作者：陆茵
出版社：人民卫生出版社
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血管生成研究方法与技术试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
血管生成研究方法与技术/陆茵主编. —北京：人民卫生出版社，2014
ISBN 978-7-117-19728-1
Ⅰ. ①血… Ⅱ. ①陆… Ⅲ. ①血管疾病-研究方法 Ⅳ. ①R543-3
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主 编：陆 茵出版发行：人民卫生出版社有限公司
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一百多年前人们就已经发现肿瘤组织较正常组织血管丰富。1945年，Algire首先提出了“肿瘤血管生成”的概念；1971年，Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，但当时这种观念并未被人们所接受。随着毛细血管内皮细胞培养技术的建立、1980年第一个血管生成抑制剂IFN-α的发现，才使这一观点为越来越多的证据所支持，而2004年第一个血管生成抑制剂获得FDA批准后，更加确定了抑制血管生成是肿瘤治疗的一个重要方向。多种疾病与血管生成过程的异常相关联。因而，时至今日对血管生成新靶点的探寻和抗血管新生药物的作用模式的研究仍然是国际上重点关注的内容和方向。
可靠的实验模型是推动血管生物学不断发展并转化成临床疾病治疗措施的关键。我们课题组长期从事中草药活性成分影响血管生成的研究，跟踪收集了近10年来国内外关于血管生成方法学的研究文献，在综合国内外先进实验室已有工作基础上，将血管生成相关的实验技术方法编辑成册。
本书的主要特点是内容全面、系统、详细。内容涉及许多血管生成相关的细胞和动物模型，模拟了血管生成的各个环节，并且还将近年来新建立的斑马鱼血管生成模型、基因敲除视网膜血管生成模型以及“三明治”三维凝胶血管生成等模型均纳入此书中。掌握血管生成研究的新技术、新方法，对于研究工作者、药物研发人员及临床医生至关重要，目前国内还没有一部如此完整的关于血管生成的研究方法和技术的工具书。
由于生命学科发展日新月异，血管生成的研究进展迅速，限于编者水平和经验，书中可能有欠妥甚至错误之处，欢迎读者给予指正。
非常感谢国内外著名专家的大力支持，感谢他们在百忙之中审阅修改文稿，感谢国家自然科学基金委员会、国家科技部、江苏省科技厅各级课题和江苏省高校优势学科二期建设工程项目的资助。感谢人民卫生出版社的大力支持。值此交稿出版之时，对所有给予帮助的人一并谨致衷心感谢！陆 茵2014年3月，南京梅花盛开时节Table of Contents第一章 抑制血管生成治疗学 第一节 前 言第二节 血管生成和抗血管生成第三节 抗血管生成的生物学基础第四节 抗血管生成治疗的策略和靶点第五节 血管生成抑制剂第六节 抗血管生成药物的靶向治疗第七节 血管生成实验模型概述第八节 抗血管生成治疗的潜在缺点第九节 展 望第十节 结 论第二章 血管平滑肌细胞的分离、培养及鉴定 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第三章 牛视网膜微血管周细胞的分离、培养及鉴定 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第四章 人脂肪组织微血管内皮细胞的分离、鉴定和培养 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第五章 人原代内皮细胞的转染与转导 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第六章 肿瘤血管生成的显微定量研究 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法第四节 现有方法的改良第五节 小 结参 考 文 献第七章 胶原凝胶法诱导内皮细胞芽生 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第八章 三维凝胶迁移模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第九章 体外基质胶血管生成法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十章 斑马鱼血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十一章 缺氧诱导的斑马鱼视网膜病变模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十二章 体内基质胶栓血管生成测定法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十三章 小鼠脂肪血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十四章 低温诱导小鼠脂肪组织血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十五章 内皮细胞球体体内移植法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十六章 藻酸盐微珠释放法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十七章 圆盘血管生成法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十八章 海绵植入血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第十九章 中空纤维测定法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十章 角膜微囊法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十一章 大鼠动脉体外三维血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十二章 鸡胚尿囊膜法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十三章 明胶海绵-鸡胚尿囊膜法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十四章 氧诱导的小鼠视网膜病变血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十五章 他莫昔芬诱导基因缺失小鼠视网膜血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十六章 胚鼠后脑血管生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十七章 小鼠后肢缺血诱导动脉生成模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十八章 小鼠切除伤口夹板模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第二十九章 小鼠背部开窗血管荧光成像模型 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第三十章 小鼠脊背皮肤皱褶腔制备 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第三十一章 跖骨血管生成测定法 第一节 概 述第二节 材 料第三节 方 法参 考 文 献第一章 抑制血管生成治疗学第一节 前 言
所谓血管生成（angiogenesis），或称血管新生化（neovascularization），是指活体组织已存在的微血管床上芽生（sprouting）出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。此概念有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成（vasculogenesis）。多种组织和器官存在血管生成现象。正常的血管生成发生于特定的、短暂的生理过程中，如生殖过程和组织修复过程（如伤口愈合）等；病理性血管生成往往持续时间长且进行性发展，如糖尿病视网膜病和实体瘤的演进过程。正常的生理性血管生成开始于胚胎时期，并且在出生后一直到成年形成正常的血管。正常的血管有规律地分布，并且按照等级依次形成动脉、小动脉、毛细血管、后毛细血管小静脉、小静脉以及大静脉。而肿瘤血管在形成后不再进一步分化为相应的动脉及静脉，无平滑肌成分，肿瘤新生血管的结构和功能具有如下特点：①新生血管可以呈现复杂性的扩张、狭窄或扭曲；②血管管壁薄，缺乏支撑细胞（pericyte），甚至仅有一层内皮细胞，肿瘤细胞可以直接与血管管腔连接；③血管具有高通透性，不具备收缩功能；④不受神经体液调节，也不受乙酰胆碱、血管紧张素Ⅱ等对正常血管有活性的物质及温度的影响。
血管生成过程受多种血管生成因子和血管生成抑制因子的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧、营养缺乏、pH降低、NO升高等因素刺激合成和释放大量血管生成因子，从不同环节促进血管生成。缺氧（hypoxia）是血管生成的主要刺激因素，它能诱导组织细胞表达缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），调节含有缺氧反应元件序列的基因的表达，如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管生成素（angiopoietin）等。这些因子介导的信号途径可以改变血管内皮细胞的基因表达，刺激内皮细胞的增殖与迁移，从而促进器官和组织内的生理或病理性血管生成。
血管生成的基本步骤是：①血管通透性增加和毛细血管基底膜降解，趋化因子和丝裂原促进内皮细胞的迁移和增殖形成管状结构；②内皮细胞募集周细胞形成稳定的血管；③基底膜的重建，也标志着血管成熟的开始。
抗血管生成疗法或称血管抑制性治疗是一种以阻止和减少病变组织血管生成的治疗策略。它对一些慢性炎症、糖尿病视网膜病等的治疗有积极作用，并已经成为肿瘤治疗的重点。许多危及生命的肿瘤如婴幼儿血管瘤、肺多发性血管瘤及一些脉管瘤，通过抗血管生成的治疗取得了良好的疗效。
最新抗血管生成抑制剂或血管靶向治疗的研究进展包括：①能够特异性地直接抑制内皮细胞的增殖（TNP-470/CAPLOSTAIN、血小板第4因子）；②直接干扰内皮细胞的迁移（内皮抑素、整合素拮抗剂）；③通过抑制反应产物或基质金属蛋白酶阻止内皮细胞的运动；④通过在肿瘤血管中选择性凝血来破坏肿瘤内皮组织并诱导肿瘤梗死的形成；⑤在体内和体外筛选能与特定器官或肿瘤选择性结合的内皮组织相关肽，后者可以成功将多柔比星肽结合物靶向传输至移植性乳腺癌细胞MDA-MB-435和MDA-MB-231中。本章将着重讨论抗血管生成疗法在当今治疗中的作用和地位。通过介绍最新的研究进展，能够给科研人员和制药企业开发新的血管生成抑制剂或促进剂提供借鉴。第二节 血管生成和抗血管生成一、 血管生成与疾病
血管生成参与了许多疾病的病理变化。事实上，内科和外科的每一分支学科几乎都要处理与血管生成相关的生理或病理情况。血管生成是肿瘤生长和扩散所依赖的，肿瘤血管的活跃程度对组织病理分级、放射治疗以及预后判断都有重要的评估价值。例如，脑星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤及胶质母细胞瘤之间在血管内皮细胞增殖上存在显著差异，血管愈丰富，恶性程度越高，预后也愈差。血管生成也是缺血性疾病、慢性炎症、糖尿病视网膜病、银屑病和创伤愈合等疾病的基本事件之一。控制血管生成有利于许多疾病的治疗，从病理学角度研究疾病状态下的血管生成和消退规律，采取有效的血管治疗策略以及开展器官移植、含血管的组织工程研究，均具有十分重要的意义。表1-1总结了与血管生成异常相关的病理性变化，包括血管生成不足和血管生成过度。表1-1 血管生成在肿瘤和其他疾病中的作用二、 血管源性恶性肿瘤
血管源性恶性肿瘤是指源于血管内皮或外皮的恶性肿瘤。血管源性恶性肿瘤包括从良性的肿瘤样血管生长（血管瘤）到过渡性恶性肿瘤（血管内皮瘤），最后演变成全恶化性肿瘤（血管肉瘤）。主要病理表现为血管内皮或外皮细胞恶性增殖，细胞呈圆形或梭形，充满血管腔（内皮），并有纤维组织及组织细胞的浸润。尽管这些血管源性恶性肿瘤的发病机制还不明确，但有理论认为血管生长失控和血管结构畸形导致的血管生成异常是其主要发病机制。临床上第一个成功应用于治疗婴幼儿血管瘤的抑制血管生成的药物是IFN-α。
卡波西肉瘤（Kaposi sarcoma，KS）是一种多发性、组织特异性的出血性肉瘤，它是1782年由Kaposi首先描述的一种恶性肿瘤，是一种非常罕见的血管增生性疾病，来源于内皮细胞，部分可能来源于淋巴管内皮，呈现多中心性，艾滋病免疫功能低下时容易发生本病。组织学上的特征是具有显著的微血管及梭形细胞束。通常认为这些梭形细胞是KS损伤的肿瘤细胞，也有观点认为它起源于内皮组织或者血管平滑肌，因其能够表达多种血管内皮细胞和新生血管的标记物。以往的研究证实，人类疱疹病毒（HHV8）是KS具有传染性的原因，感染上HHV8将会开启血管生成过程。一些促血管生成因子和趋化因子，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）以及肝细胞生长因子（HGF）刺激KS的梭形细胞增殖，上述生长因子还可以从微血管募集至KS损伤发挥重要作用。裸鼠的体内实验表明，血管生成抑制剂PNU153429以及直接沉默bFGF mRNA的反义寡核苷酸具有抑制梭形细胞生长和改善KS损伤的作用。三、 白血病是一种血管生成驱动的恶性肿瘤
最近的研究显示，血管生成也可能在白血病以及其他“液质”肿瘤的发病中起到重要作用。组织活检显示，与正常儿童相比，白血病患者骨髓组织中微血管密度及血管数量都显著增加。研究显示，白血病细胞团块充满了微血管，形成了葡萄样团块。在白血病患者的尿液中还检测出高水平的bFGF。还有研究发现，白血病细胞高表达VEGF及其受体（KDR和Flt-1）。因而有人提出假说认为白血病细胞在破裂进入体循环之前是由血管生成来供给营养的。这些发现扩大了抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的潜在适用范围。四、 血管生成抑制剂是治疗肿瘤的重要手段
目前认为一些临床有效的化疗药物，如博来霉素、环磷酰胺、多柔比星及亚硝脲的抗肿瘤机制可能部分地与它们能抗血管生成有关。现在人们越来越关注于开发具有血管生成抑制作用的细胞毒类药物。针对人的抗血管生成治疗自1988年开始以来，现全球至少有10个抗血管生成药物被批准上市（绝大多数为抗肿瘤药物），此外还有数十个药物经FDA批准正在进行临床试验。与直接针对肿瘤细胞的传统化疗相比，抗血管生成疗法具有以下优点：①不局限于某一种肿瘤，所有实体瘤的生长、转移都依赖于新生血管的生成，理论上抗血管生成治疗适用于各种实体瘤；②血管内皮细胞暴露在血流中，故针对内皮细胞的血管生成抑制剂可以直接发挥作用，而传统抗肿瘤药物经组织扩散时受到组织坏死、纤维化和组织内高压等影响，常常在组织内达不到有效浓度；③正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于静止状态，而肿瘤血管内皮细胞增殖活跃，成人器官中新生血管生成只发生在一些特定生理条件下，如子宫内膜周期性增生、创伤愈合，所以抗血管生成疗法毒副作用较小；④血管内皮细胞基因相对稳定，故不易产生耐药性。在正常成人中，除了创伤愈合及生殖周期外，几乎所有新生血管生成都是病理性的，如肿瘤、风湿性关节炎及糖尿病视网膜病等，故选择血管生成这一靶点是更安全、毒副作用更小的治疗方法。第三节 抗血管生成的生物学基础
内皮细胞（endothelial cell）在血管生成过程中起着至关重要的作用，成为抗血管生成治疗的首要靶细胞。血管生成部位内皮细胞的表型特征对于抗血管生成治疗的选择性和靶向性有决定作用。一、 内皮细胞极易受到治疗药物的影响
内皮细胞形成一个贯穿机体循环系统的连续体，并且所有的内皮细胞直接与血液相接触。这意味着它们很容易与通过静脉输入的治疗药物相接触。当以患病组织的血管作为靶点时，诸如治疗药物难以充分进入实体肿瘤组织这样的问题就迎刃而解了。二、 血管生成时内皮细胞不断增殖且对治疗敏感
毛细血管网在血液和组织之间构建了一个广泛的分界面。事实上，作为系统性散布的器官，这一看似简单的内衬有血管的内皮膜由数量122超过1×10的内皮细胞组成，它们覆盖在面积超过1000m的表面上，重量约有1kg。因此，特异性靶向于肿瘤血管内皮组织十分重要。
血管生成过程中的内皮细胞与成熟内皮细胞相比显现出不同的表型，其中一个是增殖指数。脱氧胸苷标记显示，在健康小鼠组织中任一时间点只有0.01%～1.0%（中位数是0.2%）的内皮细胞在增殖；而在异种移植的肿瘤中有1%～32%（中位数是9%）的内皮细胞在增殖。在人类肿瘤中，内皮细胞的增殖/休眠比例更低（0.8%～5.3%，平均2.2%），但还是很明显地高于周围的正常组织。增殖指数的不同给抗血管生成治疗提供了一个契机，又称为抗内皮细胞增殖疗法（APET）。
最近的研究显示，休眠的内皮细胞处在一种保护状态中，在这个状态下它们表达“保护基因”，包括阻止促炎症反应上调及抑制细胞凋亡的基因。血管生成过程中内皮细胞与发育成熟的内皮组织相比还有一些不同之处，如基底膜（BM）的组成与渗透性。这些差别使得与已有血管中成熟的、休眠的保护性内皮细胞相比，新生血管中的内皮细胞对治疗药物更加敏感。三、 血管生成时内皮细胞具有器官特异性表型
内皮细胞具有器官特异性。最近，在血管靶向的抗肿瘤药物中，从体内噬菌体展示文库中成功发现的肽激起了人们对经由内皮组织器官靶向的广泛兴趣。当以肿瘤血管为靶点通过荷瘤小鼠给药后发现，与单独使用相同剂量的多柔比星相比，多柔比星肽结合物显示出更强的抗肿瘤活性并且对其他器官毒性更低。今后人们将会不断发现新的内皮细胞器官特异性标记物，使靶向于特定器官的内皮组织成为可能。
激活的内皮细胞中发生很多分子变化，包括一些蛋白的表达升高：①表面分子；②细胞间受体蛋白激酶；③整合素；④非整合素黏附分子；⑤蛋白酶。例如，在血管生成过程中，整合素αβ和αβ介v3v5导内皮细胞与细胞外基质（ECM）之间重要的相互作用。通过抗体或肽拮抗剂阻断与玻连蛋白相结合的α，它能诱导内皮细胞凋亡并抑v制肿瘤和视网膜病变中的血管生成。四、 破坏肿瘤血管可以导致肿瘤细胞死亡
通过血管紧张素转化酶（ACE）阳性染色，估测1g的小鼠纤维肉77瘤中包含1.1×10～1.9× 10个内皮细胞，这占总细胞数量的4%～7%。89估测1g肿瘤组织中含有约10～10个肿瘤细胞，内皮细胞/肿瘤细胞的比率在1/100～1/10范围之间。这意味着内皮细胞靶向治疗有一个内在的扩增作用，血管内皮组织一个相对小的损伤即可引起血管的衰竭和广泛的缺血性坏死。有实验证据可以支持这一论点。例如，在抑制bFGF诱导的血管生成的研究中，注射反义的bFGF或FGF受体-1（FGFR-1）cDNA，可以诱导晚期黑色素瘤的坏死。通过诱导血液凝固选择性地阻塞肿瘤血管可以导致肿瘤梗死和大的实体肿瘤的根除。通过凝血激酶相关的双特异性抗体与组织因子结合，以及与毒素结合的特异性抗体能够触发选择性凝血。在这些过程中，转染的成神经细胞瘤细胞分泌的干扰素γ诱导肿瘤血管内皮细胞表达主要组织相容性复合体Ⅱ抗原。只有在肿瘤血管中，免疫毒素和双特异性抗体才靶向于主要组织相容性复合体Ⅱ。五、 基因稳定的内皮细胞不产生耐药性
在抗血管生成治疗的实验中并没有发现耐药性，即使是在重复多次给药的情况下也没有出现。对此，一个普遍接受的解释是：内皮细胞像其他基因稳定的二倍体细胞一样，与基因不稳定的异质性肿瘤相比，不容易发生耐药性的机制。因此，不产生耐药性与上述其他优点，使得抗血管生成疗法特别具有吸引力。第四节 抗血管生成治疗的策略和靶点
药物常通过干预血管生成过程中的一些关键步骤而抑制或阻断血管生成的过程（图1-1）。国内外已经发现和开发出多种具有良好临床应用前景的抗血管生成药物。图1-1 血管生成过程示意图
抗血管生成治疗策略目前主要分为六大类：①抑制内皮细胞活性；②抑制内皮细胞增殖；③抑制内皮细胞迁移；④3D结构组织的破裂（毛细小管和环的形成）；⑤干预BM和ECM的生物合成和重塑（如通过抑制内皮细胞分泌的蛋白酶）；⑥诱导内皮细胞凋亡和直接杀死内皮细胞。
阻断血管生成通常不止一种策略。例如，抑制血管生成信号途径、抑制细胞产生血管生成因子或抑制它们从细胞外基质中释放，抑或是这两者的联合作用，都可抑制内皮细胞的活化。蛋白酶抑制剂可以干预隐藏在细胞外基质中血管生成因子的释放、内皮细胞的迁移及细胞外基质的生物合成和重塑。更多的抗血管生成策略见表1-2。表1-2 抗血管生成治疗策略
在分子水平，阐明一系列分子事件有助于开发抑制血管生成的潜在靶点，这些靶点包括：①分泌的蛋白，如运动刺激因子；②生长因子及其受体；③黏附分子及受体；④调节蛋白及其介导的胞内信号途径；⑤细胞外基质降解蛋白酶及其抑制剂。随着在分子水平对血管生成认识的不断深入，更多潜在的分子靶点还将不断出现。然而，这些策略方法和分散的分子靶点可能未必同样有效，因而需要进一步努力发现最有效抑制血管生成的特定细胞或分子靶标。
阻断DII4/Notch信号途径是抑制肿瘤血管生成的另一种策略。VEGF是主要的肿瘤血管形成诱发因子，因此，在肿瘤抗血管治疗上，将目光集中在VEGF上。但VEGF的阻断不是对所有的肿瘤都适用，所以寻找替代方法的研究还在继续。最新的研究表明阻断DII4/ Notch信号途径对抑制肿瘤血管生成同样有效。跨膜分子DII4是Notch1和Notch4的配体，是胚胎血管正常发育所必须的。最近研究发现DII4高表达在肿瘤血管生成过程中发挥重要的作用，因此抑制DII4可以阻遏肿瘤生长。抗DII4疗法有两大优点，第一是抗DII4疗法与抗VEGF疗法联合使用比单独使用抗VEGF疗法效果好；第二是抗DII4疗法对那些抗VEGF疗法无效的肿瘤也有疗效。第五节 血管生成抑制剂一、 血管生成抑制剂的研究
虽然许多已知的血管生成抑制剂或抗血管生成因子都是意外发现的，如鱼精蛋白、血小板第4因子、血管生成类固醇及很多的微生物（真菌和细菌）衍生物如烟曲霉素，但过去30年里，人们在鉴别、纯化和合成血管生成抑制剂方面已作出了很多努力。最初，抗血管生成因子是从无血管的组织中提取出来，如软骨和人眼睛中的玻璃体。直接将血管上皮作为潜在血管生成抑制剂来源的研究相对较少，尽管这种观点已经通过膀胱上皮中蛋白酶抑制活性的鉴定而得以验证。
最近，科研人员新发现了几个天然内源性抑制因子。在幼年仓鼠的肾细胞株BHK21/ c113中发现了抑制血管生成的活性因子，其肿瘤抑制因子基因的活性在转化过程中被灭活；在血小板凝血酶敏感蛋白（TSP-1）的片段中发现了抑制活性因子，它的表达受野生型肿瘤抑制基因p53的调节。新策略是转染含有肿瘤抑制基因的高度血管生成的肿瘤细胞株之后，分析抑制血管生成的活性。许多证据显示，肿瘤抑制基因在基因开关中发挥作用，该基因开关可以关闭或控制血管生成过程（表1-3）。表1-3 肿瘤抑制基因和其他控制血管生成的基因
目前已发现两个有效的内源性抗血管生成因子，分别是血管抑素和内皮抑素。这两个因子均是从实验性肿瘤移植动物的血清和尿液中纯化获得的。肽序列测定显示血管抑素和内皮抑素分别是纤溶酶原和ⅩⅧ型胶原的蛋白水解片段。更重要的是，血管抑素和内皮抑素的发现揭示了一个新的血管生成调节机制，即缺乏抗血管生成活性的大蛋白“存储”编码有效的血管生成负性调节蛋白。早年已发现隐性纤连蛋白的29kD片段和催乳素的16kD片段的抗血管生成活性，但这些发现并没有立即深入下去。新发现的抗血管生成活性的隐性片段见表1-4。
血管抑素由纤溶酶原通过弹性蛋白酶的作用而释放，如肿瘤浸润性巨噬细胞释放的金属弹性蛋白酶（MME）和一些来自人前列腺癌细胞株中的丝氨酸蛋白酶。还需要进一步阐明母体分子释放的血管生成抑制片段的机制。例如，在小鼠角膜新生血管形成的模型中，筛选癌细胞株中循环的活性血管生成抑制因子，有助于了解在什么类型的细胞中以及在什么情况下能够正常地释放隐性抑制因子。表1-4 编码在大分子结构中的生理性血管生成抑制因子a母体蛋白质有血管生成抑制活性但分解产物更有效。b母体蛋白质是一个可逆的G期的抑制因子，并且当蛋白水解的产物刺激了血管的1生成，将显示对血管生成的抑制作用。二、 血管生成抑制因子的概述
目前为止，已发现数百个抗血管生成因子，部分见表1-5、1-6及1-7。大部分抗血管生成因子可分为以下几类：①生理性抑制因子（表1-5），它们大部分对不必要的血管生成发挥抑制作用，也可能赋予正常组织抵御肿瘤侵袭的能力；②天然产物（表1-6）；③微生物衍生物（表1-6）；④合成或半合成分子（表1-7）。这些抗血管生成因子中，一些正进入临床试验（表1-8），还有一些药物因为具有其他治疗活性也已用于临床，如博来霉素、青霉胺、甲氨蝶呤、紫杉醇，尤其是多柔比星。表1-5 生理性或内源性血管生成抑制剂续表表1-7 其他血管生成抑制剂表1-6 一些抗血管生成的天然产物续表表1-8 临床试验中的血管生成抑制剂
内源性的血管生成抑制剂具有较高的作用特异性并且比其他抑制剂更有效。事实上，血管抑素不仅可以延缓小鼠肿瘤的生长，还可以使肿瘤体积（如400mg，约为小鼠体重的2%）明显缩小。更显著的是，在三种快速生长的小鼠肿瘤模型中，内皮抑素能使肿瘤完全消退并诱导其进入无限期的休眠。其他抗血管生成药物甚至细胞毒类化疗药物中都没有见到类似的结果。这些新发现拉开了内源性抗血管生成药物治疗人类原发肿瘤及其转移的序幕。第六节 抗血管生成药物的靶向治疗
抗血管生成药物的靶向是一个需要考虑的重要问题。目前，根据药物与所用载体的性质分为以下几类：
1. 直接给药
低分子量的药物如苏拉明类似物和AGM-1470正常情况下可以经特殊设计的载体或者靶向配体自由传递。其他直接给药的抗血管生成药物是具有内在的靶向性，这些药物包括合成肽、中和抗体、生长因子/受体拮抗剂及整合素拮抗剂。VEGF和VEGFR的抗体以及整合素2αβ拮抗剂显示出抑制血管生成从而抑制肿瘤生长和（或）肿瘤侵袭v3与转移的作用。
2. 抗体导向治疗
特异性抗体可以与各种治疗因子相结合，如毒素（即免疫毒素）、放射性核素或者酶。遗传工程抗体片段如抗原结合片段（Fab）和单链抗体可变区基因片段（scFv），及双特异性抗体也能实现这一治疗。
3. 嵌合蛋白质治疗
血管生成因子或其受体的片段可以设计作为靶向配体并且与毒素或者其他治疗因子相融合。生长因子或者受体的片段作用的同时，可以作为拮抗剂阻断配体-受体之间的相互作用。例如，由融合了突变体形式的假单胞菌外毒素的酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）和与免疫球蛋白G（IgG）重链相关的VEGF受体嵌合蛋白质组成的嵌合毒素（aFGF-PE），分别在体外和体内显现出对血管生成的抑制作用。
4. 肽导向治疗
抗肿瘤药物可以作为肽的结合物以肿瘤血管为靶点进行体内传递。特异性抗血管生成因子也能用这种方式传递。用来靶向传递的肽结构有望拓展到与器官特异性行为相关的内皮细胞。
5. 基因转化治疗
如包括以多效生长因子（PTN）为靶点的核酶、显性负相VEGF受体（Flk-1）突变的bFGF和bFGFR-1反义靶点，利用特异内皮细胞启动子进行血管靶向基因治疗。这些可以实现血管靶向的抗血管生成治疗。
6. 细胞转化治疗
增殖的内皮细胞和内皮祖细胞聚集到血管生成激活区域表明内皮细胞会被转运继而在转运区域生长。这对于抗（促）血管生成因子传递到病理性区域很有价值。在其他类型的细胞内也能实现抗血管生成药物的传递从而发挥抗血管生成作用。如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK），尤其是肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）可能对抗血管生成因子靶向进入肿瘤血管很有用。
以上方法结合更多的复杂手段可以获得高度特异性和有效的药物体内传递，一个很好的例子就是抗体导向酶-前体药物疗法（ADEPT），即抗体-酶结合物与直接给药的前体药物联合使用。
血管生成抑制剂的应用将成为控制肿瘤生长和转移的一个重要策略，选择合理的治疗时机和治疗方案，将成为其疗效好坏的决定因素，与传统化疗、放疗联合应用，作为肿瘤综合治疗的一个组成部分将是血管抑制剂的发展方向。第七节 血管生成实验模型概述
血管生成研究需借助多种体内、外血管生成模型进行。血管形成的芽生、重塑、网络状结构等血管生成的不同阶段都可以在血管生成模型中模拟完成。本节对目前常用的血管生成研究模型及其进展作一简要概述。一、 体外模型（一） 血管内皮细胞的增殖实验（cell proliferation assay）
血管内皮细胞增殖是血管生成的起始阶段，血管周细胞的增殖对于血管生成的后期阶段也起到重要作用。目前主要有两种测定细胞增殖的方法，即净细胞数测定和细胞周期分析。①四甲基偶氮唑比色法（MTT法）测定活细胞数的化学定量方法，操作简便，价格低廉。但它不适合测定对细胞代谢有影响的药物，因为这类药物能影响MTT测定的活细胞数。近年来，MTS分析法逐渐取代MTT法用于细胞增殖的检测，其原理与MTT法相似，但操作更为简便，实验误差更小。此外，还可通过胸苷掺入法测定DNA合成来测定细胞增殖能力。应当注意的是，检测药物对细胞增殖的影响需同时考察药物对细胞是否具有细胞毒作用。②近年来有报道通过细胞周期分析来评价药物对细胞增殖的影响。细胞与溴脱氧尿苷（BrdU）短时间作用可促使BrdU掺入细胞DNA中。碘化丙啶（PI）染色后测定细胞的总DNA量，再用荧光激活细胞分析仪测定细胞中BrdU和PI的量可得出细胞周期信息。但实验用的内皮细胞处于增殖状态，与体内静止状态的内皮细胞是不同的，实验结果与体内还是存在一定差异。（二） 血管内皮细胞的迁移实验（cell migration assay）
血管内皮细胞的迁移参与新生血管的芽生过程，而血管周细胞运动能力的增强有助于周细胞向新生血管的募集从而稳定新生血管。目前考察细胞运动迁移能力的模型常包括以下两种：①血管内皮细胞的划痕实验：在培养细胞的培养皿上用刀片划痕，再经药物处理后，细胞用甲醇固定，Giemsa染色。在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数，需要注意的是划出的损伤区域一定要精确。②Boyden小室实验：Boyden小室由两层组成，两层之间为胶原包被的多孔多聚碳酸盐滤膜。细胞放于上层，同时加入待测药物孵育一段时间后，除去上层细胞，下层细胞用甲醇固定，光镜下计数下层细胞数。Boyden室模型优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感，但计数方法不同可能会造成统计结果误差较大，需要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差。（三） 血管内皮细胞小管形成实验（tube formation assay）
小管形成实验能模拟人体内毛细血管生成的过程，包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤，接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。显微镜下分析小管间的紧密连接，从而定量血管生成情况。实验一般采用48孔培养板，随机选择几个典型区域获取数据，借助软件对小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积进行定量。几乎所有的内皮细胞都能在细胞外基质上形成管状结构。近年来研究还发现，血管周细胞在体外也能形成毛细血管样结构（如肝脏中的星状细胞），因而这一模型也可用来研究周细胞的血管生成行为与机制。（四） 大鼠主动脉环实验（rat aortic ring assay）
1990年Nicosia等首次将此模型应用于血管生成研究。取下大鼠主动脉后，剪成1mm宽的血管环，再用纤维蛋白胶或胶原蛋白胶包埋，然后以无血清的MCDB131培养液培养。培养过程中每天计数主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析。用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同。胶原包埋的主动脉环，培养1周时血管数达到顶峰，第2周开始萎缩。用纤维蛋白胶包埋时能使血管数顶峰期维持更长。近年来有研究者将此方法改进，采用更薄的胶层包埋动脉环使得新生成血管染色更方便；应用双重染色法和共聚焦显微镜在同一层面上观察到内皮细胞和平滑肌细胞及外周细胞共同存在并证明了新生血管主要由内皮细胞构成。方法学的改进有利于血管生物学家更深入地研究血管生成的机制。动脉环取材范围广泛，观察方法简单，可从分子水平阐明血管生长的分子调控机制，是一个较好的体外血管生成模型。但它不能完全真实反映肿瘤生长的微血管环境，另外从不同种属和不同大小的动物体内取出的动脉环血管生成数差别很大。
新近有研究报道用人脐动脉环做类似的血管生成体外模型。该模型能够有效地用于分析调控血管芽生的功能基因及筛选促血管生成或抗血管生成药物。该模型还适用于shRNA介导的基因沉默操作以及动态分析肿瘤微环境对血管生成的相关效应。这一来源于人体组织的新颖血管生成模型是目前已建立的最接近人体真实环境的三维模型，具有重要的应用价值。二、 体内模型（一） 基质胶栓实验（Matrigel plug assay）
1992年Passaniti等建立基质胶栓模型。基质胶是从Engleberth-Holm-Swarm瘤中提取的，主要由基膜蛋白构成。4℃时基质胶是液态，将bFGF与胶混匀后注射到小鼠皮下，胶在体温状态下形成胶栓，内皮细胞等迁移入胶栓内形成血管样结构。1至3周后取出胶栓及包围在周边的肉芽组织，再定量胶栓内血管。过去定量血管生成常采用计数血管数，但基质胶栓中血管分布不规则导致计数困难。也有采用测定新生血管血液中血红素含量来定量血管生成，但无法区分新生血管、血窦及大血管中的血液，结果定量也不准确。近来有报道通过注射荧光素标记的高分子量葡聚糖来定量新生血管以及通过PCR技术分析血管生成相关基因。该模型也可应用于组织再生实验。所有组织都包含有促进或抑制血管生成的因子，而胶栓中除新生血管外本身没有组织。另外，每次注射相同体积的胶液却难以得到相同体积的胶栓，导致基质胶栓模型结果差异较大。虽然该模型存在以上缺点，现仍被广泛用于促进或抑制血管生成药物的筛选。（二） 海绵植入实验（sponge implant angiogenesis assay）
1987年Andrade等提出海绵植入实验模型，即先将待测药物注入133无菌聚酯海绵中，再将海绵植入大鼠皮下。海绵植入后用Xe清除技术测定其中的血流，血管化后可以客观、重复评价血管新生，也可以通过局部注射促进或抑制血管生成物，再收集渗出液来作生化分析。海绵植入实验可模仿肿瘤缺氧微环境，也适用于肿瘤血管生成研究。该模型也存在一些缺点，海绵植入皮下会引起非特异性炎症反应，肉芽组织逐渐包裹海绵。此外，使用不同成分海绵可引起较大的实验差异。放射性气体的使用也使得实验进一步复杂化。（三） 海绵-基质胶实验（sponge/Matrigel angiogenesis assay）
2002年Akhtar等结合海绵植入实验和基质胶栓实验建立海绵-基质胶血管生成模型。方法是将0.5ml的Matrigel注射到小鼠皮下，待胶凝固后麻醉小鼠，轻轻刮掉注射胶液处的毛发，在皮肤上开一小口，再在胶栓上开一小口后植入含有供试药物的无菌聚乙烯海绵、瘤块或其他组织，再用镊子将海绵移至胶栓的中央，实验结束后取出胶栓并定量新生血管数。模型改进后血管能定向生长，灵敏度比基质胶栓实验更高，不足之处在于实验耗时更长。（四） 圆盘血管生成实验（sisc angiogenesis assay）
1988年Fajardo等将圆盘血管生成模型应用于伤口愈合和实体瘤血管生成研究。将药物或肿瘤细胞悬液加到聚乙烯醇泡沫材料制成的圆盘中央，再将小圆盘植入小鼠胸部或腹部皮下。实验结束后取出小圆盘，石蜡包埋后切片，在显微镜下可以观察到血管、成纤维细胞及粘连组织。通过计数组织切片中血管交叉点和测定血管内面积来定量新生血管，这些方法直观且易操作。同时本模型仍存在一些缺陷，植入圆盘后引起的异物反应也能刺激血管形成，并且不能连续和动态观察小圆盘内血管生成情况。（五） 鸡胚绒毛尿囊膜实验（chick chorioallantoic membrane angiogenesis assay）
1931年Lewis等建立鸡胚绒毛尿囊膜实验模型，最初用于胚胎组织移植物发育潜能的研究。1977年Folkman等首次将其用于肿瘤微血管生成研究。该模型的特点是在鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未建立。对各种异物几乎不发生排异反应，而且取材方便、易于观察、实验周期短和费用低，适用于大量血管生成药物的筛选，同时也存在一些缺陷。植入物渗透压和pH的不同所导致的细胞损伤和炎症反应及鸡胚内血管纤维蛋白降解产物均可刺激微血管生成，造成假阳性结果。鸡胚发育本身存在的血管生长亦可干扰结果，导致结果可信度下降。近年来在鸡胚尿囊膜模型的基础上，人们发明了明胶海绵-绒毛尿囊膜实验分析法。在此模型中，新形成的血管垂直生长于海绵内部的尿囊膜平面，其中不包含预先存在的血管。孵育第8天时在发育的尿囊膜顶端植入明胶海绵，可以进行详尽的组织学分析，有助于检测发生在绒毛膜上皮的增生性反应的血管炎性浸润。海绵内血管和基质的生长还可以客观再现并量化。（六） 角膜微囊实验（corneal angiogenesis assay）
1974年Folkman等首次将该模型用于肿瘤血管生成研究。正常角膜本身无血管，可避免其他模型中原有血管的干扰，因此诱导角膜血管生成反应更能真实地反映血管生成过程。早期实验采用兔眼角膜，将健康新西兰白兔麻醉后，在角膜边缘处用虹膜刀植入载体，3～4天后血管从边缘出芽，7～10天内新生毛细血管进入载体，通过计数载体内新生毛细血管数和生长率可评价药物对血管新生的效果。但实验过程中易诱发非特异性炎症反应，难与肿瘤微血管生成因子刺激的血管生成相区别，并且模型中微血管生成呈环状排列，分布无规律，造成定量困难。后来有研究者用组织相容性好且较少引起炎症反应的高分子材料制成多聚缓释载体，在载体中加入微血管生成因子后再植入角膜微囊。改进后的模型较少引起炎症反应，但成本较高。后有人将这一方法进一步改进，采用鼠眼角膜进行实验，成本大大降低，效能基本相同，但大鼠的眼球小，给实验操作带来一定难度。（七） 视网膜血管生成模型（retinal angiogenesis model）
视网膜和其他组织一样，存在着广泛的血管发生及生长过程。视网膜血管生成模型可以为视网膜病变机制及药物作用靶标的发现提供重要的途径。在很多动物如小鼠、大鼠、兔、猫和比格犬幼犬在出生时不具有完整血管的视网膜。这种不完全的血管生成过程类似发生在新生早产儿中的未成熟的血管生成过程。猫是第一个被用于研究视网膜血管生成的动物模型。幼猫和幼比格犬的视网膜血管生成与人类相似，然而这些模型的最大缺点是花费高且试剂不容易获得。另外也有以兔为模型研究视网膜病变，但兔的视网膜血管只集中于视网膜的一个小区域，与人类新生儿视网膜血管生成不尽相同。近年来，人们又建立了小鼠视网膜病变模型，可以显示出血管新生眼部疾病的两个阶段中的分子调控途径的变化，且能阐明发育学或病理学血管生成机制。此外，基因技术的发展促使人们进一步开发出他莫昔芬诱导的基因缺失小鼠视网膜血管生成模型。这一方法可应用于分析新生小鼠、幼鼠、成年小鼠以及基因突变小鼠的病理性视网膜血管生成及定量研究。（八） 脂肪血管生成模型（adipose angiogenesis model）
脂肪组织的扩张依赖于血管生成。脂肪源性生长因子可显著影响脂肪血管生成，同时在控制脂肪组织代谢状态方面起了关键性作用。脂肪细胞和血管细胞相互作用可用来确定脂肪储存的多少和代谢状态。目前在小鼠体内，研究人员已开发出能够定量研究基于先天遗传和后天肥胖模型的脂肪血管生成和血管重构的模型，进而成功地检测原位微血管和脂肪细胞的方法，包括用冰冻切片包埋和石蜡包埋样本来进行微脉管系统的免疫检测。此外，研究人员还建立了低温诱导下小鼠体内白色和棕色脂肪组织变化和血管生成模型。应用这一模型可以对皮下白色脂肪组织向棕色脂肪组织变化过程，以及与此相关的血管生成过程进行动态研究。使用各种细胞的特异性分子标志物可以方便地检测此模型中脂肪细胞和微血管内皮细胞的结构和功能变化。这一低温诱导的小鼠棕色脂肪组织生成的模型与人体具有较好的临床相关性，可以为研究微血管的生长和功能提供很好的模型。（九） 内皮细胞球体体内移植法（pheroid-based endothelial cell microvessel formation）
近年来，研究人员建立了一种内皮细胞球体体内移植的血管生成检测方法，它可以在动物体内建立一个衍生于移植的内皮细胞的复杂5三维毛细血管网。这一方法具有很高的灵敏性，少于10个细胞即可以形成毛细管网络；还具有很高的灵活性以及检测结果的稳定性，能够进行定量分析。人工培养的内皮细胞中的球状体细胞可以嵌入在胶原基质模型中，并充当新生毛细血管出芽的出发点。此外，内皮细胞中的球状体细胞还可以作为一种输送装置，在体内适宜的凝胶模型中用于内皮细胞的移植。本方法的建立是基于内皮细胞球体移植到免疫缺陷小鼠体内的合适基质，或凝胶中培养可以形成稳定的毛细血管三维网络。这个新生的血管网络能够连接小鼠自身的血管系统，通过招募小鼠血管周细胞从而形成成熟血管。这一方法可用于血管新生和血管源性淋巴液的研究，还可用来研究内皮细胞的功能和参与血管生成的级联反应机制以及血管生成活性药物的筛选评价。（十） 胚鼠后脑血管生成模型（embryonic mouse hindbrain angiogenesis model）
胚胎小鼠后脑由于其在发育早期独特的结构和血管化过程，已成为研究体内血管生成的一个关键模型系统。与脊椎动物中枢神经系统的其他部分相似，后脑早期的血管新生对于神经祖细胞的迅速增殖和生长发挥了关键的支持作用。大约在小鼠胚胎发育的第9.75天，从神经周血管丛发生的血管生长进入胚胎后脑区域，然后向心地围绕脑室生长。从胚胎发育第10天以后，这些径向血管均沿平行方向在后脑室表面下生长。这些邻近的血管芽相互接触吻合，形成后脑室下血管丛。毛细血管网络一旦形成，便发生动静脉的分化。研究人员已利用此模型研究了生长因子信号在血管生成中的作用。胚鼠后脑模型与其他血管生成体内模型相比有很多优点，如因为其形成较为简单的几何形状的血管网络，故适用于对血管出芽和复杂血管的定量。应用此模型还可以观察血管早期发育阶段的变化。（十一） 跖骨血管生成模型（fetal metatarsals angiogenesis model）
跖骨血管生成模型是采用组织培养的方法使血管从胚胎小鼠跖骨的小血管中长出来。跖骨是从胎龄17天的小鼠胚胎中分离出来的，可进行体外组织培养。培养的第1周血管生长良好，可以用血管面积来定量。这种检测方法可用于评价药物的促血管生成或抗血管生成活性。健康的跖骨新生血管起源于骨微血管，因此，该离体血管生成模型比大血管生成过程更具典型性。但由于胚骨自身经历了血管生成，因此这项技术模拟的不是静止的微血管生长过程。三、 整体模型（一） 斑马鱼实验模型（zebrafish model）
1999年Serbedzija等用斑马鱼来筛选影响血管生成的小分子物质。斑马鱼是热带淡水鱼具有以下优点：①斑马鱼是脊椎动物，有独立的组织器官，其器官与人的器官在结构、生理、分子水平等方面惊人地相似；②个体小，喂养费用低廉，所需空间场地不大；③胚胎透明，从完整的活体可以观察到所有内部器官和结构，避免杀死或解剖动物，从而可多角度观察动力学过程。斑马鱼体外排卵，体外受精，在无营养条件下可存活3～4天，血管生成与其他脊椎动物相似，所以非常适合体内血管细胞生物学研究。与其他模型相比，斑马鱼模型实验周期短，只需要3天，斑马鱼容易喂养，药物需要量少，单剂量给药，一次可以筛选较多化合物且适合于量效关系研究。另外斑马鱼模型还可以快速鉴定血管生成中新的候选疾病基因及有潜在治疗效应的化合物。此外，为了研究缺氧诱导的病理性血管再生对视网膜病变进程的影响，人们开发了缺氧条件下诱导斑马鱼视网膜病变的模型。在这个模型中，视网膜血管再生将发生于已预测的视神经盘区域。成年斑马鱼被放置于经特别设计的玻璃缸内，使用氧传感器可以自动检测水中氧含量。暴露于缺氧水环境中若干天后，使用荧光显微镜可以很容易观察到视网膜血管再生。总之，斑马鱼血管生成模型已显示出诱人的前景。（二） 爪蟾蝌蚪模型（xenopus laevis tadpole model）
有研究人员建立了爪蟾蝌蚪模型。蟾蜍发育很快，受精后4天用显微成像技术能观察完整发育和功能性脉管系统。蟾蜍胚胎是可应用于血管生成研究的有用模型。蟾蜍与斑马鱼一样，与其他脊椎动物的血管类似，但蟾蜍与斑马鱼不同的是它淋巴系统发达，可用于淋巴管生成的分子研究。（三） 小鼠背部开窗血管荧光成像模型（dorsal window chamber model in mice）
窗口模型广泛应用于肿瘤血管生成、肿瘤微环境以及药物对肿瘤的药效反应研究中。近年来，随着荧光报告基因、荧光探针植入术以及成像技术的发展，在体内研究中这一技术又获得了极大的应用前景，包括考察血管生成、血管功能变化、血管通透性的改变、药物治疗过程中一些分子水平的变化以及组织氧分压和氧合血红蛋白等信息的变化。背部开窗技术包括使用外科手术植入一个钛合金框架来支撑那个透明的窗口。小鼠背部的皮肤折叠进钛合金框架中，同时一侧的皮肤需要移除约1cm直径的圆形区域。另外，一个圆形盖片将覆盖在开口处，从而方便进行高分辨率的显微成像。在植入窗口，肿瘤细胞可以被接种进皮下组织，数天之后肿瘤会在窗口处生长，可以进行肿瘤始发和生长过程的相关成像检查。之后可以用定量图像分析来对正常组织或者肿瘤组织中的荧光报告基因、光学探针、血液流变学以及其他参数来进行定量分析。（四） 肿瘤模型（tumor model）
有报道与血管生成有关的转基因肿瘤动物模型。也有很多其他的肿瘤模型用于研究药物抗肿瘤的潜在活性以及对瘤块大小（直径、面积或体积）和动物存活时间的影响。肿瘤模型可专门用于研究药物潜在的抗血管生成活性，它可以在同一个实验中研究药物的摄取、分布以及效应。同时也可以用来检测一个药物是否具有抗血管生成作用，如果药物有抗血管生成的作用，就会阻止或大大减少肿瘤新生血管的数量。实验性肿瘤特别是皮下注射形成瘤的局部环境与自发性生长瘤不一样，动物肿瘤模型与人体内肿瘤生长环境还有一定差别，因此动物实验不能完全等同于人体实验。
迄今为止血管生成模型还没有一个统一的评价标准。理想的血管生成实验模型应该可靠、操作简便、定量容易，更重要的是和人体生理条件相关。但是由于血管生成反应中细胞及分子活性复杂，单独一种模型不可能满足以上所有条件。体内、外血管生成模型各有其优缺点。体外模型能较好地控制和监测实验过程，操作相对简单，实验费用较低，但条件难以标准化，实验结果不能完全反映体内情况需要体内实验来证实。体内模型实验条件较接近体内环境，但操作繁琐耗时，价格昂贵，结果不易定量且易变性大，最终还是需要借助整体模型来验证和评价。第八节 抗血管生成治疗的潜在缺点
尽管抗血管生成疗法在临床研究中显示出优越性，但是对于其确切有效性与安全性还尚无定论。抗血管生成手段可能干预正常的生理性血管生成，影响伤口愈合，阻碍幼童的生长发育或引起女性的闭经。大量研究能够支持对许多疾病的抗血管生成治疗，人们也认识到抑制生理性血管生成可能造成的潜在不良反应，但是不需过分担心。首先，抗血管生成药物的毒性在年轻患者中是可以忽略的，因为正常的血管生成一般在婴儿期之后就停止了，血管内皮细胞的转化水平在儿童与青少年男子体内非常低。其次，当女性接受抗血管生成治疗后，抗血管生成药物可能给健康女性提供一个新的避孕方法。最后，伤口愈合功能的缺损在常规的化学疗法和放射疗法中也会出现，在这种情况下可以中断抗血管生成治疗或者将其替换为局部的血管生成刺激治疗。
最近有研究提示抗血管生成疗法虽然能抑制肿瘤生长，但因为抗VEGF治疗可以使代谢性旁路途径活化，增加肿瘤组织的缺氧程度，升高血浆蛋白G-CSF（粒细胞集落刺激因子）、PGF（胎盘生长因子）和SDF1（基质细胞衍生因子1）的水平，促进肿瘤浸润转移。另外，血管生成阻断剂导致肿瘤中心区血管坏死将减少化疗药物的进入；同时，血供减少引起乏氧、酸性环境和细胞低度增殖均不利于化疗药物的作用。因此，在化疗药物给药后数小时内使用血管阻断剂会获得最大疗效。但是由于化疗药物的种类繁多，作用机制不同，其与血管阻断剂联合使用的顺序和时机需要根据具体药物的情况来制订。第九节 展 望
抗血管生成疗法无疑是一个令人兴奋的研究领域，它具有改善患者许多病症的潜在作用，但仍有很多问题需要解决。一、 理想的靶标及药物传递系统
临床上寻找到内皮细胞特异性和器官特异性的“血管生成”标志物及获得更明确的选择性和功效是非常重要的。新的天然重组多肽、非多肽药物制剂和基因治疗方法有望实现这个目标。二、 监测抗血管生成治疗的功效
可以通过获得肿瘤微血管密度（MVD）来实现血管生成的定量测定。高密度的血管生成是许多癌症重要的预后因素。将来有可能检测患者体内血管生成的正向调节因子和负向调节因子的水平，建立一个与血管生成相关疾病的“血管生成网络”。到目前为止，大部分研究都把焦点放在促血管生成因子，如患者血清、血浆和尿液中的bFGF及VEGF，其他可以检测到的血管生成因子有血管生成素、EGF、aFGF、HGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α和IL-2、-6、-7、-8和-10。此外，检测天然的内源性血管生成抑制因子的水平也是很重要的。血管生成网络不仅加深我们对血管生成相关疾病的了解，并有助于设计更
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