作者：王廷璞、王静 编著
出版社：化学工业出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
食品微生物检验技术试读：
前言
Foreword食品微生物检测是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检测，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食品中毒的防治措施。食品微生物检测技术在食品科学领域和人才培养中的地位十分重要。因此，为了适应市场对食品质量安全人才的需要，加强食品微生物检测实验与教学间的联系，保持实验教学内容的连续性和连贯性，我们编写了这部既适合于高校食品质量与安全专业需求又可兼顾食品安全及卫生领域专业人员使用的食品微生物检测技术教程。
本书分为上篇和下篇。上篇为微生物实验基础，包括光学显微镜的使用，革兰染色，真菌和放线菌的形态观察，微生物的测微与显微计数技术，培养基的制备，消毒与灭菌技术，菌种的保藏等内容，将微生物实验的基础扼要地介绍给读者。下篇为食品微生物检验，该篇共包括11个食品细菌学检验实验、2个食品真菌学检验实验以及4个食品微生物快速检验实验。在实验内容的选择上，遵循新颖性、标准性、系统性、连贯性、综合性和层次性的原则，兼顾学生知识面的拓宽和能力的培养以及各高等学校的实验教学条件，经过讲授和操作，学生将受到系统的食品微生物检测方法和技术的训练，使他们能够获得食品微生物检测技术的理论和系统、新颖、准确、实用的实验技能，为他们将来从事食品安全检验奠定一定的基础。本书以食品安全有关专业的本科生为对象，也可供其他相关领域的人士参考。
本书第一章、第六章、第七章、第八章、第十二章和附录由王廷璞编写，第二章、第三章、第四章、第五章、第九章、第十章和第十一章由王静编写。
在编写过程中，我们参阅了众多的书籍和资料，在参考文献中未能全部列出。
由于本书涉及的知识面广及我们的水平有限，书中难免存在错误和不妥，敬请广大读者和同行批评指正。上篇 微生物实验基础第一章 食品微生物检验实验室的总则第二章 微生物的形态观察与镜检第三章 微生物的测微与显微计数技术第四章 培养基的制备第五章 消毒与灭菌技术第六章 微生物的分离纯化与培养技术第七章 微生物生理生化试验第八章 菌种的保藏第一章 食品微生物检验实验室的总则第一节 微生物实验室设计
微生物实验室由准备室、洗涤室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。一、准备室
准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。二、洗涤室
洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。三、无菌室
无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1.无菌室的设置
无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：
(1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房2间容积不宜过大，以便于空气灭菌。内间面积2×2.5＝5m，外间面2积1×2＝2m，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。
(2）内间设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。
(3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。
(4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。2.无菌室内设备和用具
(1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。
(2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。
(3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。
(4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。3.无菌室的消毒与熏蒸
(1)甲醛和高锰酸钾混合熏蒸 一般每平方米需40%甲醛10mL、高锰酸钾8mL，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中,然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸20～30mim即可。
(2)0.1%升汞水消毒 用0.1%升汞水浸过的纱布或海绵进行擦拭，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。喷雾后20～30mim，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。
(3)紫外线照射灭菌 在无菌箱中装一支200V，30W的紫外线灯管；每次开20～30min，就能达到空间杀菌的目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。
(4)石炭酸喷雾 在每次接种之前，用5%石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。
(5)石灰揩擦 经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法是可把各种药品交替使用，过一段时间（约5周）用石灰擦洗一遍。实践证明，这样做效果很好。4.无菌室工作规程（1）无菌室灭菌，每次使用前开启紫外线灯照射30min以上，或在使用前30min，对内外室用5%石炭酸喷雾。（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室换上已灭菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2min。（3）将各种需用物品搬进内室清点、就位，用5%石炭酸在工作台面上方和操作员站位空间喷雾，返回外室，5～10min后再进内室工作。（4）接种操作前，用70%酒精棉球擦手；进行无菌操作时，动作要轻缓，尽量减少空气波动和地面扬尘。（5）工作中应注意安全。如遇棉塞着火，用手紧握或用湿布包裹熄灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用浸润5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸润5%石炭酸的抹布擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。（6）工作结束，立即将台面收拾干净，将不应在无菌室存放的物品和废弃物全部拿出无菌室后，对无菌室用5%石炭酸喷雾，或开紫外线灯照射30min。四、恒温培养室1.培养室的设置（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房2间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4＝14m左右，2外室面积在3.2×1.8＝6m左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。2.培养室内设备及用具（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。3.培养室的灭菌、消毒
同无菌室的灭菌、消毒措施。
小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。五、普通实验室
进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。第二节 微生物实验室基本要求
食品微生物检验对实验室的环境、人员、设备、检验用品、培养基、试剂和菌株七个方面进行了要求。一、环境（1）实验室环境不应影响检验结果的准确性。（2）实验室的工作区域应与办公室区域明显分开。（3）实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要，实验室布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染。（4）实验室内环境的温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求。（5）一般样品检验应在洁净区域（包括超净工作台或洁净实验室）进行，洁净区域应有明显的标示。（6）病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（Biosafety level 2，BSL-2）进行。二、人员（1）检验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。（2）检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。（3）检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品。（4）检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。（5）有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及辨色的实验。三、设备（1）实验设备应满足检验工作的需要。（2）实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。（3）实验设备应定期进行检查、检定（加贴标识）、维护和保养，以确保工作性能和操作安全。（4）实验设备应有日常性监控记录和使用记录。四、检验用品（1）常规检验用品主要有接种环（针）、酒精灯、镊子、剪刀、药匙、消毒棉球、硅胶（棉）塞、微量移液器、吸管、吸球、试管、平皿、微孔板、广口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。（2）检验用品在使用前应保持清洁和/或无菌。常用的灭菌方法包括湿热法、干热法、化学法等。（3）需要灭菌的检验用品应放置在特定容器内或用合适的材料（如专用包装纸、铝箔纸等）包裹或加塞，应保证灭菌效果。（4）可选择适用于微生物检验的一次性用品来替代反复使用的物品与材料（如培养皿、吸管、吸头、试管、接种环等）。（5）检验用品的储存环境应保持干燥和清洁，已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识。（6）灭菌检验用品应记录灭菌/消毒的温度与持续时间。五、培养基和试剂1.培养基
培养基的制备和质量控制按照GB/T 4789.28的规定执行。2.试剂
检验试剂的质量及配制应适用于相关检验。对检验结果有重要影响的关键试剂应进行适用性验证。六、菌株（1）应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。（2）应对从食品、环境或人体分离、纯化、鉴定的，未在微生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源、表型及分子鉴定的主要特征等。（3）实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购入和传代保藏过程中，应进行验证试验，并进行文件化管理。第三节 食品微生物检验的操作技术要求一、无菌操作要求
食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，食品微生物检验要求在无菌条件下进行。（1）接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。（2）进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。（3）接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净。（4）进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用。金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。（5）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。（6）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。（7）接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。（8）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌室无菌程度的检测
无菌室的标准要符合良好作业规范（Good Manufacturing Practice，GMP）洁净度的标准要求（表1-1）。无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。表1-1 GMP规定的洁净度1.沉降菌检测方法
以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃±2.5℃培养48h，取出检查。每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。2.浮游菌检测方法
用专门的采样器，宜采用撞击法机制的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定时校检，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5min，调节流量、转盘、转速。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.5℃±2.5℃培养48h，取出检查。每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。3.监测无菌室的洁净程度的注意事项（1）采样装置采样前的准备及采样后的处理，均应在设有高效空气过滤器排风的负压实验室进行操作，该实验室的温度为22℃±2℃；相对湿度应为50%±10%。（2）采样器应消毒灭菌，采样器选择应审核其精度和效率，还有合格证书。（3）浮游菌采样器的采样率宜大于100L/min；碰撞培养基的空气速度应小于20m/s。三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。四、有毒有菌污物处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。（1）经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。（2）经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。（3）染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃，30min高压灭菌。（4）涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。（5）打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。（6）污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。第二章 微生物的形态观察与镜检
显微镜是研究微生物必不可少的工具。自从发明了显微镜后，人们才能观察到各种微生物的形态，从此揭开了微生物世界的奥秘。随着科学技术不断发展，显微镜可利用的光源已从可见光扩展到紫外线，接着又出现利用非光源的电子显微镜，从而大大地提高了显微镜的分辨率和放大率。借助于各种显微镜，人们不仅可以观察到真菌、细菌的形态和构造，还能清楚地观察到病毒的形态和构造。
当今微生物实验室中最常用的还是普通光学显微镜。我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保养的目的。
除暗视野显微镜和相差显微镜可用于观察活的细菌细胞外，其他普通光学显微镜大多用于观察染色后的细菌细胞，只有经过染色的细菌才能看清其形态和构造。因此，各种染色法也是微生物学工作者应掌握的基本技术。实验一 光学显微镜的使用【目的】
1.了解普通显微镜的构造和原理。
2.正确掌握使用显微镜的方法。【概述】
普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分（图2-1）。图2-1 普通光学显微镜的构造 1.机械装置
(1)镜座和镜臂
它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支撑显微镜的作用。直筒显微镜的镜臂与镜座之间有一倾斜关节，可使显微镜倾斜一定的角度，便于观察。（2）镜筒
它是一个金属制的圆筒，其上端安装目镜，下端安装物镜转化器，镜筒的长度通常是固定的，为160mm。有些显微镜的镜筒长度是可调节的。（3）物镜转化器
用于安装物镜的圆盘，其上可装3～4个物镜。为使用方便，物镜应按低倍到高倍的顺序安装。转换物镜时，必须用手按住圆盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以防物镜和转换器间的螺旋松脱而损坏显微镜。（4）镜台
用于安放载玻片。镜台上安装有玻片夹或玻片移动器，调节移动器上的螺旋可使标本前后、左右移动，有些移动器上还装有刻度尺，可标定标本的位置，便于重复观察。（5）调焦装置
调焦装置即安装在镜筒后方两侧的粗调节螺旋和细调节螺旋，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。2.光学系统（1）目镜
目镜的功能是把经物镜放大的物像再次放大。目镜由两片透镜组成，上面一片为接目透镜，下面一片为聚透镜，两片透镜之间有一光阑。光阑的大小决定了视野的大小，光阑的边缘就是视野的边缘，故又称视野光阑。由于标本正好在光阑上成像，因此若在光阑上粘一小段细发作为指针，就可用来指示标本的具体位置。光阑上还可放置测量微生物大小的目镜测量尺。目镜上标有5×，10×，15×等放大倍数记号，不同放大倍数的目镜其口径是统一的，可互换使用。
(2)物镜
物镜是显微镜中最重要的部件，物镜有低倍（10×以下）、中倍（20×）、高倍（40～65×）和油镜（90×以上）等不同的放大倍数。油镜上刻有“01”（oil immersion）或“HI”（homogeneous immersion）字样，也有以刻一圈红线或黑线为标记，用于区别其他物镜。物镜上标有放大倍数、数值孔径（numerical aperture，NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及要求盖玻片的厚度等主要参数（见图2-2）。图2-2 XSP-16A型显微镜的主要参数
数值孔径指介质的折射率与镜口角1/2正选的乘积，可表示为NA=n·sin（α/2）
式中 n——物镜与标本间介质的折射率；
α——镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角），见图2-3。图2-3 物镜的镜口角
显微镜的优劣主要取决于分辨率的大小。所谓分辨率就是显微镜工作时能分辨出两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值可用下列公式：D=0.61λ/NA
欲提高显微镜的分辨率，一是缩短光的波长，光波愈短则显微镜的分辨率愈高。但是普通光学显微镜所利用的光源不可能超过可见光的波长范围（400～770nm）。虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限，只适用于显微镜摄影而不适于直接观察。二是增大物镜的数值孔径。影响数值孔径的因素之一是镜口角α。当sin（α/2）增到最大时，α/2=90°，就是说进入透镜的光线与光轴成90°角，这是不可能的，所以sin（α/2）的最大值总是小于1。现在所用的油镜,其α/2为60°左右。影响数值孔径的另一因素是介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，香柏油的折射率为1.52，玻璃的折射率为1.5。因此，在物镜和标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可增大到1.2～1.4。所以，当用数值孔径在0.5μm左右，故在油镜下能看清细菌形态及某些结构。
显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积。由于物镜和目镜搭配的不同，其分辨率也不同，例如，在总放大率相同的情况下，采用数值孔径大的40倍物镜和10倍目镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20倍物镜和20倍目镜相搭配时要高些，效果也比较好。（3）聚光器
聚光器会聚光线的作用，可上下移动，在其边框上刻有数值孔径值。可用低倍镜时聚光器应下降，当用油镜时聚光镜应升到最高位置。在聚光器的下方安装有可变光阑（光圈），它由十几张金属薄片组成，可放大和缩小，用以调节光强度和数值孔径的大小。在观察较透明的标本时，光圈宜缩小些，这时分辨力随之降低，但反差增强，从而使透明的标本看得更清楚。但不将光圈关得太小，以免由于光干涉现象而导致成像模糊。（4）反光镜
反光镜安装在聚光器下方的镜座上，它是一个有平、凹两个面的双面镜，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。凹面镜起到汇聚光线的作用，对于未安装聚光器的显微镜及光源较弱时可应用凹面镜；而在光源较强并用聚光器时一般多采用平面镜。【材料与器皿】1.标本
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及大肠杆菌（Escherichia coli）的染色涂片，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的水封片。2.仪器与材料
显微镜（有油镜），香柏油，二甲苯，擦镜纸等。【方法与步骤】1.用低倍镜观察酵母菌（1）调节光源
将低倍物镜转到工作位置。上升聚光器，将可变光阑完全打开，然后转动反光镜采集光源，一般以采集北窗射入的自然光为宜，不宜采用直射日光。如遇阴天或晚上可用普通日光台灯照明。
当用显微镜灯（钨丝灯泡）照明时，因其亮度较强，而且发射光谱中有较多刺激眼睛的红光，故应根据标本染色情况选用绿色，黄绿色或蓝绿色滤光器或一面磨砂的滤光片，以减弱光的强度，同时可吸收掉红光，使视野光线柔和，并可保护眼睛。
旋转反光镜，使光线折射到反光镜中央，并调节聚光器或调节光圈大小，使视野得到均匀的照明。（2）调节聚光器和物镜数值孔径相一致
取下目镜直接向镜筒内观察，想将可变光阑缩到最小，再慢慢地打开，使聚光器的孔径与视野的直径一样大，然后放回目镜。这一操作的目的是使入射光所展开的角度与镜口角度相符合，否则因光圈开得太大而超过物镜的数值孔径时会产生光斑，如光圈收得太小则降低分辨率，从而影响了物镜的清晰度。因为各物镜的数值孔径不同，所以每转换一次物镜都要进行调节。
在实际操作中观察者往往只根据视野的亮度和标本明暗对比度来调节光圈大小，而不考虑聚光器与物镜数值孔径的配合。只要能达到较好的效果，这种调节法也是可取的。但是，对于使用显微镜的工作者来讲，必须了解这一操作的目的和原理，这样在操作时就能运用自如。（3）放置标本
上升镜筒，将酿酒酵母水封片放在镜台上，用玻片夹夹住，然后降下低倍镜，使其下端接近于玻片。（4）调焦
转动粗调节螺旋，使镜筒逐渐上升到看见模糊物像时，再转动细调节螺旋，调节到物像清晰为止。（5）观察
观察并绘制酵母菌的形态。如要精细观察可转换高倍镜。2.高倍镜观察（1）寻找视野
将在低倍镜下找到合适部位移至视野当中。
(2)转化高倍镜
用手按住转换器慢慢地旋转，当听到“咔嚓”一声即表明物镜已转到正确的工作位置上。（3）调焦
使用齐焦物镜时，只要从低倍镜到高倍镜再稍调一下细调节螺旋就可看清物像。如用不齐焦的物镜时，每转换一次物镜都要进行调焦，即先使物镜降低至非常靠近玻片的位置，再慢慢上升镜筒，并细心调节粗、细调节螺旋，直至物像清晰为止。（4）观察
仔细地观察酵母菌的形态构造。3.用油镜观察细菌（1）放置标本
将染色的细菌涂片（涂面朝上）置于镜台上。（2）找合适的视野
先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移至视野中央。（3）转换油镜
将油镜转到工作位置。（4）调节聚光器与油镜数值孔径相一致
只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到一致。（5）加香柏油
取香柏油1～2滴加到欲观察部位涂片上（切忌加多），然后将油镜转到工作位置，下降镜筒，使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头降至既非常接近玻片又不与玻片相撞的合适位置。（6）调焦
左眼从目镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜，至出现模糊的物像时，再用细调节螺旋调节至物像清晰为止。如按上述操作还找不到目的物，一种可能是油镜下降还不到位，另一种可能是油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。（7）观察
仔细观察细菌形态，并将结果填入记录表中。4.显微镜用毕后的处理（1）取下玻片
上升镜筒，取下玻片。（2）清洁显微镜
① 清洁油镜，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用蘸少许二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯；②清洁目镜和其他物镜，可用干净的擦镜纸擦净；③用柔软的绸布擦净机械部分的灰尘。（3）搁置物镜
将物镜转成“八”字式，缓慢下降镜筒，使物镜靠置在镜台上。将聚光器降至最低位置。反光镜镜面转成垂直状。（4）去除细菌涂片上的香柏油
加2～3滴二甲苯于涂片上，使香柏油溶解，再用吸水纸轻轻压在涂片上吸掉二甲苯和香柏油。这样处理不会损坏细菌涂片，并可保存以供以后再观察。如不需要保留涂片，可用肥皂水煮沸后再清洗干净。【结果记录】
将观察到的微生物形态画于下表中。【注意事项】
1.搬动显微镜时应一手握住镜臂，另一手托住镜座，镜身保持直立，并紧靠身体，步态稳健。切忌单手拎提。
2.各个镜面切忌用手涂抹，以免手上的香柏油、汗沾于镜面，否则日后易发霉、腐蚀。
3.用二甲苯擦镜头时，用量要少，不宜久抹，以防胶粘透镜的树脂被溶解。切勿用乙醇擦镜头和支架。
4.油镜的工作距离甚短，故操作时要特别谨慎，切记眼睛对着目镜边观察边下降镜筒。【思考题】
1.要使视野明亮，除调节光源外，还可采取哪些措施？
2.使用油镜应注意哪些问题？
3.试列表比较油镜、高倍镜在数值孔径、工作距离及物镜镜头的大小等方面的差别。
4.试述影响分辨率的3个因素。
5.当物镜由低倍镜转到油镜时，随着放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？实验二 革兰染色法（经典法）【目的】
1.了解革兰染色的原理。
2.掌握革兰染色的操作方法。【概述】
革兰染色法是1884年由丹麦病理学家G.Gram所创立的。用革兰+-染色法可将所有的细菌分为革兰阳性菌（G）和革兰阴性菌（G）两大类，此法是细菌学上最常用的鉴性染色法。
革兰染色法的主要步骤是先用结晶紫除染，再加媒染剂——碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留除染剂的颜色（紫色）者为革兰阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色（红色）者则为革兰阴性菌。+-
该染色法之所以能将细菌分为G菌和G菌，是有这两类菌的细胞-壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多宜被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于+渗出，结果是细菌被脱色，再经沙黄复染后细菌就染成红色。G细菌细胞壁中肽聚糖中层较厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的紫色。【材料与器皿】1.菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色球葡萄球菌（Staphylococcus aureus）斜面菌种各一支。2.仪器
显微镜。3.染色液
草酸铵结晶紫染色液，路哥尔（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。4.材料
载玻片，擦镜纸，吸水纸，二甲苯，香柏油和染色缸等。【方法与步骤】1.涂片（1）常规涂片法
挑一环水于载玻片中央，再用接种环分别挑取：大肠杆菌和金黄色球葡萄菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成薄的菌膜（注意，挑取金黄色葡萄球菌的量应少于大肠杆菌）。（2）三区涂片法
在玻片的左、右端各加1滴水，用无菌接种环挑少量金黄色葡萄球菌与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡萄球菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混匀成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌相混合成含有两种菌的混合区。2.固定
涂片在空气中干燥。手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上过3次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜）。待冷却后，再加染料。3.染色（1）初染
将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度）。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。（2）媒染
滴加路哥尔碘液，染1～2min，水洗。（3）脱色
滴加，95％乙醇，将玻片稍摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2～3次，立即水洗，以终止脱色。（4）复染
滴加沙黄染色液，染色2～3min，水洗。最后，用吸水纸轻轻吸干。4.镜检+-
用油镜观察，区分出G菌和G菌的细菌形态和颜色。5.实验完毕后处理（1）清洁显微镜
按实验一的方法进行。（2）清洗染色玻片
用洗衣粉水煮沸、清洗，沥干备用。【结果记录】
将革兰染色的结果记录于下表中。【注意事项】
1.革兰染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰阴性菌；如脱色时间较短，革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌；脱色时间的长短还受涂色的薄厚、脱色时玻片晃荡的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰阳性菌和革兰阴性菌做练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌落的革兰反应时，应同时做一张已知革兰阴性菌和革兰阳性菌的混合涂片，以观察。
2.染色过程中勿使染色液干涸。使水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3.选用培养18～24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌落死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性反应。【思考题】
1.革兰染色中哪一步是关键，为什么？如何控制这一步？
2.不经复染这一步，能否区别革兰阳性菌和阴性菌？
3.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体进行染色有何不同？实验三 真菌的载片培养和形态观察【目的】
1.学会用载片培养法培养真菌。
2.观察青霉、曲霉和假丝酵母的发育过程和各自的形态特征。【概述】
载片培养法是培养和观察研究真菌或放线菌生长全过程的一种有效方法。通常只要把菌种接种在载玻片中央的小琼脂块培养基上，然后覆以盖玻片，再放在湿室中做适温培养，就可随时用光学显微镜观察其生长发育的全过程，且可不断拍照而不破坏样品的自然生长状态。
真菌载片培养法的方法很多，这里介绍一种周德庆设计的采用营养较贫乏、载片与盖片间空间十分狭窄的载片培养，由此可以看到菌丝疏密恰当、特征构造明显、菌丝和产孢子构造分布在较狭窄平面上的良好标本。它不但易于显微镜观察和摄影，还可通过固定、染色和封固，制成固定标本加以保存。【材料与器皿】1.菌种
产黄青霉（Penicillium chrysogenum），黑曲霉（Aspergillus niger），热带假丝酵母（Candida tropicalis）。2.培养基
马铃薯琼脂培养基（原配方以无菌水作3∶1稀释，以调整其硬度和降低营养物的浓度）。3.试剂
20％甘油乳酸苯酚固定液（乳酸10g，结晶苯酚10g，甘油20g，蒸馏水10mL）。4.器皿
培养皿，载玻片，玻璃搁棒，盖玻片，圆形滤纸片，细口滴管，镊子，显微镜等。【方法与步骤】1.霉菌的载片培养（1）准备湿室
在培养皿底铺一层等大的滤纸，其上放一玻璃搁棒、一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，其外用纸包扎后，121℃下湿热灭菌20min，然后置于60℃烘箱中烘干，备用。此培养皿即为载片培养的湿室，其外形如图2-4所示。图2-4 载片培养的湿室示意图 （2）融化培养基
将试管中的稀马铃薯葡萄糖琼脂培养基加热融化，然后放在60℃左右的水浴（烧杯）中保温，待用。（3）整理湿室
以无菌操作法用镊子将载玻片和盖玻片放在搁棒上的合适位置处。（4）点接孢子
用接种针（环）挑取少量孢子至载玻片的两个合适位置上。（5）覆培养基
用无菌细口滴管吸取少量融化培养基，滴加到载玻片的孢子上。培养基应滴得圆整扁薄，直径约为0.5cm.（6）加盖玻片
用无菌镊子取一片盖玻片仔细盖在琼脂培养基上，防止气泡产生，然后均匀轻压，务必使盖片与载片间留下约1/4mm高度（严防压扁）。（7）保湿培养
每皿约倒入3mL 20％的无菌甘油，以保持培养湿度，然后置28℃恒温培养。10h后即可不断观察其孢子萌发、菌丝伸展、分化和子实体等的形成过程。（8）详细镜检
从湿室中取出载玻片标本，置低倍镜或高倍镜下认真观察霉菌标本中营养菌丝、气生菌丝和产孢子结构的形态及特征性构造，如曲霉的顶囊、足细胞，青霉孢子梗的对称性等（图2-5）。图2-5 曲霉和青霉示意图1—曲霉；2—青霉 2.假丝酵母的载片培养
准备湿室、融化培养基和整理湿室的步骤同上。（1）滴培养基
用灭菌后的细口滴管吸取少量融化的马铃薯葡萄糖琼脂培养基至载玻片的两个适当位置上，随即涂成圆而薄的形状。（2）取菌接种
用接种环从斜面菌种上挑取极少量菌苔，轻轻接至培养基中央（不使培养基破损），盖上盖玻片后轻压，留出狭窄的空间。（3）保湿培养
如前，倒入20％的无菌甘油至湿室，置28℃恒温箱中培养48h后观察假菌丝等特征性构造。【结果记录】
1.观察并描述实验中选用的各霉菌和假丝酵母斜面菌种的形态特征。
2.把显微镜下观察到的曲霉、青霉和假丝酵母的菌丝体和特征性构造（足细胞、分生孢子头、分生孢子梗、分生孢子、假菌丝等）绘图并记录在下表中。【注意事项】
1.作载片培养时，接种的菌种量宜少，培养基要铺得圆而薄些，盖上盖玻片时，不使产生气泡，也不能把培养基压碎或压平而无缝隙。
2.观察时，应先用低倍镜沿着琼脂块的边缘寻找合适的生长区，再换高倍镜仔细观察有关构造并绘图。【思考题】
1.什么是载片培养，它适用于哪几类微生物的形态观察，为什么？
2.制备假丝酵母的载片培养时，与霉菌有何不同，为什么？
3.用20%甘油作保湿剂有何优点？
4.若作载片培养时，盖玻片与载玻片之间的空隙压得过小或全无，将会出现怎样的结果，为什么？实验四 放线菌的玻璃纸培养和形态观察【目的】
1.学会在平板培养基上铺玻璃纸培养放线菌菌落的操作步骤与方法。
2.掌握用显微镜观察在玻璃纸上生长的放线菌个体形态特征。【概述】
放线菌的菌落形态较小，且与培养基结合较紧密，不易用接种环等挑取，制备镜检标本和观察菌落形态特征等都比较困难。利用无菌玻璃纸具有半透性膜的特性，若将其覆盖在平板培养基表面，再在玻璃纸的表面划线接种放线菌孢子，则孢子能通过玻璃纸膜从培养基里吸取养料，并在其表面形成菌落。此外，玻璃纸具有透光性好的优点，因而可将生长至不同阶段的放线菌微菌落等同玻璃纸一起揭下来做镜检或摄影。用此法能观察到菌落形成的各个阶段，是一种较理想的观察微生物菌落形态与其边缘特征的培养与观察法。【材料与器皿】1.菌种
细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）5406，灰色链霉菌（S.griseus）等。2.培养基
高氏1号琼脂培养基。3.器皿
培养皿，无菌玻璃纸片，镊子，载玻片，涂布棒，显微镜等。【方法与步骤】1.倒平板
融化高氏1号琼脂培养基，冷却至50℃左右倒平板，冷凝待用。2.铺玻璃纸
用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸（盖玻片样大小）平铺至平板培养基表面；若以整张铺满平板时，则玻璃纸大小应略小于平板皿底面积，铺玻璃纸时务必使玻璃纸与培养基之间无气泡产生。若有气泡，可用无菌涂布棒将其驱尽。3.涂布菌液
将待分离培养的菌种制备成一定浓度的菌悬液，再取0.1mL的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。也可用接种环蘸取菌液后在其上进行划线分离接种。4.培养
将接种后的平板倒置于28℃温箱中培养5～7d后，放线菌的孢子能在平板表面的玻璃纸上形成菌落。5.制片
在培养过程中，可取不同培养期的放线菌玻璃纸片制成标本片进行观察。制片时，只要将含菌丝体的玻璃纸细心取下，移至载玻片上，使含菌面向上。避免玻璃纸与载玻片间形成气泡，以免影响标本观察。6.观察
将上述制片置于显微镜下观察，先用低倍镜观察放线菌菌落边缘的特征，再在高倍镜下仔细观察放线菌的基内菌丝、气生菌丝和常显弯曲状或螺旋状的孢子丝等。【结果记录】
1.观察并记录在玻璃纸表面生长的放线菌的菌落形态特征，并与普通平板上的菌落做以比较。
2.绘制在低倍镜下观察到的菌落边缘的形态特征，将所观察到的基内菌丝和气生菌丝等与其他制片法所观察到的结果做以比较。【注意事项】
1.玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的正常生长。
2.玻璃纸在灭菌前应予以润湿，并将其与湿润滤纸交替分隔叠放在皿内灭菌，以防玻璃纸皱缩和相互粘贴在一起而不易揭开。
3.放线菌的基内菌丝常呈匍匐状生长在玻璃纸表面，在显微镜下观察时，菌丝体较纤细,稍浅淡些（或稍稍发亮）。【思考题】
1.以玻璃纸覆盖法培养和观察放线菌有何优点？
2.玻璃纸法可否用于培养其他微生物，为什么？第三章 微生物的测微与显微计数技术
微生物的显微镜直接计数通常使用细胞计数板，是指利用显微镜直接对样品中细胞或孢子逐一进行计数，其所得结果通常包括微生物的一些死细胞数的总含菌量。此法若与美蓝等染料的染色相结合，也能达到分别计算活菌数和总菌数的目的。
通常采用显微测微尺测量微生物细胞大小，此方法简单快捷，应用十分广泛。实验五 微生物细胞大小的测定【目的】
1.了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理。
2.掌握微生物细胞大小的测定方法。【概述】
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图3-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时必须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。 图3-1 目镜测微尺
镜台测微尺（图3-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10μm（即0.01mm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上。由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。图3-2 镜台测微尺 【材料与器皿】1.活材料
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）染色标本片。2.器材
显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，擦镜纸。【方法与步骤】1.放置目镜测微尺
取出目镜，旋开接目透镜，将目镜测微尺放在目镜的光阑上（有刻度的一面向下），然后旋上接目透镜，将目镜插入镜筒。2.放置镜台测微尺
将镜台测微尺放在载物台上（刻度面向上），通过调焦看清镜台测微尺的刻度。3.目镜测微尺的校正
先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数，即可求出目镜测微尺每小格的实际长度（目镜测微尺和镜台测微尺两个重合的距离越长，所测得数值越准确）。用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小方格所代表的实际长度。4.计算目镜测微尺每格的长度每格长度(μm)=
例：油镜下测得目镜测微尺50格正好与镜台测微尺7格重叠，则目镜测微尺上每小方格长度为7×10μm/50＝1.4μm
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。5.细胞大小的测定
移去镜台测微尺，换上酵母菌（或枯草杆菌）标本片，通过调焦，待物像清晰后，转动目镜测微尺或移动标本片，测量酵母菌菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。为了提高准确率，可多测几个细胞求其平均值。6.用毕后处理
取出目镜测微尺，用擦镜纸擦去目镜测微尺上的油腻和手印。【结果记录】
1.将不同放大倍数物镜下，目镜测微目尺校正值记录于下表。
2.将测得菌体大小记录下表中。【思考题】
1.显微测微尺包括哪两个部件，它们的作用是什么？
2.不同显微镜的目镜测微尺的校正值一样吗？为什么？实验六 微生物的显微镜直接计数【目的】
学习使用血球计数板的构造、计数原理和计数方法。【概述】
利用血球计数板计数的原理是：将经过稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血球计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。由于计数3室的容积是固定的（0.01m），故可将在显微镜下计得菌体细胞数（或孢子数）换算成单位体积试样中的含菌量。此法所计得数值为样品中死菌数和活菌数的总和，故称其为总菌计数法。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台比两边的平台低0.1mm，此平台中间又被一短横槽分隔成2个短平台，在2个平台上各有1个相同的方格网。它被划分为9个大格，其中央大格即为计数室。该计数室又被精密地划分为400个小格，但计数室有25个中格（为每中格16小格）或16个中格（为每中格25小格）两种，每中格的四周均有双线界限标志，以便在显微镜下区分（图3-3）。图3-3 血球计数板构造 2
计数室大方格的边长为1mm，则面积为1mm，计数室与盖玻片3间的深度为0.1mm，所以计数室的体积为0.1mm。计数时，先计得若干（一般为5个）中格内含菌数，再求得每中格菌数的平均值，然3后乘上中格数（16或25），就可得出1个大方格（0.1mm）计数室中4的总菌数，若再乘上10（换算成mL的含菌量）及菌液的稀释倍数，即可算出每毫升原菌液中的总菌数。【材料与器皿】1.菌种
酿酒酵母2.器材
显微镜，血球计数板，盖玻片，滴管，擦镜纸等。【方法与步骤】1.制备酵母菌稀释液
取在麦芽汁斜面上（30℃）培养48h的酵母菌1支，用10mL生理盐水分两次将斜面菌苔完全洗下，倒入含有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，使细胞分散。该菌悬液经适当稀释后作为计数菌液的样品。为提高计数精确度，菌液应稀释到每一计数板的中格平均有15～20个细胞数为宜。2.清洗血球计数板
先用自来水冲洗（切勿用硬刷子洗刷），再用95%乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，最后用吸水纸吸干。3.加菌液
将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，用滴管将菌液来回吹吸数次，使菌液充分混匀，立即吸取少量酵母菌悬液滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，让菌液沿盖玻片与计数板间的缝隙渗入计数室（避免计数室内产生气泡）。再用镊子轻碰一下盖玻片，以免菌液过多将盖玻片浮起而改变计数室的实际容积。静置片刻，待菌体自然沉降与稳定后，可在显微镜下选择中格区并逐格计数。4.计数
先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察并计数。（由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。）为了减少计数中的误差，所选的中格位置及样品含菌量均具有代表性。若计数室是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小方格）的菌数；若计数室是25个大方格组成，除数上述四个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数。5.清洗
测数完毕，取下盖玻片，用蒸馏水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。【结果记录】
将计总菌数的结果记录于下表中。【注意事项】
1.计数室不可有气泡，否则将影响菌悬液随机分布而使计数产生误差。
2.为了减少误差，应避免计数时的重计或遗漏，故菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，切莫四边均计数而使数值偏高。
3.对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。【思考题】
1.为何用血球计数板可计得样品的总菌数？
2.为什么计数室内不能有气泡？第四章 培养基的制备
培养基是一种由人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的混合养料。虽然培养基种类名目繁多，但就其营养成分而言，不外乎含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类。由于不同微生物的营养方式不同，利用各种营养物的能力也有差异，因此，必须根据各种微生物的特点及实验目的选用合适的培养基。
培养基除了满足微生物所必需的营养物质之外，还要求有适宜的酸碱度和渗透压。不同的微生物对pH的需求不一样，大多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性至微碱性，而酵母菌和霉菌则偏酸性，所以配制培养基时都要将pH调至合适的范围。
按培养基的物理状态来划分，可将培养基分成液体、半固体和固体三类，固体培养基就是在液体培养基中加入适量的凝固剂琼脂（或明矾、硅胶等）配制而成。培养异养菌最常用的凝固剂是琼脂（其熔点在96℃以上，而凝固点在42℃以下），它是从海藻中提取的多糖类物质，其主要成分是半乳糖和半乳糖醛酸的聚合物，一般不能被微生物所利用，仅起凝固剂的作用。硅胶仅适用于配制供自养微生物生长的固体培养基。
配制的培养基都必须经过灭菌后才可以使用。灭菌时应根据营养物的耐热性而选用加压蒸汽灭菌法、过滤除菌法或其他灭菌法。实验七 常用基础培养基的配制【目的】
1.了解配制微生物培养基的原理和培养基的种类。
2.掌握配制微生物通用培养基的一般方法和操作步骤。【概述】
培养异养细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种天然培养基。牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，它不仅能为微生物提供碳源、氮源，还含有多种维生素。蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白或鱼粉等经蛋白酶水解后的中间产物，含有眎、胨和氨基酸等丰富的含氮素营养物，因此完全能满足大多数异养细菌对营养的需要。
配制供细菌、酵母菌、放线菌和霉菌生长的通用培养基的程序大致相同，即先按配方称取药品，用少于总量的水分先溶解各组分，待完全溶解后补足水至所需的量、再调整pH，然后将培养基分装到合适的容器中，经灭菌后收藏、备用。有些实验要求将配制的培养基放在合适的温度下培养过夜待确证无杂菌后，才可使用。
配制一般的固体培养基时所用的凝固剂可直接用市售的琼脂粉或琼脂条，但这类琼脂常含有少量矿物质和色素，如要求用较纯净的琼脂，就必须经过特殊的处理，以去除杂质。其方法是将琼脂放在蒸馏水中泡数日，每天换水，以除去无机盐和其他可溶性有机物，然后用95%乙醇浸泡过夜，取出后放在干净的纱布上晾干，备用。
配制适合于厌氧菌生长的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸等来降低培养基的氧化还原电位，以利厌氧菌的生长。
配制成的培养基应根据其成分的耐热程度选用不同的灭菌方法，最常用的是加压蒸汽灭菌法。配制后的培养基如果来不及灭菌时，应先暂存冰箱，以防因杂菌的生长而破坏其中的营养成分。【材料与器皿】1.试剂
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，1mol/L NaOH，1mol/L HCl。2.器皿
台秤，玻璃烧杯，搪瓷烧杯，三角瓶，量筒，漏斗，试管，玻棒等。3.其他
pH试纸（pH5.4～9），牛皮纸，棉花，纱绳，灭菌锅等。【方法与步骤】1.配制牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）（1）成分
牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂粉1.5g，水100mL，pH7.2～7.4。（2）称取药品
按培养基配方与配量分别称取各药品（药匙切莫混用，瓶盖及时盖上）。取少于总量的水于烧杯中，将各培养基成分逐一加入水中待溶。（3）加热溶解
将玻璃烧杯放置石棉网上（搪瓷烧杯可直接用文火加热），用文火加热，并不断搅拌，促进各药品快速溶解，然后补充水分至所需培养基的量。有时要配制多倍浓度的培养基，其加水量按浓度计算即可。（4）调节pH
初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是微酸性的，故需要用1mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。为避免调节时过碱，应缓慢加入NaOH液，及要边滴加边搅动培养液，然后用pH试纸测其酸碱度值。也可先取10mL培养液于干净试管中，逐滴加入NaOH调pH至7.2～7.4，并记录NaOH的用量，即可防止NaOH过量，并避免因用HCl回调而引入过多氯离子。（5）过滤
若需配制出清澈透明的培养基，则可用滤纸过滤。固体培养基去杂质可用4层纱布趁热过滤。供一般使用的普通培养基可省略此步骤。（6）分装
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]