作者：邵淑娟,郝立宏
出版社：辽宁科技出版社
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电子显微镜技术在医学领域的应用试读：
前言
电子显微镜技术（简称电镜技术）作为研究微观世界的工具，其应用日益广泛，在生命科学领域为医学、生物学研究开拓了崭新的视野。尤其是医学领域，在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学、分子生物学及分子病理学上均做出了卓有成效的贡献。近年来，电镜在临床医学的实际应用中，如对疾病的病情、病因的鉴定，对肿瘤、肾病、血液病等的分型诊断中都起着重要作用。目前，广大的医学院校学生、科研人员、医务工作者都迫切需要这方面的知识。特别是在分子生物学技术普及后的今天，人们更加迫切地想了解直观可见的超微结构，作为形态学观察的重要手段——电子显微镜技术重新又回到了科研工作者的视野。
本书编写人员承担任务如下：邵淑娟第一章；邵淑娟、吕广艳、曲淑贤第六章；郝立宏第二章、第三章、第十四章；郝立宏、高船舟第十八章；刘渤第四章；丁艳芳第五章；马海英第七章；宫琳琳第八章、第十二章；张丽媛第九章；周欣第十章、第十一章、附录；于丽君第十三章；宋阳第十五章；胡军第十六章、第十七章。
本书是一本电镜技术的实用性手册，既可作为高年级本科生和研究生科研参考书，也适合从事电子显微技术研究的科研人员参考。
感谢首都医科大学组织胚胎学教研室周德山教授提供了许多电镜照片。本书得到了辽宁省科学技术协会的资助出版，同时也得到了辽宁科学技术出版社的大力支持与帮助，在此一并表示衷心感谢。
由于编写水平有限，特别是对一些新型电镜及某些特殊制样技术缺乏实践机会，书中难免有疏漏与错误，恳请读者批评指正，以不断完善本书。编者2014年6月上篇电子显微镜的原理及结构第一章电子显微镜的发展简史及应用
电镜技术是一门现代化的显微科学，电子显微镜是研究组织和细胞超微结构的一种重要工具。超微结构一般是指光学显微镜不能分辨的组织和细胞内的细微形态和一些生物大分子结构。电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的倍数下成像的仪器。
人类认识自然界大部分信息来自眼睛，用眼睛在宏观水平上研究观察世界。但是，正常人眼在25cm明视距离时，只能分辨相距0.073mm的物体，也就是说，小于0.073mm的两个质点，人眼分辨不清。为了能够看到物质结构更小的细节，科学家发明了放大镜、望远镜和显微镜等仪器，不断提高了人眼的分辨率。
显微镜的发明使人类对微观世界的认识大大地前进了一步。1665年Robert Hooke发明了第一台光学显微镜。经过300a的不断发展，已经制造出许多种类的光学显微镜，如紫外显微镜、红外显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜及暗视野显微镜等。借助这些显微镜，人眼看到了细胞、细菌。随着对这些领域研究的深入，出现了细胞学、微生物学、遗传学、血液学和病理学等重要学科。这些光学显微镜所用的光源基本上是在可见光范围内，它们已经能够分辨大于0.2μm的物体的细节，优于人眼500倍，放大倍率最高能达到2000倍，但是小于0.2μm的细小结构却无法分辨。
随着科学的进步及人类对微观世界探索的深入，人们必然要寻求更高分辨率和放大倍率的仪器，由此诞生了电子显微镜。电子显微镜的发明突破了光学显微镜由于光波的衍射效应所限制的分辨率的极限，使许多光学显微镜下不能解决的问题获得了明确的回答，使人类对微观结构的认识又产生了一个新的飞跃。电子显微镜的发展和应用对自然科学，特别是对生命科学的发展起着极其重大的推动作用。可以说，在生命科学领域中，没有一个学科不需要电子显微镜的配合。如在20世纪60年代前后出现的细胞生物学、分子生物学、分子遗传学、分子病理学、分子药理学、病毒学和电子显微镜诊断学等新兴科学，都是以电子显微镜技术为基础和前提而发展起来的。电子显微镜的出现，使人们能在原子的尺度上观察研究物质的结构，人们的观察由宏观世界进入到了原子级的微观世界。不久前，日本电子推出分辨率达0.63的透射电镜JEM-ARM300F，使透射电镜的分辨率进一步提高。一、电镜的发展和种类
要想对微观世界进行探索和研究，必然要寻求高的分辨率及放大倍率的仪器。由于受光波波长的局限（可见光的波长不能小于4000），光学显微镜的最高放大倍率为2000倍，其分辨率在理论上不能小于0.2μm。为此，促使人们去寻找更短波长的照明物质。
1873年，Abbe提出分辨本领与照射光的波长成反比，这一物理发现奠定了电子显微镜的理论基础。
1924年，Louis de Broglie（1929年诺贝尔物理奖得主）提出电子本身具有波动的物理特性。根据波动学说，运动着的电子可以看作是一种电子波，电子运动的速度越高，电子波的波长越短。如受100kV高压加速的电子，其波长为0.0375，受200kV高压加速的电子，其波长仅为0.025，即波长与加速电压成反比。该理论的提出进一步为电子显微镜的研制奠定了基础。
1926年，德国物理学家H Busch发现电子可以像经过玻璃透镜偏折一般，由电磁场的改变而偏折，证实了轴对称分布的电磁场具有能使电子束偏转、聚焦的作用，与光线通过玻璃透镜时能够折射、聚焦的原理一致，从而找到了相当于光学显微镜中的透镜——电子透镜，即具有轴对称的磁场对电子束起着透镜作用。电子束代替可见光，电子透镜代替光学透镜，这就是具有高分辨率的电子显微镜产生的基础。
1931年，Knoll和E Ruska用冷阴极放电电子源和3个电子透镜改装了一台高压示波器，获得了放大十几倍的图像，证实了电子显微镜放大成像的可能性。1932年，经过Ruska的改进，制成了世界上第一台电子显微镜。其加速电压为70kV，分辨能力达到了50nm，放大倍率12倍，成功得到了用电子束拍摄的铜网像。尽管当时的放大倍率仅有12倍，但它有力地证明了使用电子束和电磁透镜可以形成与光学显微镜影像相似的电子影像，为以后电镜的发展和应用奠定了基础。
1933年，E Ruska用电镜获得了放大倍率为1万倍的金、铂和纤维的图像。至此，电镜的放大倍率已经超过了光镜，但是其分辨率仅刚达到光镜水平。1937年，柏林大学Klaus和Mill继承了E Ruska的工作，拍出了第一张细菌和胶体的照片，获得了25nm的分辨率，从而使电镜完成了超越光镜性能的这一丰功伟绩。
1937年，E Ruska应西门子公司的邀请，建立了超显微镜学实验室。1939年，德国西门子公司制造出分辨本领达到30的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。世界上第一批商品化的透射电镜其分辨率为10nm，放大倍率为10万倍。由于E Ruska在电子光学和设计第一台透射电镜方面的开拓性工作，被誉为“本世纪最重要的发现之一”而荣获1986年诺贝尔物理奖。
除Knoll和E Ruska以外，其他一些实验室和公司也同时在研制电镜。如荷兰的菲利浦公司、美国的无限公司、日本的日立公司等。1944年，菲利浦公司设计了150kV的透射电镜，并首次引入中间镜。1947年，法国设计出400kV的高压电镜。60年代初，法国制造出1500kV的超高压电镜。1970年，法国、日本又分别制成了3000kV的超高压电镜。进入20世纪90年代后期，透射电镜进入了一个快速发展的时期，这主要得益于电子技术、真空技术、计算机技术等的飞跃式发展。
扫描电镜作为商品出现的较晚。早在1935年，Knoll在设计透射电镜的同时就提出了扫描电镜的原理及设计思想。1940年，英国剑桥大学首次试制成功世界上第一台扫描电镜。但由于分辨率很差，照相时间过长，因此没有立即进入实用阶段。至1965年，英国剑桥科学仪器有限公司开始生产商品化的扫描电镜。80年代以后，扫描电镜的制造技术和成像性能提高很快，目前，高分辨型扫描电镜（如日立公司的SU-8010型）分辨率已达0.6nm，放大倍率达800万倍。
我国从50年代初开始研制透射电镜。1959年，我国上海新跃仪表厂成功研制出第一台透射电镜，其分辨本领为3nm。以后，中型透射电镜开始批量生产。1977年，上海生产出高分辨率的大型透射电镜。同年，中国科学院科学仪器厂研制成功设计了X-3F双道X射线光谱仪，与DX-3扫描电镜匹配，发展为DX-3A分析扫描电镜。之后，我国科学家经过不懈努力，在2014年成功研制了KYKY-8000F场发射扫描电子显微镜，这标志着我国电镜发展的水平达到了一个新的高度。
目前，全电子显微镜越来越普及。经过多年的发展，在电子显微镜下不但可以看到细胞器、病毒，甚至可以看到核酸和蛋白质等生物大分子，以及组成物体的基本单位——分子和原子。JEM-ARM200F是目前全球分辨率最高的商业化透射电镜，分辨率可达0.08nm。
电子显微镜的应用技术也在发展，在常规超薄切片技术的基础上，又出现了冷冻复型、电镜组化、电镜放射自显影等新技术。由于电镜的出现、电镜性能的改进及应用技术的发展，推动了医学生物学的发展。目前，电镜不仅是形态学探索微观世界的有力工具，亦已日益成为其他相关学科的一种研究手段。
电子显微镜主要分为透射电镜、扫描电镜、超高压电镜和分析电镜等等。透射电镜主要观察组织细胞内部的微细结构，扫描电镜主要用于观察物体、组织器官等表面的形貌。20世纪70年代以来，电镜的发展主要表现在：①不断提高分辨率，以求观察更精细的物质结构、微小的实体以至单个原子。②研制超高压电镜和特殊环境的样品室，以研究物体在自然状态下的形貌及动态性质，由此发展出环境电镜。③研制能对样品包括形态、结构、化学成分等进行综合分析的设备及附件，即分析电镜。特别是90年代之后的电镜，不仅用于形态结构分析，还结合了各种元素分析、离子定位、元素浓度定量分析等附件。在生物医学研究中，功能变化与超微结构形态变化的统一研究，即功能-形态的实时研究，一直是困惑生物界的难题。因为许多生物体的功能变化多为生物体内元素、离子的浓度变化与位点变化所引起，要了解其功能变化，就必须知道与功能变化有关的元素、离子的浓度及位点变化。目前，唯有结合了各种定位、定量分析附件的电镜（分析电镜）才能完成这种独特的研究。
电子显微镜术目前已发展成为电子显微镜科学。这门科学主要包括三大方面的内容：各种电镜的设计与制造、电镜样品制备以及相关的各种设备、电镜图像的分析和处理。二、电镜技术应用
电镜技术广泛应用于医学生物学、材料学及地质学等领域。在此，主要叙述电子显微镜在医学生物学领域的应用。目前可以把医学超微结构的研究工作分为三类。一是涉及医学前沿的工作，如生物大分子高分辨成像、蛋白质分子三维重构及DNA复制过程的观察等，其样品制备技术、电镜使用技术、图像处理及阐释等均处于领先地位，也是新兴研究领域“纳米生物学”的重要组成部分。二是普通超微结构观察研究，使用常规技术对未知的或处于资料积累阶段的结构进行观察，以期望得到规律性、特征性的研究结果；目前大多数超微结构观察工作均属于这一类。三是把已形成共识的亚细胞特异形态直接用于临床诊断，即所谓诊断电镜或称超微结构病理学，如肾小球肾病的鉴别诊断、病毒病因诊断及肿瘤诊断等。（一）在基础医学的应用
电镜在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学及分子生物学和分子病理学领域均有卓越贡献。
1.在病毒学中的应用
电镜发明前，人类所能见到的最小物体是细菌。病毒的微细结构无从知晓。现在许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电镜发现的。病毒性疾病的诊断离不开电镜，电镜是确定各种病毒形态结构最有用的工具。传统的超薄切片可供观察感染细胞内病毒的大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵体的形态特征。依据电镜下病毒形态结构特征，包括衣壳的对称性、壳微粒数和排列方式、核衣壳在细胞内复制组装的部位、病毒的形态和大小以及螺旋对称核衣壳的直径等，再结合病毒的核酸和蛋白分子生物学特性，可以对致病病毒进行鉴定和分类。如肆虐全球的SARS病毒就是首先在电镜下观察到，并确认是病毒而不是支原体。迄今，电镜是直接观察病毒的唯一工具。
2.在细胞学中的应用
由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了深入的研究，观察到了过去无法看清的细胞超微结构。如，用电镜观察到了生物膜的3层结构以及细胞内各种细胞器的形态学结构等。
采用超低温快速冷冻固定技术、红外探测与计算机控制的毫秒级实时处理技术，并用透射电镜、扫描-透射电镜及电子探针X射线能谱微区分析技术，可以获得生物组织、细胞功能变化时的超微结构形态变化、离子浓度及位点变化，能够获得生理、病理条件下，在生物组织瞬时功能变化（毫秒级）的同时，其实时的超微结构形态像，使功能与形态学研究能在毫秒级的水平上同步进行。
3.在分子生物学中的应用
通过电镜观察，人们了解了核蛋白体的超微结构、核蛋白体与mRNA的关系，发现了核小体、DNA的复制及四级结构、RNA转录的分子形态等。（二）在临床医学的应用
应用电子显微镜我们看到了生物细胞的超微结构，包括细胞膜、细胞器、细胞核，进而发展成为亚细胞病理学。细胞超微结构的病理学研究包括实验病理和临床病理。综合运用电镜技术、电镜细胞化学和免疫电镜技术等观察细胞在病理状态下形态结构的变化、细胞器的改变、酶在细胞内分布以及基因产物的表达与定位等，可确定在病理状态下，细胞超微结构的特异性变化，对临床疾病诊断特别是一些疑难疾病的诊断提供有力证据。
20世纪60年代以前，电镜在病理学中主要用于实验病理学。60年代初期，人们开始将电镜应用于人体病理标本检验，通过对这些人体病理标本的超微结构分析，进一步了解了疾病的病理变化及其发生机制，同时也认识到电镜作为一个新的诊断工具可直接为临床服务，为某些疾病的诊断提供重要的形态学依据。60-70年代是国际上诊断电镜发展的黄金时代，许多疾病通过电镜检查而确诊，越来越多的病理学家认识到了电镜的诊断价值。现在电镜逐渐成为病理诊断的一个基本工具，特别是在肾活检、疑难肿瘤的病理诊断、感染性疾病等诊断中的重要作用已达成共识。
电镜可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定。电镜技术与临床各科均有密切的关系，临床科室可利用电镜进行病理、病因、病原学及机理探讨，也可对在光镜下难以做出明确结论的病理变化做出进一步诊断，特别是在肿瘤、肾病、血液病等特殊病理检查中，电镜常作为重要的辅助诊断手段。
电镜常用于对一些未分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断，如常用于无色素性黑色素瘤、肥大细胞肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌源性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤等的诊断中。以神经内分泌肿瘤为例，不论其分化程度如何，是原发的还是转移的，神经内分泌肿瘤都含有神经内分泌颗粒，这在电镜下很容易识别。
电镜对各器官系统疾病的诊断，用得最多的肾活检和某些皮肤疾病。对肾病的诊断，通常将光镜、免疫荧光光镜和电镜观察三者结合。在某些肾病的诊断中，电镜起着决定作用，如遗传性肾炎、肾小球薄基底膜病Farbry氏病等。肾小球薄基底膜病唯一的病理变化是基底膜弥漫变薄，只有通过电镜测量基底膜的厚度才能做出正确的诊断。电镜检查不仅能发现光镜水平不能达到的超微病理改变，而且能够比免疫荧光更精确地对肾小球内免疫复合物进行定位，对其沉积特点进行观察，并能显示微小病变和损伤程度。甚至一些肾小球疾病只有靠电镜检查才能做出病理诊断，如纤维性肾小球肾炎和胶原Ⅲ肾小球病。最早关于细胞凋亡的形态学描述也是源于电镜的观察。近40a来，人们应用电镜研究了大多数有关疾病的超微病理结构，并积累了相关资料，为将电镜用于各系统器官疾病的病理诊断打下了良好的基础。（三）在科学研究中的作用
细胞或细胞器的很早期的改变或功能变化，光镜下看不见，但电镜可以观察。电镜对病因学、免疫学和病毒学等病因的探讨有很大帮助。形态学在科学研究中具有重要的客观性，电镜观察的结果从形态学上证实了许多理论假说。但电镜由于本身取材小、观察范围小等特点，使其有较大的局限性，在研究中要密切配合光镜，注意电镜结果与光镜的关系、与宏观的关系，在病理诊断上尤其要注意与其他研究方法的结合。三、新型电镜在医学生物学中的应用
随着技术的进步，新型电镜层出不穷。例如，环境扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜、扫描电容显微镜、扫描光子显微镜、扫描热显显微镜、扫描离子显微镜、扫描声学显微镜、摩擦力显微镜和磁力显微镜等。环境扫描电子显微镜由于其样品室的真空度非常接近大气环境，可以置活体生物样品，其在生物医学研究中产生了惊人的飞跃。扫描隧道显微镜由两位德国科学家以量子力学中的隧道效应理论为基础研制，其表面垂直方向分辨率可达0.005nm，将人类的观察力提高了近两个数量级。扫描隧道显微镜可获得高精度的三维图像，利用扫描隧道显微镜可研究染色体定位、转录、转移和小分子DNA交互作用，对DNA-RNA聚合酶复合体等进行深入分析。原子力显微镜可以观察肾上皮细胞的细胞骨架结构、血小板的运动，观察水中活的或固定的哺乳动物细胞表面的骨架结构，能够对DNA分子链上的任何确定部位进行分割及蛋白质和小分子成像等。相信，随着技术的不断进步我们的世界将会越来越清晰。第二章电子显微镜的基本原理
人类认识自然界大部分信息来自眼睛，在对周围世界的认识中，总是希望看到细微的细节。众多微观世界的结构需要能够分辨，并达到人裸眼分辨的状态，才能够正常观察。由于正常人眼在25cm明视状态下，能够分辨的距离是0.2mm，因此可以使用放大镜将物体放大来观察物体的细节。例如，用10倍的放大镜可以将两个质点间的距离放大10倍，肉眼即可以分辨出0.02mm之间的两点，使物体看得更清晰。但放大镜的倍数有限，不能达到更高的分辨率。因此，分辨本领和放大倍率成为电子显微镜要解决的两大基本问题。一、分辨本领（一）分辨本领
分辨本领或称分辨能力是电子显微镜最重要的参数之一，分辨能力的高低决定一台电镜的优劣。分辨本领以分清两个质点间的最短距离来表示。能被分辨的两个质点之间的距离越短，其分辨本领越高。
物体在眼视网膜上的成像与物体和眼之间的距离有关：物体与眼的距离缩小，视网膜上呈的物像增大，眼的分辨能力就提高。但由于眼的屈光能力的限制，因此物体移近眼睛的距离是有限度的。一般人眼正常的工作距离为25cm，并称其为明视距离。人眼25cm的明视距离下，能分辨出相距0.2mm的两个质点，故人眼的分辨率为0.2mm。
早在100多年前，德国著名理论光学家Ernst Abbe给出了分辨本领（d）的证明公式。决定仪器分辨本领的因素由下述公式表示：
式中，d为分辨本领；λ为照明光的波长；n为介质折射率；α为物镜的半镜口角；nsinα称为孔径数（NA）。
以光镜油浸物镜为例计算其分辨本领。
注：d严格讲叫作分辨距离，而分辨本领或分辨率应为分辨距离的倒数（1/d）。
图2-1为物镜的镜口角。O.物镜S.标本面α.1/2镜口角图2-1 物镜的镜口角
由于镜口角已达极限，又无更高折射的介质可寻，光学显微镜的光源为可见光，其波长为0.39~0.78μm，由于受到光波特性的限制，故在可见光的条件下（λ以0.5μm带入公式）光镜的分辨本领约为0.2μm，已达理论极限，即光镜只能观察到大于0.2μm的结构，而对于细胞内或细胞间的许多细微结构无法观察。
从式（1）可导出仪器理论分辨本领，d=1/2λ，故欲提高仪器的分辨本领必须寻找波长更短的照明源。
De Broglie发现高速的电子流（束）具有光波的微粒性和波动性，且波长很短，为电子显微镜的诞生奠定了理论基础，从而出现了以电子束代替可见光的电子显微镜。二、放大倍率
放大倍率也是显微镜性能的一种指标。电子显微镜不仅需要有最佳的分辨本领，还需要有合理的放大倍率。只有通过合理地放大，人眼才能依靠电子显微镜的最佳分辨本领区分精细的物体和结构。
放大镜是凸透镜，其形状为中间厚，边缘薄。光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，使光线向中间汇聚。折射、聚焦是放大镜的基本原理（图2-2）。当用放大镜观察物体时，眼睛在放大镜上面，物体放在放大镜下面。物体的光线穿过时，发生折射，使光线向中间汇聚，进入人眼。物体在人眼视网膜上所成像的大小与物体对眼所张的角（视角）成正比。视角愈大，像也愈大，愈能分辨物体的细节。图2-2 放大镜工作原理
光学显微镜的物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。仪器总放大倍率是仪器各透镜放大率的乘积，以光镜为例：
式中，ML为总放大倍率；Mo为物镜放大率；Me为目镜放大率。用油浸物镜时，光镜总放大倍率为：
如果增大Mo或透镜数目，总放大倍率ML尚可增大，结果像虽然增大，但却是模糊不清的。这种无意义的放大，称空放大，确切地说就是超过有效放大率的放大称为空放大。
有效放大率由式（3）得出：
分辨本领为2的电镜有效放大率：
即100万倍，比光镜大1000倍。
综上所述，不难看出决定仪器性能的根本指标是其分辨本领，而有效放大率由分辨本领所决定，超过有效放大率的空放大是徒劳的，而低于有效放大率时则是没有充分发挥仪器的性能。
这里应该指出的是，电镜的分辨本领与我们在观察电镜图像或拍摄电镜照片时实际所能达到的分辨率是有区别的。仪器的分辨本领是在仪器最佳状态下，用特殊制备的检测标本，由最熟练的操作者，也就是在最理想的条件下得到的。在常规操作中分辨率要低得多，如观察生物超薄切片样品其分辨率一般不高于25，负染样品可达15。三、电子枪的结构及电子束的特性（一）电子枪
发射电子束的装置称电子枪，由阴极、栅极和阳极组成（图2-3）。图2-3 电子枪构造示意图
由图2-3可以看出，顶端是灯丝（阴极），通上电流可以产生电子。下端是中央有一小孔的金属板称阳极。在二极之间加以高电压，此电压称加速电压，一般为几十千伏。阴极上产生的电子在阳极的吸引下快速穿过小孔形成电子流（束），在阴极和阳极之间另有一中央带孔的控制极（栅极）。栅极电压比阴极稍低，其作用是把阴极产生的分散电子聚焦，形成电子枪交叉点；改变其负电位就可以控制通过阳极的电子数目，即改变电子束的强弱（电子束流的大小）。（二）电子束的特性
电子束是真空中相对集中而高速运动的电子流。电子具有粒子性和波动性，与光波的性质类似。
1.波长短
根据De Broglie理论，粒子在高速运动时会发射出一定波长的电磁辐射，其波长可由式（5）表示：-34
式中，λ为波长；h为普朗克常数，为6.626×10；m为粒子质量；v运动为粒子运动速度，粒子运动的速度越快，发射的电磁波长越短。
在电场中高速运动的电子，根据能量守恒定律可得式（6）：
式中，e为电子的电荷量；V为加速电压。
从式（6）中得出，电子运动的速度与加速电压成正比。-31-19
电子的质量m=9.11×10kg，电子的电荷量e=1.602×10。由式（2）和式（3）推导出，电子束波长与加速电压的关系为：
表2-1为加速电压的波长关系。表2-1 加速电压和波长关系
可见，电子束的波长甚短，其波长随加速电压而变。即加速电压越高，波长越短；波长越短，分辨率越高。故欲求高分辨率，必须在高的加速电压条件下才能获得。一般电镜加速电压可以分为数挡，操作者可自行选择。
2.可折射性
电子束通过轴对称的电场或磁场时可改变其前进方向进行汇聚，相当于可见光通过玻璃透镜折射聚焦。磁场（电场）实际上是通以直流电的线圈（电极），称电子透镜。通过线圈的电流越大，磁场强度越强，电子透镜焦距越短，放大倍数越大，故电子透镜和玻璃透镜不同，其焦距是可变的。
3.穿透能力弱
电子束穿透能力甚弱，在空气中只能运行几毫米，不能穿过玻璃。故电镜必须是高真空，切片必须超薄（小于0.1μm），并要用铜网和有机支持膜来代替玻璃载玻片。
4.成像直接不可见
电子束穿过样品，通过电子透镜聚焦所成的放大图像，人眼直接不可见，只有通过样品的电子束打在荧光物质上产生较长的光波才能呈现可见的图像，电子束可使照相底片乳胶感光，故图像可记录于照像底板上。
5.能激发金属产生X射线
高能电子束能够激发金属产生X射线，对人体造成较大伤害。因此，电镜应具备相应的防护——铅防护，电镜工作人员要注意加强自我防护。四、反差
反差又称对比度，指图像中各部分细节的亮度与它们的背景亮度的差别。如果反差太弱，即使仪器分辨本领很高，也不能辨认样品的细节。光镜中图像反差主要靠样品中不同部分的细节对光的吸收差别而形成。样品对光吸收少的地方，图案就亮；样品对光吸收多的地方，图案就暗。透射电镜的样品极薄，故吸收不是主要的。其反差主要由样品内各种结构对入射电子的散射程度不同而引起。当入射电子作用于样品时，部分电子将会与样品中的原子核和周围的电子相碰撞使其运行轨道偏离初始方向，这种现象称之为散射，这部分电子称为散射电子，而直接穿过样品的电子称为透过电子。因物镜光栏接地，散射角大的电子被光栏挡住除去，只让散射角小的电子和透射电子通过光栏孔参与成像（图2-4）。图2-4 物镜光栏挡去散射电子
样品对入射电子的散射能力大小与样品的质量厚度有关。所谓样品的质量厚度是指样品厚度与样品密度的乘积。样品厚度即样品厚薄程度，样品越厚，入射电子在样品中经历的时间、空间越长，受样品作用的机会越多，被散射的程度越大。样品密度即样品中所含元素的原子序数的大小及原子数目的多少。样品的原子序数越大，密度就越大，样品散射电子的能力就越强。由此可见透射电镜反差的形成是由于样品中各部分质量厚度不同，对入射电子散射的能力不同，参与成像的透射电子的数目多少不同，故荧光屏上的亮暗程度不同所致。电子的散射程度又称为电子密度。所谓高电子密度或电子致密就意味是散射电子多，透过电子少，形成荧屏图象中暗的部位。反之样品中透过电子较多的地方，因散射电子较少，而显得亮些，这样的亮区又常用电子透明这一术语来描述。
生物样品主要由C，H，O，N等轻元素组成，这些轻元素对电子散射极弱且差别不大，故反差极小，因而不经处理的生物样品在透射电镜下几乎无法辨认。目前，应用重原子与样品中某些结构和成分选择性地结合，目的就是在于增加样品的质量厚度，从而增强样品的反差。对样品的这种处理，称电子染色。五、场深（景深）与焦深
物体置于透镜的前方，于透镜后方置一屏幕，物体聚焦在屏幕上呈清楚的像。如果把物体在光轴方向前后移动一定距离，而屏幕上的像仍是清楚，这段距离就是场深（景深），因此，场深也可理解为成像清楚地观察对象的厚度。反过来物体不动，在光轴方向前后移动屏幕一定距离，而像始终清楚，这段可移动的距离称之为焦深。光镜的场深、焦深甚短，放大倍率100倍时，场深0.2μm左右，比光镜样品厚度（7μm）小得多，因此在聚焦成像时既不会出现结构重叠，同时通过不同平面的聚焦可得到样品中更多的信息，有可能重建某些微细结构的三维立体形态。电镜的场深和焦深比光镜长得多。
电镜场深由式（8）可得：
式中，P为场深，d为分辨本领，α为1/2物镜孔径角。电镜物镜孔-3径角甚小，α约为10rad。
电镜焦深由式（9）可得：
式中，L为焦深；M为系统放大倍率。
如分辨本领为10的电镜，其场深是1μm。由于场深大大超过电镜样品的厚度（通常为600~700），故整个样品的全部细节即使在与光轴倾斜了一个很大角度的情况下均能同时聚焦成像，这有利于电4镜的聚焦。如系统放大倍率为10，其焦深可达100m，因此，电镜中照相底片可以放在荧光屏的下方，也可以放在荧光屏的上面，而不影响成像的清晰度。六、像差
像差即由透镜所引起的像的失真。电镜有与光镜类似的各种像差，但光镜的各种像差通过用多种曲度和折射率不同的透镜组成的组合透镜得以克服。而电镜则不行，减小物镜孔径角是减少其大多数像差较为有效的方法，然而这意味着要降低分辨本领，对分辨率为2~3的-3-2电镜来说，物镜最佳孔径角为10~10rad。因此，可以说光镜的分辨本领受光波的波长限制，而电镜分辨本领受到的限制，主要是像差问题尚未得到满意解决。如电镜加速电压为100kV时，其分辨本领的理论极限d=1/2λ=1/2×0.037≈0.02，但目前实际仅达2，还相差100倍。（一）球差
球差就是从一点出发的射线通过透镜后不能都汇聚在一点上，而是近轴的射线比通过透镜边缘的射线汇聚得远一些（图2-5）。因此，在像平面上所成的像不是清晰的一点而是呈模糊的圆斑。此圆斑的直径dS即为球差，可用下式表示：图2-5 球差示意图
式中，CS为球差系数；α为物镜孔径角。可见减小孔径角，可减小球差，但分辨本领也随之下降。从衍射角度来看，孔径角越小，衍射的影响越大。因此，综合考虑效果，一般选用最佳孔径角-3-210~10rad。
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