作者：王晓、杨滨 主编
出版社：化学工业出版社
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中药化学成分程序化分离制备试读：
前言
中药及药用植物的化学成分十分复杂，含有多种生物活性成分，这些成分也是其治疗疾病的物质基础，故提取分离其有效部位或有效单体成分是中药学研究的一项重要内容。目前认为中药的有效成分主要包括蒽醌、生物碱、黄酮、香豆素、木脂素、萜类、皂苷等类化合物。获得目标化合物单体是进一步确定其化学结构、研究其药理活性的首要条件，也是对其进行结构改造、化学合成和研究化合物构效关系的前提，这些成分也往往是控制产品质量的关键指标。因此开展中药有效成分的分离纯化对推动中药新药研究及中药现代化等方面都具有重要意义。
近年来，我国中药化学、植物化学工作者每年都从很多中药或药用植物中分离制备了大量化合物，但绝大多数没有进行深入药理活性的研究。大多数报道的分离过程很烦琐、描述模糊，所采用的技术多数是常规柱色谱、重结晶等技术，而且分离周期长，制备效率低，很难重现。这些直接限制了中药现代化研究的进程。因此，开发高效、规范、可重现的分离制备程序，需求非常迫切。近年来，在中药有效成分分离方面出现了许多新技术、新方法，而一些新的分离技术具有简单、快速、高效、损失率低、被测组分与基体有效分离、准确度高等优势，并取得了显著的效益。在新的分离纯化技术中，高速逆流色谱和高效制备液相色谱因其重现性好、分离速度快、分离效率高，而成为广泛使用的“程序化”分离技术。高速逆流色谱技术可消除固态的固定相对目标活性成分的不可逆吸附、失活、变性等不良反应，而高效制备液相色谱技术可使目标活性成分的分离达到很高的分离效率和分辨率，直观性和目标性较强。两种分离技术相结合，可互补不足，实现活性成分快速、高效的分离。因此，建立规范的提取、富集、分离纯化程序，是解决化合物重现性制备的关键，也是深入研究化合物活性，进行深度开发的前提。
本书是根据笔者多年从事科研工作的实践，收集了大量2000年以后的有关利用高速逆流色谱和高效制备液相色谱分离制备中药药效成分的国内外文献资料，并结合笔者多年来从事中药化学研究的成果及应用实践编写而成。首先是通过建立标准的高效液相色谱分析方法，对中药材料进行分析，获取所含化合物的基本信息。然后进行规范的提取和富集，最后通过高速逆流色谱或高效制备液相应用标准的溶剂系统及运行参数进行纯化，获得的成分再用上述分析总样所建立的高效液相色谱法去分析纯度，对比确定所制备的化合物。通过这样的思路，笔者对优选的195种中药的化学成分的分离制备进行了描述，特别是引用了大量本实验室的研究成果，简明扼要，有较好的重现性，力图达到“程序化”分离制备的目的。
本书编写内容突出了技术的科学性与实用性，可供从事中药研发与生产的技术人员、相关专业的高校教师和高年级本科生、研究生以及从事植物化学、食品、天然产物资源研究的技术人员进行参考。由于编者水平有限和时间仓促，疏漏和不妥之处在所难免，恳请广大读者批评指正，以利于今后改进提高。最后感谢化学工业出版社的大力支持，感谢各位编者为本书做出的贡献！编者2018年6月第1章 绪论1.1 中药与中药化学成分
中药有着悠久的药用历史，是中华民族传统文化的瑰宝，它是我国各民族在防治疾病的实践中发现并运用，并不断予以增补的天然药及基本不改变其理化属性的简单加工品，是“传统中药”“草药”和“民族药”的总和。“传统中药”通常是指载于中药典籍，以传统中医理论阐释药理并指导临床使用，加工炮制规范，至今仍广泛应用的天然药及其简单加工品。“草药”是传统中药的初级形式，传统中药是草药的提高阶段。“民族药”是我国除汉民族外各兄弟民族使用的天然药物，可分为类传统中药型、类草药型和中间型。
中药是一个有层次和结构的有机整体，单一的有效成分并不能充分阐述中药的药效物质机理，其药效来自多种化学成分多靶点的相互协同和增效作用，而中药的药效物质基础研究的难点在于其化学成分[1]的复杂性。迄今为止，许多中药，特别是一些常用中药的化学成分或有效成分已经得到深入的研究，其防病治病的物质基础有的已经被基本阐明。如麻黄中α-松油醇具有发汗散寒的功效，麻黄碱和去甲麻黄碱具有平喘的功效，且后者还具有升压、利尿的作用。但是多数中药的药效成分仍然未被阐明。如中药青蒿的研究，我国科学家屠呦呦等人从黄花蒿中分离出的有效成分青蒿素具有较好的抗氯喹原虫的作用，广泛用于疟疾的治疗。但青蒿素却不具备中药青蒿所具有的退虚热、凉血、解暑的功效。由此可见，中药的药效是多种成分互相作用的结果。因此，只有深入研究中药的化学成分，才能真正明确中药治疗疾病的机理，保障用药的安全性、有效性和稳定性，推动中药事业的发展，加速中药走向世界的步伐。1.2 中药化学成分的复杂性与药效物质基础
中药按其所含主要成分分类，可分为植物药、动物药和矿物药，其中以植物药为主，并且种类繁多。我国从1953年开始编撰药典以来已经有9版，1953年版《中国药典》收载药品531种，其中植物药与油脂类65种，动物药13种；2015年版《中国药典》一部收载药材和饮片、植物油脂和提取物、成分制剂和单味制剂等，品种共计2598种，且一部正文所收载的618味中药材中，植物来源占88.03%，[2]动物来源占7.28%，矿物来源占4.69%。随着科学技术的进步，还将会发现更多的中草药。每种中药的化学成分都十分复杂，就拿植物药来说，一味中药可能会含有上百种的化学成分，而这些成分又分为不同的类型，从物质基本类型，可分为有机物和无机物；按元素组成、结构母核，可分为蒽醌、生物碱、黄酮、苯丙素、香豆素、皂苷、萜类等；按酸碱性，可分为酸性、碱性、中性；按溶解性，可分为非极性（亲脂性）、中极性、极性（亲水性）。中药化学成分的复杂性，往往是一味中药具有多方面功效或药理作用的物质基础。
近年来，中药的研究思路越来越注重药效物质基础的研究，将中药的化学成分与其功效或药理作用进行相关性研究，对于阐明中药的药效成分及作用机制是不可或缺的。利用现代科学技术的方法和手段，加强对中药药效成分的研究，对明确中药的药效物质基础、治病机理，实现中药的安全、有效、稳定和可控具有重要意义。1.3 “程序化”分离中药化学成分的必要性
分离制备中药的化学成分，是进行结构鉴定和药理药效学研究的基础工作，但是中药化学成分的复杂性大大增加了中药化学的研究难度。传统的分离技术更多依赖于常规柱色谱、重结晶等。常规柱色谱就是利用硅胶或氧化铝等常用的吸附材料作为固定相，这种方法操作简单，但分离时间长，需要大量溶剂，成本较高，产率较低，且会造成大量化学成分的不可逆吸附、失活、变性等，对于成分比较复杂或结构相近的成分来说，常常得不到理想的分离效果，而且分离过程往往难以重现。重结晶是利用固体混合物中目标组分在某种溶剂中的溶解度随温度变化有明显差异，实现分离提纯，该法由于其局限性，也不能广泛应用在中药成分的分离过程中。针对中药化学成分的研究，迫切需要一种重现性好、分离速度快、分离效率高的“程序化”分离技术，来提高中药化学成分的收率和质量。
近年来，中药化学的研究越来越注重以活性为指标，追踪有效成分的分离；在研究方法和手段上，更加重视引进和结合现代科学技术，来加快研究速度和提高研究的水平。特别需要将中药化学成分分离制备过程标准化和程序化，使之具备“可重现性”，这样可以大大降低中药化学工作者分离制备的时间，提高分离纯化的工作效率。目前运用较多的是高速逆流色谱和高效制备液相色谱，其中高速逆流色谱技术是一种不用固态支撑体的液-液分配色谱，可消除固态的固定相对目标活性成分的不可逆吸附、失活、变性等不良反应；同时，高速逆流色谱不需要复杂的样品前处理步骤，制备量大，可以直接进样分离得到高纯度的化合物；由于其两相溶剂体系组成的范围广，可用来分离大多数的化合物；由于其溶剂体系组成简单，不用固定相，分离制备重现性高，成为“程序化”分离技术的首选技术。高效制备液相色谱技术可使目标活性成分的分离达到很高的分离效率和分辨率，但是样品前处理要求高，该技术特别对已经制备的组分进行进一步的精细化分离具有优势。高速逆流色谱和高效制备液相色谱在分离机制和应用技术方面具有互补性，可实现中药化学成分快速、高效的分离制备。1.4 高速逆流色谱
高速逆流色谱法（HSCCC）是20世纪80年代初，由美国国立健康研究院（NIH）的Ito博士首创的一种不用任何固态载体的新型液-液[3]分配技术，可以在短时间内实现高效分离和制备，尤其因极高的分离效率及程序化分离模式而被日益广泛地应用于天然产物的分离提纯，高速逆流色谱正在成为天然产物分离提纯领域中的程序化制备技术。1.4.1 高速逆流色谱概述
高速逆流色谱法是利用螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合，产生一种独特的动力学现象，使两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配与传递。当仪器工作时，互不相溶的两相溶剂在螺旋管内具有单向性流体动力平衡性质，如果一相溶剂作为固定相，则另一相作为流动相载着样品穿过固定相，两相溶剂在螺旋管中实现高速的接触、混合和传递，由于物质各组分在两相间分配系数的不同，导致在管内的移动速度不同，从而实现样品分离。图1-1所示的是实[4]现高速逆流色谱的螺旋管行星式离心分离仪的设计原理。图1-2所示的是螺旋管中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。HSCCC技术因其连续高效，回收率高，制备量大等特点，可直接分离制备中药粗提取，化合物的分离仅依赖于其不同的溶解性能，不存在因不可逆吸附造成样品损失和因表面化学等因素引起被分析物变性等缺点，在各分离提纯领域中的应用越来越多，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域，已成为一种备受关注的新型分离纯化技术。图1-1 实现高速逆流色谱的螺旋管行星式离心分离仪的设计原理图1-2 两溶剂相在运动螺旋管内的流体动力学特征1.4.2 高速逆流色谱的原理
溶剂系统的选择和优化是逆流色谱分离工作的难点，也是样品能否成功分离的关键。一般来说，选择用于高速逆流色谱仪的溶剂系统时，应注意以下几点：不造成样品的分解或变性；足够高的样品溶解度；样品在溶剂系统中合适的分配系数值，一般在0.5～2.5之间；固[5]定相能实现足够高的保留；溶剂易挥发以方便后续处理。
HSCCC的溶剂系统的选择通过文献寻找同类化合物的分离实例，大致圈定溶剂系统的组成。表1-1根据被分离物质的极性，列出一些基本的可供参考的溶剂系统。通常应用HPLC来测定溶质的分配系数。具体方法为：将样品溶于一定体积的某一相中（例如上相U），然后利用HPLC测定上相溶液，得到色谱峰面积A；随后，加入一U1定体积的另一相（例如下相L），充分振荡达到两相的分配平衡后，取该溶液的上相进行HPLC测定，得到色谱峰面积A，如图1-3所U2示。根据公式计算出分配系数：图1-3 分配系数K的HPLC测定方法表1-1 高速逆流色谱常用的基本溶剂系统1.4.3 高速逆流色谱的工作步骤
① 溶剂系统的准备 通常要在使用前将确定的溶剂系统配制好，并使两相溶剂平衡充分，避免在运行过程中产生气泡。配置好的溶剂系统最好在使用前将两相分开，将分开的溶剂系统的上、下相放置于密闭的容器储存。
② 柱系统的准备与运行 运行前进行仪器的检查，然后开机。在仪器不旋转的状态下，以较高流速将固定相泵入螺旋管柱内。然后按照设定的仪器转向（正转或反转），调节转速，使之达到设定的速度，开启溶剂泵的开关，以一定的流速泵入流动相。当溶剂体系建立了流体动力学平衡时，即可进行下一步的进样操作。
③ 样品溶液的制备和进样 待分离样品通常是用上、下相的混合溶液来溶解。当样品量比较少时，可用上下相任何一相来溶解；当样品量比较多时，通常要用适量等体积的上、下相混合溶液来溶解。待溶剂系统建立了流体动力学平衡后，即可通过进样阀进样。这种方法类似于普通硅胶柱的湿法上样。还有一种类似于普通硅胶柱的干法进样的方法，是在固定相注满分离柱后，紧接着上样，然后再使之转动，同时启动溶剂泵，这样就使得样品随流动相一同进入分离柱。流动相溶剂前沿出现时的体积等于柱中固定相被推出的体积。这种进样方法常被用于pH区带精制逆流色谱中。
④ HSCCC分离 进样后，进入HSCCC分离的过程，在HSCCC操作中除了正常的洗脱方式外，进行HSCCC分离时，还能采用步级式洗脱和梯度洗脱。因此，为了获得成功的分离，需要对溶剂系统进行特别的选择：造成梯度的物质如酸、中性盐等，应几乎完全分配到流动相中；同时，不能让管柱里的两溶剂相的体积比发生明显的变化。
不论采用何种洗脱方法，在这种分离实验中，采用首到尾端的洗脱方式总能给出较好的分离结果。对于某些溶剂系统来说，尾到首端的洗脱方式会导致一定的固定相流失，从而使峰形分辨度降低。尽管这种流失不严重和对分离结果影响不大，但是，流失的固定相水滴会被吸附在检测器的流通池壁上，形成对于溶质吸收峰的“噪音”干扰。
⑤ 清洗分离柱 当HSCCC一次分离完成时，停止流动相的泵入，可以利用氮气瓶或者空气压缩机将分离柱中的液体吹出，并收集这些排出液来测定固定相的保留率[R＝（V－V）/V]。吹出的固定总下测总相，往往含有对固定相有极强亲和力的成分，也就是分配系数高的成分，不能轻易扔掉。吹出柱内溶剂的分离柱要用乙醇清洗一次，以避免残留物对下次分离工作的干扰和影响。1.5 高效制备液相色谱
色谱分离技术最早出现于20世纪初，后来得到迅速发展，使得色谱分离在理论上从线性色谱发展到非线性色谱，在实践中从分析规模发展到制备规模和生产规模。近十几年来，高效制备色谱已成为当代高效分离与纯化技术的研究前沿，具有适用范围广、操作简单、产品纯度高等优点，在天然产物化学、有机合成、生化、生物工程、医[6]药、环境分析等领域得到了广泛的应用。1.5.1 高效制备液相色谱的原理
高效制备液相色谱的原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使它们以不同程度分布在两个不相溶的相中，且各组分可在两相的相对运动过程中，在两相中发生多次分布，从而达到分离的目的。
高效制备液相色谱并非为高效液相色谱的简单放大，其操作参数主要是通过线性放大的原理优化从分析到制备过程的操作参数。通常假设分析色谱系统和制备色谱系统的化学性质、传质过程都保持不变，分析型液相色谱的进样量、流量、收集体积等乘以线性放大系数便可得制备型液相色谱的相应参数。线性放大系数即为制备色谱柱和分析色谱柱的截面积之比与柱长之比的乘积。例如，制备液相的进样量计算公式为：
式中，Q、r、L分别为分析型液相色谱的进样量、色谱柱半径111和柱长；Q、r、L分别为制备型液相色谱的进样量、色谱柱半径和222柱长。
利用线性放大方法优化分析型色谱的操作参数，直接将其应用到直径更大的制备型色谱柱中，不仅可大大节约溶剂消耗，缩短整个方法开发过程的时间，且可减少样品损失，实现最有效、最快速的分离效果。
制备色谱的核心部件是色谱柱。现代高效制备液相色谱柱的特征
[7]如下：①柱长短、内径大、呈圆饼状。目前高效制备柱的柱长与常规分析柱相仿，一般为20～50cm，内径为10～1000mm，因此可以在较大的流速下不致产生很高的柱压降，从而获得高的产率。②填料颗粒小，分布窄。采用直径为10～20μm的细颗粒，孔径及粒度分布均很窄的多孔球形或非球形填料，通常每米的塔板数在20000以上，有的甚至可达到与分析柱相仿的柱效。③流速高。流动相的流速一般在5～10mL/min，以便提高产率，降低生产成本。
高效制备液相色谱按样品的进样量，可将其分为半制备或小规模制备型（≤100mg）、制备型（0.1～100g）及大规模制备型（≥100g）三种类型；而按固定相的类型，则可分为正相、反相、凝胶、离子交换、亲和色谱等不同类型。其中正相和反相色谱柱在天然产物的分离纯化中最为常用，其分离方法的比较见表1-2。表1-2 正相与反相色谱柱分离方法的比较1.5.2 高效制备液相色谱溶剂系统的选择
高效制备液相色谱分离中，除了固定相对样品的分离起主要作用外，流动相的恰当选择对改善分离效果也具有重要的影响。作为流动相的溶剂应当成本低，容易购得，使用安全，纯度高，除此之外，还应满足下述要求。
① 用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性。
② 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，并且具有低的黏度；不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。
③ 溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折射率检测器，要求选择与组分折射率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
④ 所用溶剂应具有高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～100nm。
在正相色谱中，常用流动相多是在饱和烷烃（如正己烷等）中加入一种极性较大的溶剂为极性调节剂，如异丙醚、氯仿、二氯甲烷等。通过调节极性调节剂的浓度来调节溶剂的强度，来实现所需要的分离选择性；在反相色谱中，由于固定相是非极性的，流动相的极性大于固定相，流动相的极性增加，洗脱能力降低，通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。二元流动相一般是以洗脱力最弱的水作底剂，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的二元流动相组成包括甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水。若二元流动相不能满足需要，可配置多元流动相，如在二元流动相中加入少量四氢呋喃，可改善某些难分离物质对的分离度；[8]若色谱峰拖尾，可加入有机碱、有机酸等减尾剂，改善峰形。1.5.3 高效制备液相色谱的工作步骤
① 样品前处理 将需要制备的样品尽可能使用流动相溶解为适合的浓度，然后用一次性滤头进行过滤，将不溶物除去，置于适合的容器中备用。
② 开机 依次打开柱温箱、高压泵、检测器、计算机电源开关、操作系统。
③ 平衡进样前的系统准备 为了平衡色谱柱并清除管路中的杂质和残留的水分，纯甲醇或乙腈冲洗流路20～30min，然后用制备样品所需要的流动相冲洗流路20min左右。
④ 制备方法的设定 a.设置程序文件，包括流动相通道、流速、检测波长、分析时间、最高压力、最低压力；b.设定分析方法的方法文件，包括文件名称、浓度单位等。
⑤ 进样及目标峰的收集 将样品进行制备并根据样品的出峰位置对目标峰进行收集。
⑥ 制备工作完成后的必要维护 冲洗流路和色谱柱：若流动相为有机相和水的混合溶剂，直接用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现后可停泵关机。若流动相中含有缓冲盐、有机酸等，则先用5%甲醇冲洗流路约60min，其次用50%甲醇溶液冲洗流路约30min，再用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现后可停泵关机。
⑦ 关机 关闭检测器的氘灯，关闭检测器、高压泵、色谱工作站、柱温箱等，最后关闭计算机电源。参 考 文 献[1] 匡海学编著.中药化学.北京：中国中医药出版社，2003.[2] 国家药典委员会编著.中华人民共和国药典2015版.北京：中国医药科技出版社， 2015.[3] Oka H, Harada K, Ito Yuko, Ito Y. J. Chromatogr. A, 1998, 812: 35.[4] 张天佑， 王晓编著. 高速逆流色谱技术. 北京：化学工业出版社， 2011.[5] 曹学丽编著. 高速逆流色谱分离技术及应用. 北京：化学工业出版社， 2005.[6] 李瑞萍， 黄骏雄. 化学进展， 2004, 16: 273-283.[7] Berthod A, Deroux J M, Bully M. Liquid Polarity and Stationary-phase retention in countercurrent chromatography. In: Modern Countercurrent Chromatography. Conway W D, Petroski R J, ed. Washington D C: American Chemical Society, 1995.[8] 孙毓庆， 胡育筑编著. 液相色谱溶剂系统的选择与优化. 北京：化学工业出版社， 2007.第2章 蒽醌类化合物2.1 巴戟天
巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效。巴戟天的主要活性成分有蒽醌类和糖类成分等。其中蒽醌类主要活性成分包括芦荟大黄素（aloe-emodin）、芦荟大黄素苷（aloin）等。【主要化学成分与结构】[1]【主要化学成分提取、分离】图2-1 巴戟天粗提物的制备HSCCC分离图HSCCC条件：柱体积230mL；溶剂系统，环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶4∶4∶4），上相作为固定相，下相作为流动相；流速1.5mL/min，进样量300mg，固定相保留率56%。1—茜素-1-甲醚和1，2-二甲氧基-3-羟基蒽醌（90.6mg，＞96.0%）；2—1-羟基-3-羟甲基蒽醌和芦丁-1-甲醚（52.5mg，＞96.0%）；3—蒽醌-2-甲醚（19.8mg，＞96.0%）图2-2图2-2 巴戟天粗提物HSCCC分离部位1和2的制备HPLC分析图HPLC条件：XTerra C（150mm×19mm i.d.，5μm）；紫外检测波长280nm。18流速5.0mL/min；进样量4mL；流动相，甲醇-1%乙酸水＝60∶40；4—茜素-1-甲醚（54.9mg，99.4%）；5—1，2-二甲氧基-3-羟基蒽醌（10.2mg，96.8%）；6—1-羟基-3-羟甲基-蒽醌（16.4mg，97.6%）；7—芦丁-1-甲醚（18.2mg，97.4%）图2-3 巴戟天粗提物的HPLC分析图HPLC条件：Shim-pack C（4.6mm×150mm，5μm），紫外检测波长280nm，18流速1.0mL/min；流动相：A（1%乙酸），B（甲醇），0～20min，55%～75%B2.2 大黄
大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄 Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄的主要活性成分有蒽醌类、二蒽酮类、茋类、鞣质和多糖等。药理研究表明，大黄蒽醌类成分具有泻下、调节胃肠功能、抗病原微生物等药理作用，其中主要活性成分包括大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等。【主要化学成分与结构】[2，3]【主要化学成分提取、分离】（1）分离方法一[2]图2-4 大黄粗提物的制备HSCCC分离图HSCCC条件：柱体积260mL；溶剂系统，1%NaHPO∶1%NaOH＝（100∶0）～（0∶24100），上相作为固定相，下相作为流动相，流速2mL/min，进样量120mg，固定相保留率40%。Ⅰ—大黄酸；Ⅱ—桂皮酸；Ⅲ—大黄素；Ⅳ—芦荟大黄素；Ⅴ—大黄酚；Ⅵ—大黄素甲醚[2]图2-5 大黄粗提物的HPLC分析图
HPLC条件：SPHERIGEL ODS C（4.6mm×250mm，5μm），紫外检测波长254nm，18柱温25℃，流速1.0mL/min，进样量10μL；流动相：A（0.1% HPO），34B（甲醇），0～3min，57%B；3～20min，57%～90%B；20～40min，90%B（2）分离方法二[3]图2-6 大黄粗提物的pH区带逆流色谱图pH区带逆流色谱条件：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶7∶4∶6，体积比）；上相加10mmol/L三氟乙酸，下相加15mmol/L NaOH，转速850r/min，流速2.0mL/min，进样量1.3g，检测波长254nm。1—桂皮酸（140mg，96.1%）；2—芦荟大黄素；3—大黄酸（130mg，92.5%）；4—大黄素[3]图2-7 pH区带逆流色谱尾吹部分的常规HSCCC色谱图HSCCC条件：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（7∶3∶7∶4，体积比）；转速850r/min；流速2.0mL/min；进样量260mg；紫外检测波长254nm；固定相保留率65.5%。1—桂皮酸；2—芦荟大黄素（60mg，94.6%）；4—大黄素（98mg，96.5%）2.3 丹参
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参的主要活性成分有水溶性的丹酚酸类化合物及脂溶性的丹参酮类化合物。现代药理研究表明，丹参脂溶性成分具有抗菌、抗炎、抗氧化等药理作用，其中主要活性成分包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ、隐丹参酮、二氢丹参酮等。A【主要化学成分与结构】[4～6]【主要化学成分提取、分离】（1）分离方法一[4]图2-8 丹参粗提物的制备HSCCC分离图HSCCC条件：柱体积266mL；溶剂系统，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶3∶4∶2）（a）、（8∶5∶8∶3）（b），上相作为固定相，下相作为流动相，流速2mL/min，进样量80mg。1—丹参酮Ⅰ（14mg，99.0%）；2—二氢丹参酮Ⅰ（22mg，99.6%）；3—丹参酮Ⅱ（26mg，99.1%）；4—二氢丹参酮A（11mg，96.3%）；5—三叶鼠尾酮B（15mg，98.2%）；6—隐丹参酮（30mg，99.2%）[4]图2-9 丹参粗提物的HPLC分析图HPLC条件：Symmetryshield C（4.6mm×250mm，5μm），紫外检测波长270nm，18柱温25℃，流速1.0mL/min，进样量10μL；流动相，甲醇-水＝75∶25。1—丹参酮Ⅰ；2—二氢丹参酮Ⅰ；3—丹参酮Ⅱ；4—二氢丹参酮；A5—三叶鼠尾酮B；6—隐丹参酮（2）分离方法二[5]图2-10 丹参粗提物的制备HSCCC分离图HSCCC条件：柱体积260mL；溶剂系统，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶4∶6.5∶3.5），上相作为固定相，下相作为流动相；流速2mL/min，进样量400mg，固定相保留率50%。Ⅰ—二氢丹参酮Ⅰ（8.2mg，97.6%）；Ⅱ—1，2，15，16-tetrahydrotanshiquinone（5.8mg，95.1%）；Ⅲ—隐丹参酮（26.3mg，99.0%）；Ⅳ—丹参酮Ⅰ（16.2mg，99.1%）；Ⅴ—甘西鼠尾新酮A（25.6mg，93.2%）；Ⅵ—丹参新酮（9.3mg，98.7%）；Ⅶ—丹参酮Ⅱ（68.8mg，99.3%）A[5]图2-11 丹参粗提物的HPLC分析图
HPLC条件：SPHERIGEL ODS C（4.6mm×250mm，5μm），紫外检测波长254nm，18柱温25℃，流速1.0mL/min，进样量10μL；流动相，甲醇-水＝75∶25。Ⅰ—二氢丹参酮Ⅰ；Ⅱ—1，2，15，16-tetrahydrotanshiquinone；Ⅲ—隐丹参酮；Ⅳ—丹参酮Ⅰ；Ⅴ—甘西鼠尾新酮A；Ⅵ—丹参新酮；Ⅶ—丹参酮ⅡA
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