作者：陈棣、金红婷
出版社：中国中医药出版社
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骨与关节疾病的小鼠动物模型试读：
内容提要
骨与关节疾病问题日益突出，针对骨与关节疾病的医学研究经常用到实验动物模型，其中小鼠模型最为常见。为了医学和科研工作者们在实际应用中更好地进行参考，来自中国、英国、澳大利亚等地的骨与关节疾病研究学者共同撰写了此书，围绕骨与关节常见、多发疾病小鼠动物模型的建立和评价进行深入探讨。本书内容涵盖骨与关节疾病小鼠模型的相关基础知识和制作动物模型的基本方法与评价方法，理论讲授和具体动物模型制作并重，对于骨与关节疾病的动物实验模型应用具有重要的指导意义。本书适合生物、医学科研工作者阅读参考。序《骨与关节疾病的小鼠动物模型》是国内第一部介绍应用于骨与关节疾病研究的系列小鼠模型专著。本书涵盖制备骨与关节疾病小鼠模型的相关基础知识、模型制作技术方法与效应的评价。
本书由浙江中医药大学、天津医科大学、美国拉什大学、美国圣路易斯华盛顿大学、美国罗切斯特大学、美国阿拉巴马大学和澳大利亚悉尼大学长期从事骨与关节疾病基础研究的学者共同努力而撰成，他们为此书的问世付出了巨大的努力。
2000年1月3日，“骨与关节健康十年组织”在世界卫生组织总部瑞士日内瓦正式成立。WHO将2000年至2010年确定为 “骨与关节健康十年”，并把每年的10月12日定为 “骨关节日”，旨在十年内将人群中骨质疏松和骨关节炎等骨与关节疾病预期发病率降低25%。人类在与骨与关节疾病的长期博弈中虽然积累了丰富的治疗经验，但直至今天，骨与关节疾病依然是人类最常见的慢性疾病之一，也是排位第一的致残性疾病。仅骨性关节炎的发病率，在50岁以上人群中就达到50%，65岁以上则高达90%。骨与关节疾病的防治任务依然艰巨。
骨与关节疾病的发生发展机制复杂，除了损伤、感染、遗传因素外，人体代谢、内分泌、免疫、神经等系统的异常都会影响到骨与关节的健康。人类对于骨与关节疾病发生机制的探索从来没有停止过。
我们知道，医学基础研究受伦理和研究方法的限制，在人体直接开展研究的机会是十分有限的，更多的研究是在动物身上进行的。
美国诺贝尔奖获得者G.D Snell说过：“比较医学是推动人类健康研究的焦点学科，比较医学家将永远站在生物医学发展的基础线上。”选择和培育合适的动物模型，借助动物模型展开间接研究，可以改变在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，可以更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。
小鼠不但在生理上与人类相似，而且已经累积了非常多的遗传资源，快速发展的分子实验技术也为小鼠成为人类疾病动物模型的首选创造了绝佳优势。基于此，本书作者在查阅众多文献的基础上，结合自身在实验研究中得到的经验和教训，系统全面地介绍了适合骨与关节疾病研究的小鼠模型，填补了骨与关节基础研究领域内小鼠模型专著的空白。
本书理论和操作结合，特别是对于关键技术的介绍，详细而又实用，是一部指导性很强的专著，相信将会进一步推动骨与关节疾病临床和基础的深入研究。
最后要感谢作者的辛勤付出，也要感谢中国中医药出版社，是他们的赞赏和努力才使得本书能在今日呈现给读者。肖鲁伟杭州2017年7月6日
编者按语
随着人类社会的发展和人口老龄化的进程，骨与关节疾病已成为危害人类健康的严重疾患，其危害性日益受到世界各国的广泛关注。世界卫生组织 (WHO)将2010～2020年定为第二个 “骨关节十年”。但众多骨与关节疾病的发病机制仍不明确，防治工作依旧形势严峻。实验动物模型是生命科学实验研究中的重要组成部分，在医学研究过程中，处处都包含着实验动物模型的重要贡献，通过对实验动物模型的全面了解可更深入地掌握疾病的发生、发展过程等。由此，骨与关节疾病的动物模型凸显重要。
为了更好地供医学和科研工作者参考，来自中国 (浙江中医药大学、天津医科大学)、美国 (拉什大学、圣路易斯华盛顿大学、罗切斯特大学、阿拉巴马大学)、澳大利亚 (悉尼大学)的骨与关节疾病研究学者们共同编撰此书，围绕骨与关节常见、多发疾病的小鼠动物模型的建立和评价深入探讨。《骨与关节疾病的小鼠动物模型》涵盖骨与关节疾病小鼠模型相关基础知识和制作动物模型的基本方法与评价方法，理论讲授和具体动物模型制作并重。
本书共分十一章。其中第一章主要介绍了实验动物和动物实验的基础知识与研究进展，病证结合模型在骨与关节疾病中的应用；基因修饰动物是目前人类疾病研究的核心动物模型，所以单列为第二章；其余章节按照骨与关节疾病分类，重点介绍了影响人类健康的十种重要骨与关节疾病小鼠模型的制作原理、制作方法、模型特点、模型评估和应用等。
本书由多国学者联合编撰，书中如有编写不当之处，请各位读者给予指正和谅解，以便再版时修订。编者2017年6月第一章动物模型与疾病研究
人类疾病的动物模型 (animalmodel of human disease，以下简称动物模型)是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现［1］的动物实验对象和材料。动物模型作为最常用的疾病模型之一，可以全部或部分模拟人类疾病的临床表现或发病机制，是研究人类疾病常用的手段和最为有效的实验材料。
动物模型是由医学 (包括兽医学)科学技术领域中的研究者以动物个体为单元，从其整体出发，诱导实验动物产生某些类似于人类疾病的临床表现、病理特征和发生、发展规律，据以认识异常的有机生命现象，并且探明人们对它可能施加的影响 (如治疗)。
当前，发现、研制和建立动物模型的主要目的在于：一是解析疾病发生的生理病理机制；二是服务于疾病预防和治疗的药物研发。借助动物模型可辅助解决人类疾病的诊断与治疗问题，特别是治疗问题，例如药物 (包括植物药、化学合成药、生物制品等)治疗的疗效、有效用量、不良反应与安全性评价等方面的问题。第一节 动物模型的意义
长期以来人们发现，选用人作为实验对象来推动医学的发展是困难的，临床所积累的经验不仅在时间和空间上存在着局限性，许多实验在道义上和方法学上也受到种种限制。动物模型的吸引力就在于它克服了这些不足，已经成为现代医学科学深入发展不可缺少的工具和实验基础。动物模型在生物医学研究中所起到的独特作用，越来越受到科技工作者的重视，其优越性体现在以下几点。一、避免了人体试验的风险
因为受到法律和伦理方面的约束及限制，临床对某些疾病如中毒、外伤、烧伤或烫伤、放射病及肿瘤等的研究是有一定困难的，甚至是不可能进行的。动物则可以作为人类的替难者来承担人体试验的风险，在人为设计的实验条件下反复观察和研究人类疾病，为人类疾病的诊断、预防和治疗提供实验材料和证据，克服了在人类研究中经常会遇到的理论和社会限制，是现代医学科技进步的需要，也是现代社会文明进步的表现之一。二、便于实验材料的获取
临床上收集疾病材料在数量上和时间上都具有一定的局限性，且很多疾病材料由于受到患者的限制而很难反复收集，导致有些研究不能根据疾病的特点长期进行研究。这种局限不利于人们对疾病的全面认识，也不利于开展疾病防治的医学研究。在科学设计的前提下，疾病动物模型不仅能在群体数量上，而且在获取疾病材料的多样性上都可以满足实际需要。例如，临床上平时很难收集到放射病、毒气中毒、烈性传染病等患者，而实验室则可以根据研究目的要求随时采用实验［2］性诱发的方法在动物身上复制出所需要的模型。
一些遗传性、代谢性和内分泌等疾病，如急性白血病、血友病、周期性中性白细胞减少症、自身免疫介导性疾病等的发病率较低，研究人员可以有意识地提高其在动物种群中的发生频率，提供发病率较高的疾病材料，从而推进研究。
某些疾病发生发展缓慢，还有些疾病的致病因素需要隔代或者隔几代才能显示出来，在人类很难研究，而许多动物由于生命的周期很短，在实验室观察几十代是容易的，如果使用微生物，甚至可以观察几百代。因此，使用动物模型可以克服人类某些疾病潜伏期长、病程长和发病率低的缺点，便于实验材料的获取。三、增强实验材料的可比性
临床上疾病是十分复杂的，患者的年龄、性别、体质、遗传等各不相同，对疾病的发生发展均有影响。采用动物来复制疾病模型，可以选择相同品种、品系、性别、体重、活动性、健康状态，甚至是遗传和微生物等方面严加控制的各种等级的标准实验动物，用单一的病［3］因作用复制成各种疾病。
应用疾病动物模型，通过动物品种、性别、年龄等的实验分组，以及模型复制方法、条件、时间等的选择，可以在短时间内获得大量重复性良好、可比性较强的实验材料，并能够再现相关疾病的演变过程。四、简化实验操作和样品收集
动物模型作为人类疾病的 “缩影”，在遵循动物福利的前提下，便于研究者按实验目的需要随时采取各种样品，甚至及时处死动物收集样本，了解疾病模型动物病理反应的全过程。实验动物向小型化的［4］发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作。五、有助于全面地认识疾病的本质
临床研究未免带有一定的局限性，已知很多病因除人以外也能引起多种动物感染，其表现可能各有特点。通过建立人兽共患病动物模型开展比较医学研究，可充分了解同一病原体在不同机体内的损害特点，有助于更全面地认识这些疾病的性质，为人兽共患病的诊断、预防和治疗提供有价值的实验数据。动物疾病模型的另一个富有成效的用途，在于能够细致观察环境或遗传因素对疾病发生发展的影响，这［2］在临床上是办不到的，对于全面地认识疾病本质有重要意义。第二节 动物模型的评价原则一、比较医学原则（一）相似性原则
生命科学领域中，动物模型作为人类疾病的 “缩影”和研究工具，与人类疾病的相似程度十分重要。自然条件下，能够完全符合人类临床疾病的动物模型极少，往往需要利用其他技术加以复制。为了达到疾病动物模型尽可能再现所要研究的人类疾病，使得建立的疾病动物模型具有比较医学研究价值，设计动物模型的一个重要原则就是所复制的模型应尽可能近似于人类疾病的情况。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择；其次，还要在实践中对所采取的［5］造模方法不断加以改进；最后，建立有效的评价标准，对复制的动物模型与人类疾病之间的相关性进行有效的评价。（二）重复性原则
重复性是大多数科学研究的基本要素，理想的疾病动物模型，在复制方法、疾病特征等方面必须具有良好的重复性。为了达到这一目的，应该在模型的制备中应用标准化并且适于研究目的和模型制作的实验动物，并在模型的制备方法及其他实验条件方面保持一致。按照重复性原则，疾病动物模型通常可分为经典型疾病动物模型和非经典型疾病动物模型。经典型动物模型是已经完成标准化的动物模型，这类模型通常都具有良好的重复性；非经典型疾病动物模型则在复制技术、实验条件、疾病特征及评价体系等方面通常尚未完成标准化，这类模型的重复性要比经典型模型差。为了保证动物模型复制时的重复性，尽可能选用适宜标准化的实验动物，并且在实验者操作技术熟练程度等方面保持一致。（三）可控性原则
复制的动物模型应该力求可靠地反映人类疾病，即可特异地、可靠地反映某种疾病或某种功能、代谢或结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，所有这些指标应该能够通过检验手段加以确定，如［6］经化验或X线照片、心电图、病理切片等证实。没有客观的指标可以测定是无法得到可控性好的动物模型的，因而也就无法对动物模型质量进行评价。人类疾病动物模型不同阶段所表现出来的外部症状和内在变化应该容易控制。有些动物对某些致病因子特别敏感，造模方法不易控制，极易死亡，这样的动物也不适宜复制动物模型。二、动物实验伦理与3Rs的原则
3Rs是 Reduction(减少)、Replacement(替代)、Refinement(优化)的简称。在动物模型的制备过程中，特别是采取各种诱发手段制备相关模型时，会给动物造成严重的伤害。因此，在开展模型研究前，应该对研究目的进行审查，要论证动物模型在本研究中的必要性，探讨采用其他方法替代动物模型的可能性。如果有其他方法能够替代动物模型，并能将研究目的阐述清楚，应该避免使用动物。如果动物模型不可替代，则应在造模的全过程中对动物福利与动物实验伦理给予重视，在不影响实验结果的前提下，应该采用有效措施，尽可能减少因［5］实验操作给动物造成的与实验目的无关的伤害。三、整体实验条件控制原则
在复制动物模型时，所使用的材料、方法应尽量遵循容易得到和合乎经济原则。灵长类动物与人类近似，复制的疾病模型相似性最好，但由于价格昂贵、饲养成本高等因素，在一般性研究工作中应用得较少。除非不得已或一些特殊疾病 (如HIV、HBV和脊髓灰质炎等)研究需要外，尽量不用灵长类动物。除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外，在模型复制方法上、参考指标上也都要注意这一原则。第三节 动物模型的分类
动物模型的分类方法有多种，尚无统一的认识，其分类意义在于：了解这一大模型 “家族”的庞杂性，方便研究者的模型选用，认识动物模型工作的空白区以加大研发力度，等等。现将各种分类方法分［7］述如下。一、按产生原因分类（一）自发性动物模型（spontaneous animalmodel）
自发性动物模型指实验动物未经任何人工处置，在自然条件下自发产生疾病，或由于基因突变导致疾病，并通过遗传育种手段保留下［8］来的动物模型。
自发性动物模型以肿瘤和遗传疾病居多，利用这类动物疾病模型来研究人类疾病的最大优点就是其疾病的发生、发展与人类相应的疾病很相似。因此，近年来十分重视对自发性动物疾病模型的开发。许多学者通过遗传育种将自发性动物模型的自发性疾病保持下去，并培育成具有该病表现症状和特定遗传性状的基因突变动物，供实验研究应用。在这方面，小鼠和大鼠的各种自发性疾病模型开发和应用得最多。（二）诱发性动物模型（experimental animalmodel）
诱发性动物模型指通过物理、生物、化学等致病因素的作用，人［9］为诱发出的具有类似人类疾病特征的动物模型。
诱发性动物模型制作方法简便，实验条件容易控制，重复性好，在短时间内可诱导出大量疾病模型，广泛用于药物筛选、毒理、传染病、肿瘤、病理机制的研究。但诱发性动物模型是通过人为限定方式而产生的，最为明显的缺陷是诱发性动物模型与自然发生的人类疾病存在某些差异，况且许多人类疾病目前还不能用人工诱发的方法复［9］制，因而有一定的局限性。（三）抗疾病型动物模型（negative animalmodel）
抗疾病型动物模型指利用健康动物生来固有的生物学特征、特性作为人类疾病研究的动物模型。例如，兔甲状旁腺分布比较分散、位置不固定，摘除其甲状腺不影响甲状旁腺功能，是摘除甲状腺实验较［4］理想的动物模型；哺乳类动物均易感染血吸虫，而居于洞庭湖流域的东方田鼠却不易感染，是典型的抗疾病型动物模型。但这类动物模型与人类疾病存在着一定的差异，研究人员在使用这类动物模型时［10］应加以分析比较。（四）遗传工程动物模型 （genetic engineering animalmodel）
随着生物技术的发展，应用基因工程技术有目的地干预动物的遗传组成，建立携带 (或缺失)有特定基因的转基因动物，导致动物新的生物性状的出现，并可有效地遗传下去，形成新的可用于生命科学研究和其他目的的动物模型，这类动物模型称为遗传工程动物模型［8］
。二、按系统范围分类（一）疾病的基本病理过程动物模型 （animalmodel of fundamentally pathologic process of disease）
疾病的基本病理过程动物模型指各种致病因素在一定条件下作用于实验动物后，动物所表现出的功能、代谢和形态结构方面等共同性病理改变的动物模型。这类动物模型表现出的共同性病理变化，主要包括发热、缺氧、水肿、炎症、休克、弥散性血管内凝血、电解质紊乱、酸碱平衡障碍等，称之为疾病的基本病理过程。由于致病因素多样化及共同性的病理变化，这类动物模型的实际应用带有一定局限性，但对于某些特定疾病的发病机制及药物筛选等方面的研究，其仍具有一定的应用价值。（二）各系统疾病动物模型（animalmodel of different system disease）
各系统疾病动物模型指与人类各系统疾病相应的动物模型，如心血管、呼吸、消化、造血、泌尿、生殖、内分泌、神经、运动等系统疾病模型，还包括各种传染病、寄生虫病、地方病、维生素缺乏病、［1］物理损伤性疾病、职业病和化学中毒性疾病的动物模型。三、按模型种类分类
疾病模型的种类包括整体动物模型、组织细胞动物模型、分子动物模型、数学模型等。其中，整体动物模型是常用的疾病模型之一，也是研究人类疾病的常用手段。四、小鼠模型与人类疾病
小鼠 (Musmusculus)模型是研究人类疾病理想的动物模型。小鼠不但在生理上与人类相似，而且现在已经积累了非常多的遗传资源。有资料表明，自发的或是由放射性或化学诱变产生的小鼠突变品系已［11］达1000多种，从而为建立人类疾病的动物模型打下良好的基础。另外，高分辨率的小鼠遗传及物理连锁图谱已经建成，小鼠基因组的测序工作不久即将完成，而且修饰小鼠基因组的技术 (包括建立转基因小鼠、基因敲除，以及改建小鼠染色体的技术)也已具备；分析复杂遗传病的方法也相继建立。这些进展加速了对小鼠疾病基因位点的鉴定与克隆，同时也促进了新模型的建立，从而使得小鼠成为人类疾［11］病动物模型的首选。第四节 中医病证结合动物模型的研究
无论是中医学理论的发展和创新，还是中医临床疗效的验证和展示，都离不开科学实验。开展动物实验研究是以思辨和经验积累为特征的中医学与以科学实验为基础的现代医学相结合所必不可少的条件，在现今，更是中医实现现代化和全面走向世界的必由之路［12］。
随着中医的现代化进程，中医药的研究已经完全突破了长期以来以经典校注、引证发挥和临床诊治观察为主的传统模式，随着中医实验动物科学的发展，中医动物模型学已经成为中医方法、理论、实践体系中不可缺少的一部分，并且进行了有效的探索研究，取得了一定［1］的进展。
病证结合是目前中医临床的重要诊疗模式，它要求在临床诊疗中既重视对西医疾病的诊断，又注重对中医证候的认识。为适应临床辨病辨证相结合的实际，建立病证结合动物模型也日益受到关注，并逐渐成为中医实验动物模型发展的新方向。一、病证结合动物模型构建方法的分类
1.根据现代医学理论复制疾病模型，在疾病模型的基础上再根据中医理论复制证候模型。
2.根据现代医学理论建立疾病模型，在不采取任何人为手段的情况下观察疾病本身发展过程中的证候类型变化。
3.根据中医理论建立证候模型，再根据现代医学理论造成疾病的病理改变，从而建立病证结合动物模型。二、病证结合动物模型建立的特点
病证结合动物模型是探究疾病发生机制，以及筛选有效治疗中药的关键途径和手段，其特点体现于以下方面：①以疾病模型为基础，模型具有良好的可靠性和稳定性；②将时间观念引入模型，较好地体现出中医 “证”的动态性与阶段性特征，从而体现出中医对疾病发展规律的认识；③疾病与证候结合，宏观与微观结合，既能以中医学理论为指导，又能用实验方法加以证实，实用性和操作性较强；④病证结合动物模型使很多 “证”的不确定因素由于 “病”的限制变得更加清晰，更符合临床实际，更能精确地阐明中医证候的本质［13］。三、骨与关节疾病的病证结合动物模型
骨与关节疾病是凸显中医药疗效优势的病种，利用病证结合动物模型，可以研究骨与关节疾病中西医结合诊治的生物学基础及各种新的治疗方法、新药物的疗效及不良反应等。
之前通常使用单一物理或化学因素造成病证结合模型的方法。如［14］韩清民等根据肾虚的本质与下丘脑-垂体-性腺轴结构和功能的异常有关，性激素内环境改变是肾虚发生和发展的重要物质基础，性腺功能减弱、睾酮值升高、雌激素值降低，可出现明显的肾虚表现的原理，利用SD大鼠行双侧卵巢切除去势，结合切断单侧膝前后交叉韧带、内侧副韧带的方法，建立肾虚型膝骨性关节炎病证结合大鼠模型。
但是，传统中医病因多为非特异、单一的病因，可能造成多种不同证候，一种证候也可由多种不同病因引起，因此在复制骨与关节疾病证动物模型时，需要考虑采用多因素复合构建中医“证”模型的方法。近年来，用综合因素如过劳加饥饱失常法、劳倦过度加饮食不节［14］法等代替单一因素制作证模型是其发展趋势。
随着研究的进展，病证结合动物模型逐渐成为骨与关节疾病动物模型发展的方向，在西医 “病”模型动物宏观体征中体现中医 “证”。骨与关节疾病病证结合模型的造模，大多采用西医病理造模［15］因素叠加中医证候造模因素的方法。例如，赵万军等利用给兔臀肌注射醋酸氢化泼尼松8mg/kg，每周1次，共9周，制备激素性股骨头坏死动物模型。根据造模过程中模型动物出现畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、消瘦、体毛干枯脱落、嗜睡，伴小便清长、大便溏薄、肛温下降等一系列肾阳虚症状表现，认为肾阳虚激素性股骨头坏死模型构建成功。由于不重叠施加中医 “证”造模因素，不会影响西医 “病”模型，且能够系统动态地观察动物模型证候变化，体现了中医对西医疾病的认识规律和辨证特点。四、病证结合动物模型研究存在的问题
构建病证结合动物模型的目标就是要通过动物尽可能模拟患者的临床特征，体现中医临床的诊疗特点，为研究与揭示有确切疗效经典方药的作用机制提供较理想的载体与实验平台。但是，也有学者［16］指出，由于动物模型和人之间的差异性，决定了其症状的复杂性，以及一些重要指标 (如舌象、脉象、肤色、情感症状等)难以在动物身上模拟和体现等一系列问题，使动物身上体现出来的症状和体征多半不具有或不能反映中医证的属性，因此病证结合动物模型的实际操作性还有待验证。
从目前的研究现状来看，存在的问题主要集中在造模方法的选择及对模型的验证两个方面。其中造模方法更加注重中医药理论的指导，在对模型的验证方面更加注重实验动物信息的采集和相关方剂干预后的疗效验证，既借鉴了现代医学与科学技术，又充分挖掘了中医药学的基本理论与指导思想。但是，无论是分别建立疾病模型与证候模型，还是采用复合方法，在建模的过程中对现代医学疾病与中医证候的关联性普遍关注较少。因为在临床实际中，病与证的形成并不是截然分开的，“同病异证”“异病同证”的现象普遍存在，证候与疾病之间存在明显的相关性。特定的证候往往在某些疾病中出现的频率较高，而在其他疾病中出现的频率较低，甚至不出现。这种在疾病过程中证侯表现的多样性和倾向性不仅体现了中医学 “同病异治”和 “异病同治”的思想，也提示证候的形成与疾病的特征性病理环节必然有密切联系。（胡雪琴）
参考文献
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骨骼是人体的重要组成器官，它的功能包括为软组织提供机械支持、保护大脑和脊髓、协助肌肉运动、支持造血、维持血钙水平等［1］
。骨功能的发挥依赖于骨组织的持续更新，即骨形成和骨吸收的动态平衡过程。成骨细胞是骨质形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。破骨细胞可在骨表面调控骨吸收，并与成骨细胞的骨形成活性保持平衡。正如生物医学研究的许多其他领域，运用转基因小鼠在骨骼发育的特定阶段选择性地敲除特定基因，不仅可以特异性研究骨细胞的功能，也为在细胞水平探索骨骼与其他器官组织之间的复杂调控机制提供了强有力的工具，并显著地推动了相关疾病的研究。本章节将对成功运用于骨骼发育研究的几种主要Cre-lox小鼠及其他转基因小鼠做一综述。一、Cre-lox系统概述［2］
Cre-lox系统于20世纪80年代早期首次在细菌中被发现。环化重组酶 (Cre)是38kDa的第一代噬菌体蛋白质，它可以催化两个序列识别位点 (loxP)间的重组。loxP位点 (locus X over P1)是一段长为34个碱基对的序列，包括8个碱基对组成的核心序列，以及两侧各13［3］个碱基对的回文序列。Cre介导的重组可造成两个loxP位点之间基因的敲除。Cre-lox系统于20世纪80年代后期首次在真核细胞中得［4，5］［6，7］以运用，并于1992年进一步在转基因小鼠中得以证实，此后引发了众多小鼠模型的发展，这些小鼠的靶基因两侧均含有loxP位点 (所谓的 “floxed”小鼠)，因而可被Cre介导的重组特异性地敲除。二、Rosa-Cre和Rosa-CreER
Cre的表达可通过Rosa26报告子 (R26R)加以验证。在R26报告小鼠中，β-半乳糖苷酶 (β-gal)基因前的终止信号两侧各有一个loxP位点。因此，只有当Cre表达时，终止信号被敲除，β-gal基因才得以表达［8］
(图2-1)。在双转基因小鼠中 (同时转基因表达Cre和R26R)，表达Cre的细胞也同样表达β-gal基因，从而可通过X-gal组织染色来确认Cre表达的细胞特异性。X-gal组织染色检测Cre的活性一方面要求特殊的组织处理方法用以保存酶活性，另一方面要求解决组织背景染色这一技术难题。基于这些技术问题，近几年绿色荧光蛋白 (GFP)报告模型被用于Cre的检测，将GFP基因嵌入Cre转基因载体中，则绿色荧［9］光染色阳性组织即为Cre阳性表达。图2-1 Cre可使R26R中的β-gal基因得以表达，从而被X-gal染色识别
为了能够在空间和时间上更为精确地控制Cre的活性，从而在胚胎发育及出生后的特定时间可以精准地敲除位于loxP位点内的等位基［10］因，一种依赖于配体的嵌合Cre重组酶得到了应用。法国法兰西公学院伊尔基希遗传与细胞分子生物学研究所的Feil等人率先在人源雌激素受体的配体结合区 (LBD)形成三个碱基突变 (G400V/M543A/L544A)，使之不能与内源性雌激素结合，但能与雌激素受体的人工合成配体——他莫昔芬 (Tamoxifen)结合，再将Cre重组酶的一段融合多肽序列和突变的雌激素受体的配体结合区嵌合，从而使得他莫昔芬能够激活Cre重组酶而启动Cre重组功能。如图2-2所示，在Rosa-CreER小鼠中，Rosa26位点可调控他莫昔芬诱导的Cre-ER融合蛋白。也即是说，Rosa-CreER小鼠中的β-gal基因只有经他莫昔芬诱导［8］方能启动。图2-2 Rosa-CreER小鼠中的β-gal基因只有经他莫昔芬诱导方能启动三、靶细胞和靶基因概述
由于骨骼生长发育过程中的许多相关基因对于其他器官和组织的发育至关重要，全身性的基因敲除往往是致死的，因此骨骼系统的条件性基因敲除小鼠模型成为骨骼研究的重要工具。运用骨骼系统特异性的启动子在转录水平调控Cre-lox系统，可使得Cre在骨骼发育的特定时期表达于某种特定的细胞中，从而为骨生长发育及对特定细胞功能的针对性研究提供了可能。以下的讨论将针对骨形成与骨吸收过程中四种主要的调控细胞：软骨细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞，及其主要标记基因在Cre转基因小鼠体系中的应用。
骨的发生包括膜内成骨 (intramembranous ossification)与软骨内［1，11，12］成骨 (endochondral ossification)两种方式。在膜内成骨过［13］程中，间充质干细胞直接分化为成骨细胞；而在软骨内成骨过程中，间充质干细胞首先分化为软骨细胞并形成软骨组织，软骨组织中的软骨细胞经历增殖、成熟、分化、凋亡和钙化，最终被骨组织替［1］换而形成骨。膜内骨化发生于一些颅面骨和锁骨外侧部的骨形成过程中；而软骨内骨化发生于四肢的长骨、颅骨基部、脊椎骨、肋骨和锁骨内侧部的骨形成过程中。如图2-3所示，在骨骼发育过程中，软骨细胞和成骨细胞具有共同的前体细胞——间充质干细胞。针对间充质干细胞或骨软骨前体细胞的Cre转基因小鼠体系可用于对软骨和矿化骨中早期骨骼系统发育相关基因的条件性敲除。更为重要的是，这些模型可用于研究特异基因在成骨细胞系和软骨细胞系分化中的作［9］用。针对骨软骨前体细胞的模型主要包括Prxl-Cre、Dermol-Cre，以及Sox9-Cre。成骨细胞是骨骼系统中最为广泛研究及应用的靶细胞，成骨细胞活性的研究对于骨的初始矿化和成骨化相关的信号通路的研［1］究至关重要。因此，一系列成骨细胞特异性的Cre系统被广泛研究应用，包括表达于成骨前体细胞的Osterixl(Osxl) -Cre，以及表达于成骨细胞的Ⅰ型胶原 (Collαl) -Cre，以及骨钙素OC-Cre。一旦成骨细胞形成，足以将自己包裹在骨化基质中的骨沉积，它就被称为骨细胞。骨细胞不再分泌类骨质，但是可以调控成骨细胞活力，并具有［14］骨传导性。由于极难获取及体外培养，骨细胞的相关研究主要依赖于体内模型，而Cre-loxP转基因小鼠的应用正为此提供了极大的便利。牙本质基质蛋白1(DMPl)是特异性研究骨细胞功能表型的靶基因。破骨细胞所介导的吸收降解矿化骨和钙质是维持骨内稳态的另一［15］方面，这一过程对于形成稳定的血钙离子浓度至关重要。针对破骨细胞特异性模型包括抗酒石酸盐酸性磷酸酶 (TRAP)-Cre和组织蛋白酶K(CtsK)-Cre。
以上所述各类细胞及其标记基因均如图2-3所示，以下篇幅将就骨骼研究中不同Cre启动子模型和靶细胞类型做一综述。图2-3 骨骼发生发育相关细胞分化过程，以及以其标记基因 （若无特别注明，则为小鼠源标记基因）为靶基因的Cre小鼠模型四、Prx l-Cre和Prx l-CreER
Prxl被认为是调节四肢骨骼发育的必要基因，并由骨形态发生蛋白 (BMP)介导的信号通路调控。Prxl-Cre转基因小鼠是由哈佛医学院［16］遗传学部的Malconlm Logan及其同事首次构建的。如图2-4所示，Cre重组酶基因在转录水平由2.4kb配对相关同源框1(Prxl)增强子调控，并包括β-珠蛋白绝缘子序列 (β-globin insulator)，以及 0.7kb猿猴空泡病毒 40聚腺苷酸化序列(SV40 PA)。
Prxl-Cre转基因小鼠已被应用于骨软骨祖细胞分化的相关研究中。Seo HS等人在Prxl-Cre小鼠中特异性地敲除β-转化生长因子Ⅱ型受体 (TGF-βRⅡ)，结果显示TGF-βRⅡ是骨骼正常发育的必要因子，［17］并可抑制间充质干细胞向软骨细胞分化。Soung DY等人通过Prxl-Cre小鼠研究Runxl因子在骨骼发育及骨折愈合中的功能，结果显示Runxl对于软骨祖细胞向软骨细胞的分化至关重要，并可剂量依赖［18］性地调控软骨内骨化及骨折愈合过程。Bruce SJ等人则发现India Hedgehog基因 (IHH)受体Ptc1的敲除可抑制软骨细胞的正常分［19］化。图2-4 Logan等人合成的Prxl-Cre转基因结构
美国凯斯西储大学的Kawanami等人，通过将CreERT2和GFP报告基因插入至鼠源2.4kb的Prxl启动子的下游基因中，构建了Prxl ［20］CreER-GFP转基因小鼠 (图2-5)。这种小鼠能够在2.4kb的Prxl启动子的调控下在骨膜细胞中同时表达CreER和GFP基因，从而使得Cre的表达不仅受到Prxl启动子调控，并且含有GFP报告基因，便于进行细胞筛选。一旦经过他莫昔芬的诱导，CreER会转位至细胞核中，并与位于loxP位点之间的基因重组。如果说CreER的表达使得loxP位点之间等位基因的重组得以在时间上被调控，那么GFP报告基因则可通过细胞筛选区分表达转基因的细胞及其他骨膜细胞。通过这种转基因小鼠，他们发现表达Prxl CreER-GFP的细胞同时具有向软骨细胞和［20，21］骨细胞分化的潜能。图2-5 Kawanami等人合成的Prxl CreER-GFP转基因结构
Osx-CreER是通过将Cre-ERT2的融合蛋白cDNA及下游多聚-A(pA)元素克隆至Osterix基因启动子中构建而成的 (图2-6)。将此种可通过他莫昔芬诱导的Osx-CreER转基因小鼠与Rosa26报告小鼠杂交，可用来追踪成骨细胞系不同分化阶段细胞的命运。脉冲追踪研究表明，那些表达Osterix基因的骨细胞始祖细胞，在软骨血管侵入前即分布于骨膜中，并在骨的发育过程向松质骨细胞、成骨细胞及间充质［22］细胞分化。图2-6 Osxl-CreERT2转基因结构
Chen和Long等人通过在特定时间向新生小鼠注射他莫昔芬，得以在其体内表达Osterix基因的细胞中敲除β-catenin基因，并由此证实Osx阳性细胞中的β-catenin基因通过促进成骨细胞活性，抑制成骨细胞代谢，并抑制破骨细胞活性，以及抑制骨髓腔内脂肪的形成，对维［23］持骨稳定具有至关重要的调控作用。五、Sox9-Cre和Sox9-CreER
Sox9-Cre重组载体是由德州大学分子遗传学科的Akiyama及其同［24］事首次合成的。Sox9-Cre小鼠通过将靶载体同源重组于Sox9基因位点而建立。如图2-7所示，靶载体包括一个7.7kb的小鼠内源性［25］Sox9基因片段，与Cre重组酶结构共同嵌入3号外显子非编码区。Cre重组酶结构与内部核糖体进入位点 (IRES)，粒细胞集落因子聚腺苷酸序列 (G-CFSPA)及含有Lox-FRT位点的PGK-NEO基因表达框相融合。图2-7 Sox9-Cre转基因结构，Cre的表达由内源性Sox9启动子区域调控
将Cre小鼠与R26报告小鼠杂交可用于验证Sox9-Cre重组酶的表达。X-gal染色显示，早于ED10.5时，Cre就可在肢芽间质中表达；而ED13.5时，软骨原基和软骨膜的所有细胞均显示阳性表达；ED17时，所有的软骨细胞、软骨膜、骨膜和成骨细胞均有β-gal表达，也即是说，Sox9调控的Cre可表达于软骨和成骨细胞系祖细胞中。此外，肌腱和滑膜中也可显示X-gal阳性染色，说明表达Sox9-Cre的间充质细［24］胞可向肌腱和滑膜细胞分化。
近年来，Sox9-CreER转基因小鼠也相继建立，并且被用来追踪［26］生长早期表达Sox9基因的细胞 (详见 “细胞命运研究”)。六、Ⅱ型胶原α1-Cre（Col2α1-Cre）和Ⅱ型胶原α1-Cre-ER（Col2α1-CreER）
Ⅱ型胶原是软骨形成所需的胞外基质中基本的蛋白质。为达到软骨特异性敲除基因，德州大学分子遗传学科的Ovchinnikov及其同事［27］首次通过原核显微注射构建了Col2αl-Cre小鼠。图2-8显示其靶向结构由3kb小鼠Col2αl启动子区域组成，包括突变起始密码子修饰的第一个外显子 (Exon1)，1号内含子 (Intron1)中与剪接受体及IRES结合的3.02kb片段，Cre重组酶编码区域及SV40大段T抗原聚腺苷酸化序列。哈佛大学的Long及其同事也报道了相似的转基因小鼠合成
［28］方法图2-8 Col2al-Cre转基因结构
转基因小鼠通过Col2αl-Cre重组酶结构构建，并再次通过R26报告小鼠验证Cre的表达。β-gal活性在ED9前就首先于脊索和颅骨间充质中被检测出；ED9.5时，体节和听囊中也可检测到Cre活性；ED11.5时，Cre在颅骨间充质中高量表达；ED14.5时，所有的软骨基质中均显示出β-gal活性。有意思的是，颌下腺等组织显示β-gal非特［29］异性阳性表达，而约有5%的软骨细胞显示为β-gal阴性。迄今为止，Col2αl-Cre小鼠已被用于一系列软骨特异性基因敲除，包括［30］［31］［32］HH、Gsa，以及Ilk等。
美国罗切斯特大学的Chen等人，将Col2αl-Cre进一步与人源雌激素受体的配体结合域融合，从而构建他莫昔芬诱导的Col2αl-CreER小［33］鼠 (图2-9)。Zhu等人将他莫昔芬诱导的Col2αl-CreER小鼠用于研究β-catenin在成年小鼠膝关节软骨面的功能，结果显示，在软骨细胞中特异性地激活β-catenin后，小鼠关节面软骨丢失，软骨下骨呈现新生漩涡状骨沉积；此外，关节处软骨标记因子表达量增高，表明β-catenin的激活加速成熟前软骨细胞分化，并呈现出类似骨性关节炎 ［34］(OA)症状。本实验室利用他莫昔芬诱导的Col2αl-CreER小鼠，在生长发育的不同时期特异性地在软骨内敲除糖皮质激素受体 (GR)，结果表明，各个时期GR的敲除均未使骨和软骨的正常生长发育发生显著改变，而在应急反应中敲除GR则能够影响骨和软骨细胞的生长。例如在胫骨干骺端骨折模型中，和野生型小鼠相比，GR敲除小鼠在骨折愈合早期呈现出更大的软骨骨痂，这些骨痂在骨折愈合晚期［35］并未形成足够成熟的骨性骨痂，因而表现出骨折延缓愈合。图2-9 他莫昔芬诱导的Col2al-CreERT2转基因结构七、X型胶原α1-Cre（Co l10α1-Cre）
软骨细胞分化和软骨形成的另一个广泛研究的标记因子为Ⅹ型胶原，同样为基质胶原蛋白。北京发育和疾病遗传学实验室的Yang及［36］其同事，通过Ⅹ型胶原α1启动子特异性调控 Cre的表达。Coll0αl-Cre重组酶转基因结构包括1.0kb的Coll0αl启动子片段，1.2kb Cre cDNA，以及2.1kb人源生长因子 (hGH)聚腺苷酸化序列 (图2-10)。
R26报告小鼠再次被用作确认Coll0αl-Cre重组酶的表达模式。ED14.5时，Cre在软骨原基及骨骼和皮肤中表达，而肺、肝及其他组织中并没有Cre活性。股骨切片的X-gal染色结果显示，Cre活性仅在软骨肥大层中有表达，而在静息层和生长层中没有表达。由此可见，［36］Coll0αl-Cre重组酶特异性地表达于低层肥大软骨中。图2-10 Coll0αl-Cre转基因结构，长度为4.3kb左右八、Osterix1-Cre和Osx-CreER
在骨相关细胞分化过程中，当成骨细胞祖细胞分化为成熟的成骨［37］细胞时，它的蛋白表达模式也将发生改变。在此分化通路中，有两种特异性的标记因子：Runx2和Osterixl。如图2-11所示，哈佛大学分子细胞生物学科的Stephen J.Rodda和Andrew P. McMahon通过Osterixl启动子转录调控Cre重组酶，合成出Osxl-Cre结构，并将其同［9］源性重组于Osterixl转座子的1号外显子序列中。Cre的表达不仅受到Osterixl启动子调控，并且含有GFP报告基因，便于检测。此外，Cre-GFP结构前还融合有四环素关闭调节编码框 (TETOff)，以便进一步调节Cre表达。
除报告子GFP可被用于验证Osxl-Cre的表达外，R26报告小鼠也被用来通过β-gal活性进一步验证Cre的表达。与预期的Osterixl表达相一致，两种检测方法共同证实Cre可表达于软骨内-膜内骨中。ED14.5的胫骨切片X-gal染色及GFP荧光均显示，在内骨形成软骨膜及零星的肥大化软骨细胞中均可检测到Cre的阳性表达。进一步验证显示，自胚胎发育阶段至新生阶段，Osxl-Cre的活性仅在成骨细胞系中表达［9］
。
Zhou等人利用Cre转基因小鼠研究和N-Myc基因在胚胎骨骼发育各时期中的作用，发现其对于间充质干细胞的增殖及向骨和软骨细胞的分化具有决定性作用。然而在Osxl-Cre小鼠中敲除c-Myc和N-Myc则没有显著变化，说明其主要作用于间充质细胞而非成骨前体细胞［38］。图2-11 Osxl-Cre转基因结构九、I型胶原α1-Cre（Co l1α1-Cre）和I型胶原α1-CreER（Co l1α1-CreER）
为验证类骨质中主要的蛋白质Ⅰ型胶原 (Collαl)的表达模式，Rossert等人将不同长短的小鼠Ⅰ型胶原启动子的片段与βgal报告基因相融合。研究结果表明，小鼠0.9kb的启动子片段可使得β-gal低表达于皮肤中；而小鼠2.3kb的启动子片段，则可使其高表达于成骨细胞及成牙质细胞中；此外，小鼠3.2kb的启动子片段可使得β-gal不仅表达于成骨细胞和成牙质细胞，也可表达于肌腱和韧带纤维细胞中，［39］且在皮肤中也有少量表达。鉴于以上结果，不同的Collαl启动子片段被用于合成不同的Cre重组酶体系中。小鼠3.2kb启动子的靶细胞为间充质前体细胞，而小鼠2.3kb的启动子则以成熟的成骨细胞为靶向细胞。贝勒医学院分子和人类基因学科的Romain等人，将小鼠［40］2.3kb的Collαl启动子片段用于小鼠的转录调控。由启动子片段、Cre重组酶基因和一段褪黑激素-1聚腺苷酸化序列 (MT-1 PA)组成的小鼠2.3kb Collαl-Cre转基因结构，通过原核显微注射被转入小鼠基因组中 (图2-12)。图2-12 小鼠3.2kb和2.3kb Collαl-Cre转基因结构
R26报告小鼠再次被用于2.3kb Collαl-Cre小鼠的验证。ED14.5时的X-gal染色显示Cre可表达于颅骨，以及所有的长骨骨化中心；ED16.5及出生5天后，骨骼系统的所有骨骼中均显示X-gal染色阳性，而其他组织中均为阴性。此外，组织学检测表明，仅成骨细胞呈现阳［40］性染色，而软骨细胞和破骨细胞均为阴性。因此2.3kb Collαl-［41-43］Cre小鼠被广泛应用于分化成熟的成骨细胞基因研究中。
Chen等人在2.3kb Collαl-Cre小鼠中特异性敲除Smadl，结果显示小鼠的BMP信号通路被阻断，成骨细胞的增殖和分化被抑制，骨质［44］减少，说明Smadl对于骨形成具有重要作用。Baek等人则用2.3kb Collαl-Cre小鼠研究Osterix在分化成熟的成骨细胞内的功能，结果表明特异性敲除Osterix可延缓成骨细胞的成熟，导致不成熟成骨细胞的累积，并进而降低成骨细胞的骨形成活性，但并不影响破骨细胞［45］所介导的骨吸收过程。
康涅狄格大学卫生中心的Liu及其同事应用3.6kb或2.3kb大鼠Collαl启动子调控Cre转基因小鼠 (大鼠3.6kb Collαl-Cre，以及大鼠［46］2.3kb Collαl-Cre)(图2-13)。通过R26报告小鼠验证，大鼠3.6kb Collαl-Cre广泛表达于骨缝间质的成骨细胞系细胞中，而大鼠2.3kb Collαl-Cre只表达于颅骨的成熟成骨细胞中，并不表达于骨缝间质中未完全分化成熟的细胞中。因此，大鼠2.3kb Collαl-Cre被用于更为精确的成骨细胞的重组，而大鼠3.6kb Collαl-Cre则被用于相对广泛的间［46］充质细胞重组。大鼠2.3kb和3.6kb Collαl-Cre均已被广泛应用于［41，43，47-50］成骨细胞分化和功能的研究中。图2-13 大鼠3.6kb和2.3kbCol1a1-Cre转基因结构十、骨钙素-Cre（OC-Cre）
骨钙素是成熟成骨细胞分化的重要标记因子，以及矿化和骨形成［22］中至关重要的分泌蛋白。骨钙素仅在成骨细胞分化成熟并具有骨形成功能时产生。迄今已有诸多学者将骨钙素启动子应用于不同的骨钙素-Cre基因结构中，特异性研究成骨细胞功能。
Romain等人通过1.3kb骨钙素基因2号启动子片段调节Cre的表达。R26报告小鼠显示，1.3kb的OG2所调控的Cre仅表达于骨组织中，［40］而人工合成的OG2-Cre则在骨与软骨中均可表达。系列研究结果表明，Cre非特异性地低表达于成骨细胞中，因而不足以用于成骨细胞功能的特异性检测。
辛辛那提大学的 Zhang等人，建立另一种骨钙素 -Cre小鼠［51］。图2-14所示，他们将人源性骨钙素启动子片段、两侧含有兔β-球蛋白外显子小片段的兔β-球蛋白内含子，以及Cre重组酶基因序列相融合。Cre的合成可被β-肌动蛋白未编码区域(β-Actin UTR)终止。图2-14 OC-Cre转基因结构
转基因小鼠通过显微注射Cre转基因结构构建。Cre活性检测显示OC-Cre可表达于颅骨、股骨及脊柱中，而不表达于脑、脂肪、心脏、肝、肾、骨骼、肌肉，或者胃中。定量检测显示，转基因小鼠中Cre可在90%左右的靶细胞中表达，而对照小鼠中则并无表达。ED16时Cre尚未表达于颅骨中，而在ED17和18.5时，则显著表达于骨化中［51］心。进一步研究表明，此人源性OC-Cre可特异性地在成熟成骨细胞中高量表达，因此被广泛应用于分化成熟的成骨细胞基因研究［52］［52］［中，可条件性敲除β-catenin、APC及磷酸酶B153］等。［54］Clemens等人在小鼠中特异性地敲除胰岛素受体 (IR)后，小鼠的骨钙素表达量降低，骨形成活性降低，成骨细胞数量下降，此外，随着年龄的增长，小鼠呈现出明显的外周肥胖，血糖增高，并伴随有严重的葡萄糖不耐受和胰岛素抗性，这些症状可通过补充骨钙素缓解。以上结果表明，通过骨-胰腺内分泌循环，胰岛素可刺激成骨细胞分化及骨钙素的分泌，而骨的活性又可反馈性地调节胰岛素敏感度和胰腺的胰岛素分泌。这正是转基因小鼠模型优势的极好体现：使得研究骨细胞与其他组织细胞之间复杂的相互调控机制成为可能。十一、DMP1-Cre
当成骨细胞被完全包裹于骨基质中时，其表达模式将会发生改变，表现为停止分泌，形成新骨，通过调节其他成骨细胞及破骨细胞［14］而调节骨的形成和吸收。尽管已有研究证实骨细胞在骨形成中的重要调控作用，但因其极难获取及体外培养，其具体功能及其与其他细胞的对话尚不清楚。因此，条件性敲除基因的小鼠体内模型是研究骨细胞功能的最好方式，而DMPl-Cre转基因小鼠正是最合适的小鼠模型。
DMPl是一种在成牙质细胞和骨细胞中特异性表达的基质蛋白［55］。密苏里大学堪萨斯分校的Lu等人合成了牙本质基质蛋白1 ［56］(DMPl)启动子转录调控的Cre小鼠。DMPl-Cre是首次应用于骨细胞基因表达研究的小鼠模型。如图2-15所示，DMPl启动子是由10kb的启动子区域、1号外显子、1号内含子，以及2号外显子的前17个碱基对的非编码区域构成的。此14kb的启动子，经由Cre重组酶cDNA序列融合，被显微注射入小鼠的胚胎中以合成转基因小鼠。图2-15 DMPl-Cre转基因结构
研究表明，将DMPl-Cre小鼠与R26报告小鼠杂交后，股骨X-gal染色显示Cre高表达于6天龄小鼠的骨细胞中；大体染色显示，β-gal基因可表达于2周小鼠的颅骨和长骨中；此外，冰冻切片染色显示，新生小鼠和1月龄小鼠的颅骨和长骨中，Cre仅表达于骨细胞中，而［56］极少表达于成骨细胞中。十二、TRAP-Cre和Ctsk-Cre
破骨细胞是介导骨吸收过程的功能细胞，其活性与血钙浓度的调节紧密相连。当血钙浓度降低时，破骨细胞介导的骨吸收可通过释放［15］钙离子而维持其浓度稳定。临床上破骨细胞活性增高是造成骨质疏松的重要原因，因此抑制破骨细胞的活性也是包括双磷酸盐在内［57］的治疗骨质疏松药物的主要靶向。基于破骨细胞的功能，针对破骨细胞的Cre系统可为进一步研究骨吸收通路提供有效工具。墨尔本大学医学院的Chiu及其同事将两种破骨细胞因子——抗酒石酸盐酸性磷酸酶 (TRAP)和组织蛋白酶K(CtsK)的启动子区域，分别用于破［58］骨细胞特异性Cre的表达。TRAP催化骨吸收中众多酯类和酸酐［59］［60］的水解，而CtsK是分解Ⅰ型胶原的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。
TRAP-Cre和Ctsk-Cre小鼠均通过特异性基因构造的转基因集合而生成。如图2-16所示，TRAP-Cre结构由包括1B外显子和1C外显子在内的TRAP启动子区域片段及Cre cDNA合成。Ctsk-Cre通过pGL3-CK5.0质粒合成，此质粒中CtsK基因启动子-3359 至+1660的核酸序列与Cre cDNA相融合，并通过与TRAP-Cre相似的修饰方法合成Ctsk-［58］Cre。
R26报告被用于对Cre小鼠的验证。Ctsk-Cre小鼠中Cre在长骨、颅骨和肋骨中中度表达，并在包括肝在内的少量非矿化组织中存在低表达，此外长骨的组织学检测显示破骨细胞的X-gal阳性染色，而极少量骨髓细胞的阳性染色表明Ctsk-Cre也表达于破骨细胞的晚期。TRAP-Cre的分析显示出β-gal的高量表达于长骨、脊柱、肋骨和颅骨中，然而在肝和心脏等少数软组织中同样检测出非特异性X-gal阳性染色。此外，组织学结果显示，βgal不仅表达于长骨的破骨细胞中，也表达于生长层和肥大层软骨细胞中。简言之，Cre表达水平因转基因的集成位点而异。Ctsk-Cre能够更特异性地表达于破骨细胞中，而TRAP-Cre表现出更高的Cre表达水平，二者均可在破骨细胞中表达［58］Cre的活性。除此以外，Ferron和Vacher也合成出CDl lb启动子调控的Cre。这些小鼠在骨髓和破骨细胞的分化中表达Cre的活性［61］。
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