作者：赵雁林
出版社：人民卫生出版社
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结核病实验室诊断技术培训教程试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
结核病实验室诊断技术培训教程/赵雁林主编.—北京:人民卫生出版社，2014
ISBN 978-7-117-18933-0
Ⅰ.①结… Ⅱ.①赵… Ⅲ.①结核病-实验室诊断-教材Ⅳ.①R52
中国版本图书馆CIP数据核字（2014）第081564号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
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主 编：赵雁林出版发行：人民卫生出版社有限公司
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北京胸科医院 黄海荣 姜广路
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甘肃省疾病预防控制中心 司红艳
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北京工业大学 武 霞
湖南省胸科医院 谭云洪
山东省胸科医院 邓云峰 李学政
吉林省疾病预防控制中心 杨修军 王 博 张立夫
广东省结核病防治研究中心 钱 明 陈 涛
安徽省肺科医院 王 庆 包训迪 徐东芳
上海市疾病预防控制中心 朱国峰 王莉莉
重庆市结核病防治所 张 舜 刘 洁 沈 静序
依照现代医学实验室管理的新理念，为进行某种活动或执行某项任务时所规定的途径称为程序。按其用途分为管理性和技术性两种。结核病实验室管理程序体系的建设是结核病管控规划不可或缺的组成部分。在结核病预防、控制以及临床诊疗等各个环节均具有重要的作用。我国各地结核病实验室在规模大小和水平上，尽管参差不齐，但是，都从多方面努力改进提高。如，为统一规范全国实验操作规程和提高检验人员的操作技术水平，国家参比实验室每年定期或不定期举办检验人员业务技术培训班、知识竞赛活动等。又如，早在1995年11月，中国防痨协会基础专业委员会编著了《结核病诊断细菌学检验规程》一书。随着结核病检验诊断技术方法的不断发展，该委员会又于2006年1月修订出版《结核病诊断实验室检验规程》。十几年来，在全国各级结核病专科医院与结核病防治机构以及各级综合医院中被广泛应用。从发表的论文中看出，作为标准方法被广泛引证。2013年10月，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心副主任、国家参比实验室主任赵雁林研究员率领组织结核界众多专家编著“结核病实验室诊断技术培训教程”专著。在策划、拟定专著写作框架、审查初稿、定稿中，团结协作，集思广益，保证该书顺利完成。分别从人力资源、用房与功能分区、质量控制体系、仪器设备和试剂、环境条件以及生物安全防护等管理性程序做了系统的介绍。并且进行纵横向相互关系的协调设计，内容具有新颖性和较强的实用性，是一本重要的参考书。
2013年7月，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布了稍早前至近期的结核病诊断技术研究进展和评估状况:不同类型的诊断产品计28项，分为上市、评价、认可（或不）、推荐（或不）。我国近几年研制开发结核病实验诊断产品（试剂、仪器等），约有23项（个、台、件）之多，获得医疗器械注册证书。本专著介绍了包括国内、外传统的以及新的实验诊断技术19项。在实践中，各级结核病实验室因等级和条件不同，如何合理地选用符合实际的实验诊断技术项目，本人有几点建议供同道们参考:①WHO曾提出，试剂（盒）获得医疗器械注册证书后在正式上市用于临床诊疗之前，拟通过多中心、大样本的临床实践验证、评估，以便比起前期的临床试验更能了解、评估两者的相互关系与符合率。从中选出若干项甚至更多的已获得认可的实验诊断产品。这样，有利于提高实验诊断的准确率，也有利于上市，用起来也更有把握，进而为临床诊疗服务。②紧紧围绕着实验诊断“早期快速、操作简便、价格便宜、准确可靠、适于推广”目标的总要求，在国家结核病预防控制中心统筹下，结合实际选用符合不同等级实验室的实验诊断技术项目。③由于结核病病原菌生物学特性和结核病诊断与鉴别诊断的特点，如有70%左右为菌阴肺结核和少数非结核分枝杆菌肺病以及肺外结核，若用单一的生物标志物或试剂，时常会出现检测的敏感度、特异度一高一低的现象。拟改变研究或实验诊断的策略。如用2种或2种以上联合或先后检测，力求获得敏感度、特异度双高的结果。又如，先用显示各自不同优势的液体培养技术，择时用分子生物学或其他诊断技术做快速检测、药物敏感试验等。检测结果表明，既缩短了检验结果的报告时间，也因液体培养增菌又能提高检测的阳性率。
本书是全国结核病预防控制工作人员，特别是各级实验室检验人员的重要参考书，也适用于全国广大医护人员、检验人员以及相关科研工作人员参考应用。期待着本书的正式出版能带动全国结核病实验室管理程序规范化、操作规程标准化（及网络化）的深入开展。促进全国结核病实验室管理程序规范化水平、标准化操作水平以及检验技术人员的素质不断提高。解放军第309医院庄玉辉 研究员2014年3月6日于北京前 言
面对严峻的结核病疫情，我国需要建立强有力的结核病防治队伍。结核病实验室工作在结核病防治工作中起着举足轻重的作用，建立一支能够适应复杂结核病疫情态势和不断深入的结核病防治工作形势的实验室队伍，是我国结核病实验室网络建设的重要组分。
培训是通过集中时间学习掌握新的职业技能，或者对原有职业进行新的理论指导，以求更好地适应工作的需要；培训也是组织人力资源管理与开发的重要组成部分和关键职能，是组织人力资源资产增值的重要途径，也是工作效益提高的重要手段；培训是提升员工技术、能力水准，达到人与“事”相匹配的有效途径；培训是激励员工工作积极性的重要措施；培训是建立学习型组织的有效手段。
本书从标本采集到存储运输，从细菌学技术到分子生物学方法，从质量保证到生物安全，从传统实验技术到质谱鉴定，按照方法原理、适用范围、检测样品、仪器设备、试剂耗材、操作步骤、结果判读、质量控制、注意事项、临床意义、自测试题和拓展文献等方面进行了描述，供医疗机构、疾病预防控制机构、科研机构和大专院校等在组织结核病实验室相关培训时使用，也可供医学生、基层医务人员等自学参考。虽然本教程悉数囊括了当今可得的国内外结核病实验室诊断技术，但是囿于编者的业务水平和时间，为了进一步提高本书的质量，以供再版时修改，因而诚恳地希望各位读者、专家提出宝贵意见。编者2014年春Table of Contents第一章 结核病细菌学概述 第一节 结核分枝杆菌生物学特性与致病性第二节 结核分枝杆菌免疫原性第三节 结核分枝杆菌基本检测方法第二章 标本的采集、保存及运送 一、样本种类及用途二、采样前准备拓展文献第三章 显微镜检查 第一节 萋-尼氏染色镜检第二节 荧光染色镜检第四章 分枝杆菌分离培养 第一节 固体培养第二节 BD960液体培养第三节 BacT ALERT 3D液体培养第四节 BD手工液体培养第五节 固液培养第六节 VersaTREK分枝杆菌培养第五章 分枝杆菌菌种鉴定 第一节 生化鉴定第二节 测序分子鉴定第三节 MALDI-TOF MS质谱技术鉴定第四节 Accuprobe鉴定第五节 基因芯片鉴定第六节 线性探针鉴定第六章 分枝杆菌药物敏感性试验 第一节 结核分枝杆菌固体药敏试验第二节 结核分枝杆菌液体药敏试验第三节 结核分枝杆菌最低抑菌浓度检测第四节 非结核分枝杆菌药敏试验第五节 分子药敏试验第七章 免疫学诊断技术 第一节 结核菌素皮肤试验第二节 γ干扰素释放试验第三节 抗原抗体检测第四节 细胞因子检测第五节 细胞亚型检测第八章 分子生物学检测技术 第一节 传统实时荧光定量PCR检测第二节 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测第三节 环介导等温扩增检测第四节 RNA恒温扩增检测第五节 交叉引物恒温扩增检测第六节 线性探针耐多药检测第七节 基因芯片耐多药检测第八节 实时荧光PCR熔解曲线耐多药检测第九节 Gene Probe检测技术第十节 基因分型技术第九章 质量保证 第一节 实验室质量控制基本要求第二节 室内质量控制第三节 室间质量评估第十章 生物安全 第一节 实验室生物安全概述第二节 实验室生物安全管理与基本要求第三节 应急准备与应对方案第四节 废弃物处理第十一章 菌株及样本保存和运输 第一节 菌株保藏第二节 痰标本及菌株运输第三节 菌株保藏、运输相关注意事项附 件第一章 结核病细菌学概述第一节 结核分枝杆菌生物学特性与致病性一、生物学特性（一）结核分枝杆菌的分类
根据2001年版以系统发生为基础、参照16S rDNA序列重新编排的《伯杰细菌系统分类学手册》，结核分枝杆菌属于细菌域、放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、分枝杆菌科、分枝杆菌属，其特征是基因组中富含G+C序列（61%～71%）、细胞壁富含类脂质（可达60%）。其高G+C含量增加了结核分枝杆菌的遗传稳定性，而富含脂质的细胞壁赋予了分枝杆菌属细菌典型的特征，如抗酸染色性、极端疏水性和对伤害因素（如抗生素和机体免疫反应等）的抗性等。（二）形态学特征
结核分枝杆菌典型的基本形态为细长、直或稍弯、两端钝圆、有微荚膜、无芽胞、无动力的杆菌，常呈分支状生长。菌体宽度在0.2～0.6μm之间，菌体长1～10μm（通常3～5μm）。菌体的一端或两端有较深的异染颗粒，富含多磷酸盐，可能是能量储存和氧化还原反应的场所，有时可呈串珠状。在结核患者痰标本中结核分枝杆菌可单个散在、2个以上呈“人”、“Y”等排列，缠绕呈索状或丛状时为有毒株的典型形态学特征。
除此之外，结核分枝杆菌亦可呈现出颗粒型、滤过型和球菌型等多种形态。在结核分枝杆菌发育的特定阶段，可表现为非抗酸性、非细菌细胞性、革兰染色阳性的颗粒型体。在电子显微镜下可观测到比典型结核分枝杆菌小20倍的超小型滤过型菌体，可能是结核分枝杆菌在宿主体内产生持留现象的原因之一。而细胞壁缺陷的结核分枝杆菌可表现为球形体，可能为其免疫逃逸和产生耐药性的部分原因。（三）生长特性
受限于温血动物宿主提供的生长条件，结核分枝杆菌为嗜温、嗜中性微生物，生长的最适pH为6.5～7.2，最适温度为37℃，28℃以下停止生长。体外生长时需提供氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）和生长因子。结核分枝杆菌生长速度缓慢，18～24小时分裂一次，在固体培养基上呈现灰黄白色、干燥颗粒状，显著隆起，表面粗糙皱缩、菜花状的菌落；在液体培养基未加分散剂的情况下于液面形成粗纹皱膜，培养基自身保持透明。（四）代谢类型
结核分枝杆菌是专性需氧、自养兼异养型微生物，具有极佳的生存策略，当栖息环境变化时能够进入不同的生理途径以适应不同的特殊环境，从而最大限度地保持其病原性及物种的延续性:其在高氧分压的组织中生长旺盛，如肺部上叶病灶；在低氧分压情况下亦能耐受，如骨结核、淋巴结结核、干酪样球形病灶等；而在小鼠感染过程中又可从需氧的碳水化合物代谢模式转变成微需氧和利用脂质的模式；在体外无氧状态下不能分裂增殖，但可转入休眠状态并长期存活。（五）对外环境抵抗力
结核分枝杆菌对外环境的适应性较强，黏附在尘埃上可保持传染性8～10天，在干燥痰内可存活6～8个月，在患者衣物上可存活长达2年，对酸、碱和干燥均有一定抵抗力。但对湿热、紫外线和乙醇敏感，在阳光暴晒下仅能存活数小时，70%乙醇作用2分钟即可杀灭之。二、致 病 性（一）结核分枝杆菌致病的流行病学特点
结核分枝杆菌危及人类的历史可追溯至50万年以前，这种古老的传染病曾在全世界广泛分布，其流行可持续数个世纪，被称为“白色瘟疫”。目前，全世界约有880万结核患者（2010年数据），其中年龄分布在15～54岁之间的占75%，处在社会生产能力的黄金年龄段，且占全部患者95%的病例和99%的死亡病例均存在于发展中国家。
结核分枝杆菌可经呼吸道和消化道传染，偶可通过破损的皮肤、黏膜、生殖器官等接触传染，而先天性结核病传染途径为经（破损的）胎盘或吸入羊水感染，多于出生后不久发生粟粒性结核病或生殖器结核。
呼吸道是结核分枝杆菌主要的传染途径，约95%的结核感染者是经呼吸道传染，且可经飞沫、飞沫核和尘埃等多种空气传播方式传染。加之人体对结核分枝杆菌普遍易感、感染剂量又较低，不到10个有活性的结核分枝杆菌即可使人患病，致使结核分枝杆菌非常易于在人际间传播。
结核分枝杆菌可侵犯全身各器官而发病，但以肺结核为最多见。宿主免疫反应可以控制其不能活跃繁殖和扩散，但几乎不能根除之，是胞内致病菌中最容易维持潜伏状态的。而结核病一旦从低流行水平转入高流行水平，其主要传播方式亦将从与结核患者密切接触为主转为经公共场所的不经意接触为主，公共危害极大，故必须采取科学的综合性防治措施加以有力控制，如隔离患者、改善基础公共卫生服务措施等。（二）结核分枝杆菌致病的病理机制
结核分枝杆菌缺乏外毒素、内毒素与侵袭性酶类，基因组中无毒力岛，也不携带质粒。结核患者的临床症状与体征中除咳嗽是慢性肺部炎症的症状外，多为宿主的免疫反应所致，特征为发热、消瘦，是一种慢性消耗性疾病。因此，结核分枝杆菌的致病性可能主要与其菌体成分、菌体特殊构造、代谢物质的毒性、在宿主体内大量繁殖引起的炎症以及机体应答的免疫损伤等因素有关。
1.菌体成分（1）类脂质:
结核分枝杆菌的类脂质含量超过60%，远高于类脂质含量较高的革兰阴性菌（20%）。类脂质是一类复杂的化合物，含有分枝菌酸、索状因子、磷脂和蜡质D等，与结核杆菌的毒力密切相关。
分枝菌酸是结核分枝杆菌和棒状杆菌属独有的成分，可形成有效的屏障，使其免受溶菌酶、自由基等的损伤，并可抵抗亲水性化合物或抗生素的攻击。
索状因子是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂，可使结核分枝杆菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列，结核分枝杆菌的致病性、毒性、保护自身抵抗宿主免疫反应的多种生物学行为都可归因于此。它能破坏细胞线粒体膜、影响细胞呼吸、抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。但它亦存在于无索状形成的非致病性分枝杆菌中，故上述活性可能应归结于其特殊的表面构造及巨大的数量。
磷脂能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，形成结核结节。
硫酸脑苷脂可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在巨噬细胞中长期存活，甚至可休眠数年至数十年，并保持随时复苏的能力。
蜡质D是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可激发机体产生迟发型超敏反应。（2）多糖类物质:
多糖类物质是结核分枝杆菌细胞壁中的重要组成部分，占细胞壁组分的30%～40%，在结核分枝杆菌的致病性中发挥重要作用。脂阿拉伯-甘露醇聚糖是细胞壁的主要糖脂，可抵抗巨噬细胞的杀灭作用，而阿拉伯半乳糖层可阻止疏水性分子的进入等。（3）蛋白质:
蛋白质有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。而细胞壁上的选择性阳离子孔蛋白可有效控制或阻滞亲水性小分子的扩散、大大降低化合物的渗透性，致使药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢，构成了结核分枝杆菌对药物的第一道防线。
2.菌体特殊构造（1）细胞壁厚度与交联度:
药物敏感结核分枝杆菌菌株细胞壁的平均厚度为（15.6± 1.3）nm，但耐多药和广泛耐药株的细胞壁厚度却分别可达（17.1±1.03）nm和（20.2±1.5）nm。而且，结核分枝杆菌细胞壁肽聚糖交联的程度是70%～80%，远高于大肠埃希菌的20%～30%，可能与结核分枝杆菌的致病性密切相关。（2）荚膜:
结核分枝杆菌具有主要由多糖、部分脂质和蛋白质构成的微荚膜。荚膜可部分阻挡宿主的生物活性物质进入菌体内以保护结核分枝杆菌，还可与吞噬细胞表面的补体受体结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的黏附与入侵。而且，荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合，荚膜中含有的多种酶类可降解宿主组织中的大分子、供给入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养。
3.结核分枝杆菌与宿主免疫系统的相互作用
结核分枝杆菌是专性哺乳动物胞内寄生菌，可以感染多种细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和肺泡上皮细胞等，因此机体的免疫反应主要以细胞免疫为主。但结核分枝杆菌往往能干扰正常的细胞免疫过程，从而逃逸免疫损伤并对宿主造成伤害。（1）巨噬细胞:
是结核分枝杆菌进入人体后感染的主要靶细胞，它一方面是杀死结核分枝杆菌的效应细胞，一方面也是结核分枝杆菌潜伏感染的场所。结核分枝杆菌通常聚集在巨噬细胞的吞噬体中，它能通过抑制吞噬体与溶酶体的结合、阻断吞噬体的酸化等来抑制其成熟，以避免聚集在吞噬体中的菌体被杀灭。（2）中性粒细胞:
可最早聚集到炎症部位，通过氧依赖的杀菌物质和胞外捕获机制等来杀灭结核分枝杆菌。但由于不同宿主对结核分枝杆菌的敏感性不同，中性粒细胞的病理损伤作用可能会超过其保护作用。（3）T细胞:++
以CD4和CD8细胞为主的T细胞介导细胞免疫是机体对结核分枝杆菌的主要特异性免疫，但与此同时也会引发迟发型超敏反应并造+成对机体自身的损伤。CD8细胞可产生颗粒溶素和穿孔素来直接杀+灭结核分枝杆菌，而抗原特异性的溶细胞性CD4细胞可杀灭吞噬了+结核分枝杆菌的巨噬细胞。但CD4细胞对巨噬细胞的溶解作用会导致结核分枝杆菌的再次扩散，释放出的结核分枝杆菌又会被其他巨噬+细胞所吞噬。只有调节巨噬细胞和CD4T细胞活性间的平衡才有利于+感染的控制，否则便会发病，如HIV感染等降低CD4细胞水平时。（4）树突状细胞:
树突状细胞参与抗结核分枝杆菌感染的保护性免疫反应，可通过分泌细胞因子来诱导T细胞分化成熟为辅助性T细胞亚群（Th1）以发挥杀菌效能。但结核分枝杆菌可损害树突状细胞递呈脂类抗原的能力，其细胞壁成分能阻止脂多糖类组分诱导的树突状细胞表型的成熟，并可随感染的树突状细胞转移至外周淋巴结，从而导致感染扩散。
总之，在数十万年的进化过程中，结核分枝杆菌已高度适应人类这一最主要的宿主群体，致病机制非常复杂，人体自身的免疫系统很难将其完全清除，故亟待采取科学的综合性防治措施加以控制。第二节 结核分枝杆菌免疫原性一、免疫反应（一）天然免疫反应
抗结核免疫反应在结核分枝杆菌感染的结局中发挥着根本作用。结核分枝杆菌通过呼吸道进入机体，主要与肺部的吞噬细胞发生作用。早期天然免疫应答可以观察到中性粒细胞、炎症单核细胞、间质巨噬细胞以及树突状细胞的不断积聚。当这些细胞被招募到病灶，并被结核分枝杆菌所感染后，就会形成早期的肉芽肿。与其他感染性疾病不同，招募到结核分枝杆菌感染病灶的吞噬细胞并没有限制或消除入侵的细菌，而是额外提供了一个结核分枝杆菌进一步扩增的保护所。研究已经表明结核分枝杆菌和其他致病性分枝杆菌通过许多机制来调控免疫反应从而成功生存下来。结核分枝杆菌可利用一些毒力因子，如卡介苗缺失的ESX1Ⅶ型分泌系统，来促进感染细胞的坏死、巨噬细胞的再招募，抑制宿主细胞的凋亡，从而扩大它们在细胞间的传播。虽然早期的天然免疫并没有有效地阻止结核分枝杆菌生长和传播，但是却为下一步适应性免疫反应的建立发挥关键作用。（二）适应性免疫反应（特异性免疫反应）
结核分枝杆菌是胞内寄生菌最显著的例子，长期存在宿主体内，导致潜伏感染，称为慢性无症状感染，不引起组织损害。如同其他胞内感染，细胞介导的保护性免疫反应更重要。随着适应性免疫应答的建立，致敏淋巴细胞可产生包括INF-γ在内的多种细胞因子，与TNF-α共同作用可杀死病灶中的结核分枝杆菌。无论在人类，还是其他结核感染动物模型，针对结核分枝杆菌的适应性免疫反应主要依赖于++CD4T细胞，CD8T细胞同样也发挥着重要作用。除了经典的MHCⅠ类或Ⅱ类限制性α/βT细胞，研究也观察到其他类型T细胞在结核感染过程中发生的应答，如CD1限制性分枝杆菌脂质特异性T细胞，HLA-+E限制性CD8T细胞以及黏膜相关的先天性T细胞等。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介物的产生而将致病菌杀死。适应性免疫应答对于结核感染的控制至关重要，但是由于需要8～10天的时间才能将携带活菌的骨髓树突状细胞从肺部转运至引流淋巴结，机体适应性免疫应答的建立被明显延迟，一般要到感染2～4周后才能观察到抗原特异性T细胞反应。而且，虽然适应性免疫应答可以有效控制结核分枝杆菌的生长，但是其清除结核分枝杆菌的能力却比较有限，未被清除的结核分枝杆菌在体内长期潜伏，进入所谓的休眠状态，在机体免疫力低下的状态下再次活化，引起有症状的活动性结核病。因为结核分枝杆菌存在于胞内，通常认为其不能与抗体接触，因此体液免疫反应一般被认为没有保护作用。然而，研究已表明，在感染初期，抗体单独或和其他细胞因子共同产生重要功能，如阻止细菌侵入黏膜表面。来自几个实验室的数据也显示，宿主抗结核分枝杆菌抗体在感染的不同阶段起重要作用，如特异性抗体增加了中性粒细胞和单核-巨噬细胞对分枝杆菌的内化和杀灭，抗体包被的+分枝杆菌能更有效地被树突状细胞识别和递呈用来刺激CD4和+CD8T细胞反应。
目前，结核分枝杆菌免疫反应研究的主要问题就是尽管大部分人群和实验动物在结核分枝杆菌感染之后都产生了相应免疫应答，但这些免疫反应却不能有效地消除细菌，反而使其通过一种沉默的方式进入了所谓的潜伏感染状态，并为之后的再激活奠定了基础。尽管我们已经可以明确了一些宿主保护性免疫的主要机制，但宿主对于结核分枝杆菌免疫力的局限性和结核分枝杆菌利用什么机制来限制宿主免疫力仍然没有阐明。二、超敏反应
机体对结核分枝杆菌感染产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生，两者均为T细胞介导的结果。从郭霍现象（Koch phenomenon）的坏死组织反应可以看到，将结核分枝杆菌整个菌体初次注入健康豚鼠皮下，10～14天后注射部位缓慢出现溃疡，深而且不易愈合，附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表现为原发感染的特点，此时结核菌素实验为阴性；若以结核分枝杆菌注入曾感染并已康复的豚鼠皮下，1～2天内局部迅速产生溃烂，但易愈合，且附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散，结核菌素实验为阳性，表现为原发后感染的特点。再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，说明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡的迅速形成，说明在产生免疫反应的同时有超敏反应的参与。过量的结核分枝杆菌再感染，则可以引起剧烈的迟发型超敏反应，甚至导致死亡。近年来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主要由结核菌素蛋白和蜡质D共同引起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA（rRNA）引起。两种不同抗原成分通过激活不同的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子导致不同的反应。通过测定机体对结核分枝杆菌有无超敏反应即可判断有无特异性免疫力。第三节 结核分枝杆菌基本检测方法
活动性结核是通过检查呼吸道或其他部位标本中的结核分枝杆菌来诊断的。尽管一些新的诊断方法（如分子生物学方法）得到了一定的发展，但抗酸菌涂片显微镜检查和罗氏培养基的分离培养依然是诊断活动性结核病的“金标准”，特别是在不发达国家和地区是唯一证实临床疑似病例的可行性方法。一、涂片镜检
抗酸杆菌涂片镜检作为发现传染源、选择化疗方案、考核评价疗效的重要手段，在结核病控制工作中占有不可或缺的位置。为了确定标本中是否含有抗酸菌，将标本直接或浓缩集菌后涂在载玻片上，加热固定后先进行初染，然后用酸性乙醇脱色，为了区别于其他微生物和背景色，再用不同颜色的染料进行复染，在显微镜下观察有无抗酸菌，若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用萋-尼氏（Ziehl-Neelsen）染色和Kinyoun染色法，都是将碱性复红溶于乙醇作为初染液，用酸性乙醇脱色后抗酸菌呈红色，两种方法的区别在于萋-尼氏染色是热的抗酸染色，涂片上滴加复红后要进行加热，Kinyoun染色则是冷染色，不需要加热，我国推荐使用前者。为提高镜检敏感性，减轻工作人员疲劳，也可用金胺O进行荧光染色，在荧光显微镜下抗酸菌呈现金黄色荧光。抗酸杆菌涂片镜检简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。但检出阳性率低是其最主要的问题。二、分离培养
涂片检查只能证明抗酸杆菌的存在与否，但欲进一步证实细菌的死活情况、鉴定菌种及进行药物敏感性试验等，则须进行分枝杆菌的培养。分枝杆菌的分离培养主要采用固体罗氏培养基培养法，液体培养基培养法也有应用，其中快速培养仪培养法应用较多。无论采用何种方法分离培养分枝杆菌，待检标本均需先进行前处理。前处理的目的主要有二个，一是去污染（除去分枝杆菌以外的杂菌），二是液化标本。常用的前处理剂主要为4%NaOH（碱处理），也有用4%HSO（酸处理），用0.5%的半胱氨酸氢氧化钠溶液效果更佳。24改良罗氏培养基由国际防痨和肺病联合会推荐，是长期以来广泛使用的传统分枝杆菌固体培养基。根据不同的前处理法，选择不同的罗氏培养基。将前处理后的标本或离心沉淀物接种于固体培养基，于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的菌落，特点为黄色的菜花样菌落，表面粗糙。快速培养主要是利用快速培养仪和营养丰富的液体培养基达到快速培养的目的。其标本的前处理方法和接种方法基本一致。目前，常用的快速培养系统主要有:BacT/ALERT 3D、BACTEC460、BACTEC960、ESPⅡ和变色液体培养基等。痰结核菌培养，结果可信度高，但需时6～8周，即使快速培养仪可以大大缩短检测时间，但其成本相对高昂，应用受到限制。三、分枝杆菌菌种鉴定
分枝杆菌种类繁多，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他的分枝杆菌统称为非结核分枝杆菌。由于不同的分枝杆菌其生物学特性、致病性、免疫学和对药物的敏感性不尽相同，因此菌种鉴定对于后续研究、预防和治疗均具有十分重要的意义。根据分枝杆菌对某些化学试剂的耐受性不同，将待检分枝杆菌制成菌悬液，接种于含某种化学试剂的鉴别培养基上，根据细菌的生长情况即可初步鉴定为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。若需近一步鉴定为何种非结核分枝杆菌，则需进一步进行硝酸还原试验、烟酸试验、吐温-80分解试验和耐热触酶试验等生化反应和其他鉴别试验。四、分枝杆菌药敏试验
传统的分枝杆菌药物敏感性测定试验（药敏试验）是基于表型耐药检测为基础的，在含有一定浓度药物的培养基中种入一定数量的分枝杆菌，根据细菌的生长与否来判断受试细菌对该药的敏感性。药敏试验方法分为直接法和间接法两大类，常用的方法有:绝对浓度法、比例法、E-test法、快速药敏法和微量快速药敏法，具体操作方法见本书后续章节。五、拓展文献
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2.O′Garra A，Redford PS，McNab FW，et al.The immune response in tuberculosis.Annu Rev Immunol，2013，31:475-527
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7.中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京:中国教育文化出版社，2006
8.赵雁林.细菌学检查在结核病控制中的作用.中华医学会结核病学分会2006年学术会议论文汇编，2006:43-46
9.Davis JL，Cattamanchi A，Cuevas LE，et al.Diagnostic accuracy of same-day microscopy versus standard microscopy for pulmonary tuberculosis:a systematic review and meta-analysis.Lancet Infect Dis，2013，13 （2）:147-154六、自测试题
1.结核分枝杆菌的免疫和超敏反应主要由什么细胞介导？主要机制是什么？
2.结核分枝杆菌的基本检测方法有几种？概述各种方法的优劣。第二章 标本的采集、保存及运送
正确的标本采集、运送、保存和处理对于保证结核病实验室的工作质量至关重要，应予高度重视。实验室有责任将标本选择（包括时间和解剖部位）、收集、保存、运送、接受和安全等关键信息，用《原始标本采集手册》形式，提供给客户并严格执行。本章规定了用于结核分枝杆菌检测的痰标本，支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本，胃灌洗液，体液，组织，脓肿物、吸出的脓液、创伤标本，血液，大便标本等的采集、保存及运送，适用于各级结核病实验室开展抗酸杆菌涂片镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌菌种鉴定、结核抗体检测、IFN-γ释放试验（IGRAs）检测、核酸检测、耐药检测。一、样本种类及用途
1.痰标本，支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本，胃灌洗液，体液，组织，脓肿物、吸出的脓液、创伤标本，大便标本可用于抗酸杆菌涂片镜检。
2.痰标本，支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本，胃灌洗液，体液，组织，脓肿物、吸出的脓液、创伤标本，血液，大便标本可用于分枝杆菌分离培养和结核分枝杆菌的核酸检测。
3.抗酸杆菌涂片阳性痰标本或临床分枝杆菌分离培养物可用于基于分子生物学方法开展的分枝杆菌分子菌种鉴定和结核分枝杆菌耐药基因检测。
4.结核分枝杆菌涂片阳性痰标本、临床结核分枝杆菌分离纯培养物可用于结核分枝杆菌药物敏感性试验。
5.血清可用于结核抗体的检测。
6.肝素锂或钠抗凝血可用于IFN-γ释放试验（IGRAs）检测。二、采样前准备
1.实验室应编制详细的正确采集和处理原始标本的专用指导书，供采集原始标本者使用。
2.根据检验申请单检验项目的要求，确认采样计划并进行适当的准备工作:制订标本唯一性编码、选择合适的标本容器、指导患者做好采样前的准备工作等。采集标本前应认真核对患者、标本容器和检验申请是否一致，严防差错。
3.标本的采集和保存 用于分枝杆菌培养的标本:采集后如1小时内不能运送到实验室，除血液标本外，其他标本应4℃保存。实验室收到标本后，如不能及时处理，仍需冰箱冷藏，标本采集到接种时间间隔不能超过7天。（1）痰标本
1）可疑肺结核患者，初诊患者应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰），治疗中或随访患者应按期留取2份痰标本（晨痰、夜间痰），体积3～5ml，盛于广口和具有螺旋盖子的痰瓶中。不推荐实验室接收合并的痰标本和留取时间超过24小时的痰标本。
2）即时痰采集后立即送检，夜间痰和晨痰采集后常温保存不应超过12小时，对当日不能进行涂片检查的标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。
3）对无法咳痰的患者，可使用高渗盐水（3%氯化钠）诱导痰或收集清晨胃液标本，或使用支气管镜采集支气管灌洗液标本。
4）痰标本应足量，且满足质量要求。（2）支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本
1）对于不能留取痰标本的患者，推荐使用侵入性采集技术获取标本，比如纤维支气管镜检查、细针肺穿刺、肺活组织检查。
2）严格器械清洁和消毒，避免引起交叉污染和感染。
3）支气管镜不能接触自来水，避免污染环境分枝杆菌。
4）对难以诊断的病例推荐使用其他侵入性技术采集标本，比如细针穿刺、开放肺活组织检查，无菌条件下采集的经支气管活检和其他活检标本，运输过程中，应加入0.5～1ml无菌0.9%的生理盐水。
5）支气管分泌物至少2～5ml；支气管肺泡灌洗液至少20～50ml。（3）胃灌洗液
1）婴幼儿、儿童和迟钝者诊断肺结核时，鉴于无法采集痰标本或支气管灌洗液，推荐采集胃液标本，通过胃灌洗吸出咽下去的痰液。
2）需连续采集3天标本，体积5～10ml，调节pH值至中性。
3）标本应在采集后4小时内送到实验室，否则实验室应该提供一次性内含100mg碳酸钠的无菌容器。实验室不应接受未经中和的胃液标本。（4）尿液
1）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要40ml。
2）24小时全尿或者量不足的尿液标本（除非不能获得足够量的标本）属于不合格标本。
3）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。
4）实验室收到标本后，应立即处理或离心冷藏贮存尿沉渣。（5）无菌采集的体液（脑脊液、胸腔积液、腹水、心包积液、关节液、骨髓）
1）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标本于无菌容器。为防止标本凝固，体液标本中应加入灭菌草酸钾（每毫升体液加0.01～0.02ml 10%的中性草酸盐），或肝素（每毫升体液加0.2mg肝素），或枸橼酸钠（每10ml的体液加2滴20%的枸橼酸钠）。
2）应提交足够量的样本，脑脊液＞5ml，胸腔积液和腹水5～10ml。
3）推荐标本床边接种至分枝杆菌液体培养基中。
4）标本尽可能快地运送到实验室。（6）无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本）
1）采集标本尽可能无菌操作，放置到无固定剂或防腐剂的无菌容器中，不能浸泡在盐水或其他液体或用纱布包裹，重量不少于1g。应迅速运送到实验室，对于长时间的运输，为防止脱水可加入无菌盐水，保持温度在4～15℃。
2）针对皮肤溃疡，宜从病变组织周边采集活检标本，应在30℃和37℃不同条件下进行培养。
3）甲醛溶液浸泡过的标本不能用于涂片和培养检查。
4）极少量的活检标本可以浸泡在少量无菌盐溶液中。（7）脓肿物、穿刺脓液、创伤标本
1）无菌穿刺采集尽可能多的标本。
2）对于皮肤溃疡，应该从感染性皮肤周边下层抽吸标本。这种标本用于做分枝杆菌培养时，推荐在常规37℃条件培养外，增加在30℃条件下培养。（8）血液
1）如果血液标本接种培养基之前需要运输，磺酸钠、肝素或枸橼酸盐可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能用于做培养，血液标本量5～10ml。
2）不推荐血液标本直接接种至固体培养基上。
3）血液和脑脊液标本培养推荐使用MYCO/FLYTIC瓶（BD）或MB/BactT ALERT血培养瓶（bioMerieux MarcyLEtoile，France）。（9）大便标本
1）合并AIDS的胃肠道患者，推荐采集大便标本和其他部位采集的标本一起，用于检测鸟-胞内分枝杆菌复合菌群（Mycobacterium avium intracellular complex，MAC）。标本量＞1g。
2）大便标本涂片的敏感性只有32%～34%，不能根据涂片的结果决定是否进行培养。
4.标本的运送（1）采集后无论运送距离远近都应按要求进行包装和标识。随标本应附有与标本唯一性编码对应的送检单。送检单应与送检标本容器分开，应含有受检者姓名、样本种类等信息。（2）运送过程要按照相关要求的温度范围内运送，并使用指定的保存剂。要注意容器的密封性以保证样本的完整性，必要时应避光或保湿。（3）运输病原微生物标本时，运送方式要遵守国家、区域和地方法规的要求，确保对运送者、公众及接收实验室的安全。
1）机构内部科室间标本运输:为防止发生意外渗漏或溢出，运输感染性物质时，应使用金属的或塑料材质的第二层容器（如盒子）加以包裹，在第二层容器中应该有标本容器的支架，将标本容器固定在支架上，以使其保持直立。第二层容器应耐高压或者能抵抗化学消毒的腐蚀，以便定期清除污染。封口处最好有一个垫圈，以防止发生渗漏。
2）跨机构之间的标本运输:应遵照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定执行。在运输过程中，运输的感染性物质分为A类和B类两大类。结核分枝杆菌培养属于A类，对于陆路运输，结核分枝杆菌培养用于临床诊断或评价疗效为目的，可以视为B类。陆路运输每个包装没有最大量的限制。
5.样本的接收（1）实验室应设置单独的标本接收处。工作人员应穿戴符合生物安全防护水平相适应的个人防护用品（包括隔离衣、帽、口罩、手套等）。（2）应由检验人员或经培训合格的专人验收，在接收记录簿、计算机或其他实验室信息系统（LIS）中对收到的所有原始样本进行记录，记录收到的日期和时间以及接收者。（3）应制订有关接收标本的标准。接收标本时，确认标本标记清晰并附有相应的化验单，两者信息必须一致。应认真核对，包括标本的类型、质量、体积、检查项目、标本采集和运送是否合乎要求等，标本送检人员和标本接收人员都要做认真的记录并签字存档。（4）应制订有关拒收样本的标准。如接收了不合格的原始样本，应在其最终的报告中说明样本不合格的原因，并在检验结果解释中予以说明。拓展文献th
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6.祁国明，主编.病原微生物实验室生物安全.北京:人民卫生出版社，2006第三章 显微镜检查第一节 萋-尼氏染色镜检一、技术原理
萋尔-尼尔逊（Ziehl-Neelsen）染色，也就是我们常说的抗酸染色，是由德国细菌学家Franz Ziehl（1859—1926）和病理学家Friedrich Neelsen（1854—1898）首先提出的。它是一种特殊的细菌染色方法，主要用于识别抗酸菌，如结核分枝杆菌细胞壁内含有大量的脂类物质称为分枝菌酸，可以耐受多种酸性介质的作用，抵抗普通的染色方法如革兰染色法，正因为如此，抗酸菌的染色不能像革兰染色那样容易。高浓度的染液、加热、加入酚以及延长染色时间都是为了提高染色的质量。但着色后，同样也很难脱掉颜色，碱性复红与分枝菌酸结合形成复红-分枝菌酸复合物，能够抵抗稀酸的漂洗，而细菌的荚膜分子量很高以至于室温呈蜡状，能够防止水系染液的渗透，因此，显微镜检查时抗酸菌仍然能够保持紫红色，而其他非抗酸菌经脱色后则被复染为蓝色，正是这种特征可以用于区分抗酸菌和其他普通菌。二、适用范围（一）确定诊断
凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均应进行痰涂片检查。确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。（二）疗效评价
1.凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰。
初治涂阳患者在疗程强化期末、治疗5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5个月和6个月）；复治涂阳患者在疗程强化期末、治疗第5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5个月和8个月），分别收集1份晨痰和夜间痰进行涂片检查。
2.初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在治疗第3个月末增加痰涂片检查1次。
3.确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查。三、检测样品
可用于显微镜检查的标本包括痰液、脓液、尿液、胸腹水、脑脊液以及组织标本或干酪块等。四、仪器设备
1.具有100倍油镜和8～10倍目镜的双目显微镜。
2.天平，精确度为0.1g。
3.磁力搅拌器，具备加热功能（配制的染液量大时用）。
4.水浴锅。
5.振荡器。
6.生物安全柜。五、试剂耗材
1.可密封的、带螺旋盖的痰瓶容器，参考规格为:直径4cm，高度2cm（图3-1）。图3-1 痰标本容器
2.无菌的一次性竹签、接种环或吸管。
3.载玻片。
4.高质量的碱性复红粉末（碱性复红的含量超过88%）。
5.乙醇（95%乙醇）。
6.水（去离子水或者蒸馏水）。
7.浓盐酸（37%，又名发烟盐酸），可以使用工业级盐酸。
8.高质量的亚甲蓝粉末（染料含量超过82%的生物染色剂）。
9.定性滤纸。
10.酒精灯或加热棒。
11.二甲苯。
12.镜油。六、操作步骤（一）试剂配制
1.碱性复红初染液
10ml经定性滤纸过滤的碱性复红储存液（8g碱性复红溶于95%乙醇溶液100ml中）加90ml 5%苯酚水溶液（5g苯酚水浴加热溶解后加入90ml热蒸馏水，待溶液冷却后，补充蒸馏水至100ml）充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤，置于避光试剂瓶中。
2.脱色剂
将50ml浓盐酸沿着瓶壁缓慢倒入950ml 95%乙醇中，搅拌混匀。注意:切勿将水向酸里加入！可能引起立即沸腾甚至喷溅到操作人员的脸上。操作强酸时穿实验服、戴手套。一旦发生酸引起的事故，应该用大量的水冲洗皮肤或者衣物。
3.亚甲蓝复染液
以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液（0.3g亚甲蓝溶于50ml 95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml），充分振荡、混匀，用定性滤纸过虑即得亚甲蓝复染液，浓度为0.06%。（二）痰标本采集
1.痰标本采集的数量和分类（1）初诊患者应收集3份痰标本。
1）即时痰:就诊时深呼吸后咳出的痰液。
2）晨痰:患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。
3）夜间痰:送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。（2）治疗或随访患者应按期留取2份标本（晨痰、夜间痰）。
2.采集痰标本地点和方法（1）当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的概率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间，或通风良好的留痰室内进行。（2）深吸气2～3次，每次用力呼出，从肺部深处咳出，将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，拧紧盒盖。（3）如果患者刚吃过东西，应先用清水漱口。装有义齿的患者在留取痰标本之前应先将义齿取出。
3.标本评价
患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）:标本量一般在3～5ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、黏液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。按性状痰标本可分为以下几种:（1）干酪痰:
标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，黏度较黏液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。（2）血痰:
此类标本是因黏液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到黏液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。（3）黏液痰:
标本外观以白色、黏稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多数为圆形、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于1∶3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低于1∶1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。（4）唾液:
目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、黏度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于1∶2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，是不合格的标本。（三）涂片制备
1.涂片（1）直接涂片
1）应使用干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，如果是未进行脱脂的玻片应该以95%乙醇擦拭（或浸泡）脱脂。在玻片一端的1/3处注明实验室序号及标本序号。如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写。确保玻片上的编号与痰盒上的编号相同。
2）在生物安全柜内使用竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0.05～0.1ml。于玻片正面的右侧2/3中央处以画同心圆或者发卷的方式（图3-2）均匀涂抹成10mm×20mm左右的椭圆形痰膜，如果痰膜涂抹得很规范，在×100物镜下，从痰膜的一端看到另一端后约为100个视野。图3-2 痰涂片方法
3）涂抹后弃掉用过的竹签。如果用的是接种环，将接种环放于含玻璃珠（或沙子）的25%乙醇中，上下移动接种环以去掉痰标本，然后加热接种环直到变红。
4）涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰否则表明该玻片涂抹过厚或过薄（图3-3）。图3-3 痰涂片厚度示例（过厚-适宜-过薄）
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