作者：成诗明、王国治、王黎霞等
出版社：人民卫生出版社
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结核菌素皮肤试验使用指导手册试读：
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结核菌素皮肤试验使用指导手册/成诗明等主编.—北京：人民卫生出版社，2014
ISBN 978-7-117-18863-0Ⅰ.
①结… Ⅱ.①成… Ⅲ.①结核菌试验—皮肤试验—手册 Ⅳ.①R52-62②R446.61-62中国版
本图书馆CIP数据核字（2014）第068839号人卫社官网 WWW.Pmph.com 出版物查询，在线购书人卫社官网 WWW.iPmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
版权所有，侵权必究!结核菌素皮肤试验使用指导手册
主 编：成诗明 王国治 王黎霞 周 林出版发行：人民卫生出版社有限公司
人民卫生电子音像出版社有限公司地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号邮 编：100021E - mail：ipmph@pmph.com制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司制作时间：2018年1月版 本 号：V1.0格 式：epub标准书号：ISBN 978-7-117-18863-0策划编辑：王凤丽责任编辑：张乃戈打击盗版举报电话：010-59787491 E-mail：WQ@pmph.com本电子书不包含增值服务内容，如需阅览，可购买正版纸质图书。结核菌素皮肤试验使用指导手册
顾 问 庄玉辉 万利亚 屠德华
主 编 成诗明 王国治 王黎霞 周 林
编 委 （按姓氏笔画排序）
万利亚 王华庆 王国治 王黎霞
成诗明 刘二勇 庄玉辉 陈 伟
周 林 赵顺英 都伟欣 屠德华序 言
结核菌素皮肤试验（简称TST）应用于我国结核病防治和临床具有几十年的历史。在1979年、1990年和2000年全国结核病流行病学抽样调查，均开展了全人群结核菌素皮肤试验，获得了人群结核菌感染率。2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，全人群结核菌素皮肤试验阳性率为44.5%。一般认为，人体感染结核菌后，一生中结核病的发病率为5%～10%，如果受到艾滋病病毒的感染，结核病年发病率达到10%。为此，结核菌素皮肤试验不仅作为人群结核菌感染的检查手段之一，对结核病的辅助诊断在临床上也普遍使用，对菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核病的辅助诊断具有重要的参考价值。在我国肺结核诊断行业标准中，将结核菌素皮肤试验作为菌阴肺结核的辅助诊断方法。近年来，为了加强学校结核病防治，在大、中学新生的入学体检以及对肺结核患者的密切接触者筛查，将结核菌素皮肤试验作为了结核病筛查的方法之一。尽管结核菌素皮肤试验的敏感性和特异性受到不同因素的影响，但由于其价廉、操作简单，适合于各级医疗卫生机构，作为结核菌感染检测技术的重要手段之一。
由于结核菌素皮肤试验既有流行病学意义又有临床诊疗价值，故对其使用需要更加规范化和标准化。在试验前的试剂运输、储存，试验中的操作和结果测量以及实验结果的分析和利用等全过程中，需要按照规定的程序和规范执行。目前，尽管在全国各级医疗卫生及卫生保健机构普遍使用结核菌素皮肤试验，但由于缺乏结核菌素试验操作的标准化使用的工具书，在实际应用的质量控制中出现了不同程度的困难与问题，降低了结核菌素的应用价值。为了进一步规范各级医疗卫生和卫生保健机构对结核菌素试验的使用，提高医疗卫生人员对结核菌素皮肤试验的理论水平，规范操作标准，提高结核菌素皮肤试验的应用价值，中国疾病预防控制中心和中国防痨协会组织专家编写了《结核菌素皮肤试验使用指导手册》。《结核菌素皮肤试验使用指导手册》结合我国结核病流行病学现状，重点介绍了结核菌素制品的特点，结核菌素皮肤试验适用范围、操作方法、结果判断和异常反应的处理等。本手册可作为各级医疗卫生机构以及卫生保健机构开展结核菌素皮肤试验操作的工具书和培训教材。
由于时间有限，编写中难免存在不妥之处。希望广大读者在使用过程中提出宝贵意见，以利于不断地修改完善。编者二○一四年二月Table of Contents第一节 概 述 一、 结核病流行病学二、 结核菌感染和发病现状三、 结核菌素试剂的研发历程四、 结核菌素皮肤试验的机制及特征第二节 国内外同类制品的比较 一、 我国PPD制品情况二、 我国PPD与国外PPD的比较三、 PPD制品的局限性和研究进展第三节 结核菌素皮肤试验 一、 我国生产应用的结核菌素制品二、 结核菌素皮肤试验的实际应用范围三、 结核菌素皮肤试验的禁忌证四、 结核菌素皮肤试验方法五、 结核菌素皮肤试验的影响因素第四节 结核菌素皮肤试验的结果分析 一、 阳性反应的意义二、 阴性反应的意义三、 影响结核菌素皮肤试验结果的因素四、 结核菌素反应的灵敏性、特异性及预期值五、 结核菌素自然阳转的确定六、 结素试验中常用的统计方法第五节 结核菌素皮肤试验不良反应及处理 一、 全身不良反应及处理二、 局部不良反应及处理第六节 结核菌素皮肤试验质量控制 一、 结核菌素的保存二、 结核菌素试剂使用注意事项三、 受试者的管理四、 人员培训名词索引参考文献第一节 概 述一、 结核病流行病学
结核病是由结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tuberculosis complex，简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多器官系统，最常见的患病部位是肺脏，占各器官结核病总数的80%～90%。也可以累及肝、肾、脑、淋巴结等器官。主要的传播途径有呼吸道、消化道、皮肤和子宫，但主要是通过呼吸道。疾病分型为：原发性肺结核、血行播散性肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎及其他肺外结核。结核病在人群中流行的三个生物学环节如下：（一） 传染源
1882年，德国细菌学家和医学家Robert Koch发现结核分枝杆菌（简称“结核菌”）是人类结核病的致病菌。结核病的传染源主要是肺结核，尤其是痰细菌检查发现抗酸杆菌阳性的肺结核患者是结核病的主要传染源。此外，喉结核、支气管内膜结核也具有十分强的传染性。（二） 传播途径
结核病主要经呼吸道传播。肺结核患者经咳嗽、咳痰将带有结核菌的“微滴核”传播到空气中，当人体经呼吸道吸入后，就可能受到感染。吸入的结核菌能否引起感染或最终导致结核病，取决于吸入结核菌的数量、结核菌的毒力和人体肺泡巨噬细胞固有的杀菌能力等。（三） 易感者
健康人接触到结核菌后，约2/3接触者因吸入的带有结核菌的“微滴核”经上呼吸道清除，或被机体免疫系统清除而未被感染；1/3接触者因机体免疫功能低下或吸入细菌的量大，机体未能清除和杀死全部结核菌，这些没有被清除和消灭的结核菌在人体器官内潜伏下来，潜伏感染的结核菌与机体处于共存状态。当机体的免疫与结核菌处于相对平衡，结核菌不增殖但持续存活，成为结核潜伏感染者。一旦出现机体免疫功能下降时，潜伏的结核菌可以重新生长繁殖，发展成为活动性结核病。据研究结核潜伏感染者有5%～10%可能在一生中某一时候发病。二、 结核菌感染和发病现状
当健康人接触有传染性肺结核患者后，结核菌素皮肤试验出现阳性，可反映人体受到结核分枝杆菌感染。（一） 全球结核菌感染和发病情况
结核病是继艾滋病毒/艾滋病之后，在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手。据世界卫生组织（WHO）报道，全球有1/3的人受到结核菌感染，估计感染人数达到20亿，每年有约6500万人受到结核菌感染。2011年，估计全球新发结核病例有870万，且有140万人死于结核病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病发病人数位于全球的第二位，占全球结核病发病人数的11%。（二） 我国结核菌感染和患病现状
我国结核菌感染基数大。在五次全国结核病流行病学抽样调查（以下简称流调）中，1979年、1990年和2000年全国流调开展了全人群结核菌感染率调查。2000年第四次全国结核病流调结果显示，全年龄组结核菌素皮肤试验阳性率（结核菌素皮肤试验硬结均径≥6mm）为44.5%，估计全国结核菌感染人数达到5.5亿。在结核菌素试验阳性者中，硬结均径≥10mm 为28.3%。
我国肺结核患病人数多。2010年全国结核病流行病学抽样调查结果显示：全国15岁以上人口活动性肺结核患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万，菌阳肺结核患病率为119/10万。据此估算全国15岁以上人口现患的活动性肺结核、涂阳和菌阳患者数分别为499万、72万和129万。乡村肺结核患病率均明显高于城镇，西部地区活动性、涂阳和菌阳肺结核患病率均明显高于中部和东部地区。
我国耐药结核病负担严重。2007—2008年全国结核病耐药性基线调查结果显示，全国结核病总耐多药（MDR-IB）率为8.32%，初治结核病耐多药率为5.71%、复治结核病患者耐多药率为25.64%。据此估算，我国每年新发MDR-IB患者12万例，其中80%为农村患者，青壮年患者的比例较高。三、 结核菌素试剂的研发历程
从1890年Robert Koch最早发明旧结核菌素以来，从旧结核菌素发展为纯蛋白衍生物，结核菌素试剂的研发经过了100多年的历史。（一） 旧结核菌素（OT）
1890年，Robert Koch将结核杆菌接种于含5%甘油的牛肉汤，经6～8周37℃培养后，加温100℃约1小时灭菌，然后进行过滤，再将滤液加热80℃蒸发，浓缩至原来体积的1/10，制成了旧结核菌素（old tuberculin，OT），OT制备容易、性质稳定，但生产工艺较为粗糙，主要成分为结核蛋白及其分解产物，同时还包括了一些与活性无关的多糖、核酸、脂类、结核菌代谢产物及培养基中的各种成分，故常造成非特异性反应。1907年，奥地利人V.Pirquet应用Robert Koch制备的OT，发明了结核菌素皮肤刮种方法，以此来诊断结核菌感染和结核病，这是结核菌素试剂在结核感染和结核病诊断的最早应用。
1952年，世界卫生组织（WHO）将旧结核菌素标准化，规定1TU = 1/100mg的国际标准旧结核菌素，即旧结核菌素1mg = 100TU，1ml旧结核菌素= 1000mg，1ml旧结核菌素= 1000 × 100 = 100 000TU（tuberculin unit，结素单位）。
用于制造旧结核菌素的菌种各异，我国主要用人型93004、93009和93001株（即美国34283株）。由于旧结核菌素的特异性不足，早已经被结核菌纯蛋白衍生物所替代而停止使用。（二） 纯蛋白衍生物（PPD）
1928年首次提得结核蛋白，1932年F.Seibert用Long氏综合培养基培养，用三氯乙酸沉淀制成实验制品，称纯结核蛋白（TPT）。1934年实际使用的纯结核菌素是用Dorset培养基培养6～8周，经100℃ 3小时杀死，每千克加122ml甘油，热浴蒸发浓缩至1/5，加苯酚防腐，在冷室过滤，再用火棉胶膜超滤，10%三氯乙酸沉淀，去杂质，经无水乙醚脱水得晶体状纯结核蛋白。因其中可能仍有变性蛋白，故称为纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）。
1934年Seibert建立硫酸铵盐析法制备PPD。该种方法制备的PPD产品，其多糖、核酸、脂肪含量急剧减少，成为一种富含蛋白质的制剂。1944年，在美国以此种方法制备的PPD（批号：49608）被命名为PPD-S，作为该类型制剂的参考品。由于PPD-S效价和特异性均更强，1952年WHO将PPD-S定为哺乳类国际标准结核菌素，其含量与OT的比较见表1-1。表1-1 哺乳类动物性结核菌素的国际标准品
1955年，WHO与联合国国际儿童基金会（UNICEF）委托丹麦血清研究所生产了一大批PPD产品，定名为PPD-RT23，并推荐为各国进行结核病流行病学调查使用的产品。PPD-RT23是以7株人型结核杆菌所制成，其中E5、E9656、E1580、U1921系原制备RT19-22的菌株，新增加3株T3419、T3480、T3487是从结核病患者中分离出来的菌株。共有95批滤液，其中有18批发现有沉淀而废弃，保留了77批，用乙醚制成混悬液，挥发干燥，保证了混合均匀，提高了蛋白纯度。目前，2TU的PPDRT23被WHO和国际防痨联盟推荐使用，是全球使用最为广泛的PPD产品。
此后，许多国家都研发和生产出各自的PPD，并在PPD字样之后加后缀以示区别。如英国生产为PPD-Weybige，加拿大生产为PPD-CT68，法国生产为PPD-IP48，以及日本生产为PPD-S等。四、 结核菌素皮肤试验的机制及特征
由于结核菌素皮肤试验的反应原理是迟发型细胞过敏反应。了解其免疫机制，对结核菌素试验反应的特征观察具有一定的意义。（一） 免疫机制
人体首次感染结核分枝杆菌（多见于儿童）对结核菌没有特异性免疫反应。结核菌入侵后在入侵部位，出现炎性病变，称为原发感染，感染部位称为原发灶。从原发感染形成时起，人体在结核菌的刺激下逐渐产生对结核菌的特异性免疫反应。结核病的特异性免疫主要是细胞免疫，又称细胞介导免疫，是以T细胞为介导，以巨噬细胞为效应细胞的免疫反应，包括巨噬细胞吞噬结核菌以及处理与递呈抗原，T淋巴细胞对抗原的特异性识别与结合及增殖分化，释放细胞因子，使34巨噬细胞激活和杀菌。一般在2～12周后当结核菌数量达10～10/ml时，即可诱导机体产生相应的细胞免疫反应。在宿主特异性免疫的作用下，结核菌的繁殖被抑制，使结核菌数量明显减少，限制了结核菌在体内的播散，最终使体内大部分的结核菌被消灭。
结核菌素皮肤试验的反应原理是迟发型细胞过敏反应，即Ⅳ型变态反应。进行结核菌素皮肤试验可用来检测机体是否感染过结核菌。感染过结核菌的机体，会产生相应的致敏T淋巴细胞，具有对结核菌的识别能力。当再次遇到结核菌感染或注入微量的结核菌特异蛋白（结核菌素）时，致敏T淋巴细胞受相同抗原再次刺激会释放出多种可溶性淋巴因子，导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚、浸润。约在48～72小时内，局部出现红肿硬结的阳性反应。若受试者未感染过结核菌，则注射局部无红肿、硬结等变态反应发生。（二） 结核菌素皮肤试验的特征1.迟发过程
结核菌素皮肤试验注射部位在皮试24小时后，皮肤反应逐渐加大，72小时达到高峰，出现红肿、硬结之后，逐渐消退。这是结核菌素试验反应的基本变化过程。2.硬结特征
主要是细胞浸润和水肿，故测量结核菌素皮肤试验反应以测量硬结大小为阳性标准。注射部位形成的红晕一般认为是非特异性变态反应引起，不作为阳性标准的判断依据。3.强烈反应
当注射局部出现强烈变态反应时，除局部红肿、硬结外，还出现水疱、溃疡、坏死、双圈、淋巴管炎等。这种反应的发生，往往是机体处于强的免疫状态，对结核菌感染和发病的诊断具有重要意义。4.直接红斑反应（即发超敏反应）
少数人于注射后出现直接红斑反应，于24小时后消失。这类反应在频繁接触结核病患者的人及接触活菌提取抗原制品的人中常见。由于反应消失快，一般不会与迟发型超敏反应混淆。（三） 不同PPD间的交叉反应
由于不同菌种PPD间存在一定的共同抗原成分，在机体引起交叉的迟发型变态反应，其反应强度均弱于其对应致敏菌型感染机体。致敏菌型与PPD型别一致，反应最强；两者之间共同抗原多，交叉反应高。（四） 结核菌素试验的复强作用
在机体第二次进行结核菌素试验时，出现的结核菌素反应增强或阳转的现象。复强作用系指已经致敏的机体做第二次进行结核菌素试验时，反应较第一次增强。这种现象可发生在第一次皮试后1周，或最迟至数月或若干年以后发生。结核菌素复强作用可发生在任何年龄。为此，为避免复强作用的发生，如需要在近期内重复进行结核菌素试验时，应选择在不同的部位或手臂进行。第二节 国内外同类制品的比较一、 我国PPD制品情况
我国PPD制品包括结核菌纯蛋白衍生物（TB-PPD）和卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）。其制品和应用特点为：（一） 结核菌纯蛋白衍生物（TB-PPD）
1980年我国研制出结核菌纯蛋白衍生物（TB-PPD 80-1），是由结核分枝杆菌强毒株（H37RV）培养滤液中提取的蛋白制成。其PPD的纯度和生物活性均接近PPD-S，优于PPD-RT23。各项指标均达到了WHO关于结核菌素相关规程的要求，1984年（TB-PPD 80-1）确定为国家标准参考品。（二） 卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）
为了评估卡介苗接种后的免疫效果及筛选接种对象，依据TB-PPD的制备方法，我国研制出了卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）。BCG-PPD是由卡介菌培养滤液提取蛋白制成的，并于1991年将其确定为国家参考标准品。（三） 结核菌纯蛋白衍生物与卡介菌纯蛋白衍生物特点比较
TB-PPD与BCG-PPD有着共同的抗原成分，能在机体上引起交叉的迟发型变态反应，但在同源菌种致敏机体上的反应高于在异源菌种致敏机体的反应。TB-PPD由于是从人型结核分枝杆菌中提取，故用于人群结核病流行病学调查、结核病密切接触者筛查和结核病患者的辅助诊断等更有价值。BCG-PPD由于是从卡介菌培养滤液中提取，用于卡介苗接种后的效果评价有更好的效果。TB-PPD与BCG-PPD在不同人群皮肤试验阳性率和硬结平均直径比较见表2-1和表2-2。表2-1 BCG-PPD和PPD-C在接种BCG婴儿上的皮肤迟发型变态反应比较表2-2 BCG-PPD和TB-PPD在结核病人皮肤迟发型变态反应比较二、 我国PPD与国外PPD的比较
对我国PPD和国外PPD在工艺标准、质量控制、临床标准、PPD效价单位等方面进行比较。（一） 工艺标准
PPD生产工艺主要有盐析与酸变性沉淀两种方法。盐析法的基本原理是蛋白质溶解度取决于蛋白分子上离子基因水分子数目，当盐浓度增加到一定程度时，水的活度被降低，蛋白质表面电荷被中和，水化膜破坏，蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。由于硫酸铵在水溶液中性质稳定，溶解度大，并且不易引起蛋白质活性丧失，一般选用硫酸铵盐为盐析剂。酸变性沉淀法的基本原理是酸可使一些蛋白变性而沉淀。由于三氯乙酸可使结核菌蛋白发生可逆性变性，一般采用三氯乙酸沉淀法。盐析法蛋白沉淀次数多而产量低，酸变性沉淀法则多糖和核酸等杂质含量会偏高。我国PPD类产品生产工艺均采用酸变性沉淀加盐析的综合制备方法，既保证了产量，又能有效控制杂质含量，见表2-3。表2-3 国内外PPD制品的制备工艺和特点（二） 不同成分质量控制比较
各国的PPD制造与检定规程，基本上是以WHO制定的结核菌纯蛋白衍生物制造与检定规程为基础，无菌试验、动物安全性评价、无致敏原的致敏效应实验、成品效价等检测指标基本一致。由于不同国家的制品生产工艺不同，导致PPD制品中的多糖和核酸等杂质含量也不同，各国对此部分的质量控制存在着一些差异。
我国2010年版药典三部《结核菌纯蛋白衍生物制造与检定规程》中规定：每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg，即多糖与核酸含量应低于10%。日本PPD-S制品中关于该项质量标准的规定是：多糖含量应不高于5%。但并未规定核酸杂质含量。欧洲药典对PPD制品的多糖和核酸等杂质含量均未进行规定。通过查阅文献将不同PPD制品的蛋白、多糖和核酸含量进行对比，见表2-4。表2-4 国内外PPD制品的蛋白、多糖和核酸含量比较
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