作者：于淑池 著
出版社：北京理工大学出版社
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生物源拮抗物质的提取及应用试读：
前言
生物防治是借自然的作用或拮抗物以减少病原菌接种体密度的方法。传统的病害防治是根据微生物间的相生相克，利用或引进无害微生物来控制有害微生物生长的。1987年，Baker将病害生物防治的定义扩大为：“以一种或多种生物（包括寄主植物，但人除外）来减少病原菌数量或控制病害发生发展，以实现病害防治的方法。”这使得现代生物防治已不再仅仅是利用微生物间的相克作用，植物、微生物通过释放化学物质到环境中而产生对其他生物直接或间接的有害作用。这些物质称为拮抗物质或化感物质，它们主要是微生物或植物的次生代谢产物，分子量小、结构简单、易于提取、对病原菌作用强、对环境无害，因此利用拮抗物质进行生物防治，不会产生新的生态和环境问题，属于环境友好型生物活性物质。
本书共分三部分，分别从细菌源拮抗物质、植物源芦苇、香樟拮抗物质的提取及抑菌活性应用研究等方面进行阐述。每一部分都自成一体，理论联系实际，具有很强的科研指导性。全书重点在第一部分，详细阐述了拮抗菌的分离、鉴定，细菌源拮抗物质即抗菌蛋白的提取、纯化，及活菌实际田间抗真菌应用定植实践。第二、三部分分别对植物源芦苇和香樟叶水提取和有机物提取的方法、抑菌活性展开了详细的分析研究。本书把实验室的科学研究和实际应用联系起来，突出了科研的应用性，更是侧重介绍读者如何具体开展科学研究实验，有利于读者快速了解并掌握相关研究方法和研究背景。
本书的第一部分，由著者在石志琦、张立平老师的指导下完成，第二、三部分由著者指导湖州师范学院生命科学学院的多名学生完成，她们分别是邓红英、姜燕、汪晓莹、李经纬、童轶璇、汪梓欣、张虹、莫晓意、卢亚丽，在此对她们所做的试验工作表示最深切的谢意，并对石志琦、张立平老师表示深深的谢意。
本书集实验室研究和实践应用于一体。通过实验材料和方法的详细阐述，总结整理出实验结果和相应结论，并展开详细的讨论分析。为从事相关研究的读者提供了研究基础、理论背景和相应研究进展。另外，紧扣生物研究实际，对生物资源的提取、拮抗成分的开发利用指出了新的方向，可以为新型生物农药的研究提供来源，同时又是环境保护对当今科研提出的要求，生物源拮抗物质取自生物，安全无污染，在农业生产以化学农药占主导地位的当下，本书的应用研究就显得意义更加重大。本书行文言简意赅、易读易懂，对不同层次的读者都有一定的借鉴作用。
由于著者水平有限，缺点和错误在所难免，请广大读者和同行专家提出宝贵意见。著者2015年12月第一部分第1章细菌拮抗物质的提取及应用1.1 拮抗细菌作为生物防治手段研究概况1.1.1 生物防治的概念
植物病害生物防治的概念最早由英国植病学家Garratt（1965）提出，即在任何条件下或借助于任何措施，通过其他生物的作用减少病原物的生存和活动，从而减轻病害发生的办法。美国生防专家[1]Baker（1974）指出：植物病害的生物防治是借自然的作用或借调节环境、寄主或拮抗物，以减少病原菌接种体密度的方法。传统的病害防治是根据微生物间的相生、相克，利用或引进无害微生物，以控制有害微生物，防治病害。1987年，Baker将病害生物防治的定义扩大为：“以一种或多种生物（包括寄主植物，但人除外）减少病原菌数量或病害发生发展，以实现病害防治的方法。”这使得现代生物防治已不再仅仅是利用微生物间的相克作用，还包括微生物之间在氧、水分、营养及空间等各方面的竞争作用，微生物间的交叉保护作用，天然植物防病及抗菌物质以及以分子生物学手段和诱导剂等提高植物的抗病性等。近年来，对生物防治的研究主要集中在诱发寄主抗性、[2]利用植物次生物质和拮抗微生物等方面。1.1.2 生物防治的重要性
半个世纪以来，用化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。虽然农药对农业生产的发展功不可没，但长期、广泛、大量、[3]连续地使用化学农药，已造成一系列严重后果：（1）植保工作方面
过量地使用农药杀伤了病菌、害虫在自然界的天敌，导致病虫害再度猖獗，并造成病菌、害虫产生抗药性，而且用药量越来越大，形成恶性循环；同时，有害生物的多样性和变异性给病虫害的化学防治也带来了困难。这些都造成病虫害越来越严重，同时带来防治费用急剧增加等问题。实践说明，单靠化学农药已不能解决植保问题。（2）环境污染问题
化学农药的工厂生产和田间使用都是产生环境污染的重要来源。农药的使用对空气、土壤和水域造成污染，土壤残留量严重超标，进而使农副产品及畜牧产品农药残留严重超标，不仅危害了人类的身体健康，而且造成了很大的经济损失。（3）能源危机问题
当今世界，不论是发达国家，还是发展中国家，能源危机已成严重问题，节约能源的工作正在广泛开展。由于化学农药的工厂生产和使用都要消耗大量能源，而制造农药的原药，大多又是石油化工产品。不能过分依赖化学农药已成为全球共识。不少国家确定5～10年内减少50％化学农药用量的目标。为此，要积极利用生防手段防治农作物病虫害，减少化学农药的用量。生物防治，特别是生物农药的研究和开发自20世纪80年代以来受到了广泛重视。
生物防治是以生态学为基础，控制有害生物，是综合防治体系中一个必不可少的组成部分。它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害，更重要的是促进了农业的可持续发展。1.1.3 拮抗细菌作为生物防治手段的研究进展
以生物防治手段控制农作物病害的尝试，早在20世纪20年代就已经开始。1921年C．Hartley报道可以用十几种常见土壤腐生真菌和细菌防治树苗的腐霉根腐病。1926年Sanford报道土壤中某些拮抗性[4]微生物对于土传病原菌具有抑制性。当时美国马铃薯上发生一种放线菌（Streptomyces scabies）引起的疮痂病。1921年Millard报道施用绿肥可减轻这种病害，而Sanford经分析证明它是由于绿肥促使土[5]中拮抗性放线菌增长所致，并指出其生物学防治的实质，从此开始了寻找土壤拮抗微生物作为病害生防因子的研究。40年代和50年代开发利用拮抗性放线菌及它们产生的抗生素吸引了众多的科研工作者。60年代开始，人们逐渐转向寻找其他拮抗性微生物和生防技术[6]的研究，由拮抗性放线菌发展为利用一些快速生长繁殖的真菌、细菌以及病毒等，从利用腐生的土壤微生物发展到利用植物体微生态系中的微生物，防治的病害种类从种传和土传病害扩大到地上部分的气传和虫传病害。70年代以来，病害生物防治的研究和实践更为活跃，而且发展迅速。到80年代，我国陈延熙等研制出植物保健益菌[7]——“增产菌”菌剂，提出“植物体自然生态系”的观点，浙江、山西、四川等地应用拮抗性木霉菌防治丝核菌和小菌核菌所致病害也取得明显进展。进入80年代中后期，对芽孢杆菌（Bacillus spp）的研究更是进入了空前时期。
从各种生态环境中筛选出来的具有拮抗作用的细菌应用最多的只有几个属，主要是芽孢杆菌（Bacillus spp）、假单胞菌（Pseudomonas spp）和放射性土壤杆菌（Agrobacterium [8]-[9]radiobacter）等 。现将其研究进展分述如下：（1）芽孢杆菌（Bacillus spp）＋
芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的G 杆菌的总称。其生理特征丰富多样，分布极其广泛，极易分离培养，是土壤和植物体表、根际的重要微生物种群。芽孢杆菌突出的特征是能产生耐热抗逆的芽孢。这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定[10]殖与繁殖。批量生产上工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种较理想的生防微生物。
芽孢杆菌可对马铃薯疮痂病、苹果红癌病、赤霉病等许多土传病害和地上部病害具有生防效果。用于生防的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌（B．subtilis）、多粘芽孢杆菌（B．polymyxa）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、蕈状菌变种（B．cereus var．mycoides）等[11]。现分述如下：
①枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的研究现状及应用
由于枯草芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，故备受各国研究工作[12]者的青睐。
很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经被应用于生产实践。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌（B．subtilis）生防菌株获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可。它们是GBO3，MBI600，QST713，[13]以及B．subtilis，amyloliquefaciens FZB24。GBO3和MBI600分别由美国Gustafson公司和Microbio Ltd．公司开发。根部施用或拌种可防治Fusarium，Aspergillus，Alternaria，以及Rhizoctonia引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。FZB24为Tensa公司的产品，商品名Taegro TM，被施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治Fusarium和Rhizoctonia引起的根腐病和枯萎病。QST713为©AgraQuest公司的产品，商品名Serenade 。叶面施用它，能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌的病害。此外，澳大利亚开发的B．subtilis A-13对麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有[14]很好的防治和增产作用。日本东京技术研究所的B．subtilis RB14和B．subtilis NB22分别对Rhizoctonia solani，Fusarium oxysporum，[15]以及Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效。
我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已开发出一批生防作用优良的枯草芽孢杆菌菌株，如[16]-[19]B916，B908，B3，B903，BL03，以及XML6 。江苏农业科学院植物保护研究所的B916菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显著抑制作用，自从1991年至今对水稻纹枯病的田间防效稳定在250％～81％，目前已进行农药登记，年使用面积达6.7万hm 。南京农业大学生防菌B3（商品名麦丰宁）对小麦纹枯病的田间防效为50％～80％。莱阳农学院的BL03和XML6菌株对苹果霉心病和棉花炭[18]疽病的田间防效达90％。林东等（2001）发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S0113对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）具有强烈的抑菌作用。谢栋等（1998）分离的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-98，能强烈抑制苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）等植物病原真菌的拮抗菌株。将Bacillus subtilis接种在土壤中或做种子包衣，可以防治玉米立枯病、洋葱黑腐菌核病等。该菌不[20]但能减轻发病程度，而且能促进小麦的生长，增加产量。
②其他的芽孢杆菌
Wadling等（1998）报道，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）NCIMB 13374能抑制草莓灰霉病菌的生长。崔云龙等（1995）通过平皿培养试验表明，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）D82对小麦根腐病有强抗生作用。B．pumilus和乳芽孢杆菌（Lactobacillus sp．）都有防治豆类和番茄灰霉病的作用，能降低灰葡萄孢分生孢子的萌发和叶片腐烂的严重程度。
Oita等和Park Seonllee等分别报道地衣芽孢杆菌（B．[21]licheniformis）和P．polymyxa对灰霉病菌的拮抗作用。黄绍宁等（1999）应用地衣芽孢杆菌和木霉防治基质栽培黄瓜苗期猝倒病。
裴炎等（1999，2002）发现蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）对[22]多种作物真菌性病害有良好的防效。
Walker等从豌豆和矮化法国菜豆外种皮和子叶上获得多粘芽孢杆菌（B．polymyxa＝Paenibacillus polymyxa，多粘类芽孢杆菌），具有抗灰霉病菌的能力。张中鸽等（1994）在宁夏春全蚀病等土传病害发生严重的田块中，从无明显发病症状的植株根样中分离获得生防菌株多粘芽孢菌（Bacillus polymyxa）B48，对棉花黄萎、黑根腐、炭疽病菌、赤霉病菌、玉米全蚀病菌、水稻白叶枯病菌、花生青枯病菌、马铃薯软腐病菌、黄瓜角斑、青椒疮痂等均具有强烈的抑制作用[23]。（2）假单胞菌（Pseudomonas spp）及其应用
近来，Pseudomonas spp作为生防因子吸引了许多研究者的注意。20世纪70年代，美国的加州大学率先研究了该菌，当时就引起了普遍关注。1978年Burv等报道，将P．fluorescens和P．pudita用在马铃薯种薯上可以改善马铃薯生长。已经证实，将其应用在甜菜和萝卜上同样能改善其生长。Schroth和Hancock总结来自大田试验的报告指出，荧光假单胞菌能使马铃薯增产5％～33％。
Pseudomonas属细菌在植物根围土壤中常常能大量增殖。许多菌株对植物有抑制病害、促进生长的作用。何远礼等人用荧光假单胞菌（P．fluorescens）JF1菌株对花生种子浸泡接种，菌液对土壤中[24]青枯菌的侵染具有明显保护能力。在种类繁多的根际有益微生物中，以荧光性假单胞菌（fluorescent Pseudomonas spp．，包括P．fluorescens，P．cepacia，P．pudita等）为主的植物促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）由于具有营养要求简单、繁殖速度快，以及根际定殖能力强等独有优点而成为20多年来研究报道最多、最具防病潜力和应用价值的一类生防菌。祝新德等（2001）从上海郊区甜瓜地中分离得到一株具有广谱抑制植物真菌病害，并促进植物生长双重功能的荧光性假单胞菌ML8（P．fluorescent ML8）。楼兵干等（2001）发现铜绿假单胞菌CR56（Pseudomonas aeruginosa CR56）作为种子处理时，能有效地防治由腐霉（Pythium spp）和茄丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的黄瓜和番茄的苗期猝倒病。研究表明，黄瓜根围比番茄根围更适合[25]该菌的定殖。王远山等（2002）利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了棉花根围细菌绿针假单胞菌（Pseudomonas choloeaphtis）PL9菌株对烟草黑胫病病原菌——烟草疫霉——的拮抗作用。该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用，并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染，其液体培养物浓缩过滤液[26]也有相同的作用。
荧光假单胞菌株也能抑制植物的主要病原。例如全蚀病的生物控制，长期以来由于缺乏抗病寄主和经济的化学方法而无法控制。Weller和Cook从全蚀病衰退的土壤中分离得到荧光假单胞杆菌。将单克隆菌株用于种子处理，可增产10％左右。将几个菌株结合使用，效果更好，可以增产27％以上。荧光假单胞菌还可以有效地防治Pythium ultimum引起的棉花猝倒病。（3）放射性土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）
细菌作为生防因子应用的例子，是20世纪70年代澳大利亚的Kerr和New等用放射土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）K84菌株防治由Agrobacterium tumefaciens引起的许多植物的根癌病，并在许多国[27]家得到推广。
澳大利亚的科学家发现，利用蔷薇、核果类果树的根肿病菌的近缘种Agrobacterium radiobacter strain 84能够防治这类根肿病；后来，又发现它对桃、苦扁桃根肿病也有很好的防治效果，现已被普遍应用于世界各地。将Agrobacterium radiobacter strain 84施于核果类果树或花卉根围土壤内，阻碍癌肿病原的蛋白质及细胞壁的合成，因[24]而可预防根癌肿病。
近年来，放射性土壤农杆菌的研究取得了新进展，进一步证实了K84菌株对生物Ⅱ型和生物Ⅲ型（部分）土壤农杆菌的抑制性，对来自葡萄的生物Ⅲ型细菌无效，但对核桃根癌病的防效可达100％，并[28]试验性地开发出了K84生物农药——根癌宁。
当然，拮抗细菌还有很多。如：Beer和Rnodle报道，草生欧氏杆菌（Erwinia herbicola）能防治梨火疫病（E．amylovra）。张玉勋等（2000）研究了P．fluorescence 5号、15号菌株和B．subtilis M9及ML1菌株在大棚温室番茄上的定殖情况及其对灰霉病的控制效果。嗜麦芽黄单胞菌（Xanthomonas maltophilia）和假单胞菌的一些分离物具有防治豆类和番茄灰霉病的作用。P．cepacia和玫瑰花表生欧文氏菌（Erwinia sp．），以及另一种棒棍型细菌可防治玫瑰灰霉病。其效果与扑海因相似。Bryk等（1998）研究表明，草生欧文氏菌（E．herbicola＝Pantoea agglomerans，成团泛菌）能抑制灰霉病菌孢子的萌发。Whitman等（1998）发现液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens＝S．proteamaculans subsp．proteamaculans，变形沙雷氏菌变形斑变种）能抑制葡萄上灰霉病菌分生孢子的形成。
综上所述，近年来，拮抗细菌的筛选研究工作在我国十分活跃，研究者甚多，但缺乏系统性。筛选到的植物真菌病害的生防菌种类尽管繁多，但大多停留在拮抗活性的研究和田间防效上，真正分离到活性物质，并被应用于实际的菌种还很少。因此，我国在这方面应该加强研究。1.2 拮抗细菌产生的活性物质和拮抗机理研究概况1.2.1 拮抗细菌拮抗作用的物质基础
拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原物产生抑制是自然界中普遍存在的现象，也是众多拮抗微生物应用的物质基础。作为微生物代谢产物的抗生素，对于抑制病原菌的侵染和病害的发展有着重要作用。传统的方法是用对峙培养法测定抑菌圈，以确定该菌在生物防治中有无抗生素的涉及，但这种方法并不能直接证实在实际的生态环境中抗生素依然产生并起到抑制病原的作用。最近，液相色谱分析证实了荧光假单胞菌在土壤中仍然可以产生抗生素。进一步运用遗传工程技术使荧光假单胞菌丧失抗生素的产生能力并伴之失去防病能力，经修复还原抗生素代谢能力后，生物防治活性也恢复到[29]野生菌株的水平，从而证明了抗生素在生防中的重要作用。
拮抗微生物产生的抗菌物质主要有两类：一类是小分子的抗生素；另一类是大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类。（1）抗生素类
芽孢杆菌抗生素是其表现抗菌作用的重要物质基础之一。芽孢杆菌的抗生素有核糖体和非核糖体合成2类。非核糖体合成的抗生素包括脂肽抗生素（lipopeptide）、多肽抗生素和次生代谢产生的抗菌活性物质。
①脂肽抗生素
Iturin家族脂肽抗生素，一般对真菌具有强烈拮抗作用。目前报道的有B．subtilis合成的Iturin A，C，以及Bacillomycin L，D，F和[15]，，[30][31]Mycosubtilin等 。
②多肽抗生素
芽孢杆菌多肽抗生素有线状、环状和分支环状3类。Gramicidin[13]和Edeine是B．brevis产生的线状抗真菌短肽。Gramicidin S和[30]-[32]Tyrocidine是B．brevis产生的环状短肽抗生素 。分支的环肽抗生素包括Polymyxin，Octapeptins，以及Bacitracin。它们主要作用于细菌。近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视。研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰，以提高其活性。如Chen等（Chen H C，Brown J H，Morell J L，1998）采用该技术修饰抗菌肽Magainin 2，使其活性提高了100倍，与其他抗生素化学或半[33]合成修饰相比，既方便，又省成本。
③其他抗生素
Zwittermicin A是线状聚酰胺物，在B．cereus和B．thuringiensis[31]的很多菌株中都存在。Zwittermicin A对原核生物和真菌具有广谱抑菌活性，对Phytophthora和Pythium属病原真菌活性极强，并对Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用。（2）核糖体合成的抗菌蛋白
芽孢杆菌分泌产生的蛋白类抗菌物质主要有细菌素、细胞壁降解酶（如几丁质酶和葡聚糖酶）以及一些未鉴定的抗菌蛋白。
①细菌素
细菌素是细菌合成的对其他微生物具有抗生作用的小分子量蛋白[32]，[35]质。芽孢杆菌能产生多种细菌素 。枯草芽孢杆菌产生的＋Subtilis和Subtilisin及巨大芽孢杆菌产生的Megacins对G 细菌具有很强的活性。枯草芽孢杆菌产生的Botrycidin AJ1316，Alirin B-1，6.9kDa小肽，以及Bacillus licheniformis M-4产生的M-4 Amoebicidal同时具有抗细菌和真菌作用。
②几丁质酶和葡聚糖酶
许多病原真菌细胞壁含有几丁质和β-l，3-葡聚糖。几丁质酶（chitinase）和β-l，3-葡聚糖酶（glucanase）是植物病程相关蛋白。它们通过破坏病原真菌的细胞壁而具有抗菌防病作用。最早报道几丁质酶活性的微生物是芽孢杆菌B．chitinovrous，目前涉及B．subtilis，B．coagulans，B．megaterium，B．licheniformis，B．thuringiensis，B．cereus，B．circulans，B．stearothermophilus，以[36]，[37]及B．pabuli等很多芽孢杆菌种群 。
③其他抗菌蛋白
TasA（transition-phase sporeassociated antibacterial-protein）抗菌蛋白是Axel从枯草芽孢杆菌PY79菌株分离的孢子成分，对G＋和G-[35]细菌具有广谱抗菌活性。基因tasA是通过氨基酸序列测定和枯草芽孢杆菌基因组序列文库比较获得的。TasA前体为34kD孢子内蛋白，经信号肽酶SipW加工除去N端27个氨基酸成为31kD活性蛋白形式，并进一步掺入孢子外衣，但对孢子形成无明显作用。近年来我国有很多分离纯化枯草芽孢杆菌未知抗菌蛋白的报道，如B034菌株50.3kDa和A014菌株22.5kDa抗水稻白叶枯病蛋白，以及BS-98菌株59kDa，TG26菌株14kDa，B3菌株13kDa和BS-908抗真菌蛋白质等，但还未[16]见到有关基因研究的报道。
芽孢杆菌类生防细菌大多是通过产生抗菌蛋白或裂解酶抑制病菌的侵染。如抗稻白叶枯病的芽孢杆菌A014，枯草芽孢杆菌B034，A30，XML6，B0113，BS—98，TG26，B—916，B3，青枯生防菌[36]芽孢杆菌B130，芽孢杆菌属的XA ，XF 等菌株均能产生抗菌蛋11白或多肽。B．brevis可分泌抗黄瓜白粉病菌的短杆菌肽（gramicidin）。解淀粉芽孢杆菌（B．amyloliquefaciens）产生一种抗真菌环状多肽，即Iturin A2。徐敬友等（2002）发现，抗灰霉等多种病原真菌的地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌培养液中具有拮抗活性的物质是一种蛋白或多肽。Wakayama（Wakayama S，Lshikawa F Osihik，1984）从蜡状芽孢杆菌（B．cereus）中纯化出一种抗真菌环状多肽Mycocerin。其抑菌谱广、活力强，能同时对丝状真菌和酵母起作用，且耐热性和稳定性好。裴炎等（1999，2002）的最新报道称，从蜡状芽孢杆菌S-1菌株中分离出抗真菌多肽APS-1环状多肽，浓度为2μg/mL即可抑制黑曲霉和瓜果腐霉，并且已经分离、纯化出该物质。另一经常报道的抗菌细菌为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）。如刘颖等（1999）从枯草芽孢杆菌中分离出的抗真菌肽LP-1，为一种广谱抗真菌小肽，对瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、玉蜀黍赤霉病菌（Gibberella zeae）、长柄链格孢（Alternaria longipes）和水稻稻梨孢（Pyriculoria oryzae）等有很[40]强的抑制作用。孔建等（1999）报道，枯草芽孢杆菌B-903产生一种耐高温抗菌物质，有广泛的抑菌谱，包括土传镰刀菌（Fusarium axysporium）、气传植物病原菌（如苹果轮纹病）（Physalospora [41]piricola）、番茄早疫病（Alternaria solani）和韧皮部病菌。近来，国内外学者还利用体外合成的多肽物质对病原微生物进行拮抗试验，也收到了很好的效果。如Kanniah Rajasekaran等在体外合成的多肽D4E1对子囊菌类、担子菌类、半知菌类、卵菌类以及细菌都有很好的抑制效果（Kanniah Rajasekaran，2001）。Gul Shad Ali and A．S．N．Reday也发现，一种环肽能广泛抑制植物病原真菌和细菌（Gul Ahad Ali and A．S．N．Reddy，2000）。Belen Lopez-Garcia等对引起水果腐烂的植物病原真菌起抑制作用的六肽进行了鉴定和特性分析（Belen Lopez-Garcia，2000）。中科院上海生物工程研究中心的陆莹瑾等固相合成了4种抗菌肽，对多种植物和动物病原细菌均具[42]-[45]有抗性 。1.2.2 拮抗细菌拮抗作用的方式及作用机理（1）抗生作用
由于细菌的同化作用而产生的抗菌物质对病原菌生长繁殖的抑制作用被称为抗生作用或拮抗作用。这些抗生物质在很低浓度下即可对病原菌等其他微生物的生长和代谢活动产生毒害作用。这类抗生物质大致包括抗生素、细菌素（bacteriocin）、蛋白质类抗真菌素及挥发性抑菌物质等。
①芽孢杆菌抗生素
生防芽孢杆菌往往同时产生多种对特定病原菌具有很高活性的抗生素。无细胞培养物或抗生素粗提物平板抑菌试验和田间防病试验均能直接反映抗生素的生防作用。如B916无细胞培养液对水稻纹枯病[17]防效可达58.1％，而孢子发酵液的为77％。B．subtilis M51脂肽抗生素Iturin A2使用浓度为100μg/g的土时就能完全抑制Fusarium [13]oxysporum f．sp．lycopersici对番茄的侵染。目前，生防芽孢杆菌发酵液、无细胞培养液、抗生素和产抗生素缺失突变株的综合防病试验，已经系统证明抗生素是芽孢杆菌抗菌防病作用的重要机制。已证实B．subtilis CL27能产生3种抗生素。其中，一种为非多肽抗生素，只对Botrytis cinerea有活性；另两种为多肽抗生素：一种对Alternaria brassicicola有高活性，而另一种同时对两种病原菌有活性。
Utkhede和Rahe（1980）发现，B．subtilis能产生抑制S．cepivoum的抗生素。Broadbent等（1971）对A1 3菌株在离体条件下的广谱抗生作用研究后认为，该菌是通过对聚居于植株根部的有害微生物或对其毒素的抑制作用促进植株生长的；Cubeta等（1985）对Bsl菌株的抗生试验研究后发现，该菌株能对包括青霉菌（Penicillium sp）在内的26种大豆种子病菌起杀菌或抑菌作用，即使经高压灭菌后的培养物滤液，仍能抑制病菌Phomopsis sp的生长和子座的形成；Dunleavy（1955）和Mckeen等（1986），Baker等（1983），Pusey和Wilson（1984）分别用B．subtilis的不同分离物进行的各类病害防治试验一致表明，产生抗生素是该菌的共同防病机理。业已发现B．subtilis类抗生体可产生诸如枯草菌素（subtilis）、杆菌毒霉素（toximycin）、伊枯草菌素A（iturinA）、抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、酶基肽（acylpeptide）、优霉素（eumycin）、伊枯草菌素C及枯草杆菌肽（bacitracin）等多肽类抗生素，多肽抗生素26a，以及杆菌毒素S．L．D（bacillomycin S．L．D）等蛋白类抗真菌素，有的甚至还能产生挥发性的抑菌物质。这些抗菌物质或抑制菌丝生长，或抑制孢子萌发，或二者兼具，对病菌产生有效的拮抗作用。[46]例如B．subtilis NCIB8872及PRS等菌株产生的挥发性代谢物质几乎可完全抑制Penicillium spp．Aspergillus ochracens及R．solani等病菌菌丝的生长和孢子及毒素的形成，阻止病害的发生。生产实践中，主要是通过改变土壤或特定空间（如包装容器）的气体组成抑制病菌生长的。在已知的50多种抗生素中，绝大多数都是不常见的氨基酸、多肽或含氮（N）杂环化合物等次生代谢产物。
Pseudomonas产生的抗生物质包括细菌素、抗生素等，种类很多，如Pyoluteorin，Pyrrolnitrin（Chao W．L Nelson E B，Harman G E，Hoch H C，1986），能有机地抑制菌丝生长和孢子萌发，降低菌[47]核的活性等，从而达到防病效果。
②抗菌蛋白的生防作用
微生物抗菌蛋白的生防作用不仅被平板抑菌试验证实，而且已经[16]，[37]被应用于植病生防试验和生产实践 。Enterobacter agglomerans对R．solani引起的棉花病害防效为64％～86％，而其产的几丁质酶突变株则没有抗菌作用。Aeromonas caviae几丁质酶能使R．solani，F．oxysporum，以及Sclerotium rolfsii引起的棉花和菜豆病害减轻78％、57％和60％。Serratia marcescens几丁质酶基因chiA导入荧光假单胞菌、大肠杆菌和高等植物已经获得有显著防效的转基因遗传工程体，但对于芽孢杆菌几丁质酶、葡聚糖酶和其他抗菌蛋白的植病生防作用目前只涉及平板抑菌活性研究，尚未见到有关直接的遗传证据和防治应用报道。（2）溶菌作用
许多B．subtilis类拮抗体产生的次生性代谢物质对病原菌的菌丝或孢子的细胞壁产生溶解作用，致病菌细胞壁穿孔、畸形、菌丝断裂、原生质消解、外溢而丧失活力。例如，B．subtilis PRS5菌株的代谢产物可使R．solani菌丝分隔增多，隔间变短，胞内原生质消解，胞壁大量穿孔，或不规则消解，菌丝缩短、断裂，原生质外溢解体而失活。Rovira A．D．和Campbell R．通过电镜扫描发现，P．fluorescens定殖在Gaeumonnomyces graminis菌丝上对菌丝产生溶解作用。胡炳福观察到，Pseudomonas spp．对Hypoderma desmazierii，Fusarium sp．Lophodermium pinastri，L．unicinatum的孢子有明显的溶解作用。1.3 拮抗细菌在生防领域的应用
目前，国内外已筛选出多种拮抗细菌，但大多为直接使用菌株或菌剂防治病害。因此，它们的货架期（销售保质期）及效果稳定性就难以得到保证。况且，活菌虽可被直接用于防治土传病害，在土壤内或种子上常具有杀菌、刺激等多种功能，但对植物茎、叶、果病害的防治则表现得不太理想。只有通过提取和纯化其抗菌物质（包括抗生素与抗菌蛋白），才能将微生物发酵品变成真正的、标准的生物农药，从而更好地用于农业生产。另外，还可以构建转基因工程菌并培育转基因抗病植物。近年来，国内外开始研究拮抗微生物的遗传背景，克隆和分离了一些产生抗菌物质的基因。因此，通过遗传工程技术，构建高效、多抗转基因工程菌，或将微生物的抗菌基因转入植物，以培育转基因抗病品种，将是植物真菌病害及其他植物病害生物防治研究的重点。1.3.1 用于生产微生物农药
目前，对植物病害的防治主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今仍难以得到有效的解决。从微生物工程的角度出发，利用微生物产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治具有周期短、易于研究、便于生产、无毒、无害等优点，从而为研制新型的、无毒的、无公害的生物农药提[48]供了依据。自20世纪80年代末开始，国内利用有益拮抗微生物的研究日趋活跃，形成了生物源农药研制应用的新的热点。其中，中国农业大学（原北京农业大学）开发的“益微（增产菌）”“特立克”“克瘟灵”“消蚀灵”“棉康宁”，南京农业大学研制的“菜丰宁”，以(1)及西南农业大学推广的“丰收菌”，在全国累计应用面积超过十几(2)[49]亿亩，拓宽了植物病害生物防治技术途径。国内外至今已有多种Bacillus属细菌被成功地开发成产品并得到推广，如：美国Alabama州的Bacillus subtilis GB03既能有效防治植物病害，又能促进植物生[50]长，已得到大面积推广使用。其商品名为Kodiak。陈志谊等研制的Bacillus subtilis B-916菌液防治水稻纹枯病的效果达50％～81％，与井冈霉素按一定比例混合后可提高防病效果，已在江苏等地推广2[51][52]2000hm 以上。目前，已形成规模生产的部分生防菌剂如表1-1所示。表1-1 已形成规模生产的部分生防菌剂生防菌主要防治对象Agrobacterium radiobacter果树等根癌病Bacillus subtilis菌核病、丝核菌病、腐霉和疫霉Bacillus cereus全蚀病、果树叶部病害等Chaetomium globosum禾谷类作物苗病Mycophagous amoebas禾谷及烟草根腐病Coniothyrium minitans豆科、洋葱及向日葵菌核病Gliocladium roseum黄瓜黑根腐病Gliocladium virens番茄灰霉病及棉花苗病Laetisaria arvalis豆科等多种作物立枯猝倒病Penicillium oxalicum豌豆等作物出苗前立枯Peniophora gigantea松树桩根腐病Phialophora graminicola全蚀病Pseudomonas fluorescens多种作物土传病害Pythium aligandrum多种作物腐霉病Sporulesmium sclerotivorum生菜菌核病Streptomyces jinggangensis棉及多种作物病害Streptomycessp．（Mycostop）种传土传镰刀菌病Trichoderma viride菌核病及立枯病Trichoderma harzanum菌核病及立枯病Trichoderma hamatum丝核菌病及其他土传病害Verticillium lecanii花卉锈病[53]表1-2 目前已登记注册的微生物农药（拮抗细菌制成）1.3.2 构建转基因植物
至今为止，大多数抑制植物病原菌和腐生真菌离体生长的蛋白质[54]都是从植物材料中鉴别出来的，但在微生物中也普遍存在。如果将编码此种抗菌蛋白的基因转入植物体内，使该植物也能合成微生物起源的抗真菌蛋白，则该植物也同样能显示出抗真菌性。因此，寻找某些抑制病原真菌生长繁殖的抗菌蛋白基因，将其纯化并导入植物体[55]内，是目前农作物抗真菌病害基因工程研究的一大热点。
研究应用于生物防治的遗传工程微生物（Genetically Engineered Microorganisms）就是利用基因操作技术对某种微生物进行遗传改造，引入外来的具有防病、杀虫等作用的基因；或切除原有的、具有不良作用的部分基因；或插入一段DNA，以改变原来基因的调控与表达，从而促使微生物生防作用的加强或防治范围扩大，为高效微生物农药的研制开辟了新的途径。如：世界上第一个商品化的遗传工程杀菌剂为防治根癌病的工程菌Nogall。20世纪70年代，Kerr等发现了放射土壤杆菌（A．raidobacter）K84菌株通过分泌细菌素agrocin84对引起桃树根癌病的根癌土壤杆菌（A．tumerfaciens）有显著的抑制作用。近年来，又通过遗传构建了更为安全有效的工程菌株K1026。该菌已通过田间药效及安全性试验，定名为Nogall，并作为第一个商品化的遗传工程杀菌剂在澳、美、日等国开始登记销售。
在我国，“荧光93”是防治小麦全蚀病的工程菌。彭于发等于1987年将转座子Tn5导入小麦根部定植的荧光假单胞菌基因组内，从5100个转移接合子中选出了对全蚀病菌离体的拮抗作用提高2～3倍，并有明显刺激生长作用的菌株D93，它连续5年在冬春麦田间试验中一直保持稳定的防效，平均增产二成以上。该工程菌已被定名为“荧光93”。
对防治真菌病害有效的几丁质酶基因的利用的研究也取得了可喜进展。几丁质（Chitin）是除卵菌（Oomycetes）外大多数病原真菌细胞壁的主要成分。过去曾发现土壤中富含几丁质的甲壳类物质诱导分泌几丁质酶（Chitinase）的微生物增殖，而减轻镰刀菌（Fusarium）、丝核菌（Rhizoctonia）引起的植物病害。近年，国外对土壤细菌（Serratia marcescens）几丁质酶基因的结构与功能做了许多研究。Sandherm等于1988年将此基因导入荧光假单胞菌工程菌株，可抑制立枯菌菌丝，并使萝卜根腐病的危害明显减轻。Chet等于1991年报道，将此基因转入哈茨木霉（Trichoderma harzianum），可[55]-[56]使后者对土壤病原真菌的防治效果进一步提高 。另外，任春梅等（2002）用细菌几丁质酶基因转化番茄和烟草，采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因分别转化番茄和烟草子叶，获得了抗卡那霉[57]-[58]素的转化植株 。
对高效价抗性荧光假单胞菌的研究也正在进行中。以对水稻纹枯病菌具有抗生作用的荧光假单胞杆菌为受体，应用转基因方法，筛选出了4株远远高于母株抗生作用的荧光假单胞杆菌菌株，比对照母株提高抗性128％～187％。1.3.3 拮抗细菌研究存在的主要问题及前景（1）生防效果不稳定
在引入新生防菌时，要打破原来固有的生态平衡是较困难的。这可能是生防效果不稳定的重要因素之一。生防菌的定殖是较复杂而困难的问题。据Leben报道，喷施荧光假单胞菌拮抗菌后1d，在苹果树叶上存活的拮抗菌减少了99％。Knudsen研究了对花生叶斑病菌的拮抗细菌在田间的存活情况，认为在2周后，细菌的数量从103～104/叶减少到10～102/叶；而Mew设想植物表面最初引进的拮抗菌要维持一个有效计量，因此推测在植物的表面存在一个“支持系统”。Willocquet认为，从水稻的纹枯病病斑中流出的分泌物是拮抗菌生长的最合适的来源。根据此“支持”系统的假设，只有在水稻植株处于纹枯病发生初期才喷施拮抗菌，这样使拮抗菌更易存活和定殖。基于此理论，寻求一种更有效的支持系统，或筛选、利用植株固有拮抗内生菌，使植物终生受生防菌株的作用，而不受或少受外界环境的影响，使病害造成的损失降到最低。生防效果不稳定的问题仍然是摆在科研工作者面前的重要课题。（2）有益微生物的局限性
有益微生物一般生活在一定的环境中（包括土壤类型、温度、pH等）。所以，生产上拮抗菌对环境的适应性较窄，且有的菌株对农药的反应较敏感，并表现出较窄的抗病谱。这一问题可用基因工程、诱变等方法将有益微生物改造成高抗逆性、广适应性、高产性、高控害能力性、多抗性的超级工程菌株。这也是发展生防菌利用技术的工作重点。（3）拮抗和促生的结合较难
拮抗作用是衡量生防效果的指标之一。试验证明，在许多植株的根际或叶面存在对植株有促生作用的微生物，如荧光假单胞菌。孟颂东（1998）提出，这可能与微生物能产生一定量的生长素有关。如何使拮抗菌和促生菌有机结合仍是拮抗菌利用的难题之一。陆凡等，以及杨大旗等分别分离到了既有拮抗作用又有促生作用的拮抗菌株，证实了这些拮抗菌对植株的生长和发育起了重要的作用，且真正达到了防病增产的效果。所以，如何在生产中选育、分离这类菌也是生防工作者的目标之一。1.4 本研究的主要内容及意义
本研究借鉴他人的研究方法，主要开展以下工作：测定拮抗菌B-FS01对20种植物病原真菌的拮抗谱，并且把B-FS01分泌的拮抗蛋白分离纯化出来。对B-FS01分泌的拮抗蛋白的性质进行初步测定，对B-FS01进行种的鉴定和特性分析，并测定活菌在植株体表的定殖能力。完成这些基础工作后，可以从以下几个方面开展应用研究。1.4.1 与化学农药联合防病
将B-FS01菌剂与杀菌剂混合使用，可起到优势互补的功效。如B-3菌株同氯硝胺合用时对果腐病菌M．fructicola的防治起增效作用。Bact-2同Viclozolin及iprodione合用防治S．cepivorum的效果优于两种杀菌剂单独使用时的水平。与化学农药相比，抗生体的作用虽然更易受到环境因子的制约，但其能不断繁衍并随植株的生长从一部位（如种子）向另一部位（如根系）扩展而持久地起作用。在低温高湿土壤中抗生体的防病效果优于杀菌剂的事实表明，B．subtilis抗生体与杀菌剂之间具有优势互补性。二者的联合应用不仅可以减少农药用量，减轻环境污染，更利于病害的长期控制。1.4.2 与其他拮抗微生物协同防病
大多数细菌抗生体和真菌抗生体分别适宜在潮湿土壤和干燥土壤中生长繁殖。如将互融的二类抗生体（混用的不同抗生体之间没有拮抗、寄生、溶解或竞争关系）混合后防治某些病害，由于混合抗生体能在更大的土壤温、湿度变幅内生存繁衍，所以会获得更好的防治效果。1.4.3 与经营措施有机结合
太阳增温可使土壤的生物平衡向有利于抗生体的方向漂移。据此，在种植前深翻土地既有利于土壤增温，也可使病菌接种体远离植物根系这一主要侵染点。此外，还应适时向土中增施有机肥，向叶部喷施尿素等。1.4.4 用于生产微生物农药
从微生物工程的角度出发，利用微生物产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，具有周期短、易于研究、便于生产、无毒、无害等优点，从而为研制新型的、无毒的、无公害的生物农药提供依据。把拮抗菌B-FS01的拮抗蛋白从发酵液中分离，并提取、纯化出来，可以进一步研制微生物农药。1.4.5 研制遗传工程微生物
拮抗微生物中，将其有益拮抗的基因克隆，无疑给基因工程提供了丰富的基因资源。目前，对于有益基因的克隆仅限于一些抗虫基因，如Bt基因。另外，对真菌和细菌的几丁质酶基因的研究也比较多。还有许多拮抗作用强的芽孢杆菌、荧光假单胞菌、链霉菌及有益病毒的基因未被分离和克隆。许多研究只是停留在一些低水平的重复试验上。把抗菌B-FS01的拮抗蛋白进行测序，进而找到其拮抗基因，并克隆其基因，然后将其导入植物体的基因组中，从而得到抗病植物，将是本研究的应用前景之一。
多年来化学杀菌剂的长期应用使得病原菌产生了严重的抗药性，从而导致了防病效果大大下降；同时，大量使用化学农药也污染环境，使农副产品的农药残留量超标，危害人类健康。因此，大力发展植物真菌病害无公害防治措施势在必行。其中，生物防治是最有应用前景的措施之一。
本研究以筛选的拮抗细菌，即芽孢杆菌类为对象，主要进行种类鉴定、拮抗活性测定，拮抗蛋白的纯化和性质测定，以及活菌在植株体表定殖能力的研究，从而为这类生防菌的研究和推广应用打下坚实基础，最终达到高效、安全地控制真菌病害的发生与危害之目的，为农业的可持续发展、无害化生产服务。
(1) 西南农业大学：今为西南大学。
(2) 1亩＝666.667平方米。第2章拮抗菌B-FS01的鉴定
目的：通过对拮抗菌B-FS01的生物学特性及生理生化特性分析，对该菌进行鉴定，确定其分类地位，为进一步研究、利用该菌奠定基础。2.1 材料与方法2.1.1 菌株
拮抗菌B-FS01系江苏省农科院植保所病害组从本所保护地油菜茎秆分离油菜菌核时分离得到的。以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis作为标准对照菌（本室保存）。2.1.2 培养基及试剂
NB培养基、糖发酵培养基、淀粉培养基、明胶液化培养基、硝酸盐还原培养基、卵磷脂酶测定培养基、胰胨水培养基、丙二酸盐培[59]养基，以及柠檬酸培养基。配方见文献。碱性品红、苯酚、琼脂、苯胺、甲基红、NaCl、牛肉浸膏、丙二酸钠、柠檬酸三钠、蛋白胨、酵母膏、淀粉、明胶，以及KNO ，NaOH，ZnCl ，KI，HCl，32H O 等。222.1.3 生物学特性观察及生理生化特性测定2.1.3.1 培养
分别将待测菌株和对照菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）平板和试管斜面上，以25℃培养2d后观察。2.1.3.2 形态学观察
观察细菌的形态，包括菌体的形状、芽孢位置及鞭毛着生情况、类脂颗粒的有无，以及伴孢晶体染色、抗酸染色和芽孢染色，采用孔雀石绿染色法，鞭毛采用西萨节-基尔（Cessres-Gill）染色法，其余[59]-[60]特征观察均按参考文献 。2.1.3.3 生理生化性状测定（1）生理生化反应
卵磷脂酶、明胶的液化、不同温度下的生长试验、接触酶试验、V．P．试验及pH变化、产生吲哚试验、淀粉水解试验、从糖类（D-葡萄糖、D-乳糖、D-木糖、D-甘露醇）产酸和产气试验、硝酸盐还原试验，观察pH值为5.7的条件下生长情况，以及耐盐性（7％NaCl）[59]-[60] 。（2）分解有机磷农药特性测定
把查彼克培养基中的K HPO 成分去掉，加入25μg/mL的三唑磷，24然后在含有三唑磷的平板上划线接种多粘芽孢杆菌B-FS01，以正常查彼克培养基作为对照，观察生长情况和拮抗活性。（3）生物固氮活性测定
把查彼克培养基中的NaNO 成分去掉，制成不含氮源的查氏平3板。为了确保培养基中无氮源成分，在配制培养基时用琼脂糖代替琼脂，用双蒸水代替蒸馏水，在平板上划线接种B-FS01，以正常查彼克培养基作为对照，观察生长情况和拮抗活性。2.2 结果与分析2.2.1 菌株B-FS01细菌形态学特征
菌株B-FS01的细胞革兰氏染色阳性，菌体杆状，大小为（0.7～0.8）μm×（3.5～4.0）μm，培养72h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊稍膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，菌落淡黄色，蜡质，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头形，表面湿润；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。由此看出B-FS01与芽孢杆菌的形态特征吻合。2.2.2 拮抗菌B-FS01的生理生化特性2.2.2.1 生理生化特性
B-FS01的生理生化特性分析结果见表2-1。从表2-1可以看出：B-FS01菌株为好氧菌，但也可厌氧生长，在pH值为5.7的培养基中或7％NaCl培养基中均可生长，接触酶反应阳性，V．P．反应阳性，V．P．培养液生长7d后pH值为6.5，可利用葡萄糖、乳糖、木糖、甘露醇产酸；具水解淀粉、明胶、酪朊的能力，可利用柠檬酸盐，不能利用丙酸盐，具还原硝酸盐的能力，卵磷脂酶阳性，不产吲哚，产生H S，生长温度为10℃～45℃，最适宜的生长温度为25℃～35℃。2表2-1 B-FS01的生理生化特性测试项目B-FS01B．subtilisV．P．试验及终pH值＋，6.5＋，6.0＋-厌氧生长＋＋需氧性测定＋＋硝酸盐还原＋＋接触酶＋＋明胶液化＋＋淀粉水解＋＋pH值为5.7的营养肉汤＋＋pH值为6.8的营养肉汤--吲哚反应＋＋柠檬酸盐利用--丙二酸利用S＋＋产H 2＋-卵磷脂酶葡萄糖AA木糖AA乳糖AA甘露糖AA--5℃＋＋25℃＋＋37℃＋＋42℃--50℃＋-7％NaCl注：表中“＋”表示阳性。“-”表示阴性。“A”表示产酸。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]