作者：顾兵
出版社：人民卫生出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
实验技术中的“惑”与“获”试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
实验技术中的“惑”与“获”/顾兵等主编.—北京：人民卫生出版社，2012
ISBN 978-7-117-16684-3
Ⅰ.①实… Ⅱ.①顾… Ⅲ.①实验医学 Ⅳ.①R-33
中国版本图书馆CIP数据核字（2012）第281059号
人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书
人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
版权所有，侵权必究！实验技术中的“惑”与“获”
主 编：顾 兵 王 华 王汉军出版发行：人民卫生出版社有限公司
人民卫生电子音像出版社有限公司地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号邮 编：100021E - mail：ipmph@pmph.com制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司制作时间：2018年1月版 本 号：V1.0格 式：epub标准书号：ISBN 978-7-117-16684-3策划编辑：鲁志强责任编辑：鲁志强打击盗版举报电话：010-59787491 E-mail：WQ@pmph.com本电子书不包含增值服务内容，如需阅览，可购买正版纸质图书。编 委（以姓氏笔画为序）
Karla Haack University of Nebraska Medical Center
马天仲 广东医学院附属医院
王 华 安徽医科大学
王 芳 南京医科大学第一附属医院
王汉军 University of Nebraska Medical Center
王国栋 皖南医学院
王忠夏 南京大学医学院附属鼓楼医院
王恒进 南京大学医学院附属鼓楼医院
王福斌 宁波市第六医院
尹丽景 河北圣雪大成制药有限责任公司
刘亚伟 南方医科大学
严子禾 无锡市第二人民医院
李 慧 广州市启动子生物科技有限公司
杨 健 重庆医科大学附属第一医院
杨瑞霞 南京医科大学第一附属医院
何子毅 东莞市中心血站输血研究所
张长征 安庆师范学院
张丽霞 南京医科大学第一附属医院
张国伟 河北大学中医学院
陆 晓 南京医科大学附属南京第一医院
林海双 中国医学科学院北京协和医学院
封 巍 浙江省肿瘤医院
赵 枫 宁波大学医学院附属医院
柯 星 南京医科大学第一附属医院
顾 兵 南京医科大学第一附属医院
顾劲扬 南京大学医学院附属鼓楼医院
徐俊荣 南京医科大学第一附属医院
徐敬轩 丹阳市第二人民医院
扆雪涛 青岛市药品检验所
梅传亮 宁波市中心血站
韩 冰 南京大学医学院附属鼓楼医院
魏源华 江苏省中医院
韩志君 无锡市第二人民医院
曾 妍 重庆医科大学附属第二医院
曾晓宁 南京医科大学第一附属医院
谢而付 南京医科大学第一附属医院
裴得胜 DFCI Harvard Medical School，Harvard University
黎宏斐 南京市浦口医院其他参与编写人员（以姓氏笔画为序）
Alicia M Diener University of Nebraska Medical Center
Debra L Irsik University of Nebraska Medical Center
Erin G Rosenbaugh University of Nebraska Medical Center
Matthew C.Zimmerman University of Nebraska Medical Center
Rodrigo Del Rio University of Nebraska Medical Center
丁香园站友 南京医科大学
王 升 徐州医学院附属医院
王 琳 江苏省省级机关医院
王守业 Michigan State University
王金铎 复旦大学附属上海市第五人民医院
王跃珍 浙江省肿瘤医院
王晶晶 南京大学医学院
史先彪 南京大学医学院附属鼓楼医院
付 宇 阿拉善盟中心医院
冯 涛 虎林市红十字医院
朱扣柱 苏州大学医学部
庄君龙 南京大学医学院
刘大路 佛山南海区卫生监督所西樵分所
刘福青 湖南农业大学
关邯峰 华中科技大学同济医学院附属同济医院
许 伯 University of Nebraska Medical Center
孙一帆 柳州市中医院
孙长俭 中国人民解放军第463医院
孙永宁 宁波市第六医院
严笑鹏 南京大学医学院附属鼓楼医院
杜 勇 宁波市中心血站
李咏雪 南京医科大学
李春玲 新乡医学院
李茹恬 南京大学医学院附属鼓楼医院
李贵玲 扬州市苏北人民医院
李晓艳 南京医科大学
杨 洁 南京大学医学院附属口腔医院
苏传丽 广西中医药大学第一附属医院
苏庆军 中国人民解放军第322医院
肖 亮 University of Nebraska Medical Center
肖江强 南京大学医学院附属鼓楼医院
肖明月 南京医科大学第一附属医院
吴 涛 浙江大学医学院附属邵逸夫医院
吴少亘 南京大学医学院附属鼓楼医院
吴双顶 Sanford-Burnham Medical Research Institute
吴拓江 南京医科大学口腔医学院
邱 文 南京医科大学
邱胜丰 南京医科大学第一附属医院
余 佳 武汉大学人民医院
张 哲 宁波市中心血站
张 婧 芜湖市第二人民医院
张 晶 武汉大学
张媛媛 University of Nebraska Medical Center
陈 洁 南京医科大学
陈晓婷 南京医科大学第一附属医院
林爱翠 南京医科大学附属南京第一医院
罗贤海 宁波市康宁医院
岳君秋 湖北省肿瘤医院
周 莎 南京医科大学
周 斌 四川大学华西医院
周 霞 浙江省肿瘤医院
周建博 南京医科大学
孟 博 华东师范大学脑功能基因组学研究所
赵 琪 南京大学医学院附属鼓楼医院
赵旺胜 南京医科大学第一附属医院
柳亦松 湖南农业大学
侯 健 中国科学院广州生物医药与健康研究院
施迎春 重庆市涪陵中心医院
秦雪君 福建中医药大学附属人民医院
夏建勋 University of Nebraska Medical Center
钱 瑾 Stanford University/VA Palo Alto Health Care System
倪 芳 南京医科大学第一附属医院
徐 娟 南京医科大学
徐 蕾 皖南医学院
凌 芸 南京医科大学第一附属医院
高 娟 University of Nebraska Medical Center
高应东 南京医科大学附属南京医院
郭旭光 广州医学院第三附属医院
黄 鹏 湖南农业大学
曹 杰 University of Nebraska Medical Center
曹 胤 南京大学医学院附属鼓楼医院
龚智翔 第二军医大学附属长征医院
康祥锦 汕头大学医学院
彭 蘡 溧阳市人民医院
蒋 叶 南京医科大学第一附属医院
蒋 理 南京医科大学第一附属医院
韩 月 南京医科大学
解晓露 温州医学院
黎 青 南京医科大学第一附属医院
檀家俊 南京市中医院
曾 妍 重庆医科大学附属第二医院序
一群热爱实验的同仁，坚持着对实验真理的不断探索，通过对实验中困惑和收获的总结，《实验技术中的“惑”与“获”》便问世了。本书旨在将科研工作者们的实验过程中的“困惑”和“收获”汇集成册，以启示后来人，让他们在今后的科学实验中少走弯路！
科学研究和技术快速发展的现状不断给每一位科研工作者提出更高的、新的要求，然而个人的知识、经验和能力是有限的，大量的研究生和科研工作者为了得到满意的实验结果而废寝忘食、备受煎熬。我们发现，对于现有的常用实验技术，许多朋友遇到的实验难题具有一定程度的相似性，在难题和困惑面前，也应该是有一定的规律可循、有相似的经验可以参考的。因此本书总结了编者们在实验过程中从困惑到探索，再到收获的宝贵经验，它们有可能只是实验中的看似无关紧要的细节，但正是这些容易被忽视的盲点导致了实验结果的不尽如人意。
本书的作者都是基础或临床实验室的一线工作人员。虽然来自不同的岗位，在实验中扮演的角色也大相径庭，但是做实验的初衷只有一个，就是对揭示医学现象奥秘的执着。相信那些坚持在实验台一线的同志们，能细心总结归纳他们在实验过程中的彷徨和疑惑，把最精华的体会与读者共享。
本书名为《实验技术中的“惑”与“获”》，其中“惑”与“获”是并存的，只有对实验结果产生疑惑，有自己独到的见解，通过查询文献、向导师或同行请教等各种方法，最终解除困惑，才能有所收获，更好地完成实验任务。“惑”与“获”之所以并存，是因为任何实验工作都不是一帆风顺的，都是建立在前辈艰苦卓绝的经验积累上的，是经过专家或课题组长期的摸索才建立的实验方法，是一种知识和实践的积累；其次，实验方案即使设计地再周密，实验结果也可以因为各种客观因素而改变，如实验人员、试剂厂家、工作环境以及仪器运作等情况都可能影响结果；最后，对实验结果认知度的偏差，不能灵活运用实验客观结果，保持一种固有的成见去看待问题，错误地认为真理是不能推翻的。虽然疑惑不可避免会存在，但相信实验工作中只要能时刻保持一颗睿智的头脑，勤于思考、勇于攻克困难，那么收获是必然的。“前车之鉴，后事之师”，本书正是为了启示年轻的生物实验工作者，尤其是青年研究生，帮助他们克服实验中的种种困惑。
要想在实验工作中解除疑惑，获得真知，在惑与获之间完美地过渡，我认为只有亲身实践才能出真知。“纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行。”即使是再多文字赘述的实验标准操作规程和注意事项，也无法完全取代亲身实践得出的经验总结。期望通过本书中各位编者总结的在实验中发现问题、分析问题、直到最后解决问题、获得真知和感悟的过程，能够带给读者一些启发和思考，能够有助于读者在实践中找到适合自己的实验方法、培养严谨的科学思维和规范的操作习惯。前 言
目前，各研究单位、高校和医院对科学研究越来越重视，对SCI论文、课题及成果的要求也水涨船高，而这一切往往都依赖于一个又一个的实验。作为科研主力军的研究生们整天挣扎在实验室中，为了拿到满意的实验结果而废寝忘食。实验技术的设计和操作是一个不断探索与总结的实践过程，即使是参考书或文献中看似非常成熟的操作技术，都有可能得不到预期的结果。在这些实践和探索过程中的每一个细小环节的盲点都可能导致我们一筹莫展，每一个细小环节都值得我们深入地探究和总结。在实验过程中，我们常常会碰到诸多“困惑”，在消除困惑的过程中，又必然会或多或少有一些“收获”。“失败是成功之母”，实验一线的科研人员几乎都有失败的经历，都曾面对着一个又一个困惑。那么，如何才能从这些困惑中寻找到“柳暗花明又一村”的解决方案，去收获成功呢？曾经在实验中尝过失败滋味的科研人员，最终收获成功的话，其中一定有很多来之不易的“秘诀”。我们将丁香园站友们的诸多“秘诀”汇集成册，这将是一本关于实验技术的“宝典”。
本书共收录了近200例实验技术的案例，分为核酸技术、蛋白质技术、细胞技术、微生物与免疫技术、动物技术、临床检验技术和海外实验室技术这7篇，每篇里又分了章和节，分门别类，条理清晰。本书100多名作者大多为丁香园网站站友，来自包括北京协和医学院、南京医科大学第一附属医院、南京大学医学院、浙江大学医学院等50多家医学院校、科研单位和医院，并得到了美国内布拉斯加医学中心大学的大力支持，为本书提供海外实验室技术案例。本书的案例，都是筛选来自基础医学、生命科学或检验医学一线科研人员在实验室操作过程中遇到的一些典型例子，内容有简单的仪器使用心得体会，也有对细胞培养技术的总结，动物损伤模型建立失败后的探索，分子生物学实验细节的剖析，还有临床检验结果失真的分析等。每一个案例从操作背景开始分析，到出现困惑，并一步步探索出解决方案，作者提出一些心得收获并进行拓展，最后得出箴言。编者均以极大的热情进行案例的整理、分析与写作，分享自己的经验与教训，案例素材均来源于日常实验工作，具有绝对的原创性与真实性。写作形式上采用“背景”、“困惑”、“探索”、“收获”和“箴言”的格式，写作风格上注重专业性与文学性相结合，语言生动活泼。本书犹如讲故事一样，引领读者一步步发现问题、分析问题和解决问题，从而使读者可以轻松愉悦地掌握一个个实验技术的要领。
本书所有案例都是工作中遇到的真实案例，在朴实和灵活的写作过程中为读者提供一种发现问题、解决问题的思路，给读者以启发，能够快速准确地发现并解决类似问题；另一方面也提示年轻医务工作者在工作中做一个“有心人”，勤于动脑和动手，遇到问题要学会思考，学会积累，积少成多，逐步锻炼科研能力。从另一个层面分析，困惑少了，假阴性、假阳性避免了，我们可以把更多的精力投入到保证实验结果的质量上去，出错概率随之降低，可极大提高工作效率。
希望本书能为实验人员在实验选题、实验设计、实验操作、资料搜集和结果分析等方面提供借鉴与帮助；希望本书能进一步推动国内实验人员实验技术水平。由于本书中的案例具有“跨学科性”，仅仅掌握本研究方向的知识往往是不够的，在系统阅读的过程中，亦是一次实验技术知识不断积累的过程。最后，本书也可作为研究生、本科生高等教育有关实验技术的教学和实践辅助参考书，将实验技术的各个知识点融入到医学教育中，让实验人员真正拥有攻克实验盲点的秘诀。
在本书付梓之际，感谢人民卫生出版社和丁香园网站为本书出版所做出的努力与支持！感谢所有参与编写的人员，你们的宝贵建议是本书进一步完善的源泉，你们的辛勤劳动与默默付出是本书质量的重要保证！感谢美国内布拉斯加医学中心大学王玮教授带领的团队和美国加州大学洛杉矶分校（University of California，Los Angeles，UCLA）饶建宇教授带领的团队为本书进行了细致的审稿工作！感谢南京医科大学和安徽医科大学的部分教师与学生们，他们参与了大量的校稿工作。由于编者能力所限，书中难免有疏漏之处，恳请广大读者不吝赐教，以使本书更趋完善。顾兵 王华 王汉军2012年8月Table of Contents第一篇 核酸技术 第一章 DNA提取和鉴定技术第二章 RNA提取技术第三章 质粒提取和构建技术第四章 PCR技术第二篇 蛋白质技术 第一章 蛋白质电泳技术第二章 Western blotting方法第三章 蛋白质免疫鉴定技术第四章 蛋白质纯化和蛋白质晶体技术第三篇 细胞技术 第一章 细胞培养的基本技术第二章 细胞污染第三章 细胞活力检测第四章 细胞凋亡检测第五章 流式细胞术第六章 相关技术第四篇 微生物与免疫技术 第一章 微生物技术第二章 免疫技术第五篇 动物技术 第一章 纲举目张——建模心得第二章 未雨绸缪——实验准备第三章 画龙点睛——实验技巧第四章 知己知彼——动物习性第六篇 临床检验技术 第一章 临床血液学与临床基础检验技术第二章 临床输血检验技术第三章 临床生物化学与分子生物学检验技术第四章 临床免疫学检验技术第七篇 海外实验室技术 Section 1.Brain sliceSection 2.Array-comparative genomic hybridization （arrayCGH）Section 3.Confocal Microscopy for Live Cell ImagingSection 4.CoronaryArteryLigation on MiceSection 5.Decerebration in RodentsSection 6.In-situ Carotid Sinus Nerve Electrophysiological RecordingsSection 7.Extracellular Single-unit Recordingin vivSection 8.Fluorescence in-situ Hybridization on Formalin-fixed，Paraffin-embedded Tissue SectionsSection 9.Isolation and Culture of Alveolar Macrophage and Peritoneal Mast CellSection 10.Acute Renal Nerve ActivityRecording on an Anesthetized RatSection 11.Renal Blood Flow Recordingin an Acute Anesthetized PreparationSection 12.Chromatin ImmunoprecipitationSection 13.PCR/RT-PCR/Q-PCRSection 14.Single-Fiber Recordingof Skeletal Muscle AfferentsSection 15.Co-Immunoprecipitation and Western BlottingTechniques文后彩图第一篇 核酸技术
核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。对核酸结构和功能的阐明，对核酸工具酶的研究开发，根据核酸的分子杂交性质建立的一系列分析技术，使我们能够按照自己的意愿来研究和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，以期最终防治疾病和保障人类健康。
核酸技术是用于研究DNA和RNA的技术。核酸技术大体可分为：提取和纯化技术，包括酚-氯仿提取、微柱纯化和凝胶电泳等；定量技术，包括紫外光谱定量、定量PCR和DNA芯片等；合成技术，包括寡核苷酸的从头合成和聚合酶链反应的特异合成等；其他技术，包括DNA测序、表达克隆、Southern印迹杂交和荧光原位杂交等。
对核酸的性质与功能等进行研究，必须对核酸进行分离和纯化。因此，核酸的分离与纯化是分子生物学中重要的基本技术，其中核酸样品的制备质量将直接影响后续研究与应用。
细胞内核酸包括DNA与RNA两类分子，真核生物DNA分为染色体DNA与细胞器DNA，前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者位于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。而原核生物中还有双链环状的质粒DNA。在非细胞型病毒颗粒内，DNA存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体。除配子细胞外，体细胞有两个同源染色体，故有两份同源基因组。染色体存在于细胞9核内，是基因组遗传信息载体。人类基因组的碱基数量约为3×10bp，是细菌基因组的1000倍以上。
RNA分子比DNA分子要小得多，分离纯化、完整的RNA对于分子克隆实验至关重要，也是进行基因表达分析的基础。由于RNA的功能多样化，因此RNA的种类、大小和结构都具有多样性。DNA与RNA性质差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。所有RNA实验中，最关键因素是分离得到全长RNA，而实验失败的主要原因是RNA酶污染，RNA酶在环境中很稳定，如果RNA制剂中存在少量RNA酶就会引起严重后果。为避免RNA酶污染，实验中所用试剂、玻璃器皿和塑料制品都需无RNA酶处理。
在克隆方案中经常使用细菌质粒。在天然的大肠杆菌分离株中可含有一些自主复制、环状的染色体外DNA分子，它们具有重要的生物学功能，如抗生素抗性和产生限制酶等。在20世纪70年代，利用自然存在的质粒DNA片段在实验室中构建了许多人工质粒，这些人工质粒以及它们的衍生质粒是重组DNA工作中最常用载体。质粒DNA分子具有一般核酸分子的理化特性，如能溶于乙醇等有机溶剂，在一定pH下可解离而带电荷，能吸收紫外线，可嵌入某些染料等。但质粒DNA不同于染色体DNA，质粒DNA具有较强的抗切割和抗变性能力。质粒DNA能够通过小量制备的方法得到分离。
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。像分子克隆技术一样，PCR方法的应用使许多以前不可能的实验得以完成，PCR应用正在不断地扩展，其中包括从基因组DNA和cDNA直接克隆目的基因、体外诱变和DNA工程、对法医样品进行的遗传指纹鉴定、病原体分析、遗传疾病产前诊断、基因等位序列变异分析、RNA转录结构分析、基因组印迹分析以及对基因组DNA和cDNA进行直接核苷酸序列测定等。
1953年，Watson和Crick发现DNA为双螺旋结构后，核酸技术的进步就一直在高速持续着，从核酸提取、测序、PCR、全基因组测序和基因芯片等，一直到后基因组时代，是那么地让人目不暇接。目前，我们做的每一个科研项目几乎都会涉及核酸，而我们实验又时常在核酸技术上受挫。实验技术的设计和操作是一个不断探索与总结的实践过程，即使是参考书或文献中看似非常成熟的操作技术，我们都有可能怎么也得不到预期结果。本章是关于核酸技术的一线科研人员所撰写，围绕着“困惑”、“探索”和“收获”的主线撰写。将科研工作者们的实验过程中的“困惑”和“收获”汇集成册，启示后来人，期待大家在今后科学实验中少走弯路。通过阅读这些凝聚着实验者心得体会的精华故事，读者一定能在阅读中思考领悟，得到自己应有的收获。第一章 DNA提取和鉴定技术第一节 如何获得高产量DNA
【背景】
研究生在读期间，指导老师很忙，所以老师口头指导结束后，很多实验由本人独立操作。在实验正式开始之前，本人通过对分子生物学相关理论知识的短期突击，基本掌握DNA是遗传信息的载体、重要的生物信息物质和分子生物学研究的重要对象，同时也深知获得高分子量和高纯度的DNA是后续测序、杂交和基因表达检测的前提。因此，做好DNA提取实验是首要任务。在第一次提取DNA实验中，本人严格按照说明书操作进行，结果提取的8个样品中DNA浓度全部偏低，浓度均在20ng/μl左右，还有3个标本浓度只有0～10ng/μl之间，看到这一结果后深感郁闷，也体会到许多事情还真是说起来容易、做起来难。
【困惑】
不幸的是，第二次DNA提取实验结果仍以失败而告终。我又拿出说明书仔细研读，回顾老师提及的实验注意事项：严格按照说明书、动作轻柔和裂解要充分等。然而，如何尽快找出实验失败的原因和把握好实验中的主要影响因素？这些问题已经严重影响了我后续实验的顺利开展。
【探索】
至此，我把DNA提取实验原理和流程研读几遍，每个关键环节逐一分析。
1.标本和试剂的检查
标本是否反复冻融？标本采集是否为非肝素抗凝？所有使用到的试剂是否均在保质期内？因为标本不是自己收集的，而是从实验合作的一名医生那里取的标本，曾经遇到护士抽血用错真空采血管后，直接把血转倒入正确的真空采血管。所以，打电话亲自核实后，确定标本全部合格，也未反复冻融过，且所有试剂均在保质期内。
2.增加标本量是否可以增加DNA浓度？操作是否还不够规范？
在实际操作前，查阅资料提示，标本量过多会影响细胞裂解，继而导致DNA含量的降低；在高温水浴时要注意定时轻柔振荡。其实此时“轻柔”的确很重要。先前只注重定时，而忽略了轻柔操作，振荡时采用指弹PCR管的方法，有可能会引起DNA机械断裂。此外，本人在实验后续操作中也不是格外轻柔，因为总认为用的是带滤芯“枪头”不会引起交叉污染，使用微量移液器的时候吹打动作较快和较剧烈，难道这也能给脆弱DNA带来伤害？带着这些疑问备战下一次DNA提取。
3.DNA沉淀、干燥和溶解是否出现问题？
如果DNA沉淀不够充分也会影响DNA含量，但是我是按照说明书上的操作，严格控制异丙醇和70%乙醇的量和时间。后来经指导老师点拨，使用预冷异丙醇和乙醇更有利于标本DNA沉淀，因为DNA不溶于异丙醇和乙醇（尤其在低温条件下），但是细胞中的某些物质则可以溶于此类溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。但是说明书上并未写对异丙醇和乙醇最好预冷，所以我们在操作时一定要理解透彻每一步的原理和作用，之后我又根据情况适当延长了一点沉淀时间。
通过改进上述几个环节，本人再次提取DNA实验获得了圆满成功。
【收获】
1.提取DNA操作并不难，但是当结果不理想时，我们要学会分析和讨论。这就要求实验人员掌握DNA提取的实验原理、操作步骤的意义和注意事项，以及熟悉操作规程中的可变步骤。
2.DNA提取常见问题（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR扩增：DNA含有蛋白质、多糖和酚类等物质时，应重新纯化DNA；DNA溶解前要充分晾干，以免乙醇残留而影响后续酶解反应；若DNA中残留金属离子，通过增加70%乙醇的洗涤次数来去除；若RNA残留则可加入RNA酶降解RNA。（2）DNA降解：尽量使用新鲜标本，避免反复冻融；若提取过程中操作过于剧烈，DNA会被机械力打断，故细胞裂解后的操作应尽可能轻柔；外源性核酸酶污染也会导致DNA降解，故实验中涉及的试剂和耗材均要避免核酸酶污染。（3）DNA提取量少：标本本身不好，如再生障碍性贫血病人体内血细胞含量很少，此时我们要根据具体情况灵活掌握调整方案；裂解不充分将直接影响细胞内DNA的释放，故裂解细胞时要保证裂解液和标本量的比例合适，裂解时间要足够；异丙醇或70%乙醇吸附或沉淀不完全，这无形中就会造成DNA的损失，故建议用预冷的异丙醇和（或）乙醇，或延长沉淀时间；洗涤时DNA的丢失，也可造成DNA提取量少，故在倾倒上清、留取沉淀的步骤中一定要缓慢小心进行，不可急躁，以免DNA丢失。
【箴言】
知其然更要知其所以然，只有这样才能把许多事情做好。因此，我们在实验操作中不仅仅要知道按照说明书操作，更要明白其中的操作原理和注意事项，只有这样才能应对各种问题的出现，灵活采取各种应急措施。（李贵玲，邮箱为liguiling728@163.com）第二节 乙醇沉淀核酸中盐的作用
【背景】
进行核酸相关研究，首先要对核酸进行分离和纯化。乙醇沉淀法因其通过沉淀来改变和重新调节核酸溶液的浓度，并可去除溶液中某些盐类和杂质，在一定程度上将核酸纯化，且操作简便，回收率高，是浓缩核酸最常用的方法。在乙醇沉淀核酸的操作中要加入一定浓度的盐，多数书本写明所需加入盐的种类和浓度，通常为0.3mmol/L醋酸钠（NaAc），然而许多实验人员对是否一定要加入盐，加入何种盐、何种浓度的盐回收效率较高并不是很清楚，只是按照书上所写的实验步骤进行操作。
【困惑】
在实验操作中我们发现若在乙醇沉淀核酸的过程中不加入盐，回收效率很低，几乎为零，这提示盐在乙醇沉淀法中起着重要作用。那么加入何种盐回收效率较高？加入盐浓度为多少时回收效率较高？这些看似简单的问题却引起我的关注。
【探索】
我们在实验中用不同浓度的一价盐和二价盐对回收效率的影响开展研究。
1.不同浓度的一价盐对在乙醇沉淀核酸实验中核酸回收效率的影响
取50μl核酸溶液，分别加入不同体积3mol/L NaAc，双蒸水补足至100μl，加入2倍体积无水乙醇，使溶液中的NaAc的浓度依次稀释为0、0.5、1、1.5、2.5、5、10、50、100和500mmol/L。离心，70%乙醇洗涤，20μl双蒸水溶解后测紫外分光光度值。结果见表1-1-2-1。表1-1-2-1 不同浓度NaAc对乙醇沉淀核酸回收效率的影响
用origin7.0软件作图得到NaAc浓度（x坐标）与回收效率（y坐标）的点线图（图1-1-2-1）。图1-1-2-1 NaAc浓度与回收效率的点线图
由表1-1-2-1和图1-1-2-1可以发现，当NaAc浓度为0时，回收效率也基本为0；随着盐浓度升高，回收效率也逐渐上升。当NaAc浓度升高至50mmol/L时，出现一个转折点；当NaAc浓度继续增大时，回收效率又经历一次上升期和之后的缓慢下降期。
为了验证此实验结果是否具有普遍性，我们摸索了不同浓度氯化钠（NaCl）对乙醇沉淀核酸的影响，本试验所用NaCl浓度为3mol/L NaCl。其余的处理设计完全同上述NaAc。实验结果见图1-1-2-2。图1-1-2-2 NaCl浓度与回收效率的点线图
通过与图1-1-2-1对比，不难看出一价盐对乙醇沉淀核酸的影响具有共性。
2.不同浓度二价盐对乙醇沉淀核酸实验中核酸回收效率的影响
本试验所用盐为氯化钙（CaCl）。其余设计完全同上述NaAc。2结果见表1-1-2-2。表1-1-2-2 不同浓度CaCl对乙醇沉淀核酸回收效率的影响2
用origin7.0软件作图得到CaCl浓度（x坐标）与回收效率（y坐2标）的点线图（图1-1-2-3）。图1-1-2-3 CaCl浓度与回收效率的点线图2
由表1-1-2-2和图1-1-2-3可以看出CaCl的回收效率走向和一价盐2略有不同，其转折点出现在10mmol/L处，但整体趋势相似。同样为了确认二价盐对乙醇沉淀的影响，我们又研究了氯化镁（MgCl）对2乙醇沉淀核酸回收效率的影响，本试验所用盐为3mol/L MgCl。其余2的处理设计完全同NaAc。结果见图1-1-2-4。
由图1-1-2-4可以看出二价盐MgCl的回收效率走向和二价盐2CaCl基本相同。这些结果提示，这些规律可能具有普遍性。从上面2的一价盐和二价盐实验数据中可以看出，当盐浓度为0时，核酸回收效率接近0；一价盐在100mmol/L处达到最高回收效率，二价盐在50mmol/L处达到最高回收效率。图1-1-2-4 MgCl浓度与回收效率的点线图2
【收获】
通过本次探索，我们发现盐在乙醇沉淀核酸实验中起关键作用，且不同价态的盐在不同浓度时回收效率是不同的，一价盐在100mmol/L处回收效率最高，二价盐则是在50mmol/L处。这些结果对今后乙醇沉淀核酸实验具有实际指导意义。此外，在探索实验中我感受到自己探索知识过程中的乐趣，从书本出发，发现问题，继而解决问题，以一种思考的态度做实验，收获到的知识比预想的要多得多，无形中提高了自身发现问题的灵敏度，同时带有好奇心的探索过程会促使你对整个实验充满激情。
【箴言】
以上结果表明，盐在乙醇沉淀核酸中起着重要作用。同时，建议大家在平常的学习和实验中一定要抱着思考和批判的态度，古语有云：“尽信书则不如无书”，思考、怀疑和验证的过程会让你获取更多知识，进步更快。（解晓露，邮箱为xiaoluxie126@126.com）第三节 核酸抽提中乙醇洗涤的作用
【背景】
在分子生物学实验中，实验材料中核酸（质粒DNA、基因组DNA或细胞总RNA等）的抽提是非常普遍且重要的操作。然而，一般的核酸提取方法通常写明，在核酸沉淀之后，需要75%乙醇洗涤1～3次，然后再用含RNA酶抑制剂的水或者TE缓冲液溶解。这些洗涤步骤，由于看似不太重要，且操作比较烦琐，还有人认为洗涤可能会造成核酸的损失，因此不被重视或者直接被省略。
【困惑】
如果省略洗涤步骤，有时可能会导致很严重后果，如可能会造成吸收光谱的异常，表现为A吸光值偏高，但是电泳结果却提示核酸260含量很低；更常见的后果是影响后续聚合酶链反应（PCR）、逆转录（RT）-PCR或者酶切实验。
【探索】
本次实验对一些核酸抽提的样品进行分析，测量其260nm、270nm和280nm的吸光值，结果详见表1-1-3-1。表1-1-3-1 几个核酸样品的紫外吸收光谱结果
上述样品中，1～7号样品都没有充分洗涤，而8和9号样品则用70%乙醇充分洗涤了2次。根据A值的大小和A/A比值，1～7260260280号样品都还是可以的，浓度也差不多。然而，1～7号样品的实际浓度远低于按照A计算的结果，其中7号样品实际浓度接近0。因此，260用这些样品做PCR或酶切肯定也没什么好结果。
为什么会产生这样的结果？我们对光谱结果做了分析，发现未洗涤的样品A值明显偏大。而核酸抽提中最常用试剂——酚在270nm270恰好有一个最大吸收峰，实际上酚在270nm的消光系数还是相对很大-1-1的，大约在1 300～1 500Mcm。我们用水饱和酚的水相测量结果显示，稀释1 000倍后仍然有较强的吸收，其A/A为0.581左右，260270而对纯品核酸的测量结果表明，其吸收峰在260nm，而A/A约为2702600.845。这些结果提示，上面未洗涤的样品内很可能是残留了酚而导致光谱吸收异常。对此，我们简单列了一个方程，设A=0.581x+y260和A=x+0.845y，其中x为酚在270nm吸光度，y为RNA在260nm吸270光度，得y=（A-0.581×A）/（1-0.581×0.845）=（A-0.581×260270260A）/（1-0.584× 0.845）=1.974（A-0.581×A）。这样就可以270260270算出样品中实际所含核酸在260nm的吸光度。我们用这个公式对表1-1-3-1结果重新分析，结果详见表1-1-3-2。
表1-1-3-2结果显示，充分洗涤样品用公式修正前后A值变化不260大，而未洗涤样品修正前后A值相差较大。试想若轻信未修正的错260误数据，可能对后续实验造成严重影响。表1-1-3-2 核酸样品的紫外吸收光谱的修正结果
【收获】
一般，分子生物学实验手册上注明乙醇洗涤的作用是去除盐类，或者在使用异丙醇后乙醇使样品容易晾干。本实验结果发现，乙醇洗涤还有一个重要的作用是去除核酸样品中残留的酚。酚在紫外区的吸收相对是比较强的，即使有少量残留，也会对样品的光谱吸收造成严重影响。此外，酚还是很多酶的抑制剂。使用含有酚的核酸样品，也影响后续涉及酶反应的实验。因此，乙醇洗涤在核酸抽提过程中起重要作用。上述结果也提示检测核酸的量和纯度不能只测A和A，260280测量270nm的吸光度对于一些用酚抽提的样品也是必要的，也可用我们给出的公式对残留酚的量作估计。最后，我们结果还表明，用异丙醇沉淀的核酸中酚的残留比乙醇沉淀更严重，这提示乙醇洗涤更加重要（结果未在文中列出）。
【箴言】
以上结果表明，乙醇洗涤对于核酸抽提非常重要。所以，对于分子生物学实验操作，我们要铭记“勿以善小而不为”和“知其然，还要知其所以然”。只有这样，才能使我们的各项实验工作更加顺利，行之有效，起到事半功倍的效果。（徐蕾，邮箱为hsuley@gmail.com）第四节 DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染
【背景】
最常用的DNA区带染色方法是溴化乙锭（EB）染色。EB是一种高度灵敏的荧光染色剂，结合到DNA分子上的EB被紫外线照射激发产生荧光而达到观测目的。尽管这种方法简便快速，并且能满足大多数实验要求的灵敏度，但是它有两点不足之处：第一，EB具有致癌作用，使得对凝胶的操作和处理变得复杂；第二，需要合适的紫外照射与防护装置。
【困惑】
DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法除可克服上述缺点外，还具有较高灵敏度。DNA银染是用硝酸银对聚丙烯酰胺凝胶上的DNA进行+染色的方法。银染液中的Ag可以与DNA形成稳定的复合物，在碱性环境下，甲醛使银离子还原成银颗粒，使DNA条带呈黑褐色而显现出来。其灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收。其实，DNA银染方法也深受操作细节的影响而出现高背景、显影过度和杂带等难题。
【探索】
DNA银染步骤包括电泳、固定、染色和显色等步骤。下面是操作过程中需注意的细节。
1.银染前准备（1）银染固定液和显影液有几种配制方法，我们采用的固定液是10%冰醋酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。显影液用的是10%碳酸钠，显影液要提前配制，放入4℃冰箱预冷。显影液若没有充分预冷，显色时间难以控制。（2）硝酸银溶液浓度不宜超过0.15%。硝酸银浓度越高，胶越黄越丑。我们用的是0.1%硝酸银溶液。硝酸液溶液需现用现配，时间长了硝酸银会分解。（3）银染水质要求较高，推荐使用双蒸水或去离子水。（4）装胶器皿需清洗干净，最后用双蒸水多冲洗几遍。（5）操作时戴手套，避免在胶上印上指纹。（6）跑胶时最好采用大梳子、小样本量。因为银染本身分辨率就很高，样本量太大时，杂带太浓，且小梳子的条带比较模糊。
2.银染过程（1）银染时间不可过长，否则胶的背景太深。（2）染色后充分地漂洗可以降低背景染色，因此漂洗时间至少1分钟。同时水洗时间也不能太长，以免DNA被洗掉，染出来颜色背景是黑的，DNA处为白色。（3）显影时看到模糊条带后，立即用大量双蒸水冲洗，终止显影。如果看到清晰的目标条带时再终止显影，可能显影过度，拍片时背景极深。（4）采用低浓度、长时间显影策略。实践证明，较高浓度溶液容易显影过度。（5）为便于控制显影速度，银染的显影液温度不要过高。（6）显影后尽早拍片。早拍的片子分辨率较高，杂带少。随着时间延长，胶片会逐渐变黄，条带越来越浓，最后杂带逐渐显现。
【箴言】
我们在DNA银染过程中，通过改变染色液浓度和时间以及显影液的浓度和时间等细节来优化实验结果。（魏源华，邮箱为labmedicine@126.con）第五节 荧光素酶双报告基因中调节目的质粒与内参质粒比例是关键
【背景】
荧光素酶报告基因是将载体转染到细胞中，通过荧光素酶检测系统测定荧光素酶基因的表达，进而反映靶基因的表达或启动子的转录效率等。随着1986年萤火虫荧光素酶基因的发现及应用，荧光素酶报告基因系统已经广泛用于生物学和分子生物学等研究领域。为了使报告基因检测均一化，通常在转染目的报告基因的同时，转染一个内参质粒。既往使用的内参基因通常为β-半乳糖苷酶（β-Gal）或氯霉素乙酰转移酶（CAT），但是因其在定量前需要长时间保温，并且不少细胞中含有内源性表达，灵敏度不够，给实验带来不便。因此，目前广泛使用的是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）结合的报告基因系统。本课题组采用荧光素酶报告基因来评价给药后某蛋白转录水平的变化。实验中，将构建好的含有目的蛋白结合位点和萤火虫荧光素酶的质粒导入细胞中，并共转作为内参的Renilla荧光素酶质粒，使用国外某公司提供的双报告基因检测试剂盒检测系统中两种荧光亮度以评价目的蛋白的转录活性变化。
【困惑】
实验室初次使用双报告基因这一实验技术，在试剂的使用剂量及操作步骤上处于摸索阶段，且报告基因检测受多种因素影响，如细胞状态、转染效率、加样精度和裂解效率等。因此，如何成功地完成这一实验？可能需要解决的问题有：①细胞转染时间为多长？②转染试TM剂使用的为国外某公司的Lipofectamine2 000（Lip2000），这一转染试剂使用的量为多少？③如何增加质粒的转染效率？在转染过程中，目的质粒与内参质粒分别转染多大量，其比例为多少？④如何增加细胞的裂解效率，裂解后是否需要离心？⑤实验中有哪些注意事项，哪些细节会影响实验结果？……这些问题成为阻扰实验开展的难题，如何解决这些问题是完成这一实验的关键。
【探索】
明确存在问题后，我咨询了很多之前做过荧光素酶报告基因实验的研究生和老师，查阅了相关文献，并在网上搜索了大量关于报告基因实验的资料，结合自己的实验情况，制定了一系列的实验解决方案。
1.解决细胞培养中存在的问题（1）质粒转染多长时间合适？之前实验室做过siRNA的相关实验，转染时间一般在18～48小时，而质粒转染时间也在18～48小时。故本实验中选定24、36和48小时这3个时间点，通过检测Renilla的荧光强度，发现36小时的荧光强度相对比24小时高，而培养48小时后的细胞荧光强度与36小时无差异。（2）使用转染试剂后，是否在24小时的时候更换为正常培养基？Lip2000这一转染试剂对细胞生长是有毒性的，且在转染时，使用的是无血清无双抗的培养基，不更换培养基是否会影响细胞状态？之前siRNA实验提示，不更换培养基，细胞状态不佳，且细胞死亡数目较更换培养基的要多。因此，在转染24小时后，将培养基更换为正常含血清的培养基。
2.如何增加细胞转染效率？（1）转染试剂Lip2000的使用量为多少？
在实验中，使用的转染试剂为国外某公司的Lip2000，根据说明书，DNA与Lip2000的使用比例为1∶2到1∶3，如在24孔板中，加入0.8～1.0μg的质粒，需要2～3μl的Lip2000。而转染8.0μg的质粒，需要20μl的Lip2000。由于Lip2000转染效率的局限性，其使用量是较大的，这提示，我们在转染24小时后，需要将培养基更换为正常培养基。（2）目的质粒与内参质粒的比例多少为最佳？
咨询之前做过双报告基因实验的同学，内参质粒（Renilla，海肾荧光素酶）的转染量通常为10ng，而与目的质粒（萤火虫荧光素酶）的比例通常为1∶20～1∶50，但转染效率会因为细胞及质粒的不同而不同。文献中提到有两种不同比例，一种为1μg的Renilla和10μg的目的质粒；另一种为1ng的Renilla和200ng的目的质粒。我们先使用10ng的Renilla，并且选择与目的质粒的比例为1∶20及1∶50这两个比例，进行预实验。结果显示，在这两个比例中，Renilla的荧光强度可以达到1万以上，但目的质粒的荧光强度却只有几百，比值太小，数据缺乏可靠性。根据之前实验结果，转染10ng的Renilla荧光强度已经能达到1万多，说明该转染量不存在问题，故只需增加目的质粒的转染量。查阅丁香园等实验技术网站后，发现实验中两者的比例可以达到1∶1 000，甚至达1∶10 000。因此，在接下来实验中，又分别尝试了1∶1 000、1∶4 000和1∶8 000这几个比例，相对的把Renilla的转染量降到1ng。结果显示，1∶8 000的比例，即转染1ng 的Renilla荧光强度为几千，目的质粒的荧光强度也为几千，给药后的甚至能达到1万，这样的比值可以用于统计。
3.使用试剂盒检测荧光强度
转染成功后，使用国外某公司的双报告基因试剂盒进行测定。操作步骤参照说明书，选用被动裂解及手动进样方式进行检测。（1）试剂准备和贮存：
试剂盒中试剂是需要自己配制，因为试剂的新鲜程度对实验结果的精确度也起着重要作用。试剂盒提供5×PLB，使用浓度为1×PLB。在这个实验中，PLB是现用现稀释；荧光素酶底物需要用试剂盒中提供的Buffer溶解，溶解后必须放于棕色瓶，-20℃贮存待用；用于淬灭萤火虫荧光及海肾荧光素酶底物的Stop＆Glo试剂，由于贮存时间较短，我选择了现配现用，且配制好的试剂须用锡箔纸包严，以免见光分解，影响后续实验结果。（2）被动裂解的过程：
不少实验室在被动裂解后，会将裂解后的液体吸出，1000rpm短暂离心1分钟，在实验中，我对同组两个样品采用离心或不离心处理，结果显示，离心后对荧光量并无影响。
【收获与拓展】
1.荧光素酶报告基因技术是一种很重要的实验技术，不仅可以用于监测目的基因的表达，也越来越多地被应用于体外监测细胞生长、增殖以及与基因表达和信号转导有关的细胞活动。近年来，荧光素酶因其在药物筛选中具有特异靶点、高敏感性和高通量的特点，使得在新药研制领域中，高效和特异地筛选有机小分子化合物成为可能。随着报告基因技术的发展、检测方法的改进以及更多无毒害报告基因的发现，我们坚信，报告基因在基础研究、临床实践，甚至药物治疗中都将被广泛应用。
2.荧光素酶报告基因技术的最大优势是精确度高和灵敏度高。相对于western blotting（WB），荧光素酶报告基因的灵敏度高1 000倍以上，具有可靠的统计学原理。虽然荧光素酶报告基因相对WB有灵敏度高和检测快等优势，但是我们并不会放弃WB的实验方法，样品在进行WB检测后，再使用荧光素酶检测，可以使实验结果更加可信。
3.虽然荧光素酶报告基因技术有很多优点，如操作简便，但是要得到良好的实验结果，还是有许多注意事项，具体如下：（1）报告基因检测结果往往会受到加样量及操作的影响。为了避免操作误差，在同批样品中，我们建议做3个或者3个以上的复孔，海肾荧光素酶内参报告基因相对于传统使用的内参基因，可以与萤火虫荧光素酶具有同样的精确度和灵敏度，是理想的双报告基因；而国外某公司生产的双报告基因试剂盒结合萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，提供一种先进的双报告基因技术。（2）在本次实验中，我们发现细胞转染时间不宜太长，36小时相对其他时点，细胞状态稍好，且裂解相对简便快捷。（3）做好荧光素酶报告基因的关键是找到最优的目的质粒与内参质粒的比例。对于不同实验有不同具体情况。实验前，最好先做预实验，确定最佳比例和剂量。两者比例可以由1∶10、1∶50或1∶100开始摸索，根据结果调整，最大的比例甚至可以达到1∶10 000。如果海肾荧光素酶的发光值比萤火虫荧光素酶的发光值大2个数量级，即海肾荧光素酶的发光值为几万，而萤火虫荧光素酶的发光值为几百，甚至几十，这样相对荧光值是不科学，且不能采用的。普遍认为，萤火虫荧光素酶检测的发光值大于海肾荧光素酶发光值且两个荧光素酶发光值相差一个数量级较好。但是转染的质粒不是越多越好，过高的转染量甚至会影响细胞的转染效率。Renilla内参质粒的转染量通常为1～10ng。（4）荧光素酶发光值的结果分析：
A.检测值只有几百，说明样品中荧光素酶表达过低，可能与细胞状态、转染量和条件有关，此时可以调整转染条件或转染量，以提高发光值。
B.检测值可以达到几万甚至几十万，提示超过检测仪器的上限，数值的准确度下降，此时需要适当降低转染量来降低发光值。（5）国外某公司提供的试剂盒中说明双荧光素酶反应体积为裂解产物（20μl）-萤火虫荧光素酶底物（100μl）-海肾荧光素酶底物（100μl）。但是在实验中，我们尝试了2个反应体积，即说明书上推荐的反应体积和将该反应体积减半。结果发现，两个不同的反应体积，其荧光素酶的发光值无差异。故实验中，在节约试剂的前提下，可以采取以下反应体积：裂解产物（10μl）-萤火虫荧光素酶底物（50μl）-海肾荧光素酶底物（50μl）。（6）细胞用PLB裂解时，裂解产物无需离心。离心后的结果与不离心的结果无差异。细胞裂解产物可在-20℃中保存1个月。此外，荧光素酶报告基因中使用的液体最好是现配现用，配制好的液体必须严格保存在规定温度中，注意避光，尽量减少反复冻融次数，以免试剂失效。（7）在检测过程中，裂解产物与底物混合加样速度要快，所有样品的混合时间要尽量一致，加样过程避光。
【箴言】
一系列实验结果显示，做好荧光素酶报告基因的关键是确定最佳的目的质粒（萤火虫荧光素酶报告基因）和内参质粒（海肾荧光素酶报告基因）的比例。此外，为了保证好的实验结果，建议大家在操作过程中多注意细节。国外某公司生产的双报告基因试剂盒提供了科学的双报告基因技术，若有需要，可考虑使用。（陈洁，邮箱为simpleme7977@163.com）第二章 RNA提取技术第一节 如何提高RNA提取质量
【背景】
在进行大学生创新实验的过程中，我掌握了许多实验技术，这些技术无论是在细胞生物学、免疫学检验还是分子生物学领域都有着非常广泛的应用。为了研究几个基因在mRNA水平上的表达，我们开始在半定量逆转录（RT）-PCR扩增技术上进行了大量的尝试与思考。
【困惑】
在整个试验中，我们用得最多的技术就是半定量RT-PCR，所以对于MMP-9、MCP-1 和β-actin mRNA这3个基因的提取就显得关系重大。刚开始几次用TRIzol试剂提取总RNA时，最后检测结果并不是太理想，RNA的浓度和A/A比值根本达不到可接受的范围。由于260280当时技术不熟练及提取步骤不完善，我们认为是DNA、有机溶剂或RNA酶的污染。到底该如何改善我们的操作步骤，提高核酸纯度和完整性呢？
【探索】
接着，我们将实验想法与实验室里的学长交流，他建议我们要在拥有有效提取试剂的前提下，重点要在实验细节上多思考，且严格防止RNA酶污染也是重中之重。查阅文献并借鉴前人经验后，我们首先作了如下调整：
1.RNA提取物品准备
EP管、PCR反应管和枪头等均以0.1%DEPC溶液浸泡12小时以上，120℃高压灭菌30分钟，烘干后备用。操作中戴口罩、手套，以防RNA酶降解RNA。试想提取RNA全程中都要接触这些物品，如果只是因为物品没有准备好而影响RNA质量的话就太可惜了。
2.样品制备与分离
取生长状态良好的细胞，移去培养液，并加入适量TRIzol试剂，移液器反复吹打至透明无颗粒，转移细胞裂解物至EP管中，4℃下静置5分钟。我曾经试过把贴壁细胞先用胰酶消化后再加TRIzol，可结果证明提取质量并不佳，故不需要胰酶消化。
3.RNA的沉淀
4℃下12 000g离心10分钟，取上清。按0.2ml氯仿/1ml TRIzol加入EP管内，振摇15秒，4℃孵育5分钟；4℃下12 000g离心15分钟。迅速转移EP管内上层无色液相至另一EP管。按0.5ml异丙醇/1ml TRIzol加入EP管内，盖上管盖，剧烈颠倒多次以彻底混匀，样品在4℃下孵育20分钟。再在4℃下12 000g离心10分钟，可见乳白色沉淀物附在管壁，弃上清。这步中氯仿可将溶液分成3层，实验者一定要特别注意不要吸到中层和下层的DNA或蛋白，否则会严重影响RNA纯度。
4.RNA的洗脱和再溶解
向EP管内加入1ml 75%乙醇（DEPC水配制），漩涡振荡混合样品，4℃下7 500g离心5分钟，再次得乳白色沉淀，弃上清。空气干燥RNA沉淀5分钟后，用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5%SDS溶液来重新悬浮和溶解RNA。需要提醒的是这步干燥RNA时也不能让沉淀完全干燥，否则后面RNA难以完全溶解。
5.样品鉴定
抽提好的RNA进行琼脂糖凝胶电泳并用EB染色，可见2条核糖体RNA条带位于5kb（28S）和2kb（18S），低分子量RNA介于0.1kb和0.3kb之间（tRNA，5S）。A/A比值为2.0左右是高质量RNA的标260280志。
我们认为在所有RNA实验中，实验失败最常见的原因是RNA酶污染，导致分离不到全长RNA。所以，为了获得高质量RNA，一方面要严格控制外源性RNA酶污染；另一方面要最大限度地抑制内源性RNA酶。由于我们实验中用的都是细胞，且研究的RNA都是制备完成后立即逆转录，并不涉及保存问题，所以我们更加关注的是外源性RNA酶污染，但如果是提取组织RNA，便可以保存于-80℃冰箱或液氮环境下。外源性RNA酶存在于操作环境中，实验所用的试剂、EP管等都有可能受到污染。经查阅资料和本实验探讨发现，防止RNA酶污染措施有：①所有玻璃器皿均应在用前于180℃高温干烤4～6小时；②EP管应严格用0.1%DEPC水浸泡；③试剂配制应尽可能用0.01%DEPC，在37℃处理12小时以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC；④操作人员戴一次性口罩、帽子和手套，实验过程中手套要勤换；⑤设置RNA操作专用实验室，所有器械和耗材均为专用。
考虑到一切可能的因素，小组人员严格遵守操作步骤提取RNA，采取一切措施防止RNA酶污染。经此多次尝试后，最后RNA纯度和浓度的鉴定结果终于达到了可接受范围（有几次纯度甚至达到了1.9～2.0），这充分证明我们的改进措施是有效的。所以，为获得高纯度和完整片段RNA，优化实验操作步骤和防止RNA酶污染非常重要。
【箴言】
RNA提取的前期准备工作和每个实验细节都有可能影响RNA质量。为获得高质量RNA，操作人员应最大限度地使实验中的每个步骤都得到优化，尤其注意防止RNA酶污染。（柯星，邮箱为conankx@yahoo.cn）
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]