作者：李慕勤、王晶彦、吕迎、杨涵崧 著
出版社：化学工业出版社
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骨组织工程支架材料试读：
前言
随着现代科学技术的发展，人们对生活质量提高的迫切愿望加速了临床对生物医用材料的需求，使生物医用材料的研发迅猛发展，成为世界经济的一个支柱性产业，也成为世界各国争先占领的重要领域。生物医学材料研究追求的目标是设计和合成可诱导组织再生、重建或恢复病变组织的生物功能材料。其中，可诱导组织再生和重建细胞支架材料是重要的研究内容，支架材料是骨组织工程的核心材料。多孔支架材料由于拥有良好的表面活性，为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境，维持正常细胞的生长；支架材料的降解速率与组织细胞的生长速率相适应，不同的骨生长环境对支架材料有相应的要求。
本书结合国内外骨组织工程支架材料的研究发展，系统地介绍了近年来作者在骨组织工程支架材料方面的基础理论、制备工艺、分析与检测和相关的国内外研究成果和先进技术。主要内容包括：铈分散的纳米羟基磷灰石及生物相容性、羟基磷灰石-生物活性玻璃骨组织工程支架材料、双相磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架材料、骨碎补-双相磷酸钙-壳聚糖骨组织工程支架材料、骨碎补-天然羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架材料、生物活性医用多孔钛材料、细菌纤维素复合支架材料生物相容性等。
全书由佳木斯大学的李慕勤、王晶彦、吕迎和杨涵崧执笔完成。书中，绪论、第1章和第7章由李慕勤执笔，第2章由吕迎执笔，第3章中3.1和3.2由吕迎执笔，3.3和3.4由王晶彦执笔，第4章和第5章由王晶彦执笔，第6章由杨涵崧执笔。宋宪民、孙海燕、刘继光、刘翯翀、王艳萍、何立松、路荣、苗波、张海亮、管大为、杜晓岩、毛艳、刘正及天津大学的万怡灶和王静等为本书编写做了大量试验及研究等工作，全书由李慕勤和王晶彦负责统稿，吕迎校对。
感谢佳木斯大学材料科学与工程学院吴明忠高级工程师、袁士丹老师、刘文斌高级工程师、刘冬梅高级工程师、田春英高级工程师、曲立杰博士、高晶高级讲师及化学与药学院的刘红副教授、基础医学院病理科姚海涛教授在实验过程中给予的大力支持和帮助。
本书的编写工作还得到了国家自然科学基金项目（31070859，31370979）、黑龙江省教育厅项目基本科研业务费基础研究项目（2016-KYYWF-0564）、黑龙江省高校生物材料重点实验室开放课题（L5309）的资助。
由于作者水平有限，书中不足之处难免，敬请各位专家和读者批评指正。著者0 绪论
骨组织工程的概念由生物力学专家Y.C.Fung于1985年首次提出，它是应用工程学和生命科学的基本原理和技术，在体外构建具有生物功能的人工替代物，用于修复组织缺损，替代失去功能或衰竭的［1，2］组织、器官的部分或全部功能。骨组织工程的研究范围非常广，几乎涉及人体的全部器官，如骨、牙、软骨、皮肤、血管及脏器［3，4］等，其中骨组织工程是研究力量投入最多的领域。骨组织工程是利用细胞生物学和工程学原理，研究开发修复和改善损伤骨组织形态和功能的生物替代物的一门科学，就是将支架材料作为信号因子和细胞的载体或模板诱导成骨，或从周围骨组织募集细胞使其趋化和［5，6］分化，最终形成新骨的过程。骨组织工程的三要素是种子细胞、生长因子和支架材料，而核心问题仍是合理的支架材料设计和选择。0.1 支架材料需满足的条件
在构建组织工程人工骨的过程中，支架材料作为细胞外基质替代物，起着引导细胞生长、促进血管长入及传输营养物质的重要作用，也是支撑细胞迁移生长形成立体组织的关键所在。支架设计的4F准则包括：形状诉求（form）、性能诉求（function）、功能诉求（formation）和可植入性（fixation）。形状诉求是指支架材料必须能够完全填充复杂的三维缺陷，并在该处诱导再生骨组织填充整个缺陷；性能诉求是指支架材料必须拥有相应的力学性能，替代缺失组织的作用，来满足日常活动的需求；功能诉求是指支架材料能够通过释放生长因子和提供合适的环境来促进组织再生；可植入性指的是支架［7］材料可以在外科手术中植入人体，并起到预期的功效。0.2 骨组织工程对支架材料的基本要求
C.M.Agrawal等总结出10条骨组织工程支架材料所具备的条件［8］
：
①具有良好的生物相容性；
②具有良好的生物降解性或生物吸收性；
③支架材料的降解速率应与骨形成能力相匹配；
④具有良好的多孔性能；
⑤具有很强的渗透能力；
⑥具有精确的空隙尺寸以适合目标细胞的生长；
⑦具有良好的力学性能为细胞提供适宜的微应力环境；
⑧具有适宜的表面结构以促进细胞的黏附；
⑨增强细胞的功能以促进细胞分泌细胞外基质的能力；
⑩可充当信号分子如生长因子的载体。
K.J.Burg等认为支架材料的生物相容性与生物降解性、孔隙大小与孔隙率、表面拓扑结构等因素影响细胞的黏附、增殖分化和骨缺损部位的骨生长，因此，提出12条骨组织工程支架材料应具备的条件［9］
：
①临床上容易手术操作；
②支架材料的吸收速率与骨生长速率相互匹配；
③依人体骨缺损形状仿形；
④具有骨传导性或骨诱导性；
⑤保证精确的力学性能；
⑥促进骨质沉积；
⑦促进骨生长；
⑧可防止软组织向移植物骨组织界面生长；
⑨平均孔径在200～400μm之间；
⑩对周围组织无不良影响；消毒过程不影响支架材料的性能；降解产物无毒性。0.3 骨组织工程用生物材料
骨组织工程的发展对支架的生物功能及其他功能提出了更高的要求。因此，优化支架材料和性能成了国内研究者进一步追求的目标。从目前研究可以看出，在骨组织工程中研究较多的支架材料主要有天然支架材料、人工合成的支架材料以及复合材料。目前多为两种或多种复合材料。天然支架材料和人工合成支架材料间可以达到互补，但仍然存在着较多的不足，为此，多种材料的复合支架可实现优势互补。（1）天然支架复合材料
天然支架材料主要是胶原、藻酸盐、明胶、壳聚糖等，是较为理想的细胞外基质替代材料，但由于力学强度差，难满足骨组织工程对支架材料的基本要求。天然的异体骨需要经过脱脂、脱矿、消毒及冻干等处理获得脱钙骨基质，保留了骨的多孔结构，具有骨诱导性及骨［10］传导性。但经过脱矿处理，造成机械强度下降，免疫原性仍是难以克服的问题。因此，结合不同类型材料的优势，形成复合材料是当前制备支架材料的主要方向。清华大学的崔福斋团队根据骨组成及结构进行仿生，通过自组装制备纳米晶羟基磷灰石/胶原的骨修复产品“骼金”，达到与天然骨成分及骨纳米结构相似的结构，获得美国［11］食品和药品管理局认证并应用于临床，效果良好。壳聚糖结构与细胞外基质成分糖胺聚糖（GAGs）相似，具有良好的生物相容性和可调节的生物降解性能，可形成不同微观形貌与宏观形状，制备成［12，13］三维多孔支架材料，具有一定力学强度。但单纯的壳聚糖支架用于骨组织修复时力学强度差，在液体潮湿环境中易变形，促进［14，15］成骨细胞活性的能力和刺激成骨相关因子表达较低。壳聚糖-同种异体骨粉复合多孔支架材料具有适宜孔隙率和良好成骨活性，可有效修复大鼠骨缺损，其成骨量及成骨速度优于单纯壳聚糖支架［16］。M.E.Frohbergh等制备出了京尼平交联的静电纺丝壳聚糖-羟基磷灰石支架材料，可以调控支架材料降解时间、改善支架材料的物［17，18］理性能。通过仿生矿化的方法在京尼平交联的壳聚糖三维多孔支架孔道表面生长了一层羟基磷灰石纳米结构，再用银离子取代纳米羟基磷灰石中的钙离子，原位形成磷酸银，磷酸银可持续释放银［19］离子，起到抗菌作用。近年来，研究者发现氧化石墨烯（graphene oxide，GO）具有良好的力学性能，将石墨烯与壳聚糖水凝胶复合制备的支架材料，提高了支架材料拉伸强度和抗压强度，扩［20］大了应用范围。以壳聚糖为模板构建骨组织工程支架材料前景广阔，将成为骨修复的重要材料之一。（2）人工合成的支架复合材料
人工合成高分子材料具有降解速度和强度可以调节，易构建高孔隙率三维支架结构等优点。但有的人工合成支架材料生物活性低，有的会发生轻微的炎症反应，降解产物呈酸性，不利于骨生长。将合成的高分子和陶瓷材料复合制备多孔支架材料可以增强生物活性和强度，并减少高分子材料降解造成的副反应。目前应用或研究最广的生物降解性可植入高分子材料种类很多，主要有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物（PLGA）等。例如，将右旋聚乳酸（PDLA）与碳酸钙复合，用于猪桡骨缺损的修复，发现骨引导膜没有引起明显的炎症反应，并促进新骨的形成，而且碳酸钙的加入并没有影响聚乳［21］酸膜的力学强度。
人工合成支架复合材料以羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（β-［22，23］TCP）陶瓷材料应用最为广泛。羟基磷灰石作为骨的主要无机成分，具有良好的生物相容性和骨传导性，成为骨缺损和牙科修补主要材料之一，但也存在脆性大、降解速率较慢问题。磷酸三钙存在着机械强度差、降解速率过快等问题。但将两者结合后，通过调节HA/β-TCP比例，调控降解速率，达到降解吸收与骨生长速率相匹配，其降解产物不断释放钙、磷离子，利于类骨磷灰石的沉积，促进新骨形成。双相磷酸钙（BCP）生物陶瓷作为骨组织工程支架已商业化，［24］产品在美国、日本及欧洲等国家得到广泛应用。四川大学生物材料工程研究中心的张兴栋院士从20世纪80年代开始开展磷酸钙生物陶瓷的研究和开发，90年代初期发现具有特定组成和结构的多孔［25，26］磷酸钙陶瓷植入非骨部位后，有新骨形成的现象。张兴栋院士率先提出一定组成和结构的磷酸钙生物陶瓷具有骨诱导性的观点，突破了传统的“无生命的生物材料不可能具有诱导组织再生的生物功能，只有活性生物物质才可能诱导组织形成”的观点。（3）多种复合材料制备支架材料
单一材料已经不能满足骨缺损修复的需要，各种材料经合理设计及复合可实现取长补短的效果。目前，常用的复合材料包括：天然高分子生物材料与无机非金属材料复合，如胶原、丝素与HA复合，壳聚糖与双相磷酸钙复合；无机非金属材料与人工合成高分子相互复合，如HA、生物活性玻璃与人工合成高分子复合，HA、TCP人工促成高分子复合等；无机非金属材料、金属材料与高分子材料复合，如HA中掺杂Mg、Ag、Zn、Cu后再与高分子材料复合，所添加的抗菌功能金属如Ag、Cu、Zn等，不影响支架材料的生物活性。添加中药提取物可以实现抗感染和促进骨生长的作用，如添加中药骨碎补、淫羊藿等；添加具有促进骨生长和抗菌功能的抗菌肽、乳蛋白等。目前的骨组织工程支架已经由单一的成分转向多种材料复合，并可填入一种或多种生长因子，以此增加种子细胞的黏附、扩增、分化，从而促［27］进骨缺损的修复。
构建理想的骨组织工程支架材料需要多种材料复合和适当配比以及合理的加工工艺。将生物相容性良好的可降解生物材料魔芋葡甘聚糖、壳聚糖和纳米羟基磷灰石复合，经熟化、除碱和冷冻干燥等工艺手段，制备得到魔芋葡甘聚糖-纳米羟基磷灰石-壳聚糖复合多孔支架，［28］使支架材料抗压强度提高至1.1MPa。华中科技大学课题组利用胶原-丝素蛋白双模板协同共组装新策略制备出胶原-丝素-羟基磷灰石复合仿生骨替代材料，并对其矿化过程中多种有机模板成分协同诱导［29］［30］作用的机理进行了研究。R.Rajesh等报道了一种新型碳纳米管道复合海藻酸盐及羟基磷灰石的骨组织工程支架，抗压力测试在72KPa左右，体外细胞培养展示出了良好的组织相容性。胶原-羟基［31］磷灰石-硫酸软骨素-骨形态发生蛋白复合支架，更能提高骨组织的强度及韧性。研究者构建了纳米羟基磷灰石-重组类人胶原基-聚乳酸支架进行桡骨缺损的修复，支架具有良好的孔隙率、力学性能、［32］生物相容性及降解速度。0.4 骨组织工程支架材料制备技术
从仿生角度出发，骨组织工程支架材料的设计要考虑修复不同部位骨结构、形状特征、功能性等方面。骨组织工程支架材料的设计之一就是要求具有三维支架的孔隙尺寸，即获得300～500μm的互联贯穿大孔结构和微孔，以保证新骨生长的营养物质的传输和代谢物排出。另外，骨修复过程中宿主组织的毛细血管可在支架互联的多孔网络中进行生长，血管组织起到传输养分、进行气体交换和代谢物的消除的作用。
骨组织工程支架材料的制备技术很多，许多制备多孔材料的方法均可用于制备骨组织工程支架材料。化学发泡法是将在较高温度能够分解，产生气体或发生化学反应产生气体的化学物质与HA粉体浆料混合成型，在一定温度下加热处理发泡，再烧结形成多孔陶瓷［33］。常用的发泡剂是过氧化氢（HO）分解产生气体而形成多孔22HA，以聚乙烯醇等水溶性聚合物为黏结剂。造孔剂法是在陶瓷配料中添加造孔剂，在高温下燃尽或挥发而在陶瓷体中留下孔隙，可以制［34］得形状复杂、气孔结构各异的多孔制品。无机造孔剂有碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵等高温可分解的盐类等，有机造孔剂主要是天［35］然纤维、高分子聚合物和有机酸。胶晶模板法是采用单分散的胶体颗粒经自组装后形成的胶态晶体为模板，再向其中填充HA前驱体，最后去除模板后得到孔结构高度有序、孔径分布均匀的HA复合支架，成为制备无机陶瓷材料，特别是多孔骨组织工程支架的常用方［36］法。有机泡沫浸渍法是K.Schwartzwalder等在1963年首先提出，其原理是利用可燃尽泡沫塑料吸附陶瓷浆料，然后在高温下燃尽［37］载体材料而形成孔隙结构，可制取孔径均匀、孔隙相互贯通的高气孔率的多孔支架材料。快速成型技术或“3D”打印技术是最早（1987年）出现的应用于制造业的高新技术，其本质是用积分法制造三维实体，先由三维造型软件在计算机中生成部件的三维实体模型，然后将其用软件“切”出设定厚度的一系列几十微米的片层，再将这些片层的数据信息传递给成型机，通过材料逐层添加法制造出来［38］，目前已成为个性化人工骨制备的重要方法。凝胶注模成型是把传统陶瓷成型工艺与高分子化学反应相结合的一种崭新的陶瓷成型工艺。它主要利用陶瓷料浆中有机单体的原位固化来赋予陶瓷坯体的［39］形状，可制备各种形状复杂的陶瓷坯体。有机骨架复制法是利［40］用珊瑚的天然多孔结构制成种植体。冷冻干燥法是由英国人B.Wollaston于1813年发明，其原理就是将需干燥的物料在低温下先行冻结至其共晶点以下，使物料中的水分变成固态的冰，然后在适当的真空环境下，通过加热，使冰直接升华为水蒸气而除去，从而获得［41］干燥的制品。目前还有超临界流体技术、无纺布构造法、相分离法、颗粒滤沥法、选择性激光烧结、三维细胞打印技术等多种技术制备三维、多孔、高比表面积的骨组织工程支架材料。0.5 本书的主要内容及特点
本书将近年来研究的相关骨组织工程支架方面的研究内容展现给读者。本书中所述的骨组织工程材料以纳米复合材料为主体，涉及多种骨组织工程支架的设计方法及支架材料的表面修饰。主体制备材料可包括无机非金属材料HA、TCP、BCP、生物活性玻璃及天然HA（猪骨）、造孔剂等；高分子材料主要以壳聚糖为主，添加中药骨碎补粉和水提取骨碎补，选用硅烷偶联剂（KH-570）、单体丙烯酰胺、交联剂亚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚丙烯酸钠等。金属材料主要为纯的钛、镁或其中添加锌、银或铜等。依据不同部位骨修复对材料孔隙率、强度、降解性和生物活性的要求不同，选择不同材料和制备方法。采用湿法合成制备HA、TCP、BCP等主要原料，以高分子材料为骨架材料，并添加活性物质或偶联剂提高骨支架材料性能。
第1章主要介绍HA制备及分散剂对纳米HA形貌、尺寸及团聚的影响，并通过体内和体外的相关毒性实验，验证不同分散剂对其的影响。第2章中的HA-生物活性玻璃支架材料采用有机泡沫浸渍法，研究陶瓷浆料组成及性能的关系以及添加剂对料浆流动性和稳定性的影响，并用流变公式进行计算。制备出孔径200～400μm、孔隙率达70%～80%、孔隙相互贯通，具有一定强度和韧性、生物相容性好的支架材料；经过体外模拟和体内动物植入实验进行证实，可应用于具有一定承载力的骨修复场合。第3章中HA-磷酸钙-壳聚糖骨组织工程支架材料的制备方法为凝胶注模法，研究了单体丙烯酰胺（AM）、交联剂亚甲基丙烯酰胺（MBAM）、磷酸钙类粉体和壳聚糖粉配比关系试验，并采用偶联剂单烷氧基型钛酸酯偶联剂（NDZ-101）和硅烷偶联剂（KH-570）来改性磷灰石，其抗压强度为20～38.5MPa，孔隙率在43%～66%。第4章和第5章采用冷冻干燥技术制备中药骨碎补-双相磷酸钙-壳聚糖骨组织工程支架和天然羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架，具有抗菌和促进早期骨生长的作用。以壳聚糖为模板的支架材料，可用于非承载或承载很弱骨修复。第6章中的生物活性医用多孔钛材料是以碳酸氢铵作造孔剂，采用粉末冶金法制备而成，并经碱处理及热处理表面改性获得表面活性，通过体外模拟研究其生物活性。该种材料可用于修复具有一定承载能力和骨生长后仍需要保持力学支撑的骨修复场合。第7章以细菌纤维素（BC）为基础材料，采用物理交联或化学交联方法，与纤维蛋白（Col）、羟基磷灰石（HA）、明胶（GEL）等复合，再利用冷冻干燥法制备骨组织工程支架材料，进行细胞黏附性实验和颌骨缺损修复研究。该支架材料可用于非承载或低承载的骨修复。参考文献
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［41］ Lee H，Jang T S，Song J，et al.The production of porous hydroxyapatite scaffolds with graded porosity by sequential freeze-casting［J］.Materials，2017，10（4）：367-340.第1章 铈分散的纳米羟基磷灰石及生物相容性
多年来，骨缺损修复问题一直困扰着骨整形科专家。实践证明自体骨移植仍是当前治疗骨缺损的最好方法，但是又造成第二术区，且来源有限。异体骨移植存在免疫排斥反应。因此，人工骨缺损修复材料发展很快。目前，用于骨修复的材料有两大类：一类是生物骨修复材料，如珊瑚人工骨、脱钙骨基质等；另一类是人工合成材料，如羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、生物活性玻璃和聚乳酸（PLA）等。其中，人工合成的HA已成为解决骨缺损的一条重要途径。目前，［1～7］以医用为目的制备HA粉体的工艺很多，已成为研究热点。
HA是硬组织生物材料中研究和应用最多的一类材料，分子式为［8，Ca（PO）（OH），是脊椎动物骨和齿的主要无机成分104629］。HA作为一种人工合成生物材料，具有良好的生物安全性和组织［10～12］相容性，已被广泛地应用于医学领域，用于骨/牙修复等。另外，生物体的骨骼、牙齿、肌腱等都是由纳米微粒形成的具有纳米结构的天然生物材料。因此，纳米HA（Nano-HA）的研制成功为骨缺损修复开辟了一条新的途径。但纳米微粒的聚集倾向、纳米微粒的［13］分散问题以及纳米材料的长期临床评价等还需要深入研究。在合成Nano-HA中，掺杂其他元素形成复合HA成为研究热点，如掺杂［14～17］硅、锌、钛、银等。通过掺杂可获得特殊功能，掺杂元素Nano-HA所具有的独特的优势正显示它作为生物材料巨大的潜力和广阔的应用前景，正在引起越来越多的关注和研究。
必需微量元素在维持人体新陈代谢等方面发挥着极其重要的作［18，19］用，动物及人体内均有一定量的稀土。少量的稀土元素对［20，21］人体是有一定积极作用，如抗肿瘤、抗菌作用等，但过量的稀土元素会产生毒性。本章选择湿法合成HA，并掺杂铈，铈还可以作为分散剂，并采用乙醇分散、球磨、超声破碎的工艺制得了含铈和不含铈的Nano-HA，然后从粉体形貌、相结构、急性毒性试验、溶血试验、微核试验、植入试验等方面对它进行初步的生物相容性评价，探讨其作为骨组织工程支架最基础的原材料和其作为骨填充材料应用于临床试验的可行性。1.1 Nano-HA粉体制备
采用湿法合成Nano-HA，其化学方程式见式（1-1）。10Ca（OH）+6HPOCa（PO）（OH）+18HO 234104622（1-1）
湿法合成HA的反应装置见图1-1，制备过程如下：HA合成前，设计钙磷原子比例为1.67，将HPO缓慢加入配制好的Ca（OH）饱和342水溶液中搅拌使合成反应发生，pH值为8.6，合成反应温度50℃，反应4h后，离心去上清液。然后用离心机离出水分，所得胶状物经酒精分散、烘干后，在850℃保温2h后随炉冷却得到HA。之后，分别用95%乙醇和95%乙醇+5%硝酸铈盐分散。分散过程中95%乙醇（或95%乙醇+5%硝酸铈盐）用氧化锆球磨12h，离心后以10℃/min的速度升温至850℃烧结；然后经第二次球磨12h后，离心、烘干，制备HA粉为Nano-HAⅠ（乙醇）和Nano-HAⅡ（铈）。图1-1 湿法合成HA装置示意图1.2 HA粉体组织结构及元素分析
不同分散剂处理的粉体X射线衍射相分析见图1-2。无论是未分散或是采用不同分散方法处理的粉体，均有Ca（PO）（OH）相10462产生。其中，5%铈盐分散处理的粉体还发生了铈取代了部分钙，有Ce（PO）（OH）相产生。10462图1-2 不同分散剂的HA粉体XRD图谱（a）未分散；（b）乙醇和5%铈盐分散
对未分散处理的HA粉体经色谱质谱分析其元素见表1-1。其有害的重金属含量远小于YY 0303—1998《医用羟基磷灰石粉料》中杂质元素及重金属元素极限的Pb≤10，Cd≤3，As≤2，Hg≤2的标准，说明所制备的HA粉体的元素含量满足医用标准。表1-1 HA粉体Ca/P和重金属元素分析
采用TEM分析湿法合成未烧结的粉体形貌见图1-3。湿法合成中经一定反应时间的粉体呈竹叶形态。未分散处理的粉体竹叶多呈现团聚堆积，单体粒子形态很多分不清；经乙醇或5%铈盐分散的粉体可看到每个竹叶的形态，尤其是5%铈盐分散的粉体呈竹叶状均匀地分布。图1-3 不同分散剂的未烧结粉体TEM形貌（a）未分散；（b）乙醇分散；（c）5%铈盐分散
经高温烧结后HA粉体的TEM形貌见图1-4。经烧结的竹叶状形态按最小自由能生长原理产生收缩呈球状化，HA粒子呈六方晶体结构。未进行分散处理的HA部分呈单体条状、球状或六方晶体结构，还有很多粒子团聚一起；酒精球磨分散的HA尺寸为纳米级，基本呈六方晶体状态，粒子间有单体存在，呈微量团聚状态，说明乙醇有一定的分散作用；稀土铈盐分散的HA粒子有的单一粒子呈六方晶体，六方晶体边缘不规整，还有的由点状物构成，单一的小点状物尺寸在10nm以下，分散效果很好。以铈盐分散的HA进一步高倍观察呈六方晶体结构，晶粒尺寸宽为50～70nm，轴向尺寸为70～100nm，见图1-5。图1-4 经高温烧结后HA粉体的TEM形貌（a）未分散；（b）乙醇分散；（c）5%铈盐分散图1-5 铈盐分散HA的TEM形貌
羟基磷灰石晶体为六方晶系，分子式为Ca（PO）（OH）1046，属LPC对称型和P63/m空间群，晶胞参数a=0.938～0.943nm，26oC=0.686～0.688nm，Z=2。HA有与天然骨相似的结构。骨盐约有060%以结晶的羟磷灰石形式存在，其余40%为无定形的CaHPO，并4可以转变为HA。HA是微细的结晶，亦称骨晶（bone crystal），可以2++--吸附液体中其他离子如Mg、Na、Cl、HC、F、柠檬酸根等，进行离子交换。利用HA与骨结构相同的特点，而把人工合成的HA运用于动物试验与临床骨移植中。HA亦是人牙釉质的主要结构，成分占98%，釉质中的HA为20nm×60nm×160nm的六方棱柱晶体结构，生物蛋白可吸附在其上形成骨细胞的附着，引导骨组织生长，加速骨创［22］的愈合。因此，通过人工合成的HA，可作为骨组织工程支架最基础的无机材料。1.3 HA粉体急性毒性检测实验
生物材料的急性毒性试验按GB/T 16886.11—2011进行。一般指机体（实验动物）一次或24h内多次接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。其途径可包括经口、经皮、经腹腔、经静脉等不同的给予方法，可以从不同角度了解不同处理的HA粉体进入机体后的全身代谢和造成的机体毒性反应，从而评价生物材料的急性毒性作用。1.3.1 实验材料及方法
选用不同HA粉浸提液和混悬液（浓度为10mg/mL）、普通HA粉末浸提液。实验动物为18～22g健康昆明小鼠（黑动字第99101001号）77只，由佳木斯大学动物中心提供。
将77只小鼠，随机分成11组，分别进行腹腔注射生理盐水（对照组）、HA微粉浸提液、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混悬液、铈盐分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混悬液。尾静脉注射生理盐水（对照组）、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混悬液、铈盐分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混悬液，注射剂量为50mL/kg。注射后，0h、24h、48h、72h、168h称量小鼠的体重，观察记录动物的一般状态，毒性表现和死亡动物数。材料毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。一周处死小鼠，解剖观察脏器变化，肝脏、肾脏做组织切片，镜下观察，对于混悬液组，观察有无Nano-HA栓塞在脏器的血管内。注射后动物反应观察指标见表1-2。表1-2 注射后动物反应观察指标1.3.2 实验结果及分析
所有动物在注射后1周内的活动、进食正常，无惊厥、瘫痪、呼吸抑制、死亡等不良反应，无肉眼可见的毒性表现，1周后动物解剖脏器观察，无坏死、出血、变性等病理表现，且未发现纳米羟基磷灰石造成血管栓塞的现象。各组小鼠在24h、48h、72h和168h（1周）的体重变化见表1-3和表1-4。各试验组腹腔注射与尾静脉注射各时期小鼠体重变化与阴性对照组比较的统计分析见表1-5和表1-6。表1-3 腹腔注射的急性全身毒性试验小鼠体重变化情况（X±SD） 单位：g表1-4 尾静脉注射的急性全身毒性试验小鼠体重变化情况（X±SD） 单位：g表1-5 腹腔注射同期急性全身毒性试验结果的统计分析表1-6 尾静脉注射同期急性全身毒性试验结果的统计分析
结果显示所有腹腔注射的小鼠各实验组和空白对照组比较24h、48h、72h和168h的体重变化没有显著差异。尾静脉注射小鼠中Nano-HAⅠ浸提液组和Nano-HAⅡ浸提液组与空白对照组比较24h、48h、72h和168h的体重变化，没有显著差异；Nano-HAⅠ混悬液组、Nano-HAⅡ混悬液组与空白对照组比较24h、48h、72h的体重变化，有显著差异，168h显著差异。
图1-6是铈盐分散的Nano-HAⅡ混悬液注射腹腔后小鼠肝脏和肾脏HE组织学图像。10倍观察小鼠肝脏和肾脏组织学，观察未见变性、坏死等异常［图1-6（a）和图1-6（c）］；40倍观察肝细胞多边形，细胞界线清晰，核膜清楚，核仁可见［图1-6（b）］；40倍观察肾小球、肾小管、血管均未见异常［图1-6（d）］。组织学切片对所有实验组和对照组肝脏、肾脏进行观察均未见变性、坏死等病理现象，细胞核完整，核仁清晰可见，胞浆染色正常，无异染物质。图1-6 铈盐分散的Nano-HAⅡ混悬液小鼠肝脏和肾脏HE组织学图像（a）肝脏×10；（b）肝脏×40；（c）肾脏×10；（d）肾脏×40［23］
在急性毒性研究中，文献中认为HA的半数致死量为13.43g/L。本试验采用Nano-HA浸提液进行尾静脉注射、腹腔注射外，考虑到Nano-HA植入后有被吸收入血的可能，附加了Nano-HA混悬液组，发现只有浓度为10mg/mL的Nano-HA混悬液在静脉注射后24h、48h、72h小鼠体重变化与生理盐水组对照有显著差异，注射后1周没有显著性差异，腹腔注射各组鼠的体重变化与生理盐水组都没有显著性差异。1周后各组小鼠的肝脏、肾脏在大体观察时和组织学镜下观察均未见异常，说明不同分散处理的Nano-HA不含有害成分，10mg/mL浓度的Nano-HA混悬液虽在短期内可影响小鼠体重变化，但也是安全剂［24］量，与文献的研究结果HA-sol的安全剂量9.85g/L相似。1.4 Nano-HA粉体溶血试验
溶血试验是用于评价长期与骨组织或软组织接触的材料的体外急性溶血活性。通过材料与血细胞在体外接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定，对材料的体外溶血性进行评价。该试验能敏感地反映材料对红细胞的影响，故是一种特别有意义的材料筛选试验。采用YY/T 1532—2017《医疗器械生物学评价纳米材料溶血试验》，通过对不同兔血的反应测定，其平均溶血率为5%。一般来讲，具有毒性物质的材料所造成的溶血反应程度较其在细胞培养中所产生的毒性反应程度大，当在溶血试验中测得有溶血活动时，可提示材料有毒性。1.4.1 溶血试验方法
进行溶血试验时采用Nano-HAⅠ生理盐水浸提液、Nano-HAⅠ生理盐水混悬液（10mg/mL）、Nano-HAⅡ生理盐水浸提液、Nano-HAⅡ生理盐水混悬液（10mg/mL）4组材料。
穿刺新西兰兔心脏取血20mL，加入1mL 20g/L草酸钾制成新鲜抗凝血，取8mL抗凝血加10mL生理盐水稀释。将试验材料样品分为4组，每组3份，分别加入浸提液10mL，置于37℃水浴中保温30min。阳性对照组为10mL蒸馏水3份，阴性对照组为10mL生理盐水3份。18只试管中均加入0.2mL稀释兔血，混匀后，置于37℃水浴箱中保温60min，1000r/s离心5min，吸取上清液移入比色皿中，用721分光光度计在波长为540nm处测吸光度，根据结果按公式计算溶血度。1.4.2 溶血试验结果
相关的ISO标准要求试验组中阳性对照组吸光度值应在0.8±0.5范围内，阴性对照组吸光度值应小于0.03，否则不可进行。标准溶血浓度小于5%为不溶血。本试验各试验组溶血率均小于5%，见表1-7。表1-7 各组Nano-HA溶血程度
按照标准建议的方法，对Nano-HA的溶血活性进行测试，同时考虑到Nano-HA的粒子尺寸大小的特点，有通过毛细血管壁（内径为8～10μm）进入血液循环的可能，测试了10mg/mL混悬液的溶血率，结果均小于5%，故认为不同分散处理Nano-HA材料无溶血反应。1.5 Nano-HA粉体微核试验
微核技术是一种简单、快速、在细胞学水平上筛查染色体损伤的方法，评价材料、药物、放射线及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤程度时，按照YY/T 0127进行。微核来源于染色体断裂形成的片断或因纺锤体紊乱形成的整个滞后的染色体。由于某种理化因子的作用，有丝分裂间期的细胞受到伤害，在有丝分裂间期，这种断片落后于向两极移动的染色体，而滞留于细胞质中，当其他染色体复制形成子细胞核时，这些落后的断片在子细胞中演变为微核，形成主核旁边的一个或多个“小核”。微核染色体的结构和颜色深浅同主核相似，转动微调时，与主核处于同一平面，呈圆形或椭圆形，界限清楚，包含于胞浆中，直径为主核的1/20～1/5，并与主核不相连；微核完［25］整，不重叠，但死亡或降解的细胞除外。各种文献报道中，正常对照的微核数也有很大的差异，但药典中的阳性标准是［26］5‰。1.5.1 微核试验方法
选用实验组同溶血试验相同。实验动物为健康昆明小鼠30只，体重为20～25g，将小鼠随机分成6组。阴性对照组与实验组小鼠分别按体重静脉注射剂量为0.1mL/20g生理盐水、材料浸提液、混悬液，阳性对照组按体重注射80mg/kg环磷酰胺，两次腹腔注射染毒，间隔24h。第二次染毒6h后，颈椎离断法处死小鼠，迅速剪下小鼠两条股骨，除去筋膜肌肉，剪去股骨两端，用注射器吸取1mL小牛血清推入骨髓腔中，将骨髓冲洗入离心管中，反复冲洗至骨髓腔中无血。然后以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，用毛细管吹打沉淀物，吸少许均匀涂片。每只小鼠涂片两张，晾干后用甲醛固定，用0.25%M-G染液染色，再以1∶10Giemsa液染色10min，用蒸馏水分色10s，晾干后进行镜检，高倍镜下选择细胞分布均匀、染色好的区域，镜下计数骨髓嗜多染红细胞（PCE）数，PCE在油镜下呈灰蓝色。微核直径相当于PCE的1/20～1/5，呈圆形，边缘光滑，与其他有核细胞核质一样染成紫红色或蓝紫色。一个PCE中出现两个以上的微核按一个微核细胞计，计数每2000个PCE细胞中含微核的PCE数，结果以‰表示。1.5.2 微核试验结果
微核试验中取每只试验鼠计数2000个PCE细胞，并观察含微核的PCE数，其结果见表1-8。阴性对照组、实验组微核率范围在1.0‰～1.8‰，阳性对照为23.5‰。所有试验组均低于药典的阳性标准5‰，无致突变反应。说明不同分散的Nano-HA均没有造成细胞过度损伤。表1-8 各组样品微核试验结果比较1.6 HA局部植入试验1.6.1 局部植入试验方法
以Nano-HAⅠ（乙醇分散）和Nano-HAⅡ（铈盐分散）为实验组，未进行分散处理的HA为对照组。实验动物为32只新西兰兔，由佳木斯大学动物中心提供，雌雄不限，体重为2.5～3.5kg，普通环境饲养，术后1周、4周、8周和12周取材，每种试验样每个试验期为4只。
手术过程采用速眠新注射液0.3mL/kg肌肉注射，麻醉显效后，动物侧卧于兔台绑定后，于股骨外侧皮肤剪毛，在0.5%碘伏消毒术区，铺无菌手术单，于股骨外侧髁处纵行切开并逐层分离皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜，显露股骨外侧髁，用慢速牙钻机与生理盐水冷却下在外侧髁下方骨皮质处钻3个直径为2mm的孔，间隔8mm。用生理盐水反复冲洗创区，充分止血，将预先用生理盐水调和后的干燥成型的不同粉体块材植入创区，在骨植入区外侧分离臀大肌成肌袋3处，植入同种2mm直径的材料，分层对位缝合创口，碘伏消毒创区，术后连续5天每日一次肌注庆大霉素0.5mg/kg、预防感染，并观察动物状态、创口愈合情况。
术后1周、4周、8周和12周，每组试验样各处死4只动物，立即将含修复区周围组织（股骨及肌肉组织的复合组织块体）离体取出，采用生理盐水冲洗后，置于10%甲醛中固定24h；完成骨组织脱钙（脱钙液为硝酸∶甲酸∶蒸馏水=2∶2∶6）后，制作常规组织切片、HE染色，并置于Olympus BH-2型显微镜下观察。1.6.2 局部植入试验结果及分析
植入试验是用体内植入的方法评价宿主组织对材料的生物学反应。评价的生物学指标包括：纤维化程度；炎症程度；组织变性；界面炎细胞类型；是否存在坏死；材料碎片脂肪浸润；肉芽肿等。对骨组织主要观测骨组织与材料的界面处，应评价植入体与骨的接触面积和植入物周围骨的数量及其间的非钙化组织，以及骨吸收和骨形成的情况。（1）肌肉植入实验
实验动物一般状况良好，创口无感染，也无植入物排斥反应。肉眼观察，植入部位肌组织无异常，材料与肌肉结合紧密，材料周围无骨组织产生，HE组织学观察见图1-7。1周时，界面周围的肌肉内可见到少量到中等程度的炎症细胞浸润，材料周围可见到不同程度的成纤维细胞和纤维组织增生；4周时，浸润的炎症细胞开始减少，纤维组织、细胞成分逐渐稳定；8周时，纤维包膜变薄，纤维组织长入材料内部；12周时，浸润的炎症细胞消失或已经很少见，周围肌组织始终保持正常结构。各期Nano-HAⅠ组、Nano-HAⅡ组和普通HA组的组织反应略有差异，相对比较8周和12周时，Nano-HAⅠ组、Nano-HAⅡ组发现少量胶原纤维和纤维细胞长入材料间隙中，肌肉组织和材料有的难以分清。图1-7 植入材料与肌肉组织HE组织学图像×40—材料；—肌肉组织；—纤维组织（a）HA（1周）；（b）Nano-HA Ⅰ（1周）；（c）Nano-HA Ⅱ（1周）；（d）HA（4周）；（e）Nano-HA Ⅰ（4周）；（f）Nano-HA Ⅱ（4周）；（g）HA（8周）；（h）Nano-HA Ⅰ（8周）；（i）Nano-HA Ⅱ（8周）；（j）HA（12周）；（k）Nano-HA Ⅰ（12周）；（l）Nano-HA Ⅱ（12周）图1-7 植入材料与肌肉组织HE组织学图像×40—材料；—肌肉组织；—纤维组织（a）HA（1周）；（b）Nano-HA Ⅰ（1周）；（c）Nano-HA Ⅱ（1周）；（d）HA（4周）；（e）Nano-HA Ⅰ（4周）；（f）Nano-HA Ⅱ（4周）；（g）HA（8周）；（h）Nano-HA Ⅰ（8周）；（i）Nano-HA Ⅱ（8周）；（j）HA（12周）；（k）Nano-HA Ⅰ（12周）；（l）Nano-HA Ⅱ（12周）
肌内植入试验可见，材料周围无新骨形成，表明Nano-HA无骨诱导活性，同时材料仅引起一过性的炎症反应，并且未见异物反应，从而证实Nano-HA具有高度的组织相容性，植入机体后能很好地被机体“容受”。（2）骨内植入试验
材料与骨组织HA染色图像见图1-8。1周的脱钙骨组织切片镜下可见材料与骨组织之间无肉芽组织，材料周边有纤维骨痂形成；各组材料亦见大量的纤维骨痂长入材料，材料周围形成纤维组织，周围骨组织对三种材料的反应无明显差异。4周时，Nano-HAⅠ组和Nano-HAⅡ组，材料周围可见大量骨基质出现，纤维骨痂已经开始钙化成骨，但未出现明显的钙化线，生长良好的新生骨组织长入材料内部，材料周围可见成骨细胞；对照HA也可见骨基质形成，新生骨长入材料内部。8周时，Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ材料周围已有大量的新生骨组织，并可见染色较浅的骨基质新沉积于材料周边，骨纤维形成钙化线，新生骨胶原纤维组织呈同心圆排列，即将形成哈佛氏系统；对照HA组亦见有新生骨形成，但并未见哈佛氏系统的形成。12周时，可见Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ已可见较成熟的骨组织，但骨纤维排列尚欠规则，骨创完全愈合，新生骨与周围骨相接成为一体，充填的材料基本消失，材料周围的骨已趋于成熟，有成熟的骨陷窝，已形成较成熟的哈佛氏系统；对照HA可见大量新生骨生长，有一定量残留的材料，哈佛氏系统少见，新生骨的成熟程度较差。
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