作者：尹昌喜 著
出版社：化学工业出版社
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CMS水稻包穗及不良开花习性的激素调控试读：
前言
前 言杂交水稻的推广应用为我国粮食安全作出了重大贡献。1964年袁隆平提出杂交水稻育种理论，开启了我国杂交水稻的研究历程。1970年李必湖在海南三亚普通野生稻中发现花粉败育型雄性不育［1］株，即野败不育株。通过回交于1972年育成珍汕97、二九南1号、V20、V41等细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile，CMS）系和保持系。1973年实现野败型CMS系、保持系和恢复系三系配套，并配组了一批野败型杂交水稻组合，如南优2号、汕优2号、汕优6号等。由于杂交稻具有杂种优势，杂交稻在大面积种植中表现出强大的产量［1］优势，其推广面积迅速扩大，1976年达到208万亩（1亩2=667m）。从1976 年至2013年，全国累计种植杂交水稻5.3162亿公2［2］顷（1公顷=10000m）。2012年，杂交水稻年种植面积超过0.16 亿公顷，约占水稻总种植面积的57%，而产量约占水稻总产量的65%。杂交稻一般比常规稻增产15%～20%，在当前耕地逐年减少的情况下，推广种植杂交稻对解决我国的粮食需求问题发挥了极其重要［3］的作用。
然而，CMS水稻普遍存在包穗和开花习性不良问题。包穗是指倒一节间（最上节间）伸长不足而导致穗子不能完全抽出倒一叶的叶［4］鞘；包穗致使很多颖花不能接受父本的花粉，严重降低了杂交水稻的制种产量。目前，生产上主要通过喷施“九二〇”来解除CMS水稻的包穗问题，“九二〇”的主要成分是赤霉素A（gibberellin 3A，GA），大量施用“九二〇”不但增加杂交稻制种成本，而且还33会加剧环境与稻米的污染以及降低种子质量，特别是在雨水多的年份，喷施“九二〇”容易引起倒伏和穗发芽。开花习性不良是指CMS水稻花时分散、开花高峰不明显、午前开花率低，而雄性可育的恢复系水稻开花习性良好（花时集中、开花高峰明显、午前开花率［5］高），这就引起杂交水稻父母本“花时不遇”。“花时不遇”会显著降低杂交水稻的制种产量和制种效益。
CMS水稻包穗和开花习性不良问题限制了杂交稻的发展。随着工业化、城镇化的深入推进，农村劳动力短缺，劳动工价提高，杂交水稻制种成本不断攀升。杂交水稻制种成本的增加必然会导致农民水稻种植成本的增加，当前杂交水稻种子均价是常规水稻种子均价的五倍以上，种植杂交水稻用种成本显著高于种植常规水稻用种成本［6］
。杂交水稻制种主要通过“三系法”和“两系法”进行，虽然“两系法”制种发展势头良好，但目前“三系法”制种仍然占有重要地位。在“三系法”制种中，CMS水稻花粉败育越早，其包穗和开花习性不良问题越严重，制种产量及制种效益就越低。可见，CMS水稻的包穗和开花习性不良问题导致杂交水稻制种产量和制种效益低，推高了杂交水稻种子价格，限制了杂交水稻的发展。
植物激素在植物生长发育过程中具有重要的调控作用。植物激素（plant hormone）是指在植物体内合成的、并能从产生之处运输到作用部位、对植物的生长发育产生显著调节作用的微量有机物。植物激-6素的含量通常在10g/g鲜重甚至更低，只相当于植物鲜重的百万分［7］之一甚至更少。可见，植物激素的功能非常强大。20世纪末，［8］美国科学院院士Hans Kende和Jan Zeevaart等将早期发现的生长素（auxin）、赤霉素（gibberellin，GA）、细胞分裂素（cytokinin，CTK）、脱落酸（abscisic acid，ABA）和乙烯（ethylene，ETH）统称为“经典”的五大类植物激素。1998年，在国际植物生长物质学会第十六届大会上增加了三类植物激素，它们分别是油菜素甾醇（brassinosteroid，BR）、茉莉酸类（jasmonates，JAs）和水杨酸［6］（salicylate，SA）。近年来，独脚金内酯（strigolactone，SL）［7， 9］亦被提名为植物激素。通过研究植物激素合成突变体、信号转导突变体、外源激素及其抑制剂处理对植物生长发育的影响及其影响机制，证实了植物激素在茎伸长生长、花器官发育、开花、叶片衰［7， 老、种子成熟与休眠、根系生长等过程中具有重要的调控作用9］。
本书阐述了植物激素对CMS水稻包穗及不良开花习性的调控作用及其机理。为了揭示CMS水稻包穗和不良开花习性的机理，广于应用的珍汕97A被选为CMS水稻的代表材料，珍汕97A存在严重的包穗和开花习性不良问题。研究结果表明：①雄性器官的正常发育是水稻倒一节间伸长生长所必需的，发育正常的稻穗能合成吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）并运输至倒一节间，穗源IAA能促进倒一节间中活性赤霉素A（gibberellin A，GA）的合成、抑制GA的降1111解，进而通过维持较高的GA含量来促进倒一节间伸长生长；CMS水1稻雄性器官败育后，穗中亏缺IAA并减少向倒一节间输送IAA，导致倒一节间亏缺IAA，进而引起倒一节间中GA亏缺，导致倒一节间伸1长不足而产生包穗。②浆片吸水膨大是水稻颖花开放的主要动力，茉莉酸（jasmonic acid，JA）通过促进水稻浆片积累渗透调节物质来促进浆片吸水膨大，进而促进水稻颖花开放；CMS水稻浆片中JA合成的关键酶基因OsAOC表达受阻导致浆片JA亏缺，浆片JA亏缺通过抑制渗透调节物质在浆片中积累、抑制浆片吸水膨大，进而引起CMS水稻开花习性不良。在揭示CMS水稻包穗及不良开花习性机理的基础上，有望通过品种遗传改良或借助外源调控措施安全高效地解除CMS水稻的包穗和开花习性不良问题，进而提高杂交水稻制种产量和制种效益、降低杂交水稻种子价格、促进杂交水稻发展、保障我国粮食安全。因此，该领域的研究及宣传工作具有重要的科学意义和广阔的应用前景。
本书围绕CMS水稻包穗和开花习性不良问题展开论述，结合笔者的科研成果，全面系统地介绍了植物激素对CMS水稻包穗及不良开花习性的调控作用及其机理。本书以杂交水稻制种过程存在的问题作为选题背景，具有针对性、系统性、新颖性和实用性等特点。本书主要面向农学、生物等相关专业的学生（本科生、研究生）、科研院所相关专业的教学或科研人员、杂交水稻制种单位的工作人员等。希望本书的出版能让更多的人了解杂交水稻制种中存在的问题，为更好地解决杂交水稻制种中存在的问题提供理论指导和技术服务，从而促进杂交水稻的发展、保障我国粮食安全。
尹昌喜
2018年5月于湖北武汉参 考 文 献
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1970年，野败（wild abortive，WA）雄性不育水稻的发现，掀开了“三系法”杂交水稻育种的辉煌篇章，1973年利用野败的细胞质雄性不育野生水稻作为不育细胞质源，育成了我国第一个“三系”籼［1］型不育系 “二九南1号A”。随后，一系列的细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile，CMS）系培育成功，实现了三系配套，攻克了繁种、制种难关，杂交水稻于1976年正式投入大面积推广［2］
，之后迅猛发展，使我国的粮食生产出现了一个重大飞跃。杂交［3］水稻一般比常规良种增产15%～20%。因此，杂交水稻的推广应用，为解决广大人民的温饱问题作出了重大贡献。［4，5］
然而，目前生产上应用的CMS水稻普遍存在包穗现象，包穗是指水稻倒一节间（最上节间）伸长不足而导致水稻穗子不能完全抽出倒一叶的叶鞘。包穗使得水稻的很多颖花不能接受父本的花粉，因此严重地降低了杂交水稻制种产量。在杂交水稻繁殖、制种过程中，外源赤霉素的施用一般能解除包穗问题，这说明细胞质雄性不育水稻包穗可能是由于缺乏具有生物活性的赤霉素引起的。在20世纪30年［6］代，赤霉素的发现始于对水稻叶片、叶鞘及节间伸长的促进作用。［7～10］随后，很多试验结果都表明赤霉素是茎伸长生长的控制因子。外源赤霉素能促进CMS水稻倒一节间伸长生长，从而能解除包穗。［11］
在笔者发文之前，人们对CMS水稻花粉败育与其倒一节间缩短产生包穗的关系还不清楚。如果是因为缺乏活性赤霉素导致倒一节间缩短产生包穗的话，那么倒一节间为什么会缺乏活性赤霉素？是赤霉素的合成减少了还是活性赤霉素的钝化加强了？
研究表明，吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是植物茎合［12～14］成赤霉素所必需的。在豌豆茎中，IAA能够通过促进赤霉素［15］合成步骤GA → GA的转化，从而促进赤霉素的合成；而在烟201草中，IAA则通过促进赤霉素合成步骤GA → GA的转化从而促进1920［16］赤霉素的合成。那么，在CMS水稻中，是因为倒一节间缺乏IAA导致赤霉素合成减少产生包穗的吗？在水稻中，IAA是通过调控赤霉素合成的哪个步骤来调控赤霉素含量的呢？如果是因为倒一节间缺乏 IAA 导致赤霉素合成减少产生包穗的话，那么，CMS 水稻花粉败育是通过什么途径导致其倒一节间缺乏 IAA 的呢？水稻穗的发育和倒一节间伸长生长到底存在什么关系呢？
在杂交水稻种子生产中，主要通过喷施“九二○”来解除CMS水稻的包穗问题，“九二○”的主要成分是赤霉素A（gibberelin A，33GA），大量施用“九二○”不但增加杂交水稻制种成本，而且还会加3剧环境与稻米的污染以及降低种子质量，特别是在雨水多的年份，喷［1］施“九二○”容易引起倒伏和穗发芽。笔者发文之前，穗发育调控倒一节间伸长生长的机制还不清楚，CMS 水稻包穗机制没有得到很好的阐述。如果能搞清包穗的真正原因，那将有望能寻找到比较好的方法去解除包穗问题，从而可以降低繁种、制种成本，提高水稻杂交种的质量。
珍汕97A（Zhenshan 97A，ZS97A）是杂交稻繁种、制种中应用比较广泛的细胞质雄性不育系。ZS97A 是由江西萍乡农科所1971年用长江流域迟熟早籼珍汕97（Zhenshan 97B，ZS97B）作父本与［17］“野败”杂交，经过连续回交于1973年育成。ZS97A和ZS97B具有相同的细胞核不同的细胞质，它们在营养生长期表型上几乎没有差异，但是到了抽穗期，ZS97A倒一节间伸长严重受阻引起包穗，而ZS97B的倒一节间能够正常伸长并把穗子推出倒一叶的叶鞘。
基于上述研究的历史和现状，带着上面提出的问题，笔者以广于应用的 CMS 水稻珍汕97A（ZS97A）及其保持系珍汕97B（ZS97B）作为实验材料，比较分析了不育系和保持系在幼穗分化、节间伸长等过程中存在的差异，并从生理和分子水平对包穗进行了研究。以期在理论上对包穗机制进行阐述，在农业生产实践上从分子和生理水平解除包穗或者为研制能安全高效解除包穗的复配剂提供科学依据。参 考 文 献
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［17］ 袁隆平，陈烘新.杂交水稻育种栽培学.长沙：湖南科学技术出版社，1988：79.第二章 植物激素及其对植物茎伸长生长的调控
控制植物茎伸长生长最重要的组织是顶端分生组织和近顶端分生组织。前者控制后者的活性，而后者的细胞分裂和伸长决定茎的生长速率。茎由节和节间组成，节通常不伸长。节间伸长部位则根据植物种类而定，有均匀分布于节间的，有在节间中部的，也有在节间基部的。禾谷类植物的近顶端分生组织包括居间分生组织和中央空隙，禾谷类植物茎秆伸长是由居间分生组织不断分裂产生新的细胞以及伸长区细胞伸长引起的。
植物激素（plant hormone）是指在植物体内合成的、并能从产生之处运输到作用部位、对植物的生长发育产生显著调节作用的微量［1］有机物。在茎的伸长生长过程中，赤霉素、生长素、乙烯等植物［2～激素都具有调控作用。资料表明：赤霉素既能促进细胞分裂4］［4， 5］，还能促进细胞伸长，从而促进茎的伸长；生长素不但能［6， 7］［8， 9］［10］够促进细胞伸长、RNA和蛋白质的合成，还能［11～14］通过促进赤霉素的合成，从而促进茎的伸长。在深水水稻［15］上研究表明，乙烯能够通过提高茎秆响应赤霉素的能力，从而促进节间伸长。第一节 赤霉素及其对植物茎伸长生长的调控
赤霉素（gibberellin，GA）调控植物体生长发育的许多进程，如［16］［17］［18］种子的萌发、叶片的扩展、茎的伸长、开花以及果［19］实发育等。GA对高等植物最突出的作用是在很低的浓度下就可以刺激茎的伸长生长，使植株明显增高，但并不改变节间数目。在一定浓度范围内，随处理浓度的增加，刺激生长的效应也增强。研究发现，赤霉素促进植物生长的主要原因，是由于它能明显促进细胞的分裂和伸长。研究表明，GA缺失突变体和GA不敏感突变体在植株生长上都受到影响，这些突变体植株伸长生长都受到抑制，植株表现出不［20， 21］同程度的矮化。一、赤霉素的生物合成
1.赤霉素前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生物合成
甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）是水稻和其它高等植物中GA［22］生物合成的最初前体。甲羟戊酸是乙酸被乙酸硫激酶激活形成［23］乙酰-CoA，经硫解酶的催化，两个乙酰-CoA分子发生缩合反应生成乙酰乙酰-CoA，在3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA合酶和3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA还原酶的作用下形成3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA和产物［24］MVA。MVA经过加磷酸基团反应和脱羧反应形成异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）；IPP在IPP异构酶的作用下可逆异构化形成二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），它与一个IPP分子在牻牛儿基焦磷酸合酶催化下，头尾相连形成C 中间产物牻牛儿基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，10GPP），后者与另一个IPP分子缩合为法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP），并进一步与第3个IPP分子在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的作用下缩合为C 中间产物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸20（trans-geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）。也有人认为3-磷酸［25］甘油醛/丙酮酸盐是赤霉素合成最初前体，因为某些藻类以及高等植物可以将3-磷酸甘油醛或者丙酮酸盐转化成异戊烯焦磷酸［26， 27］（IPP），这一途径主要存在于质体中，它与甲羟戊酸途径的不同点在于IPP的形成方式不同。在叶绿体中，IPP是由丙酮酸在转酮酶的作用下，提供二碳单位给甘油醛-3-磷酸而形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，再经分子重排形成IPP或DMAPP。从IPP 到GGPP的合成甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径是一样的。
2.赤霉素生物合成的三个阶段
如图2.1所示，根据反应类型和酶的种类，可将GA的生物合成主［28～31］要分成3个阶段 。［31］图2.1 赤霉素合成途径
第一阶段， GGPP合成内根-贝壳杉烯（ent-kaurene）。这些反应是在前质体中进行的，有关的酶是可溶性的酶，不与膜结合。在古巴焦磷酸合成酶（ent-copalyl pyrophosphate synthase，CPS）的催化下，GGPP环化形成古巴焦磷酸（ent-copalyl pyrophosphate，CPP），后者在内根-贝壳杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）催化下环化成为赤霉素的前身——内根-贝壳杉烯。
第二阶段，内根-贝壳杉烯氧化为 GA-醛（GA-aldehyde）。1212这些反应是由与微粒体膜结合的依赖细胞色素P450的单加氧酶（monooxygenase）催化的，需要O和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸2（NADPH）。内根-贝壳杉烯转化为内根-贝壳杉烯醇（ent-kaurenol）、内根-贝壳杉烯醛（ent-kaurenal）、内根-贝壳杉烯酸（ent-kaurenoic acid）、内根-7α-羟-贝壳杉烯酸（ent-7α-hydroxykaurenoic acid）再到GA-醛。12
第三阶段，GA-醛进一步氧化为不同的GA。首先把GA-醛的1212C-7醛基氧化成羧基，成为GA，再将C-20的甲基氧化成羟甲基，成12为GA。GA和GA在GA 20-氧化酶（GA 20-oxidase）和GA 3-氧535312化酶（GA 3-oxidase）作用下，分别形成有生物活性的GA和GA。14它们在GA 2β-羟化酶（GA 2β-hydroxylase）的作用下，转变为无生物活性的GA和GA。这3种酶都是双加氧酶（dioxygenase），需要8342-酮戊二酸（2-oxoglutaric acid）和氧分子作为辅底物2+（cosubstrate），Fe和抗坏血酸为辅因子（cofactor）。与此同时，GA和GA也会转化为各种GA。5312二、赤霉素代谢对植物茎伸长生长的调控
1.赤霉素合成受阻抑制植物茎伸长生长［32］
如图2.2所示，已经有很多赤霉素合成突变体被筛选鉴定出来了。这些突变体共同的特点是：内赤霉素合成途径中的基因发生了突变，导致赤霉素合成受阻，因而体内活性赤霉素的含量降低，从而抑制了植株的生长，导致植株表现出不同程度的矮化。［32］图2.2 赤霉素合成突变体以及合成受阻的步骤
GA1基因所编码的ent-kaurene synthetase A酶能够催化GGPP→CPP的转化，GGPP→CPP的转化是植物体合成赤霉素第一个关键的步骤。GA1基因发生突变产生了一些赤霉素缺失型的拟南芥突变体［33］（表2.1），这些突变体内赤霉素的合成在GGPP→CPP步骤被阻断，植株体内严重亏缺赤霉素导致矮化；但是，它们都能够响应外源的赤霉素。ga1-3是ga1突变体的一种，ga1-3因为亏缺赤霉素导致［34］植株不能正常生长。不过，利用在野生型拟南芥中克隆到的［33］GA1 cDNA转入到ga1突变体中能够恢复其矮化表型。
ga2是赤霉素缺失型的拟南芥突变体，该突变体中KS缺乏活性。KS是催化CPP→ ent-kaurene的关键酶。ga2突变体缺乏KS活性导致赤霉素合成在CPP → ent-kaurene被阻断，导致ga2突变体内缺乏赤霉素，从而引起植株矮化。然而，利用在南瓜（Cucurbita maxima）中克隆到的CmKS cDNA转入到ga2突变体中能够恢复该突变体的矮［35］化表型。
GA3基因编码ent-kaurene oxidase（KO），KO是催化赤霉素合成［36］ent-kaurene → ent-kaurenoic acid。ga3 是GA3 基因突变产生的拟南芥缺失型突变体，该突变体也因为赤霉素合成受阻导致体内赤霉素含量降低、植株矮化。ent-kaurene synthetase A、KS 和 KO 分别由GA1、GA2和 GA3三个单独的基因编码，这三个基因突变后分别产生的突变体 ga1、ga2和ga3的赤霉素合成严重受阻，导致内源赤霉素含量很低，从而引起植株矮化。不过，GA4和GA5基因突变所产生的拟南芥突变体（ga4和 ga5）仅仅表现为半矮化。GA4 和 GA5 能够分别编码GA 3-oxidase和GA 20-oxidase，但是GA 3-oxidase和GA 20-oxidase 都是分别由好几个GA3ox基因和 GA20ox基因共同表达的产物，所以即使GA4和GA5 基因突变了，其余几个GA3ox基因和GA20ox基因的表达能够部分地弥补GA 3-oxidase和GA 20-oxidase的
［37］活性。因此，ga4和ga5体内有部分赤霉素的合成，所以植株表现出半矮化。［33］表2.1 拟南芥ga1 突变体的突变情况注：下划线表示每个突变体中的碱基替换。
上面介绍的是赤霉素合成受阻的拟南芥突变体。此外，在其它植物体中也发现了很多赤霉素合成受阻的突变体（图 2.2）。这些突变体都表明：赤霉素合成途径中某些步骤受阻会导致植株伸长生长受阻，外源赤霉素处理能够促进这些突变体伸长生长。因此，赤霉素是植物伸长生长所必需的。
2.赤霉素过量合成促进植物茎的伸长生长
在植物体中，催化赤霉素合成的一些关键酶活性升高会引起植物［38］体大量合成赤霉素，从而促进植物体高度伸长。Huang等报道：GA 20-oxidase 是催化赤霉素合成的关键酶，在插入一个cDNA片段（该片段能够高度表达GA 20-oxidase）的转基因拟南芥中发现活性GA含量显著升高，GA的大量合成促使转基因植株高度伸长，导11致转基因植株最终的高度是其对照的3倍多。
3.活性赤霉素钝化减弱促进植物茎的伸长生长
内源活性赤霉素的含量不但受控于赤霉素的生物合成，还受控于活性赤霉素的异化作用（活性赤霉素的钝化）。水稻 ELONGATED UPPERMOST INTERNODE（EUI）基因能够编码细胞色素P450单加氧酶，而细胞色素P450单加氧酶能够催化活性赤霉素环氧化，从而促使活性赤霉素发生钝化。在野生型水稻植株中，赤霉素的生物合成与其钝化作用存在着一定的平衡关系，因而植株中活性赤霉素的含量［39］维持在一个能够调控植株正常生长的水平。然而，Zhu 等指出：在突变体eui植株中，因为活性赤霉素钝化受阻导致活性赤霉素的含量显著高于野生型。正常水稻倒一节间中活性GA含量很低，用 GC-4MS 方法没能测出 GA 的含量；然而，在eui突变体中活性 GA的含44量极高，而且eui突变体中活性GA的含量也显著高于野生型。因1此，eui突变体植株显著伸长，eui突变体倒一节间长度高达野生型倒一节间长度的2倍左右。在EUI 高度表达的转基因植株EUI-OX中，活性赤霉素钝化作用极强，使得EUI-OX植株中活性赤霉素含量极低，导致了EUI-OX植株伸长生长严重受阻，从而引起矮化。
4.活性赤霉素钝化加强导致植物茎的伸长生长受阻
GA 2-oxidase（GA2ox）能够调控植物活性赤霉素向非活性赤霉素（GA→GA，GA → GA）的转化。GA2ox 在调控植物体内源43418活性赤霉素含量中起了很重要的作用，GA2ox 表达水平升高会引起活性赤霉素钝化的加强，从而降低活性赤霉素的含量。Schomburg ［40］等试验表明：在正常的拟南芥植株中AtGA2ox7和AtGA2ox8几乎都不表达；然而在AtGA2ox7和AtGA2ox8被激活表达的突变体AtGA2ox7 和 AtGA2ox8中，赤霉素钝化作用得到了加强，导ACTACT致突变体AtGA2ox7 和 AtGA2ox8的伸长生长受阻，从而引起ACTACT植株矮化。转了AtGA2ox7和AtGA2ox8的转基因植株也因为内源活性赤霉素钝化的加强产生矮化现象。
此外，与野生型水稻相比，携带Act：OsGA2ox1的转基因水稻中活性赤霉素GA的含量降低了75%，而GA的含量是野生型的2.5倍。18GA是水稻营养生长的控制因子，因此携带Act：OsGA2ox1的转基因1水稻由于GA钝化作用的加强而引起GA的亏缺，从而导致植株伸长11［41］生长严重受阻产生矮化表型。三、赤霉素信号转导对植物茎伸长生长的调控
植物体内存在赤霉素信号传递网络。赤霉素受体感知GA信号后，激活信号传递通道中的各基因表达，从而调控植株的生长发育。当编码这些信号因子的基因或者是它们所识别的顺式作用位点发生突变时，其下游基因的表达和相关蛋白间的相互作用就会发生相应的变化，从而导致植物对GA的响应发生改变。近年来，随着对模式植物拟南芥和水稻基因组的测序及其突变体的大规模筛选，人们对赤霉素信号转导途径有了更深入的了解。（一）赤霉素信号转导途径主要组分及其调控功能
1. DELLA蛋白
在模式植物拟南芥中，隐性的功能缺失突变体gai和rga能够部分地恢复赤霉素缺失突变体以及赤霉素抑制剂处理的植株所引起的缺乏［42， 43］赤霉素的表型。GAI 和 RGA 具有很高的同源性，它们都是核内的转录调控因子。在拟南芥中发现了5个 GAI/RGA 相关基因，它［44， 45］们是GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3 。研究表明，GAI、RGA、RGL1、RGL2都是赤霉素信号转导负调控因子，目前 ［46］RGL3的功能还不清楚。
在拟南芥中，GAI、RGA 以及类似的同源蛋白被称为 DELLA蛋白，DELLA 蛋白是属于GRAS家族的成员，可能是转录抑制子，它们［46， 都具有N-端的 DELLA 域、中部的 VHIID 区和 C 端的 RVER 域47］。DELLA 蛋白是GA信号转导阻遏物，RGA 和 GAI 可单独或共同调节 GA 信号转导。在GA 诱导的 DELLA 蛋白转录后磷酸化修饰中 DELLA 域可能起着重要作用。
具有生物活性的 GA 是通过削弱 DELLA 蛋白的抑制作用来调控植物的生长发育的。DELLA 功能缺失突变体可抑制赤霉素缺失突变［48］体 ga1-3 的表型。gai-1 突变体是一种表型为 GA 不敏感的矮小个体。gai-1显性等位基因缺失了包括一个开放阅读框在内的51个碱基，可能编码一个 gai-1 突变蛋白，该蛋白产物在保守的 DELLA 区［42］中少了17个氨基酸。含有 rga-Δ17 或 rgl1的转基因植物编码的 rga 或 rgl1 蛋白可能在高度保守的 DELLA 域中都缺少17个氨基酸，［49， 50］并表现出 GA 不敏感性矮化。实验表明，GA 是通过可诱导野生型拟南芥 GAI 和 RGA 蛋白快速降解，使得响应 GA 的一些基因［51］得以表达，从而完成 GA 对植物生长发育的调节作用。［52］
在水稻上，Ikeda 等报道了SLR1 功能完全缺失突变体 slr1-1具有组成型响应赤霉素的表型，SLR1基因和GAI/RGB/RHT/D18 具有很高的同源性。目前为止，SLR1蛋白是在水稻中已经报道的唯一的 DELLA 蛋白。虽然slr1-1突变体内活性赤霉素含量很低，对赤霉素也不敏感，但植株却高度伸长；赤霉素抑制剂烯效唑（uniconazole）不能抑制slr1-1突变体的生长。SLY1
2. SCF E3 Ub 复合体
SLY1 蛋白是一个含有151个氨基酸的 F-BOX 蛋白，其 N-端有 F-［53］box 基序。在sly1 突变体中，RGA 的蛋白水平都显著提高，而且外源赤霉素处理不能诱导sly1 突变体中 RGA 蛋白的降解，从而导致植株伸长严重受阻；然而外源 GA 处理能够促使 RGA 蛋白的降解SLY1（图2.3），从而促进植株伸长。SLY1 已经被假定为SCF 复合物的一部分，GA信号刺激能够促使 SLY1 和 DELLA 蛋白识别并结合，而且能够直接相互作用，这个过程是通过 DELLA 蛋白的C-端 GRAS ［54， 55］结构域所介导。SLY1 在 DELLA 蛋白的降解过程中起了很重要的作用。rga 和gai 的等位基因共同突变后，可完全抑制 sly1的［53， 55］矮化表型。三重突变体（sly1/rga/gai）能生长，但花发育不正常，说明 SLY1 在 GA 诱导 RGL 蛋白的降解中也起作用。酵母双杂交实验表明，SLY1 与 RGA 能够直接相互作用，SLY1 能够把 SLY1DELLA 蛋白募集到SCF E3 Ub 复合体上，进而降解它；酵母双［55］杂交实验也表明 GAI 具有与 SLY1 相互作用的结构域，但 DELLA 域并不是 GAI/RGA 与 SLY1 相互作用的必需基团，酵母中 GAI 的 GRAS 域单独就可以和 SLY1 作用。［53］图2.3 sly1突变体不响应GA（二）赤霉素信号转导途径［33］［34］
Sun和 Thomas已经在拟南芥上提出 GA 信号转导模型（图2.4）。DELLA 基因（GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3），可能是下游的 GA 应答基因的关键抑制子。在拟南芥中，DELLA 蛋白在调控 GA 介导的植物生长发育各方面都起着重要作用。具有生物活性的 GA 被一个假定的原生质膜上的受体所感知，进而引起信号级联反应。在水稻上研究发现，信号级联反应的早期阶段涉及DELLA 蛋白磷酸化激酶的激活以及翻译后的一些修饰过程。DELLA 域被推SLY1测在感知 GA 信号过程中起作用。随后，SCF E3 Ub 复合体通过 GRAS 域的 SLY1 亚基识别并连接被修饰过的 DELLA 蛋白，很多SLY1的 DELLA 蛋白被募集到 SCF E3 Ub 复合体上就形成 DELLA 的遍在蛋白多聚体，这些多聚体能够被26S蛋白酶体识别并降解。DELLA 蛋白水平的降低允许下游一些基因的表达，进而植株响应 GA 促进生长发育。［46］图2.4 拟南芥植株中GA信号转导模式四、赤霉素促进植物茎伸长生长的机制
植物茎的伸长源于细胞数目的增加和细胞伸长。赤霉素能够显著地促进植物茎的伸长可能与增加细胞分裂、促进细胞壁松弛和增加细胞渗透吸水有关。（一）赤霉素促进细胞分裂［2～4］［56］
研究表明，赤霉素能够促进细胞分裂。Bleecker 等报道，赤霉素或淹水处理能使深水稻最上节间居间分生组织的细胞分裂周期从24h缩短到7h，加快了新的细胞产生的速率，从而使得细胞［57］数目比对照增加2倍。随后，Lorbiecke 和Sauter的试验表明：在细胞分裂间期1（G1）向DNA合成期（S）过渡阶段，赤霉素或淹水处理能够诱导cdc2Os-2（一种细胞周期蛋白基因）和Histone H3（一种组蛋白基因）的表达；在细胞分裂间期2，赤霉素或淹水处理能够提高细胞周期蛋白基因cycOs1和cycOs2的转录水平。（二）赤霉素促进细胞伸长
1.赤霉素促进微管与细胞长轴呈垂直排列
植物细胞壁的主要组成是纤维素，呈晶形微纤丝，这种微纤丝无伸展性，所以，当微纤丝与细胞伸长的方向平行时就会抑制细胞伸长；当微纤丝与细胞伸长的方向垂直时细胞就存在伸长的潜力。研究表明，微纤丝在细胞壁中的取向由分布于质膜内侧的微管的排列方向所控制，并与微管的排列方向平行；GA处理能够促使微管的排列方向与［58］生长着的细胞长轴垂直，从而有利于细胞伸长。
2.赤霉素提高木葡萄糖内转葡萄糖基酶的活性
木葡萄糖类（xyloglucans）是植物初生壁的主要成分之一。木葡萄糖除了受纤维素酶催化外，还受木葡萄糖内转糖基酶（xyloglucanen-dotransglycosylase，XET）作用。研究表明XET可以使木葡萄糖产生内转基作用，把木葡萄糖切开并重新形成另一个木葡［59］萄糖分子，再排列为木葡萄糖-纤维素网，从而使细胞壁延长。［60］GA 能显著提高XET 的活性。 在水稻上已经报道了4种 XET 相关基因（OsXTR1、OsXTR2、OsXTR3、OsXTR4），其中OsXTR1和［61］［61］OsXTR3主要在节间伸长区表达。Uozu 等实验结果显示：水稻矮秆突变体（Akibare D 和 Waito C）节间中OsXTR1、OsXTR3mRNA水平很低，而OsXTR2、OsXTR4 mRNA水平和野生型几乎没有差异；外源GA处理能够提高这两种突变体节间中3OsXTR1、OsXTR3表达水平，并使它们的 mRNA 水平接近野生型，从而促进节间细胞伸长、促进矮秆突变体节间伸长，这一结果说明了GA是通过提高XET相关基因的转录水平促进细胞伸长的。3
3.赤霉素诱导膨胀素的产生并增加其活性
膨胀素（expansin）能够通过断裂细胞壁多聚体间（如微纤丝和半纤维素间）的非离子键，引起细胞壁松弛从而促进细胞伸长。已有［62］充分证据表明膨胀素是促进细胞伸长的关键因子。研究表明［62， 63］，外源GA处理能够促进水稻节间中膨胀素基因Os-EXP4 mRNA 的积累，随后节间细胞迅速伸长引起节间伸长，这一结果说明外源GA促进细胞伸长是通过诱导膨胀素的产生并增加其活性来实现的。第二节 生长素及其对植物茎伸长生长的调控
生长素（auxin）参与了植物体许多生理生化过程的调节与控制，具有十分广泛的生理作用。从细胞水平看，它可以影响细胞的伸长、分裂和分化；从器官水平看，它可以影响营养器官和生殖器官的［64］生长、成熟和衰老。一、生长素的代谢（一）生长素的生物合成
天然植物生长素的主要活性形式是吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）。植物可以通过依赖于色氨酸的途径或者非依赖于色氨［65］酸的途径合成IAA 。尽管目前对非依赖于色氨酸IAA合成途径的了解十分有限，尚未分离出该途径中的重要基因，但是，早期研究结［66～69］果暗示了植物可以利用色氨酸的前体分子合成IAA。如图2.5［70， 71］所示，依赖于色氨酸的途径可以分为以下几条支路。［70］图2.5 IAA合成途径
1.吲哚-3-丙酮酸途径
色氨酸通过转氨作用，形成吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvate）再脱羧形成吲哚-3-乙醛（indole acetaldehyde），后者经过脱氢变成吲哚-3-乙酸。许多高等植物组织和组织匀浆提取物中都发现上述各步骤的酶，特别是将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的色氨酸转氨酶。
2.色胺途径
色氨酸脱羧形成色胺（tryptamine），再氧化转氨形成吲哚-3-乙醛，最后形成吲哚-3-乙酸。
3.吲哚-3-乙醛肟途径
由吲哚-3-乙醛肟（indole-3-acetaldoxime，IAO）经中间产物吲哚-3-乙腈合成吲哚-3-乙酸的合成系统。高等植物都含有与上述合成［64］系统有关的酶系。如加中间产物，很快即转变为吲哚-3-乙酸。
4.吲哚-3-乙酰胺途径
在拟南芥中过量表达细菌生长素合成基因iaaM后，植物可以利用水解酶（hydrolase）将吲哚-3-乙酰胺（indole-3-acetamide，IAM）［72］转变为IAA。（二）生长素的结合与降解
植物体内具活性的生长素浓度一般都保持在最适范围内，对于多余的生长素，植物一般是通过结合（钝化）和降解进行自动调控的。
1.束缚态和游离态生长素
植物体内的IAA可与细胞内的糖、氨基酸等结合而形成束缚态生长素（bound auxin），反之，没有与其它分子以共价键结合的易从植物中提取的生长素叫游离态生长素（free auxin）。束缚态生长素是生长素的贮藏或钝化形式，束缚态生长素无生理活性，在植物体内的运输也没有极性，当束缚态生长素再度水解成游离态生长素时，又表现出生物活性和极性运输。
2.生长素的降解
在植物体内，生长素在不断地合成，同时也在不断地被降解破坏。［64］生长素的降解可分为酶氧化和光氧化两种类型。酶氧化是IAA的主要降解方式，可分为脱羧降解和不脱羧降解。脱羧降解是由IAA氧化酶催化的，是一种过氧化物酶，是含铁的血红蛋白，它需要两个辅2+基：Mn 和单元酚（如香豆酸、阿魏酸等）。在IAA氧化酶催化下，IAA侧链被氧化脱羧，产物除了CO外，还有羧基吲哚衍生物（3-亚2甲基氧吲哚、3-羟甲基氧吲哚等）以及吲哚醛。在不脱羧降解途径中，IAA的羧基没有脱去，但是杂环中的C-2被氧化而形成氧化吲哚-3-乙酸。
光氧化与酶氧化的反应不同。体外的吲哚-3-乙酸在核黄素催化下，可被光氧化，每降解一分子的吲哚-3-乙酸吸收一分子氧，产物与酶氧化产物（亚甲基氧吲哚和吲哚醛）相同。二、生长素对植物茎伸长生长的调控
生长素是最早被发现的一种植物激素，生长素在调控植物生长过程中起着很重要的作用。很多研究结果指出，生长素在调节细胞扩张［6，7］中能够增加细胞壁的伸展性。细胞壁的伸展有弹性（elasticity）及塑性（plasticity）两方面，弹性是可逆的，而塑性则是不可逆的。生长素与赤霉素都能够促进植物幼茎塑性的生长，生长素还能促进植［8， 9］［10］物弹性生长。此外，生长素能促进RNA和蛋白质的合成。因此，生长素是通过增加细胞壁的伸展性并促进RNA和蛋白质的合成，从而促进细胞生长的。研究表明，生长素可以通过促进赤霉素的［11～14， 73］合成、抑制活性赤霉素的降解，从而促进茎的伸长。
1.生长素促进细胞壁伸展［74］
生长素促进细胞壁伸展的作用机理至少有两种可能：①生长素通过ATPase活性的促进把质子送到质子膜之外，使细胞壁酸化，从而打断细胞壁结构中对酸不稳定的键。生长素对ATPase的促进不是直接的作用，极可能是通过第二信使的活动，因生长素能刺激2+2+2+2+Ca 的释放，增加游离态Ca 的浓度，Ca 或Ca-CaM能激化蛋白激酶，进而促进蛋白质磷酸化。②生长素通过第二信使促进水解酶的活性，从而打开细胞壁纤维素结构间交结点的键。
实验表明，生长素能促进植物初生细胞壁的主要成分（木葡萄糖类）分解，木葡萄糖的抗体能抑制生长素促进的Azuki豆（Vigna ［75］angularis）上胚轴伸长及细胞壁松弛。这项实验结果支持生长素促进细胞壁木葡萄糖的分解与伸长生长有关的看法。
生长素促进细胞壁伸展基本上是由于酶的活动的结果，已知生长素能促进葡萄糖苷酶（β-glucosidase）与葡萄糖内水解酶（β-glucan ［76］endohydrolase）活性，促进纤维素酶合成及半纤维素分解［77］［78］以及阻止木葡聚糖的聚合。
2.生长素促进核酸和蛋白质的合成
生长素促进细胞生长除了使细胞壁松弛外，还促进RNA和蛋白质［79］的合成。试验指出，生长素处理豌豆上胚轴3d 后，顶端 1cm 处的DNA和蛋白质含量比对照增多2.5倍，RNA含量增多4倍。如果用RNA合成抑制剂放线菌素D（actinomycin D）处理，则减少RNA合成速率，如果用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（cycloheximide）处理则抑制蛋白质的合成。试验指出，用50μmol/L生长素处理玉米芽鞘，20min后，芽鞘延长，与此同时，分离芽鞘的mRNA。这些mRNA在3535含有S-蛋氨酸的无细胞胚乳提取物中，能翻译出有S标记的蛋白质。由此可见，生长素是能够促进RNA和蛋白质的合成。
综上所述，生长素一方面促进细胞壁伸展、增加细胞壁可塑性，从而增强细胞渗透吸水能力，使细胞体积加大；另一方面，生长素促进RNA和蛋白质的合成，为原生质体和细胞壁的合成提供原料，保持持久生长。
3.生长素通过调控赤霉素代谢促进茎伸长生长
研究表明，生长素在调控一些植物节间伸长作用中，主要是通过调控节间中赤霉素代谢来实现的。在豌豆中，2，3，5-三碘苯甲酸（2，3，5-triiodobenzoic acid，TIBA）等生长素运输抑制剂处理能够抑制顶部合成的IAA 向节间运输，进而通过抑制赤霉素的生物合成导［11］致节间伸长受阻。如图2.6所示，豌豆茎切断试验表明，IAA能够通过促进GA → GA的转化，从而促进赤霉素的生物合成；IAA201还能够抑制GA2ox基因的表达，从而抑制GA → GA以及GA→1819［73］GA的转化（图2.6）。29［12， 73］图2.6 IAA对豌豆和烟草GA代谢的调控作用实心箭头表示促进作用，实心箭头越粗表示促进作用越强［12］
随后，Wolbang和Ross 在烟草中也发现了IAA能够调控活性赤霉素GA的合成，从而调控节间伸长。烟草去顶处理能够显著降1低切口以下部位IAA、GA以及GA的含量。进一步研究发现，去顶201处理降低了GA → GA以及GA →GA的转变；然而外源IAA的处1920201理能够促进GA → GA的转变，但外源IAA的处理对GA →GA的1920201转变作用不明显（图2.6）。说明在烟草中，IAA是通过促进GA →19GA的转变从而促进赤霉素的合成。20
可见，生长素不但能够通过增加细胞壁的伸展、促进RNA和蛋白质的合成，从而促进细胞生长；生长素还可以通过促进活性赤霉素的合成、抑制活性赤霉素的钝化，使得植物体内赤霉素维持一个正常的水平，从而促进节间伸长。以上试验表明，在不同的植物中，IAA促进赤霉素合成的步骤存在差异。第三节 脱落酸及其对植物茎伸长生长的调控
脱落酸（abscisic acid，ABA）是五大经典植物激素之一，是一种类倍半萜植物激素。在绝大多数高等植物中都能发现ABA的存在，尤其是在成熟、衰老的组织或即将进入休眠的器官中含量丰富，当植物遭遇逆境胁迫时，体内ABA含量也会剧烈升高。在以往的报道中，ABA的生理功能主要集中在对植物成熟、衰老、抗逆等过程的调控。然而，ABA在茎（节间）伸长生长过程也具有调控作用。Hoffmann ［80］BS等利用深水稻研究表明：淹水处理能够促进水稻节间迅速伸长，而这种迅速伸长效应能够被ABA处理所抑制。给深水稻幼苗施加类胡萝卜素合成抑制剂氟啶酮（fluridone），致使体内 ABA含量降低［81］后，水稻胚芽鞘比对照增长67%。随后，宋平等的试验表明，携带半矮秆基因的水稻品种的内源ABA含量显著高于高秆品种，且水稻株高、苗高与ABA含量呈显著负相关。这些结果暗示了ABA抑制水稻茎（节间）伸长生长。一、脱落酸的代谢
1.脱落酸的合成
高等植物体内可能存在直接和间接两条ABA合成途径。直接途径是由三个异戊烯单位聚合成 C15前体——法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP），然后FPP经环化和氧化直接形成ABA；而间接途径由甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）聚合成C40前体——类胡萝卜素，再由类胡萝卜素裂解成C15的化合物，如黄质醛［82］（xanthoxin，XAN），最后由黄质醛转变成ABA。目前，C40途径被公认为是高等植物ABA的主要合成途径。高等植物细胞内ABA的合成涉及质体和细胞质两个区域，质体内发生的反应主要包括叶黄素的合成和降解，形成黄质素。黄质素通过质体被膜进入细胞质，经过［83］两步氧化过程最终形成ABA。
如图2.7所示，在高等植物中，ABA合成的前半部分步骤在质体中进行，ABA的最初前体来自于C40类胡萝卜素玉米黄质，在玉米黄质环氧酶ZEP 的催化作用下玉米黄质转变为紫黄质。紫黄质随后在9-顺-新黄质合成酶作用下形成 9-顺-新黄质。然后9-顺-新黄质在酶催化作用下形成9-顺-环氧类胡萝卜素。ABA合成的关键限速步骤是9-顺-环氧类胡萝卜素被裂解成C15的ABA前体黄质醛，此步骤由9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED催化完成。此后，黄质醛从叶绿体被转运到细胞质中。在胞质中，黄质醛被一种短链脱氢/还原酶转变为ABA醛。最后ABA醛在ABA醛氧化酶AAO的催化下形成有生物活性的［82］ABA。
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