作者：黄亚东,时小艳
出版社：中国轻工业出版社
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高等职业教育“十二五”规划教材·微生物实验技术试读：
前言
随着现代生物技术的迅猛发展，生物技术已成为当今科技发展的主要推动力，生物产业对解决人类面临的健康、粮食、能源、环境等主要问题具有重大的战略意义。国家《促进生物产业加快发展的若干政策》把生物技术作为当前科技发展的重点，把生物技术产业作为新兴产业培育的重点，把生物经济作为引领新经济发展的重点。《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006—2020）》已将生物技术作为科技发展的五个战略重点之一。随着生物技术产业结构调整及产品升级速度的加快，微生物已被广泛应用于食品、发酵、环境、化工、医药等领域，同时现代化实验手段在微生物实验中也得到了广泛应用。因此，掌握微生物实验技术不仅对人类开发利用有益微生物资源，而且对推动生物技术的发展具有十分重大的意义。微生物技术应用领域范围广、产品种类多、技术更新快，关键技术岗位从业人员的知识、技能要求高，共性强，迫切需要大批从事微生物培养、生产操作、分析检验、生产管理、质量控制、产品开发等工作的高端技能型人才，许多高职高专院校应运开设了生物技术类专业。《微生物实验技术》是高职高专院校生物技术类专业开设的一门重要的专业基础（平台）课程，具有很强的职业性和实践性。通过本课程的理论学习与技能训练，可使学生了解微生物实验的基本概念及基本原理，掌握典型设备的结构、工作原理、性能特点、操作要点、选用及保养方法，并能灵活运用所学知识和技能分析、解决微生物应用领域一般性技术问题，同时培养学生的工程意识、职业意识和责任意识。
本书内容主要包括显微镜的使用技术，微生物形态结构的观察，细菌染色技术，培养基的制备及灭菌技术，微生物接种及厌氧培养技术，微生物生长规律，微生物生理生化反应，菌种保藏等。在教学过程中可根据培养目标及实验、实训条件有针对性地进行教学。本书既可作为高职高专院校生物技术类专业教材，也可供生物技术应用领域工程技术人员参考。
在编写过程中，注意由浅入深、注重应用、突出实践、循序渐进地安排单项技能实验、综合性实验及设计性实验，并将《微生物培菌工》职业标准融入教学内容。为了便于教学，按“重点掌握”、“一般掌握”和“了解”三个层次对每个实验项目提出教学要求，并安排一定数量的习题，以强化学生对实验原理、操作要点、注意事项的理解和掌握。通过理论与实践、知识与技能、校内学习与企业锻炼交互进行，促进学生的素质与能力不断提升。
本教材项目一、项目二、项目八、项目十由江苏食品职业技术学院黄亚东、时小艳和解放军第八二医院赵亚萍，中国科学院动物研究所马雪山合作编写；项目三、项目四、项目五、项目六、项目十一由江苏食品职业技术学院黄亚东，淮安市产品质量研究所陈长毅，金陵科技学院潘丽红合作编写；项目七、项目九、项目十由江苏食品职业技术学院时小艳，江苏省农科院于建宁，中国科学院动物研究所马雪山，江苏今世缘酒业股份有限公司王家玉合作编写；项目十二、项目十三由江苏食品职业技术学院黄亚东、时小艳和淮安市产品质量研究所陈长毅合作编写。全书由江苏今世缘酒业股份有限公司高级工程师吴建峰统稿。
本教材引用和借鉴了一些已发表的文献资料，在此向相关作者和提供过帮助的同志们表示感谢。
由于我们水平有限，书中不妥之处在所难免，敬请广大读者批评指正。编者2012年5月项目一微生物实验室建设与管理
教学目标【重点掌握】 微生物实验的进行程序及相关要求；微生物实验规则及注意事项。【一般掌握】 微生物废弃物的处理及意外事故的处置。【了解】 微生物实验室的基本建设设施。
微生物实验主要是对个体微小，肉眼看不见的微生物进行操作和培养等。实验操作人员接触的微生物或未经妥善处理的微生物对人体存在潜在的危害。因此，实验中要尽量确保在无菌及整洁环境下操作。微生物实验室合理布置建设，了解并严格遵守微生物实验守则和实验室的各项规章制度，对于确保实验人员人身安全及顺利进行实验显得尤为重要。任务一 微生物实验守则
在微生物实验室内做实验时，人身安全是十分重要的。部分微生物实验是使用具有潜在致病性或致病性的微生物作为实验目标菌或操作用菌，为了保证实验者和实验室的安全，学生进入实验室之前必须认真阅读并熟知以下实验守则。
一、实验程序和要求（1）预习 学生在课前应认真预习实验指导书或教材有关内容，必须对所做实验的目的、要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。（2）讲解 教师对所做实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。（3）独立操作与观察 除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验过程中，要按实验要求认真操作，仔细观察实验现象，及时完整地记录原始实验数据、结果。（4）示教 每次实验都应备有示教内容，帮助学生了解某些实验中的难点，在有限时间内获得更多知识。（5）作业 实验报告内容主要包括实验目的和原理、实验步骤、实验结果和分析与讨论等。撰写实验报告必须强调科学性，应实事求是地记录、分析、综合，并在实验结束后及时呈交。学生应认真阅读教师批改后的实验报告，了解自己在实验过程中存在的问题，进一步提高分析、综合能力。（6）小结 实验结束后，由师生共同总结所做实验的主要收获及应注意的问题。
二、实验规则和注意事项（1）每次上课前必须充分预习实验指导书，明确所做实验的目的与要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊，避免出现差错。（2）上实验课时，必须穿上干净的白色工作服，扣好衣扣。非必需的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方。（3）每次上课应携带实验指导书、实验报告纸及绘图文具等，按学号入座。（4）实验前，要认真检查所用药品是否齐备，仪器使用记录是否正常，如有缺损应及时向指导教师报告，不得擅自随意调换标本、仪器等。未经指导教师允许，不能动用实验室其他非本次实验所用的仪器设备和药品。用湿布擦净台面，必要时可用0.1%的新洁尔灭溶液擦拭。实验前要洗手，以减少染菌的概率。（5）遵守实验课堂纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗。（6）遵守实验操作规程，严格按照指导教师的安排和实验指导书的要求进行。使用显微镜检查非永久装片时，要特别小心。防止染料或试剂沾污镜头和镜台，不要用高级显微镜观察非永久装片。操作要规范，观察要认真仔细，及时完成实验报告。（7）酒精灯使用结束后应立即将其熄灭，不要让其一直燃烧。（8）微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，应严格做到以下几点：
①操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。
②接种时不要走动和讲话：以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。
③含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。
④含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。（9）凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果，按时交实验报告。（10）实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖或手指等物，以免感染。（11）若实验过程中出现任何意外或事故，应及时向实验指导教师或实验室技术人员报告。（12）实验过程中应爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告，应做好详细记录，并向实验指导老师或实验室技术人员说明情况。（13）凡是自配的试剂和溶液，必须贴上标签，注明名称、成分、浓度、配制日期及配制人。（14）实验结束后，使用过的显微镜要如实填写使用情况，按原样放置清理。桌面清理时，用过的物品放回原处。离开实验室之前要用肥皂洗手。（15）值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
三、废弃物的处理（1）为了防止泄漏和扩散，所有包含微生物及病毒的培养基必须放在生物医疗废物盒内，经过去污染、灭菌后才能丢弃。（2）所有污染的非可燃的废物（玻璃或者锐利器具）在丢弃前必须放在生物医疗废物盒内。（3）所有的液体废物在排入下水道前必须经过消毒处理。（4）碎玻璃在放入生物医疗废物盒之前，必须放在纸板容器或其他的防止穿透的容器内。（5）针头等锐利器具要放在抗穿透的容器内丢弃，针头不能折弯、摘下或者打碎，锐利器具的容器应放在生物医疗废物盒中。（6）每次实验结束后必须将实验室内所有垃圾清理干净。
四、意外事故的处置及控制（1）处理意外事故的方案 操作及保存二类、三类、四类危害的实验室，应制定详细的处理意外事故的方案。紧急情况下，与所有的人员保证信息畅通。实验室管理层、上一级安全管理层、安全护卫部门、医院及救护电话都应张贴在所有的电话附近。应配备医疗箱、担架及灭火器。（2）生物安全柜内的溢出事件 若在生物安全柜内发生溢出事件，为了防止微生物外溢，应立即启动去污染程序：
①用有效的消毒剂擦洗墙壁、工作台面及设备。
②用消毒剂充满工作台面、排水盘，并停留20min。
③用海绵将多余的消毒剂擦去。（3）打碎玻璃器皿 如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒。（4）菌液污染手部皮肤 先用70%酒精棉球拭净，再用肥皂水洗净。如污染了致病菌，应将手浸于2%～3%来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经10～20min后洗净。（5）菌液吸入口中 应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌的致病程度做进一步处理：
①非致病菌：用0.1%高锰酸钾溶液漱口。
②一般致病菌（葡萄球菌、肺炎链球菌等）：用3%HO、0.1%22高锰酸钾溶液或0.02%米他芬溶液漱口。
③致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用②法处理后，再注射1000 U白喉抗毒素做紧急预防；若吸入伤寒沙门菌、痢疾志贺菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经②法处理后，可注射抗生素预防发病。（6）衣服或易燃品着火 应先断绝火源或电源，搬走易燃物品（乙醚、汽油等），再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。（7）皮肤烫伤 可用5%鞣酸、2%苦味酸或2%龙胆紫液涂抹伤口。（8）化学药品灼伤
①强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5%NaHCO或5%NaOH中和。3
②NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5%硼酸或5%乙酸中和。
③石炭酸：用95%酒精洗涤。
④如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质分别处理，例如，遇碱灼伤可用5%硼酸冲洗，遇酸灼伤可用5%NaHCO冲洗，在此基础上再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以3润湿即可。任务二 微生物实验室的基本建设设施
微生物实验室的设计要求应当尽量满足微生物生长、发育的需要，能保证实施菌种分离和扩大培养的无菌操作规程，使接种的菌种能有一个洁净、恒温和空气清新的培养环境，以提高微生物的成活率和纯培养质量。所以，微生物实验室应选择在水电齐全、环境洁净、空气清新的地方，尽量避免与畜禽圈舍、饲料仓库及排放“三废”的工厂相邻。尤其夏季，更应注意实验室周围的环境卫生。房间要求既能密封，又能通风、保温，并且光线充足。实验室的墙壁、天花板应光滑、耐腐蚀，防水、防霉，易于清洗，地面用水泥抹平，各个房间要求水电配套，利于控温控湿。
一、微生物实验室的布局
在条件允许的情况下，实验室应按照配制培养基→蒸汽灭菌 →分离或接种→培养→检验→保存或处理的顺序进行平面布局，相应安排洗涤室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、检查室及冷藏保存或处理室，使其形成一条操作流水线。
二、洗涤室及其设备
洗涤室是洗刷培养微生物用的试管、培养皿、三角烧瓶等用品用具的场所。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，室内为水泥或瓷砖地面，墙角及拐弯处应设计为弧形，四壁由地面起1.5m高为瓷砖墙面，以便于清洗。室内应具有下列设施。
1.水池
陶瓷或不锈钢水池均可。池底有放水塞，池内有水龙头。
2.干燥架
干燥架设于水池的两侧或一侧，板上钉有大小不同的斜木钉，以倒挂清洗过的玻璃仪器，或木台上开有口径不同的半圆孔洞，用来悬挂有肩的玻璃瓶。木盘上钻有大小不同的圆孔用来插置吸管，以便控干水分。
3.工作台
台上放电炉、铝锅及其他。
4.干燥箱
室内放1只干燥箱，以供干燥器皿、试管及吸管等。
5.辅助用具
洗刷器皿用的盆、桶等，各种毛刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。
三、培养基配制室及其设备
培养基配制室是供调配各种培养基、培养料的场所。室内要求清洁、宽敞、无杂物。其主要设备有以下几类。
1.衡量器具
一般应有粗天平、量杯、量筒等，用于称取或量取药品及拌料用水。
2.药品柜、壁橱、工作台等
用来放置培养基的原料、药品、天平、漏斗、煮锅、烧杯、电炉、铁架台、试管架、试管夹、试管、棉花、纸、刀、剪等。
3.拌料用具
拌料时必备的用具有小铁铲、铝锅、塑料桶、玻璃棒等。必要时还应配置一些机械设备，如切片机、粉碎机、榨汁机等。
4.装料用具
三角烧瓶、培养皿、试管等。
四、灭菌室及其设备
灭菌室是对配制好的培养基、培养料及器具设备进行灭菌的场所，灭菌室内应有通风设备。常用的灭菌设备有高压蒸汽灭菌锅、干燥灭菌器等。
1.高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅用途广泛，效率最高。它是一个密闭系统并具有夹层，能承受一定的压力，在锅底或夹层中盛水，锅内的水经过加热后煮沸产生蒸汽，由于蒸汽不能向外扩散，迫使锅内的压力升高，从而使水的沸点也随之升高，因此可获得高于100℃的蒸汽温度，从而达到快速彻底灭菌的目的。
2.干燥灭菌器
干燥灭菌器又称干热灭菌箱或干燥器。培养皿、试管、吸管等玻璃器皿，棉塞、滤纸以及不能与蒸汽充分接触的液体（石蜡）等，都可用干燥器灭菌。
五、接种室及其设备
接种室又称无菌室。一般有里外两间，里间是接种间，外间为缓冲间。接种设备是指分离和扩大培养菌种的专用设备，如超净工作台、接种箱及各种接种工具。
1.接种室
接种室的构造及设备如图1-1和图1-2所示。图1-1 无菌室构造→表示门窗的推拉方向图1-2 接种室的平面布置1—移门 2—紫外线灭菌灯 3—日光灯4—工作台 5—椅子 6—菌种架（1）接种间 接种间的面积不宜过大，一般为2m×2.5m，高度不超过2.5m。室内地面、墙面均应光滑整洁，房顶铺设天花板，以减少空气流动，门要设在离工作台最远的地方，最好用拉门。为提高无菌室的密闭性能，室内应全部采用双层结构的玻璃窗。通气窗应开在接种间门上方的天花板上，窗口用数层纱布和棉花遮好，有条件的可安装空气过滤器。
接种间的中部设有工作台，台面要平整光滑，台上置有酒精灯、接种工具、75%酒精、火柴、玻璃棒、脱脂棉、胶布等。工作台的上方，应安装紫外线灭菌灯及照明的日光灯各1支，灯的高度以距地面2m为宜。
接种间容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在接种间使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。（2）缓冲间 在接种间外要有一个缓冲间，供工作人员换衣帽、鞋等准备工作之用，缓冲间的门要与接种间的门错开，并避免同时开门，以防止外界空气直接进入接种间。一般缓冲间内设有衣帽柜。房间中央离地面2m高处，应装灭菌灯和照明用日光灯各1支。（3）在分隔接种间与缓冲间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作为接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出接种间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。
2.接种箱
接种箱是供菌种分离、移接的专用设备。接种箱要求封闭严密，操作方便，使之能成为无菌环境，以便进行无菌操作。常用的接种箱有单人操作式和双人操作式两种，如图1-3 所示。一般采用长143cm、宽86cm、高159cm 的双人操作箱。箱的上层两侧框架中安装玻璃，能灵活开闭，便于接种时观察和操作。箱腰部两侧各留有2个直径15cm的洞口，洞口上装有40cm的布袖套，双手从此袖套内伸入箱内操作，布套的松紧带口能紧套在手腕处，可以防止外界空气中的杂菌进入。箱两侧最好也装上玻璃，箱顶部为木板或玻璃。箱内安装紫外线灭菌灯及日光灯各1支。箱体安装木板或玻璃均可，但要注意密封。图1-3 接种箱（单位：mm）
由于接种箱的构造简单，制作容易，移动方便，灭菌效果好，气温高时人在外面操作不会感到闷热，故接种量不大时多采用它。
放置接种箱的房间距离灭菌室要近些，房间要宽敞明亮，经常保持清洁，最好不要和其他操作间混用。
3.超净工作台
超净工作台是没有建设无菌室的微生物实验室的必备设备，也可用于有更严格无菌要求或其他小环境条件要求的微生物接种、分离和鉴定等操作。超净工作台能在局部形成高洁净度的工作环境。其工作原理是室内新风经预过滤器送入风机，由风机加压进入净压箱，再经过高效过滤器除尘，洁净后通过均匀层，以层流状态均匀垂直向下进入操作区，或以水平层流状态通过操作区，同时上部狭缝中喷送出高速空气流，形成操作区不受外界干扰的空气，从而可在操作时获得洁净的空气环境。由于洁净气流是匀速平行地向一个方向流动，空气没有涡流，故任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌都很难向别处扩散转移，而只能就地排除掉。因此，洁净气流可以造就无菌环境。
与无菌室和接种箱比较，使用超净工作台具有工作条件好、操作方便、无菌效果可靠、无消毒药剂对人体危害、占用面积小且可移动等优点。如果放在无菌室内使用，无菌效果更好。其缺点是价格昂贵，预过滤器和高效过滤器还需要定期清洗和更换过滤介质。
六、培养室及其设备
1.培养室（1）培养室的设置
①培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间2容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在14m左右，外室面积在26m左右，高以2.5m左右为宜，应有天花板。
②分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。
③为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。
④内外室都应在室中央安装紫外灯，以供灭菌用。（2）培养室内设备及用具
①内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。
②外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。
小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。
2.恒温培养箱
恒温培养箱可分为两大类，即直热式恒温培养箱和隔水式恒温培养箱。（1）直热式恒温培养箱 为直接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热空气”技术，结构为：保温板材箱内装继电器控温电加热器。这种培养箱造价低，制造工艺简单，但恒温效果较差，温度波动大。（2）隔水式恒温培养箱 为间接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热水控制空气温度”技术，结构为：薄钢板外壳内衬玻璃棉，内置紫铜板水箱，水箱内装继电器控温电加热器，设双层门。这种培养箱制造工艺复杂，造价高，但由于先用电加热水层，再由水传热至箱内空气，因而温度上升和下降缓慢，加之可通过双层门的玻璃内门观察，对箱内温度影响小，故恒温效果好，调温为（20～60）℃±0.5℃，很适于微生物培养之用。（3）摇瓶 在制作液体菌种和进行微生物溶液培养时，必须使用摇瓶机，也称为摇床。摇瓶机有往复式和旋转式两种，前者振荡频率为80～120 次/min，振幅为8～12cm；后者振荡频率为220次/min。往复式摇瓶机因结构简单、运行可靠、维修方便而普遍使用。摇瓶机可放在设有温度控制仪的温室内对菌种进行振荡培养。（4）空气调节器 利用空气调节器调节培养温度，从而为微生物的生长提供一个较理想的人工气候环境。
七、检查室及其设备
1.检查室的设备2
检查室一般为30～60m的房间，可根据实验人数或实验规模确定，内有实验台和水槽，若干个电源插座。要将电冰箱、显微镜、恒温培养箱等设备放在适当的位置上，还要设置放仪器、器皿的架子。
2.常用的仪器（1）天平 用于称量化学药品。常用的托盘天平，称量1000g，感量1.0g；扭力天平，称量100g，感量0.1g；分析天平，称量100g，感量0.1～1.0mg。（2）显微镜 用于观察微生物的必备仪器。（3）玻璃器皿及器具 常用的玻璃器皿有烧瓶、烧杯、培养皿、试管、离心管、称量瓶、酒精灯、漏斗、量筒、容量瓶、滴管、吸瓶等；器具有剪子、镊子、接种环、接种针等。（4）干湿温度计 用于测定室内空气温度和空气相对湿度。（5）恒温水浴锅 也称水温箱，用于溶化培养基和各种保温操作。该设备是金属制成的长方形箱，箱内盛水，箱底装有电热丝，并有自动调节温度装置以控制温度恒定。
八、菌种贮藏及其设备
1.菌种库
菌种库是贮藏和存放菌种的场所，其大小可根据菌种量而定。要求清洁、干燥。
2.电冰箱和冷藏箱
用于储存培养基和培养物的设备，储存病毒必须使用低温冰箱，储存一般培养基和培养物用普通冰箱即可，是微生物实验室必备设备。
按结构形式可分为单门、双门和多门，立式前开门和卧式上开门；按使用功能可分为冷藏式（0℃以上）、冷藏冷冻式（冷藏室0～10℃，冷冻室-18～-6℃）。低温冰箱整个箱壁内侧围绕冷却管，可保持-70～-20℃的低温。习题
1.名词解释（1）高压蒸汽灭菌锅（2）干燥灭菌器（3）接种室（4）超净工作台
2.填空题（1）每次上课应携带______、实验报告纸及绘图工具等，按______入座。（2）每次微生物实验操作前，要求操作者认真检查所做实验的药品是否齐全、______记录是否正常，如有缺损应及时向指导教师报告，不得擅自调换______、______等。（3）在进行微生物接种时，要严格按照无菌操作技术要求进行操作，接种时不得______和______，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。（4）凡是自制的试剂和溶液，必须贴上标签，注明______、______、______、______和______。（5）实验报告内容主要包括实验目的、______、______、______和分析与讨论。（6）实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔______、______或______等物，以免微生物污染。（7）洗涤室是洗刷培养微生物用的试管、培养皿、三角烧瓶等用品用具的场所。因此室内要求具备______、______、______、______和辅助用具等设施。
3.判断题（1）微生物实验室里所有液体废物在排入下水道前必须经过消毒处理。（ ）（2）菌液一旦污染手部皮肤，可先用70%酒精棉球拭净，再用肥皂水洗净即可。（ ）（3）将一般致病菌吸入口中后，应立即吐出，并用大量的自来水漱口多次，再用0.1%的高锰酸钾溶液漱口。（ ）（4）如果眼睛被碱性化学药品灼伤，应立即用大量清水冲洗，然后用5%硼酸冲洗，再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。（ ）（5）干热灭菌器用于灭菌干燥的玻璃器皿，因此所有液体都应采用高压蒸汽灭菌锅灭菌。（ ）
4.选择题（1）接种间内不可能有（ ）。
A.75%酒精
B.接种环
C.记号笔
D.置物架（2）在下列的设施中，培养基制备室内除了（ ）都应具有。
A.衡量工具
B.灭菌锅
C.搅拌工具
D.药品柜
5.简答题（1）微生物实验中严格要求无菌操作，应从哪几方面避免杂菌污染？（2）生物安全柜内发生微生物外溢事件时，应启动去污染程序是什么？（3）衣服或易燃品着火时应该怎样处理？（4）为了方便教学，并符合微生物操作规程，请合理设计一个微生物实验室平面布局图。项目二显微技术
教学目标【重点掌握】 普通光学显微镜的操作技术及维护。【一般掌握】 暗视野显微镜和相差显微镜的操作技术；制作电子显微镜标本的基本技能。【了解】 显微镜的类型；普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜的工作原理。
由于微生物个体微小，我们必须借助显微镜才能了解其个体形态特征和内部结构特征。熟悉显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
现代显微镜一般可以分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类显微镜又可根据不同的方法分成若干类型，如图2-1所示。图2-1 显微镜的分类
通过普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜四种显微镜的使用，使学生对显微镜的构造及使用有较全面的了解。任务一 普通光学显微镜的使用
一、目的（1）熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。（2）掌握油镜的工作原理及使用方法。
二、显微镜的基本构造
普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成，其结构如图2-2所示。机械部分包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒和调节器等；光学部分包括目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜等。图2-2 普通光学显微镜的构造1—物镜转换器 2—物镜 3—游标卡尺4—载物台 5—聚光器 6—虹彩光圈7—光源 8—镜座 9—电源开关10—光源滑动变阻器 11—粗调螺旋12—细调螺旋 13—镜臂 14—镜筒15—目镜 16—标本移动螺旋
1.机械装置（1）镜座和镜臂 镜座位于显微镜的底部，呈马蹄形，可支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂用于支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。（2）镜筒 由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。两筒之间距离可调，以适应两眼宽度不同者调节使用。（3）物镜转换器 装在镜筒的下方，为两个金属碟所合成的一个转盘，其上有3个孔（有的有4个或5个孔），用于安装不同规格的物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。（4）载物台 又称镜台，为方形或圆形的平台，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上，有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，可向前后左右推动。有的推动器上还带有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。（5）调焦装置 调节物镜和标本间距离的机件，有粗调螺旋和细调螺旋，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则可得到清晰的图像。
2.光学系统（1）物镜 安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体（标本）的镜头，故又称接物镜。其作用是将物体第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，低倍物镜有4×、10×、20×；高倍物镜有40×和45×；油镜有90×、95×和100×等。数字越大，放大倍数越高。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：N.A 0.30；10×；160/0.17；16mm。其中“N.A 0.30”表示数值孔径（numerical aperture，简写为N.A），“10×”表示放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。（2）目镜 装于镜筒上端，是接近观察者的眼睛的镜头，亦称接目镜。由两块透镜组成。目镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有5×、10×、16×等规格，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500～700倍，最大也不能超过1000倍选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。为了便于指示物像，有的目镜镜头中装有一条黑色细丝为指针。（3）聚光器 光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间滴加香柏油。虹彩光圈由薄金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。（4）光源 较新式的显微镜其光源通常安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。（5）滤光片 可见光是由各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。当只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。
三、普通光学显微镜成像原理
普通光学显微镜的成像原理如图2-3所示。由光源发射的光线经聚光镜汇聚在被检标本上，使标本得到足够的照明，由标本（AB）反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45°角的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处成一个放大的倒立的实像AB，该实像再经目镜的接目透镜放大成一个正立虚像AB于无穷1122远或明视距离，以供人眼观察。所以人们看到的是虚像。图2-3 普通光学显微镜成像原理（1）显微镜的放大率 显微镜放大物体成像，首先经过物像第一次放大成像，目镜在明视距离造成第二次放大像。放大率就是最后的像和原物体的两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V）和目镜放大率（V）的乘积。即V=V×V。物体1212通过物镜的放大倍数V=T/F，T为光学镜筒长（为物镜后焦点与目11镜前焦点之间的距离），F为物镜焦距。目镜的放大倍数 V=250mm/12F，250mm为明视距离，F为目镜焦距。22（2）焦点深度 在显微镜下观察被检物体时，焦点与某一物体点一致时，物像最清晰。此外，还能看清楚与焦点一致的物体点上面和下面的物像，这种清晰部分的厚度称为焦点深度（简称焦深）。也就是说，焦点深度是指看清楚焦点上面和焦点下面的物像之间的距离。如果焦点深，就能看到被检物体的全层，便于观察。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比，即数值孔径和放大率越大焦深越小。因此使用高倍物镜时，须灵活地运用调焦装置，上下移动细调焦螺旋，才能从上到下观察到被检物体的全层。因此，调节高倍物镜要比低倍物镜更加仔细，否则易使物像滑过而找不到物像。（3）焦距 指平行光线经过单一透镜后集中于一点，由这一点到透镜中心的距离。一般，物镜的放大倍数越大，焦距越短。（4）工作距离 是指观察标本最清楚时的物镜下面透镜的表面与盖片上表面之间的最短距离。物镜的放大倍数越大，工作距离越短。
研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10倍）、高倍物镜（4mm，40～45倍）和油镜（1.8mm，95～100倍）三种。油镜是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000～2000 多倍。从图2-4 中可看出油镜的焦距和工作距离最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。（5）干燥系物镜 玻片与物镜之间的介质为空气，放大倍数60 倍以下的物镜。（6）油浸系物镜 放大100 倍的物镜。载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层与玻璃折光率（1.52）相近的折射率n=1.55的香柏油。图2-4 物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系
使用油浸系物镜时光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，进而增加照明度。相对的使用干燥系物镜时，光线通过载玻片后，发生折射散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就降低了视野的照明度（图2-5）。（7）数值孔径 是物镜与标本介质折射率（n）和光的最大入射角 α 正弦之积，也称为镜口率，简称N.A，可用下式表示：N.A=n·sin（α/2）
式中 N.A——数值孔径
n——介质折射率
α——镜口角，光线进入物镜的最大夹角
由公式可知，镜口角越大，显微镜的效能就越大，如图2-6所示。该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0.87。图2-5 两种物镜的光线通路
图2-6 物镜的入射角以空气为介质时：N.A=1×0.87=0.87以水为介质时：N.A=1.33×0.87=1.15以香柏油为介质时：N.A=1.52×0.87=1.32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
式中λ——光波波长
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如数值孔径为0.65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0.42μm。而在0.42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的最小距离为：
因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（N.A=0.65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（N.A=1.25）和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0.22μm间的距离。
四、材料（1）观察标本片 金黄色葡萄球菌染色玻片标本、枯草芽孢杆菌染色玻片标本。（2）试剂 香柏油、二甲苯。（3）器具 显微镜、显微镜灯。
五、方法
1.观察前的准备工作（1）观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。（2）显微镜在使用之前应检查一下显微镜使用情况记录手册，查看上次使用情况是否正常。不正常需及时向老师反映，更换显微镜。
2.显微镜的放置
从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。显微镜应放置在左肩前方，镜与桌沿相距6～7cm处，这样便于右手绘图。
3.调光
插上电源，打开显微镜开关，调节光照度到合适大小。
4.调节聚光镜和虹彩光圈（1）转动物镜转换器，将低倍镜旋转到镜筒下方。（2）瞳距调节，双眼对着目镜根据瞳距调节镜筒间距离，如图2-7所示。图2-7 瞳距调节（3）将镜头调节至距镜台1～2cm处，取下目镜，向镜筒内观察，如图2-8 所示。调节聚光镜上的虹彩光圈，使其孔径与视野恰好一样大或略小于视野，目的是使入射光展开的角度与物镜的数值孔径相一致，既可充分发挥该物镜的分辨力，又能把超过该物镜可能接受的多余光挡住，否则会产生干扰，影响清晰度。图2-8 虹彩光圈的调节（4）放回目镜，通过调节聚光镜的高度或调节照明度控制钮，选择最佳的照明效果。
5.放置标本
下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台，将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。
6.低倍镜观察
将低倍镜旋转到镜筒下方，旋转粗调螺旋使镜头和载物台距离约为0.5cm。再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜缓缓远离玻片，标本在视野中显现后，再使用微调节器调节至图像清晰。为检查观察到的图像是否为标本，可调动标本移动螺旋，若图像随着调动向相反方向移动，即是标本。
7.高倍镜观察
在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后，侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后，用微调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦状态，这种现象称为物镜的同焦。
8.油镜观察
使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要观察的区域后，移开镜头，在待观察的区域滴加1滴香柏油，将油镜转至油中，把虹彩光圈开到最大，使之与油镜的数值孔径相匹配，或调节聚光镜的高低使光线符合要求，再用细调螺旋调节物像清晰为止。
对于不等焦的显微镜，用粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜逐渐远离玻片，在标本观察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方，须在侧面注视下，调节粗调螺旋上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中，并几乎与标本相接。把虹彩光圈开到最大，或调节聚光镜的高低使光线符合要求。然后眼睛注视目镜，缓慢地调节粗调螺旋，使载物台下降（或使镜筒上升）即可看到物像，再转动细调螺旋使物像清晰。
9.显微镜用毕后的处理（1）用粗调螺旋使载物台降至最低点，取下载玻片。（2）取一张擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后在另一张干净的擦镜纸上滴少许二甲苯溶液，擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的溶液。切忌用手或其他纸擦拭镜头，用擦镜纸顺着镜头直径擦，不要沿着圆周方向擦，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。（3）将光强调至最低，关闭电源。（4）再将物镜镜头从通光孔移出，把镜头转成“八”字形。（5）检查物镜是否沾水或沾油，如沾水或油要用擦镜纸清洁。（6）检查完毕后，罩上防尘罩，登记显微镜使用情况记录表。
六、注意事项（1）不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。（2）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别是在使用油镜时，切不可使用粗调螺旋，以免压碎玻片或损伤镜面。（3）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。将显微镜放置桌上时，务必要轻轻放下。（4）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
七、结果
分别绘出在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。任务二 暗视野光学显微镜的使用
一、目的（1）了解暗视野光学显微镜的基本原理及用途。（2）掌握使用暗视野光学显微镜观察微生物样品的操作技术。
二、原理
生活细菌在明视野光学显微镜下观察是透明的，不易看清。暗视野光学显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时，可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的，即给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品上反射或折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样品能够看得更清楚。因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体，故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。
暗视野光学显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器，在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光可进入物镜，如图2-9 所示，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野光学显微镜时，只需将明视野光学显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野光学显微镜聚光器下面的滤光镜支架上放一片星形遮光板（图2-10）构成暗视野，这种方法适用于低倍镜观察。图2-9 暗视野光学显微镜光路图
在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，所以暗视野也被用来区分死、活细胞，此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。图2-10 星形遮光板
三、材料（1）菌种 酿酒酵母。（2）仪器及其他 暗视野光学显微镜、载玻片、盖玻片、无菌水。
四、方法（1）选厚薄在1.0～1.2mm的干净载玻片一块，滴上酿酒酵母悬液，加盖玻片。注意切勿有气泡存在。（2）将聚光镜光圈调至1.4。（3）光源的光圈孔调至最大。（4）在聚光器上放一大滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触（不能有气泡发生）。（5）用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点，如图2-11所示，光点越小越好，由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。（6）换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。图2-11 暗视野聚光器的中心调节（7）在盖玻片上滴1滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。
五、注意事项（1）进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，不能得到暗视野照明。（2）在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节和焦距调节，使焦点与被检物体一致。（3）由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（N.A=1.2～1.4），焦点较浅，因此，过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处，一般载玻片厚度为1.0mm左右，盖玻片厚度宜在0.16mm以下，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的物像。
六、结果
描述在暗视野显微镜中枯草芽孢杆菌的运动情况。任务三 相差显微镜的使用
一、目的（1）了解相差显微镜的基本原理和用途。（2）学习掌握相差显微镜的操作技术。
二、原理
光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部分微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化（相应发生的差异即相差），而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。相差显微镜与普通光学显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜（通常标有PH的标记）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的物像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合轴调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必须调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。
1.相差
相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，我们的眼睛很难分辨出这种差别的，只有变相差为振幅差（明暗之差），才能被分辨。当光波通过两种折射率不同的物质时，如由空气-水，或空气-玻璃，其波长、振幅和相位均有不同变化（图2-12）。如光波通过1cm厚的水和1cm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相位上产生一定的差异。通过玻璃的光波相位落后，因为玻璃的密度和折射率比水大，所以光波的波长和频率都小于水。相差决定于光波通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（光程之差）。介质越厚或折射率越大光波减速也越大，即相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。图2-12 光波通过不同介质时产生的相差
2.衍射与干涉（1）衍射 波在同一介质里传播是沿直线方向传播，如果在它传播的方向上，遇到迎面挡住的孔或障碍物不比它的波长大很多，这次波就会明显地绕到障碍物后面或孔的外面去（传播路线发生弯曲），这种现象称为波的衍射。衍射光和直射光比较有1/4的相差，振幅亦弱，如图2-13所示。（2）干涉 在同一种媒质里传播的两列波，如果频率与波长相同，在两列波相交的区域里，由于叠加的结果，每一点的合振幅都是一定的，并且出现振动加强或减弱，这就是波的干涉现象。光通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这两种光相遇或叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，这就是光的干涉现象。如果物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时，由于光程（折射率与厚度的乘积）比较大，所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为被检粒子的衍射光相位比折射光相位大约迟1/4波长的缘故。若是在直射光的通过点和大部分的衍射光的通过面放置吸收光的物质或推迟相位的物质时，就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅，如图2-14所示。图2-13 直射光及衍射光的产生与波动图2-14 直射光和衍射光的不同叠加结果
如果把直射光相位推迟1/4波长，使与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光的振幅之和（P=S+D），振幅加大，亮度提高，如图2-15所示。图2-15 光的干涉及明相差形成A—实线，直射光，相位推迟1/4波长B—虚线，衍射光，相位与A一致C—粗线，合成波；振幅比A大，形成的像比背景亮
相反地，把衍射光相位推迟1/4 波长，两者的相差变为1/2 波长，合成波的振幅等于两波的振幅差（P=S-D），这时亮度减弱变暗，如图2-16所示。图2-16 光的干涉及暗相差形成A—实线，直射光 B—虚线，衍射光，相位推迟1/4波长，相位与A相差1/2波长C—粗线，合成波；振幅比A小，形成的像比背景暗
光线的相位肉眼是看不见的，但利用衍射和干涉的现象把相差变为振幅差（明暗反差）就能用肉眼识别。衍射光的相位比直射光推迟1/4波长，合成波由与两者干涉而生成，形成被检物体的像，振幅与直射光相同，相位稍延迟，如图2-17所示。
3.相板的作用
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板。在圆形相的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分为两部分。（1）共轭面 通常为环状，是直射光通过部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（2）补偿面 共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分，如图2-18 所示。图2-17 光的干涉及相差形成A—直射光（细实线） B—衍射光（虚线）B 比A 推迟1/4 波长 C—合成线（粗实线）形成被检物体的像，振幅与A相同图2-18 相板的结构
在相板的共轭面和补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，当光线通过时，使光波的相位或振幅发生改变，因此可利用相板推迟光波相位，或者改变振幅。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，使亮度改变。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。
不同种类的相板对光吸收率不同（图2-19），产生不同的反差效果，从反差上可分成两大类。图2-19 相板的种类及构造黑色—吸收光线层 浅色—推迟相位层 白色—玻璃
第一类，明反差或负反差：在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，被相板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光的物质）推迟1/4波长，同时吸收80%～90%，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟1/4波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的相位，合成波P等于直射光（S）与衍射光（D）之和（P=S+D），故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P，所以只有直射光照射的背景亮得多。
第二类，暗反差或正反差：在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面（涂有改变直射光相位的物质）的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直射光的相位相差1/2波长，同时，直射光在共轭面（涂有吸光物质）被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波振幅变小，被检物的影像比背景变暗。
4.光路与成像
相差显微镜的照明光束，由转盘聚焦器环状光阑的环状孔射入聚光镜，投射载物台上的被检样品，经样品后，入射光除投射的直射光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，相位滞后直射光和衍射光进入物镜，前者由环状的共轭面，后者由较大的补偿面透过相板，并相互干涉造像。样品的影像由直射光和衍射光经干涉后的合成波造成，背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类型而定。成像原理如图2-20所示。图2-20 相差显微镜的成像图解C—目镜 D—环状光阑 M—聚光器 N—载物台 O—透镜：金属层涂有吸光物质，目的在于减小通过光的强度，电解质层为一层半透明的圆环 P—相板（一）相差显微镜的特殊装置
1.相差物镜
在相差物镜内的后焦面上装有不同的相板，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差。物镜在明暗反差上可区分为两大类：即明反差（B）或负反差（N）物镜和暗反差（D）或正反差（P）物
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