法、单体聚合法、化学转化法、生物合成法等。

2.3.1　包埋法

包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性高分子微球。磁性粒子表面与亲水性高分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些高分子的溶液中，再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。为了增加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层等进行稳定化处理。天然高分子磁性微球均采用这种方法制备。该法简单易行，但制得的磁性微球粒径难于控制，形状不规则，在细胞分离等领域的应用受到限制。采用甲壳胺包埋磁粉，经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁性甲壳胺微粒，并将其共价结合卵清黏蛋白得到磁性亲和吸附剂，应用于胰蛋白酶的亲和纯化。

包埋法是将磁性粒子分散于生物大分子溶液中，采用交联、雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段通过范德华力、氢键、磁颗粒表面的金属离子与高分子链的螯合作用或共价键，使水溶性高分子链缠绕在磁性颗粒表面，形成聚合物微球。包埋法一般用于制备磁性生物高分子微球，是常用的制备方法之一。

目前常用的包埋材料有纤维素、磷脂、葡聚糖、脱乙酰甲壳胺、蛋白质等。通过悬浮交联技术得到的磁性甲壳胺微球，颗粒形状不规则，粒径分布宽，常被用于酶的固定化。

该方法操作简单，制备的颗粒生物相容性好，表面本身含有各种活性功能基团，可直接偶联所需配基。但所得颗粒形状不规则，颗粒大小不易控制，粒径分布宽，壳层中常混有乳化剂等杂质，使之在免疫测定、细胞分离等领域中的应用受到很大的限制。

泡沫载体和有机发泡剂在热处理过程中热解除去后所形成的孔洞。微观孔洞是由于羟基磷灰石颗粒在烧结过程中，粉体颗粒堆垛而形成，微观孔的存在使相邻的宏观孔之间相互连通起来，并与宏观孔洞一道，使支架材料具有不同孔径大小和分布的多孔结构，以便满足组织工程材料的要求。

2.3.2　单体聚合法

单体聚合法是先将磁性粒子、单体、引发剂、稳定剂等的混合液通过均化器分散均匀，再在适当的条件下进行聚合以制备核-壳式磁性高分子微球的方法。聚合方法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合（包括无皂乳液聚合、种子聚合）等。因为很多有机单体疏水性很强，难以与磁核的亲水表面紧密结合，所以往往要对磁微球表面进行预处理，使其表面具有一定的疏水性，或者适当改变聚合体系的有机组成，以利于聚合的进行。所制备的磁微球粒径分布范围宽，难以形成均匀包裹的高分子微球。以聚乙二醇修饰的磁性氧化铁粒子作为聚合种子投入乙醇／水分散介质中，进行丙烯醛和苯乙烯的共聚，得到微米级的磁性复合微球。

2.3.3　化学转化法

化学转化法是指先合成均一的多孔有机聚合物微球，微球中含有—C、—CHO、—NO、—OH等官能团，均匀地分布于微球的表面12和孔洞中，然后将一定浓度的Fd离子和三价Fe离子渗透到微球的内部与上述基团作用而被固定，再升高pH值使Fd离子和三价Fe离子在孔中形成FeO。此法操作简便，所制备的磁性微球粒径和磁性都具34有高度的均一性，但对聚合物微球的要求比较严格。多孔的聚苯乙烯微球，用上述方法处理后得到的是粒径均匀、悬浮性好的磁微球。磁性微球通常具有核壳结构，即无机磁性材料为内核，高分子材料为外壳，或者是高分子作为核，磁性材料作为壳层，除此之外也可做成夹心结构，即外层、内层为高分子材料，中间层为磁性材料。现有技术合成超顺磁性微球的方法主要有包埋法、单体共聚法、化学转化法、共沉淀法和硅烷化法。

2.3.4　喷雾干燥法

通过喷雾干燥法及用低、中、高分子质量的甲壳胺和羟丙甲纤维素、以不同的药物-聚合物比例制备卡马西平甲壳胺微球，药物的包封率和释放特征依赖于制备微球的聚合物组成和药物-聚合物比例，即使用低分子质量甲壳胺制备的微球可获得最好的包封率，药物包封率低的微球（质量分数6.3％）较包封率高的微球能更好地控制药物释放。

甲壳胺可与一定量的多价阴离子反应，形成甲壳胺分子的交联，这一性质可应用于甲壳胺微球的制备。

载药微球的制备：采用吸附药物法制备载药微球。将上述湿球置于一定浓度的扑热息痛（简称PCTM）溶液中，静置12h，微球达到药物吸附平衡，制得载药微球。50℃下干燥12h至恒重，得载药干球。磁性微球是由超顺磁性的核和聚合物外壳组成，外壳可以保护酶不与金属氧化物（通常是铁氧化物）核心接触。磁性微球应用于酶和细胞的固定化，具有以下优点：①磁性微球颗粒小，接近于纳米尺寸，有巨大的比表面积，能对周围的小颗粒产生较强的吸附作用，将底物颗粒富集于微球表面的酶或细胞周围，便于底物与酶或细胞充分接触；②固定化酶或细胞从反应体系中分离和回收简便。对TX2酶体系，当一种酶失活时，可以用磁性材料再固载另一种酶，回收后反复使用；③利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶或细胞的运动和方向，替代传统的机械搅拌，提高固定化酶的催化效率。磁性微球主要合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒或在磁流体存在下进行聚合反应，均可得到纳米级的磁性微球。此外甲壳胺是一种很好的天然高分子材料，甲壳胺与磁性纳米材料的耦合使用顺理成章。将甲壳胺与磁性FeO纳米粒子耦合应用，加入交联剂戊二醛制成纳米级甲壳胺磁34性微球固定漆酶，制得的甲壳胺磁性微球与普通甲壳胺微球相比成型好，粒径分布均匀，重复使用方便。固定化后的漆酶的热稳定性、储藏稳定性及操作稳定性均得到提高。

2.3.5　铁甲壳胺磁性微球

400mg甲壳胺溶于20mL3％的醋酸配成2％甲壳胺醋酸溶液，再加入400mg铁粉超声分散处理，然后加入4mLSpan-80和80mL液体石蜡中，常温下充分搅拌30min，以形成均匀细小颗粒。造粒结束后，加入1.0mL25％的戊二醛进行交联，先在40℃下反应1h，再升温到60～70℃下反应3h。产物分别用无水乙醚、丙酮、水充分洗涤，60℃真空干燥。

铁甲壳胺磁性微球中铁含量63.4％。3　应用拓展

试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]

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