作者：王晖
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皮肤外用药物研究方法学试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
皮肤外用药物研究方法学/王晖主编.—北京：人民卫生出版社，2017
ISBN 978-7-117-24273-8
Ⅰ.①皮… Ⅱ.①王… Ⅲ.①皮肤病-外用药-研究 Ⅳ.①R986
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主 编：王 晖
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排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司
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皮肤药物学是近年来发展比较迅猛的一个新兴研究方向，但相对于皮肤外用药物的剂型研究和药理学等，还是相对比较滞后。发展滞后既与思想上不够重视有关，认为皮肤药物的研究相对比较简单，难以取得成果；也与相关研究缺乏系统性总结有关，尤其是对皮肤外用药物研究的工具书偏少。
因此，本书主编结合多年的研究工作，组织国内同行中的皮肤药理学研究工作者，比较系统地归纳、整理了皮肤外用药物研究的一些关键技术、方法及科学问题，希望为皮肤药物学学科的发展起到抛砖引玉的作用。全书共分五篇，第一篇为总论，介绍皮肤药理学的相关研究，如吸收促进剂的作用及机制、经皮给药药代动力学、皮肤用药的安全性、经皮吸收的数学模型、药物经皮吸收的方法等；第二篇对常用的统计学方法进行介绍；第三篇是结合本研究室的研究实例，介绍了多种综合评价方法在皮肤给药的药效研究中应用；第四篇为皮肤相关疾病动物模型的研究方法；第五篇则是皮肤常用药物剂型及透皮给药方法的介绍。
该书立足于皮肤外用药的药效研究方法，力求解决目前皮肤药物药效评价的难点，尤其是将定量药理学的方法和手段应用到皮肤外用药物药效的评价上，是国内为数不多的有关皮肤外用药物研究方法学的工具书，对皮肤用药物的研究和外用新药的开发都具有一定的参考价值。
该书具有以下特点：
1.科学性强 所有资料来自权威期刊和本研究室的研究工作。
2.内容新颖 介绍多种药效研究的综合评价方法及国内外相关研究的新方法、新技术。
3.实用性好 提供理论和实践结合的多种实例，让读者容易操作和掌握。
4.适用面广 不仅适用于大专院校、科研院所的教师、学生、科研人员，也适用于皮肤科（外科）临床医师。
5.可读性强 图文并茂，文字精练，有具体实例可供参考。
由于编者水平有限，尽管数易其稿，本书可能仍存在不少错漏之处，恳请同行和广大读者批评指正。王晖2017年5月于广州第一篇 总 论第一章 皮肤用药的历史与现状
皮肤具有不断自我更新的能力，是身体各组织中代谢较为活跃的组织之一。随着老化的表层角质脱落，基底细胞不断分裂、增殖，并向上移行。将药物实施于患部皮肤或穴位，针对局部靶器官，即表皮、真皮及皮肤附属器，增加了病灶部位药物有效的浓度，起效迅速，且不受胃肠道酶、消化液等的影响，避免了肝脏的首过效应和胃肠道的破坏；经皮释药还可针对系统靶器官，即全身各器官组织发挥治疗作用。局部发挥疗效的药物仅需通过释放和穿透两个步骤，而全身发挥疗效的药物则需通过释放、穿透及吸收入血液循环三个阶段。“皮”与“肤”二字的渊源。在先秦，皮专指“兽皮”，而人的皮称“膚”（读fu），即“肤”，可见区别，两者不同。《周礼·天官》：“凡兽，入于猎人；皮毛筋角，入于王府”。《诗经·卫风·硕人》：“肤如凝脂”。《墨子·修身》：“畅之四肢，接之肌肤，华发隳颠……”。《荀子·告子章名下》：“必先苦其心志，劳其筋骨，饿其体肤，空乏其身”。《荀子·荣辱》：“鼻辨芬芳腥臊，骨体肤理辨寒暑疾养”。可见皮肤二字，中国医界先用“肤”，后用“皮”，到了汉代，“皮”字开始用于人的皮肤，且常常“皮肤”二字连用，例如《史记·扁鹊仓公列传》：“乃割皮解肌，诀脉结筋”。《神农本草经》：“皮肤中热，风搔身痒”。《伤寒论》：“其身如虫行皮中状，此以久虚故也”。《金匮要略》：“理者，是皮肤脏腑之文理也”。约成书于汉代的中国第一部系统的药物学著作《神农本草经》，记载的皮肤病有疥、白秃、癣、息肉、面黑黚、瘾疹、血痹、肬、面皯疱、黑子、皮肤涩、毛落、阴蚀、面黑等病症；医学经典巨著《黄帝内经》的形成标志着中医学理论体系的确立，该书分《素问》与《灵枢》两册各9卷，共81篇，分别论述皮肤解剖、生理、病理、皮肤附属器及皮肤病的诊疗，其中65篇有“皮”字，专设“皮部”和“痈疽部”。
远古时期，人类出于本能利用自然界的天然物质对某些病痛施行自发的治疗，以缓解痛苦为主，如用树叶、草茎等涂敷伤口而逐渐发现有些植物外敷能减轻疼痛和止血，甚至加快伤口愈合，并在偶然间发现了药物的作用。《周礼·天官》记载了以外敷药物治疗疮疡；帛书《五十二病方》记载了“刑赤竭，以血涂之”，还记载了最早的酒剂外用。最早的医学典籍《黄帝内经》中多个篇章都载有关于外治的叙述，如《灵枢·刺节真邪》：“桂心渍酒，以熨寒痹”。汉代名医张仲景著《伤寒杂病论》，创用黄连粉外治皮肤浸淫疮，王不留行散治外伤金疮。
晋代出现了我国现存的第一部外科学专著《刘涓子鬼遗方》，比较详细地介绍了用中药外治多种皮肤病的方法。如首次记载了用黄连、雄黄、水银等药制成水银膏治疗皮肤病，此外还记载了用紫草膏方治小儿头疮，用白蔹膏方治皮肤热疮，用五黄膏方治久病疥癣，用擦香膏方治面野胞，用白芷膏方治发顽等。晋葛洪所著的《肘后备急方》亦介绍了多种外治皮肤病的简易方法，如疠风用酢磨的乌贼骨敷之，白驳取鳗鱼脂敷之，白秃用藜芦、猪油搽之，漆疮用汉椒汤洗之等等，对黑膏药制法、条件、用具，均有详细记载。另外，至晋代已开始有了硬膏的制作和临床应用。隋、唐时期，名医孙思邈著《备急千金要方》，介绍了用丹砂、矾石、水银和铅硬膏等外治皮肤病的方法。其中，还载有“治痈久不瘥方：马齿苋捣汁，煎以傅之”等用药经验。明、清两代，皮肤疮疡外科名医辈出，各种皮肤病外用中药的剂型和制剂不断增多，有力地促进了皮肤病外用中药的发展。如明·陈实功的《外科正宗》有用纸贴剂和玉容丸外治皮肤病的记载，其中纸贴剂是将中药煎液或研粉后固定在文油纸上，用时视疮面的大小外贴患处。玉容丸是用甘松、白芷、防风、菊花、羌活等20种中药研粉加肥皂制成，是一种早期的药皂丸，用来早晚外洗治疗男女雀斑、酒刺及身体皮肤粗糙。《本草纲目·序例》详细描述了制膏程序。清代外科专著《外科大成》详细描述了皮肤病湿敷的操作方法和作用，曰：“以软帛叠成七、八重，勿令太干，带汤于疮上，两手轻盈，施压片时，帛湿再换，如此洗按四、五次，流通气血，解毒止痛，祛癖脱腐”。《疡医大成》记载了用布帛搽剂外治皮肤病的方法：“治痒块方，苍耳子、大枫子、硫黄、樟脑、雄黄各二钱，用芝麻一合，炒黑和研成泥，生布包药擦”。《理瀹骈文》应用辨证论治思想，总结近百种外治方法，以膏药为主，用药量大而药味多，分五官孔窍用药、腑穴用药、病位用药，其制药别具一格，多选气香力雄、辛窜透达之品以利渗透。
由此可见，在传统医学中，皮肤病外用中药很早就已得到应用，经过历代医家的反复实践，剂型和制剂得到不断充实、提高和发展，其中临床比较常用的传统剂型有水剂、散剂、硬膏、软膏、糊膏、油剂、配剂、洗剂、熏药、搓药、布帛擦剂等10多种。《医宗金鉴》云：“不时以原汁润之，盖借湿以开窍，干则药气不入，更添拘急之苦”。此处的“窍”指的是体表的细微孔窍，外治用的药就是通过这些细微孔窍渗透于体表、组织，直达病所。即清代名医徐灵胎谓“用膏贴之，闭塞其气，使药性从毛孔而入其胰理，通经贯络，或提而出之，或攻而散之，较之服药尤有力，此至妙之法也。”
长期以来，“外治之药，即内治之药；外治之理，即内治之理”这一思想，指导着中药外治临床用药。人们在继承传统方法的基础上结合现代科学手段进行研究，中药外治新方法、新器具、新剂型不断出现，中药外用的功效多沿用内服的功效现代研究证实。但内服药经过许多间接作用而产生了中药内服的功效，因此需要我们对外用中药的功效进行整理、规范、提炼，通过建立中药功效与临床应用分析系统，结合动物实验研究和临床验证，进一步规范中药的外用功效，建立与内服相对应的常见外用中药功效体系。
目前，对于中药外治整体病变机制研究的现代医药学基础研究普遍不足，中药外治局部病变虽能给以一些机制阐述，但单纯从成分作用特点尚不能很好解释中药良好的临床疗效。应在建立常见药物外用功效的基础上，依据穴位刺激，经络传感，并结合现代药理学研究方法，运用各种组学和生物信息学等技术展开研究。进一步丰富和完善中药外治理论，深入开展方剂组方研究，从而更好指导中药外治的临床应用。
中药外敷制剂多为复方，且多用辛辣芳香、气味浓烈的窜透性药物和活血化瘀力强的药物促进透皮和疏通经络、脏腑，所谓“假猛药、生药、香药率群药，开结行滞，直达病所”，这是中药透皮内病外治的理论依据。内病外治法大体可归为药物外敷法、针灸、按摩、刮痧等，在外治手法上有敷、熏、洗、浸、擦、灸等。药物外敷法是用药物制成不同的剂型，施用于皮肤局部，利用药物的渗透性能直达病灶，而产生治疗作用。
外治药物按作用分类有清洁药、保护药、止痒药、止痛药、收敛药、消毒抗菌药等，治疗领域已由传统的外科正在向急症、儿科、妇科、内科、五官、皮肤、肿瘤等学科发展，由局部体表病变治疗向全身性疾病治疗发展。另外，对于一些疑难杂症采用中药外治法，有时可收到意想不到的效果。外治的实验研究、临床研究也已经取得了一定的进展，药物的选择亦多遵循中医辨证论治的原则，给药途径和药物吸收机制研究日趋深入。
药物透皮吸收给药系统是药剂学中一个新兴的领域，20世纪70年代是实验和发明时期，80年代是商品化时期。自从1981年首创的产品东莨菪碱透皮吸收贴剂问世以来，国外市场上相继已有近10种产品脱颖而出，特别是硝酸甘油、硝酸异山梨酯、烟碱、雌二醇、芬太尼、可乐定和睾酮等透皮制剂的投入市场，显示这种新剂型的优越性和发展潜力。角质层的紧密结构是皮肤限制体内外物质交流的主要屏障。体外物质透过角质层的速度也是经皮吸收的主要限速步骤，但在一定条件下某些物质可以有选择地透过角质层。一般而言，分子量小于300，带正电的物质，如果兼具脂溶性和一定水溶性则易于渗透。如能改善角质层的通透性可极大提高经皮吸收率。随着高分子药用材料的应用以及制药技术的进步，治疗皮肤病的常见外用剂型从古代的汤剂、粉剂，逐步发展为膏剂、洗剂、酊剂、油剂、散剂、溶液剂等，并进一步开发研制出了各种新剂型如涂膜剂、膜剂、巴布剂、贴膏、贴片等。将传统中医外治与现代透皮技术结合，如采用离子导入、微针技术、低频超声、脂质体、传递体及采用缓释控释剂型等，以形成的透皮治疗系统，将是全身性疾病外治研究的发展趋势。参考文献
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皮肤是人体最大的器官，其作为屏障一方面保护机体内各种器官和组织，使机体免受外界环境中机械性、物理性、化学性和生物性等有害因素的损伤，另一方面防止机体内各种营养成分、电解质和水分等物质的流失。皮肤屏障主要包括皮肤的物理屏障、色素屏障、神经屏障、免疫屏障以及其他与皮肤相关的屏障功能。皮肤屏障功能主要由角质层的角质形成细胞（keratinocyte，KC）及其细胞间的脂类混合物组成。角质层是由无生命的角质形成细胞层叠交错构成的致密结构、丝聚蛋白、兜甲蛋白、内被蛋白等（占角质套膜中80%的蛋白）物质之间相互交联，形成的不溶性致密结构。角质之间的脂质与角质形成细胞共同形成“砖墙样”结构，“砖墙样”结构维持表皮的渗透性，防止理化因素的刺激、水分流失和皮肤表面的细菌、真菌和病毒等入侵人体。从组织结构的角度看，皮肤的屏障功能不仅依赖角质层，更依赖于表皮全层结构；从生化组成和功能的角度看，皮肤屏障不仅和脂质有关，也和各种蛋白质、水、无机盐及其他代谢产物密切相关。第一节 皮肤屏障的结构一、角质形成细胞角化包膜和脂质膜
KC角化包膜（cornified envelope，CE）厚度为15nm，包绕KC胞质，与角蛋白1、2e、10交叉连接，在钙依赖性转谷氨酰胺酶1、3、5催化下由兜甲蛋白、外皮蛋白、中间丝聚合蛋白（filaggrin，FLG）、小分子富含脯氨酸的蛋白质和毛透明蛋白等蛋白交叉连接所构成。KC脂质膜厚10nm，由来自板层小体界膜的疏水性ω-羟基神经酰胺紧密排列组成，与外皮蛋白共价结合，包绕在CE的外侧，限制细胞内水及水溶性氨基酸的丢失及细胞外水的摄入。角化包膜和脂质膜共同作为角质层细胞外板层膜结构的支架，参与屏障的机械性和通透性功能，前者正是表皮角质层屏障结构的物质基础，在此过程中参与的角蛋白中间丝相关蛋白基因表达的正确性与角蛋白细胞骨架的完整构建有密切关系。当角蛋白基因突变或其他先天性缺陷将直接影响表皮组织结构的完整性，进而影响物质经表皮的渗透速率。虽然角蛋白中间丝相关蛋白基因异常并不引起角质层形态结构的异常，但可通过染料法显示皮肤屏障功能出现紊乱。同时，中间丝相关蛋白缺乏导致尿酸浓度的减少，使得皮肤组织对UVB诱导的细胞损伤会更加敏感。兜甲蛋白在正常皮肤中表达为2%，当编码角化包膜的基因发生改变时，兜甲蛋白表达量发生改变，从而导致角化细胞终末呈典型的两极分化，导致皮肤屏障功能的异常。KC终末分化时，丝聚合蛋白原被水解成多个分子量为37 000的FLG肽，连接和聚集角蛋白中间丝成为紧密的束状，使角蛋白细胞骨架塌陷；其排列与细胞膜平行对齐，使椭圆形的颗粒层细胞塌陷成扁平的KC，形成角质层致密层。FLG散布于角蛋白丝周围参与CE的形成，在角质层中上层，被水解成组氨酸、谷氨酸、精氨酸等游离氨基酸，其相应终末产物如尿刊酸、吡咯酮羧酸、鸟氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸，组成具渗透活性的物质，为天然保湿因子的主要来源，调节角质层的水合功能，从而进一步影响皮肤的屏障功能。二、板层小体和角质层角质形成细胞间质
板层小体将内容物分泌到颗粒-角质层分界面的细胞间质。在细胞间质，葡萄糖神经酰胺和鞘磷脂分别被β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶转变为神经酰胺，磷脂被分泌性磷脂酶A转变为游离脂肪酸和2甘油。50%神经酰胺、25%胆固醇、15%游离脂肪酸等组成的非极性疏水性脂质，以适当的等摩尔比值比例组成具有成熟屏障功能的复层板层膜，充满整个角质层KC间质。角化桥粒为非通透性，富含复层板层膜且曲折的角质层KC间质，成为物质进出表皮时所必经的通透性和机械性屏障。三、细胞连接
皮肤细胞间连接形式有多种，包括紧密连接、黏着连接、桥粒和缝隙连接。最近的研究主要集中在由claudin蛋白、闭锁蛋白、tricellulin蛋白、结合黏附分子等蛋白组成的位于颗粒层的紧密连接，紧密蛋白颗粒重复形成一排排的索，连接相邻的细胞，封闭细胞间的空隙，形成大小和离子特异性的半透性屏障，可限制顶部和底外侧膜组分的扩散。颗粒层的紧密连接结构是皮肤屏障的最后一道防线，其主要包含黏着蛋白和支架蛋白，角质形成细胞之间可通过黏着蛋白如紧密连接蛋白1（claudin-1，CLDN1）紧密衔接，这些蛋白构成如阀门一样的通道，控制水分、溶质、离子等通过细胞旁途径进入颗粒层。第二节 皮肤的通道和相关因子一、TRPV4和TRPV3通道
TRPV4和TRPV3通道是瞬时感受器电位离子通道香草素受体（TRPV）亚家族成员，属非选择性阳离子通道，对钙离子通透性适中，可被生物体内外环境中机械力、热、低渗等多种理化刺激所激活，参与维持机体内环境的稳定，对机体许多生理功能的正常完成具有重要意义。皮肤TRPV4离子通道与β连环蛋白（一种具有黏着功能和细胞骨架功能的关键成分蛋白）相结合可以促进皮肤角质形成细胞间连接的形成及后期紧致屏障的构建。TRPV4缺陷时皮肤屏障功能的细胞间连接缺失，细胞间渗透性会增加。TRPV3广泛分布在包括感觉神经元和皮肤角化细胞等部位，热激活温度范围为31～39℃，反复给予热刺激可增加TRPV3通道的热敏感性，增加电流值和对热加快刺激的反应速度。二、表皮型脂加氧酶（lipoxygenase，LOX）
表皮型LOX是哺乳动物LOX多基因家族成员之一，表皮特异性LOX分别是15-LOX-2、12R-LOX和表皮型LOX3（eLOX3）。12R-LOX和eLOX3在表皮中优先表达，表达量基本平行，表皮型LOX可影响皮肤屏障的发育、形成、功能及其外观与结构等。采用RT-PCR分析发现，小鼠表皮中12R-LOX和eLOX3的mRNA局限在分化细胞区域，提示两者在KC分化过程中可能发挥重要作用。建立12R-LOX定向失活的小鼠模型，发现12R-LOX基因去除造成新生小鼠表皮不能发挥正常屏障功能。运用western印迹法显示，在编码12R-LOX基因缺陷的小鼠表皮发现中间丝相关蛋白单体完全缺失，同时伴有蛋白水解中间产物水平升高，提示丝聚合蛋白原的蛋白水解过程受损，干扰丝聚合蛋白原向中间丝相关蛋白的转化；ALOXl2B缺陷的小鼠角质包膜脆性增加，表皮脂质中神经酰胺组成成分改变。三、热休克蛋白27和IL-1α
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）又称应激蛋白，参与细胞骨架形成、细胞分化和凋亡、细胞的损伤与修复等重要的生物过程。在正常健康皮肤中主要表达HSP27，在表皮正常终末分化和维护皮肤屏障的功能中发挥作用。HSP表达上调，在表皮角质形成细胞分化后期会发生磷酸化和骨架再分配。进一步研究显示上游MAP激酶途径启动子双亮氨酸拉链样激酶（DLK）表达不足导致HSP27的磷酸化，细胞边缘定位，后者在低分化KC中被重新分配给细胞骨架。采用siRNA下调HSP27表达，DLK随之表达降低，进而影响角化包膜的形成。
白细胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）参与调节成人皮肤屏障系统的动态平衡。采用实时PCR和免疫组化对IL-1α在胎鼠皮肤中的表达进行检测，发现胎鼠表皮胎龄19～20天时，IL-1α表达为高峰期，该时间点与完整皮肤屏障功能形成时间一致。采用IL-1α处理的胎鼠体外移植皮肤，发现经皮水分流失减少，证明皮肤屏障功能成熟，并且角化蛋白表达增加。第三节 皮肤转运蛋白和皮肤细胞色素P450酶
皮肤中存在一系列的转运相关蛋白和代谢酶，参与转运和代谢多种化合物（包括内源性和外源性）的功能。常称角质形成细胞层为皮肤的物理屏障，是第一道防护门；皮肤转运蛋白和细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）则是皮肤的化学屏障，为外源性物质的第二道屏障。一、转运蛋白
皮肤中转运蛋白根据底物跨膜转运方向，分为外排性和摄取性。还有一些转运蛋白在皮肤中的表达，随人体年龄的不同而存在差异。皮肤中的转运蛋白参与药物的透皮吸收、转运及分泌等过程。当药物通过皮肤角质层后，表皮和真皮层中转运蛋白参与药物的转运及代谢，使其变成有活性或无活性的化合物，起到药物生物转化、反向转运及药物生物利用的协同作用。
皮肤能表达一系列多药耐药相关转运蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs），如MRP1、3、4、5、6，但不表达MRP2，MRPs具有外排转运谷胱甘肽-S-结合产物的功能。MRP1在皮肤中高表达，参与其非特异性荧光底物（fluo-3）的外排。MRP1的表达调节及单核苷酸多态性，很可能影响KC中外源性化合物外排和对不同化合物的敏感性，因此MRP1将是提高透皮效率的新靶点。二、水通道蛋白（aquaporins，AQPs）
水通道即指存在于哺乳动物和植物细胞膜上转运水的特异孔道，该孔道是由一系列具有同源性的内在膜蛋白家族成员所组成，称为水通道蛋白，其作用为介导不同类型细胞的跨膜水转运。AQP3是皮肤中表达最多的水通道蛋白，其在角质形成细胞中是一个完整的跨膜蛋白通道。由于AQPs的存在，细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压，而且也能转运尿素和甘油等物质进出皮肤，是维持皮肤水合作用的一个关键因素。AQP3介导的甘油运输对于皮肤功能具有十分重要的意义，它的功能缺陷可导致皮肤干燥、弹性下降和屏障作用减弱等，而过表达则增加了患皮肤癌的几率。三、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）
皮肤中也有P-gp的表达，ItoK等通过免疫组化技术检测到P-gp荧光主要出现在真皮层，但表皮层及汗腺周围未显示荧光，他们认为可能由于真皮及皮下组织中P-gp含量显著高于其表皮层中含量，导致其荧光区域显现不出。随后Claudia等也通过免疫组化技术发现皮肤中除了真皮层有P-gp表达外，其表皮层与汗腺也有少量分布，证实了Ito K的假设。一些皮肤疾病可以引起P-gp分布及含量的改变，有研究发现在寻常性银屑病和特异性皮炎患者皮肤中的浸润细胞、角化细胞和血管内皮细胞胞质中的P-gp表达显著增加。
皮肤中的P-gp在功能上具有特异性。在树突状细胞（dendritic cells，DC）从皮肤向淋巴结迁移过程中P-gp发挥了重要作用。有实验表明，mdr1a基因敲除小鼠的单核细胞迁移至淋巴结的数量显著减少，并发现P-gp的表达可促进树突状单核细胞迁移至淋巴结并呈递外源性物质，使T细胞发挥吞噬作用，从而调节免疫功能。不仅如此，最新研究发现P-gp可能促进药物在皮肤中吸收，而以往在其他组织中的研究只发现P-gp具有药物外排作用。Ito K等采用P-gp底物罗丹明123进行透皮实验，结果mdr1a小鼠皮肤的底物透过量高于正常小鼠，猜测皮肤中P-gp对底物有促吸收作用。P-gp促吸收作用的研究十分有意义，可对经皮给药等研究提供新思路。但该作用仍需要更多实验去证实，并进一步对其机制进行研究。四、皮肤细胞色素P450酶
皮肤是肝外药物代谢的主要器官之一，有多种代谢酶表达。CYP是一组含亚铁血红素的超家族基因编码的同工酶，参与多种内源性物质和外源性物质的代谢，在维持皮肤的正常生理功能和保护内环境稳定等方面发挥重要作用。
哺乳动物皮肤组织和原代培养的KC、成纤维细胞均有多种CYP表达，CYP主要在KC表达，表皮是皮肤药物代谢的主要部位，汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器也有多种CYP表达，共同参与皮肤的屏障功能，如CYP3A4与P-gp能减少有害物质在表皮细胞的聚集，构成了皮肤药物生物利用度屏障。CYP可代谢大约25万种外源性物质，包括药物、污染物、自然界中的植物产物、杀虫剂、卤代烃、多环芳烃、芳烃胺和除草剂等物质。CYP主要参与代谢外源性物质体内氧化、还原、水解的Ⅰ相反应，并可被外源性化合物诱导和抑制。第四节 屏障功能的测定一、皮肤屏障功能的测定方法
常使用皮肤水分散失测试仪测量透过皮肤水分的丢失速度（transepidermal waterloss，TEWL），以此判断表皮的屏障功能。TEWL的测试原理为：使用特殊设计的两端开放的圆柱形腔体测量探头在皮肤表面形成相对稳定的测试小环境，通过两组温度、湿度传感器测定近表皮（约1cm以内）由角质层水分散失形成的在不同两点的水蒸气压梯度，直接测出经表皮蒸发的水分量。TEWL不能直接表示角质层的水分含量，而是表明角质层水分散失的情况，TEWL值越高，表明经皮肤散失的水分越多，角质层的屏障功能越差。由于TEWL值在临床上易于测量，因此可提供角质层屏障的相关临床参数用以评估正常的皮肤功能和疾病引起的变化。
TEWL可以用菲克第一定律表示：
其中：K表示角质层和活力表皮之间的扩散系数；ΔC表示皮肤表层和角质层底部水的浓度差；D表示角质层的表观扩散率；h表示角质层的厚度。二、皮肤的紧密连接功能测定
皮肤的屏障功能主要由角质层承担，但是表皮中存在的紧密连接（tight junction，TJ）也具有屏障功能。TJ对于形成角质层屏障的角质形成细胞和细胞间脂质都起着重要的作用。通过培养正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocyte，NHEK）和人体表皮三维模型，利用小肠细胞TJ功能阻碍剂——癸酸钠，进行对TJ2+与细胞外Ca梯度分布以及板层小体极性分泌的相关性研究。用含2+0.15mmol/L Ca的角化细胞特异性培养基（HuMedia-KG2）培养NHEK，数日后更换为添加1.3mmol/L CaCl的HuMedia-KG2进行诱导2分化。用电阻电压仪测量上皮细胞跨上皮电阻（trans-epithelium electrical resistant，TER），以评价癸酸钠对TJ屏障功能的抑制作用。选用生物素诱导体作为细胞间透过示踪剂，利用免疫荧光染色法和冷冻割断扫描电子显微镜法观察TJ。将Transwell板中培养的NHEK2+以及人体表皮三维模型的基底层一侧，置于含5mmol/L Ca的培养基2+中，角质层一侧添加不含Ca的培养基。2小时后回收角质层一侧的2+培养基。采用ArsenazoⅢ比色法，测定角质层一侧的Ca透过量。2+Ca透过系数（P）按式（2-2）计算：Ca2+
C表示基底层一侧培养基的Ca初始浓度，baso1ateral_inltlal22NetFlux根据各自的培养表面积1.0cm、0.5cm（3D表皮）来计算。参考文献
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第三章 皮肤结构的检测方法
皮肤结构的变化，可能会影响药物的经皮吸收后进入全身血液循环产生的全身作用或影响药物在靶组织发挥药效，而常见的检测方法有如下几种。第一节 物理和化学法
物理和化学法是应用最为广泛的一种皮肤结构检测方法，包括化学前处理阶段和物理方法观察阶段。一、化学前处理阶段
化学前处理阶段是电镜和光镜观察的前提，对收集整理好的皮肤样本进行如下处理后观察其结构：
1.固定
用固定液进行反应。常见固定液有不同浓度的戊二醛、锇酸（四氧化锇）、多聚甲醛、鞣酸及甲醛溶液。戊二醛渗透力强，可与皮肤多肽链交联，保存组织中的蛋白物质，但不保存组织中脂类；锇酸渗透力弱，可溶解皮肤和黏膜非饱和脂类，可在一定程度上与组织中饱和脂肪酸类发生反应从而固定饱和脂肪酸类；多聚甲醛适宜固定结构致密的皮肤和黏膜组织。
2.脱水
常用试剂是乙醇和丙酮的系列浓度溶液。
3.置换和清洗
常用试剂是醋酸异戊酯溶液、磷酸缓冲液、蒸馏水及二甲砷酸钠溶液。
4.临界干燥阶段
常出现于黏膜，尤其是鼻咽黏膜结构的处理阶段，一般采用CO2临界干燥或CO临界干燥。2
5.渗透与包埋
包埋的材料种类较多，主要包括石蜡、树脂、环氧树脂及树胶等，其目的在于包埋剂逐步渗透入组织细胞，使其和细胞聚合，有利于样品的性质稳定。
6.切片
可分为机器切片和人工切片两种，切片的厚度随观察精度的不同而不同。如用光镜观察，切片厚度通常是µm级，而在电镜观察时，往往是nm级。
7.染色
适用于光学显微镜的HE（苏木素-伊红）染色、PAS-阿尔新蓝（alcian blue）双染色、亚甲基蓝-天青双染色、碱性复红染色、Schmorl染色等和适用于电子显微镜的双重染色（电子染色），常用的是醋酸钠和枸橼酸铅双染色法。为了便于观察不同样本的不同结构特征，往往选择不同染色剂和不同的染色法。例如在观察皮肤表皮下基底膜带时，用苏木素-伊红染色可见均匀一致紫红染色带；在检测真皮上部网状结构时，用硝酸银浸染时，只可见真皮上部网状结构，再用阿尔新蓝染色时，可同时见到多糖带及网状结构；在皮肤切片中的弹性纤维染色应采用Gomori醛复红染色法染色效果最佳。染色是较为复杂的一个环节，不仅由于其染色物质繁多，而且更重要的是该步骤常需要配合其他的结构观测方法，具有较为重要的意义。二、物理观察方法
主要包括显微、摄影、超声及激光等技术显示皮肤及黏膜微观、超微观结构，为观察者认知。该方法主要包括：
1.肉眼观察
仅限于对皮肤、黏膜的外观检测，如毛发脱落，局部皮肤的红肿、溃疡、坏死、结痂及流脓等。特点是直观，但检测精度不够。
2.光学显微镜观察
适用于对皮肤及黏膜微观结构的检测，通常可达到细胞水平。如在皮肤结构观察中，可观察到表皮表面的微观结构，如皮脂囊、汗腺、毛囊、基底细胞及毛乳头等。病理状态下观察皮肤表面或基底细胞坏死、淋巴系统和血管破裂、皮脂腺的肿胀和毛乳头的破坏等。
3.电子显微镜观察
其原理与光学显微镜类似，但其放大倍率和精确度远高于光镜，通常达到nm级，可观察到亚细胞水平，如可以观察到皮肤的嵴细胞的线粒体、高尔基体，基底细胞的核质及胞质，基底层的半桥粒、桥粒、张力微丝，胞浆中的线粒体。扫描和透射两种电镜在观察精确度和立体感方面存在一定差异。
4.摄影、摄像及放射技术的应用
用显微仪器观测到皮肤的微观结构、超微观结构，以照片、录像带、光盘、光片的形式记录下来，有利于这些检测结果的保存与回顾。
5.超声技术的应用
常用于检测皮肤表面创面和内部组织的损伤。还可用来检测皮肤的厚度以及皮肤内某些成分的含量。采用彩色多普勒超声诊断系统对真皮进行扫描，并进行局部放大，待图像清晰后停帧，测定真皮厚度。用高频超声波检测生理和病理状况下皮肤结构中水的含量并与磁共振法比较，结果表明超声信号可穿透皮肤达数毫米，至真皮层及部分皮下脂肪组织，并可同时对皮肤中某些成分进行定量。
6.激光技术的应用
利用激光经光导纤维传送至皮肤，部分激光被组织吸收，部分被散射。其中皮肤或黏膜上相对静止的结构（如血管壁、结缔组织）所散射的频率与原入射光相同，而运动着的部分（如血液）散射的频率则发生改变（频移），其大小与运动着的皮肤结构速度成正比。频移部分与不频移部分的激光束被另外的光导纤维接受并输入光导探测器进行混频，可以产生外差拍频信号，再经过信号处理及频率-电压转换，即可得到与频移成正比的电压信号。通过对比电压信号的观察，就可得知皮肤的静态或动态的微观结构。因激光技术安全性及可靠性远远高于传统的皮肤微观结构检测技术，故具有非常光明的发展前景。第二节 对皮肤角质层结构的物理研究方法
近年来出现了一些新的皮肤结构检测方法，尤其是角质层结构的检测方法。角质层主要含有存在于细胞内相的角蛋白（约40%）、集中于细胞外相的类脂（15%～20%）、水（40%）。有许多物理方法适用于研究皮肤角质层结构，主要包括以下几种方法：一、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）
DSC主要利用生物膜的热致相变的性质，即生物膜在进行量热扫描时会出现不同的吸收峰，通过研究这些吸收峰的变化，了解生物膜（角质层）结构。对于水合角质层，DSC图谱可显示出4个吸收峰（40℃、75℃、85℃、100℃），皮肤促渗剂处理角质层可引起DSC峰形状与位置发生变化。二、傅里叶红外光谱法（fourier transform infrared，FTIR）
FTIR是研究皮肤角质层细胞间脂质结构微观变化的有力工具，它可提供脂质分子振动方式，在分子水平阐明角质层结构变化机制。-1典型的人皮肤角质层表现为很强的氨基峰（1500～1700cm）与水-1-1-1峰（3000～3600cm），其中靠近2850cm和2920cm的峰称为对称和反对称亚甲基（—CH）伸缩振动峰，它主要来源于皮肤角质层脂2质—CH的吸收。而当皮肤角质脱脂后，对称和反对称峰的—CH伸22缩振动峰吸收强度明显减弱。三、X射线衍射分析法（X-ray diffraction analysis，XRD）
XRD利用X射线的波长与原子大小及原子间距数量级一致的特性，当X射线入射到样品晶体分子上时，组成分子的原子使散射的X射线互相干涉形成衍射图形，衍射点位置与强度取决于分子中原子排列和相互关系。四、电子自旋共振法（electron spin resonance，ESR）
ESR用来研究未成对电子结构的顺磁性物质在生物膜中运动。其中自旋标记技术是一种新型的ESR研究法，原理是将一顺磁自旋标记物嵌入生物膜，利用ESR特征谱反映标记物周围微观结构的变化。对于生物膜，多采用脂肪酸类氮氧自由基自旋标记物。五、荧光分析法（fluorescence analysis）
主要用于研究皮肤脂质双分子层中脂质相的特征。它是将一个亲脂的膜荧光探针插入脂质双分子层中，研究其光谱学特性，探针光谱参数的变化反映其周围皮肤脂质双分子微观结构的变化。第三节 其他方法一、计算机及其软件技术的应用
随着信息时代的来临，计算机技术已被广泛应用于解剖科学的研究之中。近年来又出现了Digital Morph、Digital Biograph软件对皮肤结构进行检测。该技术在人体微观结构检测分析中将占有越来越重要的地位。二、生物酶及免疫组化技术的应用
生物酶技术主要用于皮肤的染色过程，且效果优于传统的化学染色。将皮肤样本的组织块，放入对苯二甲酸（EPTA）分离液中浸泡2小时，分离皮下组织，取上皮用Tris缓冲液固定20分钟，再以ATP铅液孵育70分钟，1%硫化铵室温显色2分钟，光镜观察。观察朗格汉斯细胞，结果较普通染色清晰、明显。免疫组化是将免疫细胞化学技术、单克隆抗体技术和免疫荧光技术结合应用的技术。其中在皮肤结构观察中应用较为广泛的是免疫金银染色法，其方法主要如下：取标本用8%蔗糖-4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4℃）固定3小时，恒冷切片10µm切片，依次滴加1︰1000鼠抗人单克隆抗体，孵育48小时，1︰5金标羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，显影液中避光显影10～15分钟，脱水后观察。ATP酶染色法和免疫金银染色法有其突出优点，即往往用常规化学染色法难以观测的皮肤组织，用该法观察较为清晰，不易受外界变化影响。三、其他
除上述几种检测方法外，还有几种专属性的检测方法。这些方法常与物理化学方法联合使用，用于检测某些特殊皮肤结构。
1.盐酸化学消化法
扫描电镜可显示生物组织和细胞三维结构，在扫描电镜下观察细胞基底形态及组织深层表面形态时，可采用盐酸化学消化法。具体步骤依次为灌流固定、前固定、清洗、盐酸消化、Tween液浸泡、后固定等，再经脱水、干燥、喷镀后，于电镜下观察。
2.冷冻复型法
冰冻复型蚀刻技术可以将生物膜的两层分离，是唯一一种可以观察细胞间连接装置的方法。应用这一技术，对人全身大部分黏膜及皮肤结构进行观察，具体方法是取1.0cm×5.0cm皮肤样本，投入预冷的2.5%戊二醛缓冲液中（4℃）固定3小时，然后用0.067mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤数次，再放入磷酸盐缓冲液的30%甘油生理盐水浸渍8小时，按冷冻复型常规操作，将处理的皮肤样品成形装入样品杯内（以便有不同层次的割断面），在液氮中冷冻至-200～-196℃，然后用喷气镀机将样品进行割断、喷铂、喷碳，剥制复型膜，将膜捞在铜网上，再用透射电镜观察、摄片。
有关皮肤结构检测的方法多种多样，有其基本的处理与观测方法，但不同方法又有其优点和不足之处。随着当代科学技术，尤其是数学、化学、物理、生物技术和计算机科学及其他相关科学的迅猛发展，人类已有的皮肤及黏膜结构的观测技术将日臻完美，并有希望出现一些新的结构检测技术。参考文献
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Ca作为人体细胞重要的第二信使，能通过多种钙信号转导途2+径调节皮肤细胞的生理活动，钙调素是细胞中多功能的Ca结合蛋2+白，在细胞的信号转导过程中发挥着非常重要的功能。Ca与钙依赖性钙调素形成的复合物在皮肤的修复和一些皮肤疾病的钙信号转导中发挥重要的作用。第一节 钙离子对表皮功能的调节2+
在正常的表皮内存在Ca浓度梯度，自基底细胞层到颗粒层2+2+Ca浓度由低到高，而角质层中Ca浓度极少。表皮屏障功能是表2+皮Ca浓度呈梯度分布的重要调节因素，当表皮屏障功能破坏后，2+2+由于水分丢失，细胞外Ca，尤其是颗粒层Ca浓度迅速下降，从而使细胞膜上蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活化和二酰甘油2+2+2+水平升高，导致细胞内Ca外流；随着细胞内Ca的减少，Ca浓度梯度因此消失，引起一系列表皮屏障修复的反应。在表皮基底层，2+细胞内低钙浓度促进KC增殖；而在颗粒层最上层，细胞外Ca浓度2+增高明显，大量Ca进入细胞内，激发KC终末分化，促进板层小体分泌；在颗粒层转变为角质层之前，随着细胞膜结构被KC包壳代替，2+2+细胞内Ca又被释放到细胞间，维持颗粒层细胞外高Ca浓度。正2+2+常KC细胞内外Ca浓度可以相互影响，细胞外高Ca浓度能活化2+2+Ca通道受体，使胞内钙库（如内质网和高尔基体）释放Ca。随2+着细胞内钙库耗竭，细胞内Ca开始缓慢升高，通过活化胞质膜上2+2+的钙通道促进Ca内流；同时钙结合蛋白、胞质膜上的钙泵和Ca-+Na泵，以及内质网和高尔基体等细胞内钙库共同作用，维持细胞内2+Ca浓度稳定。2+
Ca在表皮功能中发挥重要的作用，它能维持表皮细胞间连接2+和促进KC增殖、分化和修复皮肤。当细胞外Ca浓度升高，在2+2+2+Ca受体介导下，细胞内Ca和Ca储存发生一系列的变化，肌动蛋白迅速重组，形成的丝状伪足与相邻细胞的丝状伪足形成拉链样结2+构，从而形成细胞间黏着连接，而且细胞外高Ca浓度可以诱导钙2+黏蛋白聚集在细胞间黏着连接部位；随着细胞内Ca浓度同时升高，促进细胞分化，增强桥粒组分表达，桥粒组分与角蛋白中间丝网2+络粘连形成桥粒。Ca在创伤皮肤愈合的不同时期发挥重要作用，如合成和释放凝血因子促进血小板聚集，促进KC有丝分裂和分化和2+影响KC的迁移促进表皮再生等，可见Ca对于表皮细胞的功能和稳态有多种调节作用，具有重要的生理意义。
细胞内外的受体、配体、温度变化、渗透压和电压依赖性变化等2+因素均能调节细胞内外Ca浓度，而且其所引起的钙信号转导途径也有多种多样，从而调节多种器官组织的功能。其作用主要通过以下2+几种途径进行：①通过钙结合蛋白：细胞内游离Ca浓度升高后可2+与钙结合蛋白结合，再刺激靶酶，触发生理生化反应；②Ca通过2+直接调节某些酶的活性调节细胞反应；③Ca参与其他离子通道的调节。第二节 钙调素对表皮功能的调节
钙调素（calmodulin，CaM）是一种在细胞中广泛分布和极其重要的钙结合蛋白。在人的烧伤液中CaM水平显著增高，并能促进KC和成纤维细胞增殖，因此，CaM可能在表皮功能中发挥重要的作用。CaM是由19种氨基酸共148个氨基酸组成的耐热、耐酸的小分子量（16.7kDa）可溶性球蛋白。CaM分两类：一种是钙不依赖性钙调2+素，一种是钙依赖性钙调素。它主要活化形式是Ca/CaM复合物，具有调节各种重要酶的活性、血小板功能和细胞增殖分化和运动等作用。目前已阐明了CaM的空间结构，都具有1～4个呈EF手形的2+Ca结合结构。CaM的三维空间结构观察到其含有4个相似的内在氨2+基酸序列的基本结构单位，各能结合多个Ca，从N-端到C-端顺序称为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区域，每个结构单位的原子空间排列相同。Ⅰ、2+2+Ⅱ区域为Ca低亲和力区，Ⅲ、Ⅳ区域为Ca高亲和力区。当细胞2+2+受到刺激，引起胞内Ca浓度升高时，Ca结合到CaM的结合位点上，导致CaM构象发生改变，暴露出疏水部位，后者被认为是CaM与靶蛋白相互作用的部位，同时可使靶蛋白发生变构，CaM便由无活性的松散的螺旋型结构形成更为紧密和更稳定的螺旋结构，从而变成激活型。
CaM本身不具有酶的活性，但能与靶蛋白相互作用并调节靶蛋白2+的活性。CaM与Ca结合，不但能以直接方式影响细胞活动，还可2+以通过影响Ca浓度和细胞内其他重要调节物间接地影响细胞活2+动。Ca/CaM复合物能激活多种酶和释放多种细胞因子，在皮肤修2+2+复中发挥重要作用。Ca/钙调素依赖的丝氨酸苏氨酸激酶（Ca/calmodulin-associated Ser/Thr kinase，CASK）表达在新生啮齿类动物皮肤基部KC的细胞核和发育的毛发滤泡，调节表皮KC增殖与粘连；CASK下调能促进创伤表皮的KC迁移和增殖。在体液中发现了CaM的存在，当把CaM加入到培养细胞的介质中去时，能促进细胞分裂，并显示出与体液中的表皮生长因子（EGF）有定量的关系；CaM随EGF浓度的变化而变化；而EGF具有加速皮肤和黏膜创伤愈合、消炎镇痛、2+防止溃疡的功效。Ca/CaM复合物与网蛋白结合和整联蛋白磷酸化，阻碍网蛋白与整联蛋白相互作用，导致半桥粒分解，促进KC分化和伤口愈合。特异性皮肤CaM相关因子（skin calmodulin-related factor，Scarf）表达在表皮分化层细胞中；用急性表皮破坏方法改变表皮2+Ca梯度，可使Scarf、钙磷脂结合蛋白、钙网蛋白和内质网蛋白-722+表达上调，14-3-3蛋白和核仁素表达下调，从而恢复表皮Ca浓度梯度和皮肤屏障。在KC中发现了与钙调素基因有同源性的钙调素样蛋2+白（calmodulin like protein，CLP），能结合Ca使myosin-10上调，促使角质形成细胞迁移与增殖，从而治愈表皮损伤。由上述的研究结果可知，钙依赖性CaM的信号途径是皮肤功能中的重要途径，它并非单一途径转导，而是一种复合型途径，并且与其他途径共同作用，通过多靶点、多途径对创伤皮肤进行修复。第三节 钙离子与钙调素在皮肤疾病中的作用2+
Ca和CaM除了在创伤皮肤，还在一些皮肤疾病中发挥重要作用，如白癜风、银屑病、系统性红斑狼疮、特异性皮炎、毛囊角化病2+和特异性皮炎等。Ichinose等发现系统性红斑狼疮细胞高度表达Ca/CaM依赖的蛋白激酶Ⅳ（calcium/calmodulin-dependent protein kinasetypeⅣ，CAMK4），激活T细胞受体-CD3复合物，引起T细胞活化；抑制CAMK4，可以抑制细胞因子IFN-γ和TNF-α产生，减少B细胞的共刺激分子CD86和CD80，减轻狼疮模型小鼠的症状。芹黄素和木2+2+犀素能抑制因紫外线诱导Ca内流和Ca/CaM依赖的蛋白激酶磷酸2+化，从而抑制基质金属蛋白酶的产生，有效治疗皮肤光老化。Ca/CaM复合物调节的钙神经素信号能影响人体免疫系统，促进KC增殖，并诱发肿瘤产生，因此，改变钙-钙神经素信号可能成为治疗角质形成细胞癌的重要途径。几种瞬时受体电位离子通道（canonical transient receptor potential channel，TRPC）例如TRPC1、TRPC4或者TRPC6是调节KC中高钙离子浓度诱导细胞分化的靶蛋白，银屑病2+2+KC外的高Ca浓度因为TRPC通道活性降低而引起Ca内流。TRPC2+通道激活剂能抑制Ca内流，将可能成为治疗局部银屑病的新药。2+由此可见，Ca与CaM在皮肤疾病所涉及的方面有很多，其中包括了神经系统、免疫系统和血液系统，而且与多种酶、细胞因子、靶蛋2+白和离子通道等有着密切的关系。因此，在皮肤中，Ca/CaM复合物结合靶蛋白所引起的一系列的转导反应将成为重要的研究对象，并且对于不同病因和病理条件的疾病所涉及的钙信号转导途径将成为治疗皮肤疾病的研究新靶点。2+
目前，对Ca和CaM在皮肤功能中的调节机制已有进一步的了2+解，但仍有许多方面值得去探讨，如Ca和CaM结合靶蛋白的分子结构基础和作用机制还不十分清楚；钙依赖性CaM的钙信号并非仅由单一通道转导的，该钙信号转导途径错综复杂，而且涉及其他途径共同完成细胞功能。明确皮肤中钙依赖性CaM的钙信号途径及其作用机制具有重大的研究价值，可以为钙信号调节剂在皮肤临床研究中提供理论依据。
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