食品卫生微生物检验技术(txt+pdf+epub+mobi电子书下载)

作者：李有文,吴静,张秀萍,索朗斯珠

出版社：湖北科学技术出版社

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食品卫生微生物检验技术试读：

前言

随着我国经济的不断发展，人民物质生活水平的不断提高，人们对食品质量安全的要求越来越高。为了提高动物产品的卫生质量，加强检疫队伍建设至关重要。近年来各农业院校、高职高专学校、医学院校都开设了动植物检疫、动物防疫与检疫、动物检疫、食品安全检与质量控制、卫生检验等专业。《食品卫生微生物检疫技术》是以上专业的一门重要的专业课，但目前食品微生物检验类的教材并不多，并且不同院校、不同地区、不同的研究者编写的目的不同，内容各异，专业侧重也不一样，系统性和难易度也不同，并不能满足所有院校该专业的教学需要。另外，西部地区经济文化相对落后，少数民族地区有其民族风俗、饮食习惯等方面的特殊性。因此，编写一部西部地区适用的食品微生物检验方面的教材非常必要。为此，塔里木大学联合西藏大学农牧学院，并邀请内地长江大学编写一部《食品卫生微生物检疫技术》教材，供西部农业院校相关专业使用。

本书系统的介绍了食品卫生微生物检验的基础理论、基本技术和方法、相关检验法规和标准。全书共八章，主要介绍食品微生物检验的基础知识和基本技术；食品中毒及食源性污染的检测及处理；依据最新的国际、国内检验标准，重点讲述食源性细菌、真菌和病毒的检验方法；介绍了较广泛流行的致病菌（人兽共患病原）的检测方法及判断标准；并从不同食品种类出发，针对某类食品的检验，从采样到检验和结果判定做了较系统的阐述。

编写过程中具体分工是：李有文负责统稿、编写

绪论

本书的特点如下。

1．重基础，系统性强

本书从微生物检验室的建设、布局到微生物操作技术、注意事项及防范和各类食品卫生微生物的检验标准方法做了较详细的介绍，有利于学生系统掌握微生物检验技术。

2．法规标准性强

介绍的微生物检验方法以国标检验方法为主，并附以其他常用、快速检验方法，有利于学生灵活运用。

3．难易适中

检验方法选择常规标准加现代分子生物学技术，达到本专科学生接收的水平，也附以高科技检验法，有利于学生提高水平。

由于时间紧迫，编写者水平有限，经验不足，其中不足或错误在所难免，恳切希望广大读者提出宝贵意见，以便我们及时更正错误。编者2013年7月绪论“国以民为本，民以食为天，食以安为先”。这句古训充分说明了食品安全与卫生的极端重要性。然而任何食品都不是绝对安全的，因为所有的食品都是来自大自然，自然环境本身就纷繁复杂，既提供人体生长发育的各种营养物质，如蛋白质、碳水化合物及发酵酵母等，又含有大量种类繁多，形态各异的有毒有害物质：例如重金属、化学毒物以及有害生物等，在食品的生产、贮运、销售等各环节中，这些有毒有害物质时刻都有可能混入食品，危及人们的健康与生命安全，并且食品的生产工艺越复杂，生产环节越多，污染的可能越大。食品的安全与卫生问题也愈加突出。总体来讲，影响食品卫生和安全的因素有两大类，一类是化学因素，另一类是生物因素。生物中又包括微生物和寄生虫两类。食品卫生微生物检验技术主要针对的是食品中与食品安全有关的微生物的含量及影响检测的技术。通过学习食品微生物学的基础知识，掌握微生物的特点及活动规律以及识别有益的、腐败的、致病的微生物的技术和方法，以充分利用有益微生物为人类服务，更重要的是控制腐败和病原微生物的活动，防止食品变质和杜绝因食品而引起的病害，保证食品卫生的安全。0.1食品中微生物的来源与种类0.1.1 食品中微生物的来源

微生物在自然界分布极为广泛，不论在土壤、水、空气中，还是在人和动植物体以及各种用具上，甚至火山爆发的岩浆中都有微生物的存在，而食品生产的原料，加工、贮运、销售的每个环节都是在自然环境中进行，因此在食品中混入微生物是不可避免的，并把这种微生物进入食品中的过程叫食品的微生物污染。这是食品中的微生物的主要来源。一般不同的环境所存在的微生物在类群、数目等方面不同，由此而引起污染食品中的微生物种类、食品的污染程度也有差异。

另外一个来源就是人为添加，主要用于食品加工过程中。例如酿酒、制醋、制作面包、生产酸奶等。这类微生物在食品中数量少，背景清楚，检验容易。0.1.1.1 食品中微生物的污染途径

食品在生产加工、运输、贮藏、销售、烹调直至食用的整个过程的各个环节，都有可能出现微生物的污染。作为食品其污染还来自于动植物本身，常由此而污染某些病原微生物，这在食品卫生学上是非常重要的。关于污染途径是多方面的，但归纳起来可分为两类。（1）内源性污染。是由动植物本身所携带的微生物而造成食品的污染，也称第一次污染。这种污染包括健康动物体表、呼吸道、消化道以及泌尿生殖道的一些常在微生物引起的污染和动物由于感染了某种病原微生物而造成生前在动物组织和脏器中有病原微生物的存在。（2）外源性污染。经这一途经污染的情况较为复杂，是食品经生产加工到食用这一系列过程中所污染的，称为第二次污染。污染的情况因食品种类、所处环境的不同而不尽相同。这种污染，是食品微生物性污染的主要方面。0.1.2 食品中微生物的种类

从微生物与人的关系来讲，微生物既可在食品制造中起有益作用，又可通过食品给人类带来危害。因此可分为有益微生物和有害微生物。0.1.2.1 有益微生物在食品制造中的应用

以微生物供应或制造食品，这并不是新的概念。早在古代，人们就采食野生菌类，利用微生物酿酒、制酱。但当时并不知道微生物的作用。随着对微生物与食品关系的认识日益深刻，逐步阐明微生物的种类及其机理，也逐步扩大了微生物在食品制造中的应用范围。概括起来，微生物在食品中的应用有三种方式。（1）微生物菌体的应用。食用菌就是受人们欢迎的食品；乳酸菌可用于蔬菜和乳类及其他多种食品的发酵，所以，人们在食用酸牛奶和酸泡菜时也食用了大量的乳酸菌；单细胞蛋白（SCP）就是从微生物体中所获得的蛋白质，也是人们对微生物菌体的利用。（2）微生物代谢产物的应用。人们食用的很多食品是经过微生物发酵作用的代谢产物，如酒类、食醋、氨基酸、有机酸、维生素等。（3）微生物酶的应用。酱类是利用微生物产生的酶将原料中的成分分解而制成的食品。如豆腐乳、酱油。微生物酶制剂在食品及其他工业中的应用日益广泛。

我国幅员辽阔，微生物资源丰富。开发微生物资源，并利用生物工程手段改造微生物菌种，使其更好的发挥有益作用，为人类提供更多更好的食品，是食品微生物学的重要任务之一。0.1.2.1 有害微生物对食品的危害及预防

微生物引起的食品的危害主要是食品的腐败变质，因而使食品的营养价值降低或完全丧失。有些微生物是使人类致病的病原菌，有的微生物可产生毒素。如果人们食用含有大量病原菌或含有毒素的食物，则可引起食物中毒，影响人体健康，甚至危及生命。所以食品微生物学工作者应该设法控制或消除微生物对人类的这些有害作用，采用现代的检测手段，对食品中的微生物进行检测，以保证食品安全性，这也是食品微生物检验学的任务之一。从微生物的生物学分类分为细菌，病毒、真菌三大类。（1）细菌。细菌是食品中最容易污染的微生物。常见的需氧芽孢菌有枯草芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等；厌氧芽孢菌有酪酸梭状芽孢杆菌、巴氏固氮梭状芽孢杆菌、魏氏梭菌、肉毒梭菌等。他们常引起食品中蛋白质和糖类的分解，造成食品变色、产生异味、产酸、产气、产生毒素。沙门菌以及其他肠杆菌、葡萄球菌。肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌，布氏杆菌、炭疽杆菌、魏氏梭菌等，可以引起食物中毒和感染、炎症等疾病。（2）真菌。真菌是食品加工中的重要生产菌种，例如用啤酒酵母制造啤酒，绍兴酒酵母制造绍兴米酒，利用毛霉、根霉和曲霉的菌种制造酒、醋、味精等。酵母菌、霉菌在自然界广泛存在。可以通过生产的各个环节污染食品。经常出现的酵母菌有：假丝酵母属、圆酵母属、酵母属、隐球酵母属，霉菌有：青霉属、芽枝霉属、念珠霉属、毛霉属等。当然也可以进入有害的真菌，例黄曲霉、寄生曲霉、赭曲霉蜂蜜曲霉等产毒性曲霉菌。（3）病毒。病毒是一类没有细胞结构，必须依赖细胞才能生长的微生物，污染食品后往往通过食品进入人体，造成发病。例如乙型肝炎病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒、疯牛病病毒等。0.2食品卫生与微生物检验的关系0.2.1 相关概念

食品卫生：食品生产、加工、储存及制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施。在世界卫生组织《食品安全在卫生和发展中的作用》的文件中认为“食品安全”与“食品卫生”同义。

食品卫生学：是研究与食品卫生质量有关的各种因素及其评价方法、预防与控制措施，防止食品中可能出现的有害因素损害人体健康的科学。

卫生微生物学：研究与人类健康直接或间接相关的微生物（致病的或非致病的）在人体外环境的发生发展以及这种发生发展对人类健康影响的规律的科学。

食品微生物检验学：运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性等，建立食品微生物学检验方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。

食品卫生微生物检验学：研究食品中与食品卫生有关的微生物的数量、种类、分布及其分离培养、检验鉴定方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。作为监控食品质量的工具，早已经应用于食品的原料、生产、产品等的微生物学检验，其中许多方法已经成为食品生产厂家和食品检测常规检验项目。0.2.2 食品卫生学与食品卫生微生物检验学的关系

食品卫生学是应用食品化学分析、微生物学、毒理学和流行病学方法研究食品中可能出现的有害物质及作用机理，为提高食品卫生质量，采取相应的预防措施，以及制定食品卫生质量标准提供依据。主要的内容为：食品添加剂及其卫生；食物污染物的来源、性质、对人体危害及其机理、有关的预防措施；食物中毒及其预防；食品卫生质量鉴定和制订食品卫生质量标准；主要食品和主要食品企业卫生管理等。

食品卫生微生物检验学以微生物学的理论为基础，利用生物学、生物化学、免疫学以及兽医学等方面的知识，依据《中华人民共和国国家标准——食品卫生微生物检验方法》，对食品中不同的微生物，采取相应的检验方法，把握微生物的特点及活动规律，识别有益的、腐败的、致病的微生物，在食品生产和保藏过程中，可以充分利用有益微生物为人类服务，同时控制腐败和病原微生物的活动，防止食品变质和杜绝因食品而引起的病害，保证食品卫生的安全。

因此食品卫生学侧重从理论的角度对食品的卫生质量进行宏观监控的研究，而食品卫生微生物检验学主要从技术的角度出发对食品中微生物的种类数量性质进行具体的检测。前者范围大，后者更细致。0.2.3 卫生微生物学和食品卫生微生物检验学的关系

卫生微生物学研究所有环境中与人体健康有关的微生物及其分布规律，而后者则只针对食品中与食品质量有关的微生物的检测、防控方法。侧重点和范围各不相同。0.2.4 食品微生物检验学和食品卫生微生物检验学的关系

两者都针对食品中的微生物，研究方法、方法论据都相同，但范围不同。前者不仅研究卫生微生物，还关注食品加工微生物，而后者只注重卫生微生物。0.3食品微生物检验的目的、意义、任务0.3.1 食品微生物检验的目的

目的就是要为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。要使生产工序的各个环节得到及时控制，不合格的食品原料不能投入生产，不合格的成品不能投放市场，更不能被消费者接受，因而对食品进行微生物检验至关重要。0.3.2 食品微生物检验的意义

食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。（1）它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。（2）通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品销贮环境的卫生状况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据。（3）食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有重要意义。0.3.3 食品卫生微生物检验的任务（1）研究各类食品中微生物种类、分布及其特性。（2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量。（3）研究微生物与食品保藏的关系。（4）研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物。（5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准。0.4食品卫生微生物检验的范围和内容0.4.1 食品微生物检验的范围（1）生产环境的检验。包括食品生产、车间用水、空气、地面、墙壁等的微生物检验。（2）原辅料检验。包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。（3）食品加工、储藏、销售诸环节的检验。包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。（4）食品的检验。重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。0.4.2 食品卫生微生物检验的内容

我国卫生部颁布的食品微生物检验指标有菌落总数，大肠菌群和致病菌等多项内容。0.4.2.1 菌落总数

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。0.4.2.2 大肠菌群

大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。0.4.2.3 致病菌

致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。0.4.2.4 霉菌及其毒素

2010国家制定了霉菌、酵母的平板计数的国标（GB 4789.15-2010）。另外对黄曲霉毒素等多种霉菌毒素的检测有相应的国标。0.4.2.5 其他指标

微生物：指标还应包括病毒，肝炎病毒，猪瘟病毒，鸡新城疫病毒，马立克氏病毒，口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。0.5食品微生物检验的要求0.5.1 建立符合要求的食品卫生微生物检验实验室

食品卫生微生物检验实验室的设置有其专业性的特定要求，选址要注意安全，方便操作为原则。实验室通常应包括如下一些功能区（室）：标本接收及接种室、细菌分离及鉴定室、培养基配制室、无菌室、消毒灭菌室等。0.5.2 配备完善的仪器设备、试剂、菌种

食品卫生微生物检验实验室除了配备常规的微生物分离培养和生化鉴定的仪器设备和试剂外，还应配备自动化或半自动化的微生物鉴定仪器。例如Vitek系列、MicroScan系列、BD PHOENIXTM等自动微生物分析系统和半自动微生物鉴定/药敏系统，微生物数码分类鉴定系统等。还应该常备一些微生物的诊断试剂，标准菌株等。0.5.3 具备微生物检验专业技能的人才队伍

微生物检验人员要有良好职业道德和高度责任心；扎实的基础理论教育；专业化的技能培训；并不断的继续教育，及时获得新知识，新技术。0.5.4 建立规范的病原微生物培养、分离、鉴定技术方法

检验样品的采集、保存、运送和验收和检验鉴定，结果报告整个过程中都要坚持规范操作，标准判断，以国标为准绳。0.5.5 建立室内质量控制，接受室间质量评价

质量控制是临床微生物实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系，质量控制包括室内质量控制和室间质量控制评价，室内质量控制是由实验室内部制定并实施的，是质量保证的核心和基础。室内质量控制的内容包括人员与组织管理，标准的操作手册，培养基、试剂、染色液和抗血清的质量控制，药敏试验质量控制，常用仪器设备的监控等。0.6食品微生物学检验的发展概况

食品微生物检验学的发展是与整个微生物学的发展是分不开的。总体来讲是随着人类对微生物的认识的加深，微生物技术的改进和提高，以及人类在利用微生物和微生物对人类的影响的的相互作用中逐渐形成发展起来的。在此大概分为五个时期。0.6.1 朦胧时期（公元1677年之前）

在远古时代，人们当然不知道有微生物存在，但是根据日常生活中的许多现象，例如制醋、发酵、人可以得病且相互传染等，人们认识到肯定会有因素在起作用。许多思想家就曾推测自然界中可能存在着微小生命，并预言它们可通过饮食、水、空气、人们的衣物及病人进行传播。例如：中国夏禹时代，就有仪狄酿酒的记载，《齐民要术》一书中也详细记载了制醋的方法。中国自古已有“病从口入”的民谚。中国隋唐时期杰出的医药学家孙思邈“勿食生肉，伤胃，一切肉唯须煮烂”，中国明代李时珍：“凡井水有远从地脉来者为上，有从江湖渗来者次之，其城市近沟渠污水杂入者成碱，用须煎滚，停一时，碱澄乃用之，否则气味俱恶，不堪入药、食茶、酒也”。中世纪罗马设有专管食品安全的“市吏”。这些记载都说明古代人对微生物趋于正确的认识。但是由于当时无法对这些预言进行验证而不能被人们所接受。有更多的人用上天制造、神的意志等来加以解释。这使微生物的长期处于似有似无的蒙眬状态，直到1677年人类第一次看见微生物，漫长的蒙眬时期才宣告结束。0.6.2 形态学时期（1677年-19世纪中叶）

微生物形态学的形成归功于列文虎克（Antory Van Leeuwenhock,1632-1723）。他是显微镜的发明者，也是首先观察到微生物的人。列文虎克在做荷兰德尔夫特市市政府收发员时，着迷于磨制透镜。他用自制的放大倍数达300倍左右的透镜从雨水、井水及一切可拿来观察的样本中观察到的细菌，首次证实环境中微生物的存在并正确描述了各类细菌的基本形态，从而揭示了除动、植物以外的另一个微生物世界。自此微生物学由推测时期进入观察时期，并为微生物形态学的建立奠定了基础。也成为微生物检验的开始，现代微生物检验中形态学检验也是重要的检验方法。

此后微生物学的先驱者们从自然、生活和生产环境中的微生物入手开始了最初的观察研究和形态描述。意大利学者斯巴兰扎尼（L.Spallanzani,1729-1799）用种子的浸液装入两组烧瓶，加热煮沸后一组瓶颈熔封，一组敞开。经过一段时间后，熔封组浸液清洁如初，没有观赛到微生物，而未熔封组却看到密布着微小的生物，由此断定这些微小生物来自外部空气。1837年，德国学者施旺（T.Schwann,1810～1882）通过对不同处理的肉中微生物的观察，首次报道了空气中微生物可污染食品，并造成食品的腐败变质。观察时期持续了近200年，人们描述了大量的微生物，但对它们的作用的了解却几无进展。直到法国学者巴斯德的杰出贡献才把观察时期带入实验时期。0.6.3 生理学时期（19世纪中叶-20世纪初）

1854年，法国科学家巴斯德（Pasteur,1822-1895）发现了酒类酿造是酵母菌的作用，而酒类变质则是由于外界杂菌污染所致；并发现，刚发酵完毕的酒，在沸点之下文火加热，就可以杀死酒中存在的污染微生物，酒就不会再变质，创造了沿用至今的巴氏消毒法。巴斯德的研究开创了微生物的生理学时代。人们认识到不同微生物间不仅有形态学上的差异，在生理学特性上亦有所不同，进一步肯定了微生物在自然界中所起的重要作用。自此，微生物开始成为一门独立学科。生理生化研究也成为微生物检验的重要方法。

之后的微生物学的另一奠基人德国医生科赫（Robert Koch,1843-1910）。他发明了固体培养基，可将细菌从环境或病人排泄物等标本中分离成单一菌落，便于对各种细菌分别研究；同时又创用了染色方法和实验性动物感染，为发现各种传染病的病原体提供了有利条件。使微生物的形态学检验和生理生化检验方法更加成熟，易于操作。

科赫于1876年从病死畜的血液和组织中发现并分离出炭疽杆菌，这是人类第一次从病变组织中分离到致病菌，向人们揭示了一种传染病是由一种特定细菌引起的事实；并经实验证实炭疽杆菌在一定条件下可以形成芽孢，一旦形成芽孢就能耐受冷、热、干燥，并能长期存活在环境中，致使畜群连年感染，指明了疾病——致病菌——外环境之间的相互关系。1883年又发现了霍乱弧菌。随后的20年里大多数细菌性传染病的病原体被发现并分离培养成功。俄国学者伊凡诺夫斯基于1892年发现了第一种病毒即烟草花叶病病毒。以后相继分离出人类和动、植物的许多病毒。

随着对病原微生物和疾病的认识，致病菌的研究受到极大关注。由于空气微生物对环境的污染和危害的认识，食品中微生物的研究也得到了迅速的发展。由于懂得了防范空气中微生物的污染，给食品行业和其他相关事业带来的巨大利益是难以估量的。微生物的检验得到了世界各国广泛的重视。0.6.4 微生物检验指标建立（20世纪初-20世纪末）

19世纪以后，随着大城市、大工业中心的形成，造成人口的高度集中，生活和居住条件日益恶化，环境的污染直接威胁着人类的健康与生命，促使人们对污水、污物的处理与净化、饮用水的集中供给与消毒、食品工业的卫生管理与监督检验等一系列重要的卫生问题给予了越来越多的重视；进入20世纪后重要病原微生物已大部分被发现，又由于抗生素的问世，细菌性传染病对人类生命造成严重威胁的阶段逐步宣告结束，此后微生物学的研究朝着多元化的方向迅速发展并取得了很大的进步。

1885年德国儿科医生埃施利希（T.Eseherich）分离并命名了大肠埃希菌，并被认为是人和动物肠道中正常菌群的一部分，为后来以大肠菌群作为粪便污染指标菌奠定了基础。1885年英国开始对饮用水进行细菌检验，并发现砂滤处理能除去水中大部分细菌。1888年法国医生马赛（E.Mace）第一个建议用检验肠道杆菌指示水被粪便污染的程度，这可能是卫生指标菌的最早应用。

二次世界大战以后，科学技术的发展，促进了工农业生产的发展。但由于盲目开发资源和无序生产，造成环境污染、公害泛滥，导致食品污染问题日益严重。人们不得不全力开展食品中危害因素、种类、来源的调查，危害物性质的研究，含量水平的检测以及各种监督管理与控制措施的建立和完善等。同时相关学科如食品微生物学、食品毒理学、预测微生物学及现代食品生产和贮运技术不断发展，各种检测手段的灵敏度不断提高。

英、美、法、日等国是最早建立专门的食品安全与卫生法律、法规的国家。如1851年法国的《取缔食品伪造法》、1860年英国的《防止饮食品掺假法》、1906年美国的《食品、药品、化妆品法》、1947年日本的《食品卫生法》等。我国先后颁布了“中华人民共和国食品卫生法”、“环境保护法”和“传染病防治法”等；先后制定了生活饮用水标准检验方法与卫生标准、食品卫生检验方法与卫生标准、消毒灭菌效果的评价方法与标准、公共场所卫生标准监测检验方法与卫生标准等。通过这一系列工作，我国一些严重威胁人民健康的食源性疾病已得到有效地控制。

指示菌：是在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。检验指示菌的目的，主要是以指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。

指示菌可分为三种类型：

A．为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。

B．特指粪便污染的指示菌，主要指大肠菌群。其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。他们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。

C．其他指示菌；包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。0.6.5 微生物检验技术的快速发展（20世纪末至今）

20世纪中叶后，科学技术与现代工农业的迅猛发展使物质得到极大地丰富，给人类生活、生产带来巨大便利，推动了社会的进步，提高了人类生活质量，人们更加关注自身健康；但同时也加剧了资源的过度开发、生态的破坏和环境的污染，使人类的生存环境和食物的生产环境更加恶化，新的食源性病原体不断出现，食源性疾病成为全球食品安全的主要问题。无论在发达国家还是在发展中国家，人人都面临着患食源性疾病的危险。

近几十年来，由于生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学等学科的发展，以及电子显微镜、气相、液相色谱技术、免疫学技术、分子生物学技术等的进步，促进了微生物学的发展。人们得以从分子水平上探讨病原微生物的基因结构与功能、致病的物质基础及诊断方法，使人们对病原微生物的活动规律有了更深刻的认识。相继发现了一些新的食源性病原微生物，如弯曲菌、耶尔森菌、大肠埃希菌O157∶H7、戊型肝炎病毒、诺若病毒及蛋白侵染因子（Prion）等。

欧盟、美国、加拿大、日本等发达国家和韩国、马来西亚、泰国等发展中国家在《贸易技术壁垒协定》（TBT）、《卫生和植物卫生措施应用协定》（SPS）等国际通用规则下，纷纷以食源性病原体的风险分析作为构建食品安全控制体系的基础，强调“从农田到餐桌”的全过程监控，探索出一条建立食品安全控制体系、保障食品安全、协调食品国际贸易、处理食品安全事件的基本模式，将食品安全度控制在消费者可以接受的水平。

目前我国尚未建立起完善的食源性疾病报告体系，在我国的传染病报告制度中，大量的、散发的感染性肠炎等食源性疾病和病毒性、寄生虫性食源性疾病并不包括在内。建立和完善食源性病原体污染的主动监测和食源性疾病报告体系和对高危食品的食源性病原体进行危险性分析以及提高食源性病原体主动监测、诊断、溯源技术与方法的特异性与灵敏性，是我国食品生物质量控制的首要任务。思考题

1．叙述食品卫生微生物学检验的概念、目的和任务。

2．怎样理解这门课程的性质，怎样才能学好这门课程？

3．什么是食品卫生学、卫生微生物学、食品卫生微生物学检验？

4．食品卫生微生物学检验与动物性食品卫生微生物学检验有何区别？试举例说明。

5．了解食源性微生物及其检验的发展过程。第一章食品卫生微生物检验基础食品微生物检验是运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性、检验方法和检验标准的。因此有关微生物操作的物质基础和管理制度、技术水平和科学的样品获得都是保证食品检验结果正确的必要条件。1.1食品卫生微生物检验的物质基础

微生物检验首先需要建筑符合要求的实验室，这是微生物检验的物质基础。微生物也是生物安全最为关注的对象，因此微生物检验实验室的建设要达到与检验的微生物相应的生物安全级别，遵守《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424条令）、《兽医实验室生物安全管理规范》（2003年农业部302号公告）、WS233-2002《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》、OIE 2003国际动物卫生法典、WHO《实验室生物安全手册》第二版、GB19489-2004《实验室生物安全通用要求》的规定要求。1.1.1 微生物生物安全级别和生物安全实验室级别划分1.1.1.1 微生物生物安全级别及相应防护级别的划分

微生物的安全级别分为四级：一类微生物：对个体和群体危害程度高，通常引起人和/或动物严重疫病且暂无有效的预防和治疗措施的致病微生物；通过气溶胶传播的，有高度传染性、致死性的人和/或动物致病微生物；未知危险的人或动物致病微生物；我国尚未发现或已经宣布消灭的微生物。二类微生物：对个体危害程度高，对群体危害较高。能通过气溶胶传播引起严重或致死性疫病，导致严重经济损失的致病微生物，或者比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。对人引发的疾病具有有效的预防和治疗措施。三类微生物：对个体危害程度为中度，对群体危害较低，主要通过皮肤、黏膜、消化道传播。对人和/或动物有致病性，但一般对实验人员、动物、环境不会造成严重危害、传播风险有限的致病微生物，具有有效的预防和治疗措施。四类微生物：对个体和群体危害程度低，通常情况下不会对健康成年人和/或动物致病的微生物。

根据微生物的安全级别，拟从事相应级别微生物操作的防护水平也分为四级：一级生物安全防护水平：能够安全操作对实验室工作人员和/或动物无明显致病性的，对环境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。二级生物安全防护水平：能够安全操作对实验室工作人员和/或动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平。三级生物安全防护水平：能够安全地从事本国和外来的、具有可能经呼吸道传播以及引起严重的或致死性疾病的、对人引发的疾病具有有效的预防和治疗措施的病原微生物工作的生物安全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认知的病原体，也应在此种水平条件下进行操作，只有取得足够的数据后才能确定最后的生物安全水平等级。四级生物安全防护水平：能够安全地从事从国外传入能通过气溶胶传播，实验室感染高度危险，严重威胁人和或动物生命和危害环境的，没有特效预防和治疗方法的微生物工作的生物安全水平。与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认知的病原体，也应在此种水平条件下进行操作，只有取得足够的数据后才能确定最后的生物安全水平等级。1.1.1.2 生物安全实验室分级

根据国际和国内相关生物安全规定，生物安全实验室分为一级、二级、三级、四级，习惯上称为P1、P2、P3、P4（美国国立卫生研究所的分类方法），或BSL—1、BSL—2、BSL—3、BSL—4（美国疾病管理中心的分类方法）。具体分类及要求如下。表1-1 生物安全实验室安全级别分类及要求1.1.2 食品卫生微生物检验实验室及建设（食品微生物检验室及配置）

食品卫生微生物检验的实验室一般应具备二级生物安全的级别。二级生物安全实验室对人体、动植物或环境具有中等危害或具有潜在致病因子，对健康成人、动物和环境不会造成严重危害，具有有效的预防和治疗措施。因此对食品卫生微生物检验实验室的建设、布局、设施必须有一定的要求。1.1.2.1 食品微生物检验室的选址（1）实验室应选择在清洁安静的场所，远离生活区、学校、锅炉房和交通要道，远离粉尘、散发异味气体等地点。（2）实验室应选择在光线充足，通风良好的场所，与生产加工车间有一定的距离。（3）实验室应选择在方便扦样和检验，距离车间较近的场所。1.1.2.2 结构和布局

食品卫生微生物检验室的结构。一般微生物检验实验室从功能上分有两大区域：实验区和非实验区。具体构成如图1-1所示。（1）非实验区包括办公室、资料档案室、样品室、信息室、卫生清洁室。这个区域是对外交流、业务联系、化验人员进行原始记录等各项工作的场所，非化验室人员交往较多的场所，因此，应设在整体综合化验室的最外层，只需有桌、椅、电脑等简单设施即可。此区域禁止带入细菌检验标本。图1-1 食品卫生微生物检验实验室结构图（2）实验区是微生物检验实验室的核心区域，按作用分为实验室和辅助实验室。实验室根据检验项目和内容设有病原检验鉴定室，食品化妆品等常规检验室、动物实验室等。辅助实验室主要是为实验室做准备的一些功能实验室。例如灭菌室、配剂室、培养室等。1.1.2.3 食品卫生微生物检验实验室的总体布局

所有这些区域、功能室的平面布局和流程要科学合理、流程简捷、洁污分明、层次清晰。尽可能做到人流物流分开、严重污染的区域与洁净区域设立缓冲区，同时达到去污有效，能有效地切断感染途径，降低感染率。具体平面布局如图1-2。

实验区与非实验区明显分开，上人楼梯和上物楼梯分开，不相互使用。在实验区，各实验室和辅助实验室在功能相互补充的按顺序排在一起，避免了交叉。1.1.2.4 实验室的内部布局（1）实验室内装修。实验室建筑围护结构和室内装修，应选用气密性良好，且在温度和湿度变化时变形小的材料。内墙壁的表面应平整、光滑、不起尘、避免眩光、便于除尘，并应减少凹凸面。拐角和墙角尽量是圆形光滑易清洗。不宜采用砌筑墙抹灰墙面，当必须采用时宜干燥作业，抹灰应采用高级抹灰标准。墙面抹灰后应刷涂料面层，并应选用难燃、不开裂、耐清洗、表面光滑、不易吸水变质发霉的涂料。地面应平整，耐磨、易清洗，不易积聚静电，避免眩光，不开裂等。室内的色彩宜淡雅柔和。（2）实验室内布局。

1）总体原则。动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）应分开放置；常温设备与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其他一切设备分开，不然会影响其他设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其他设备，影响其使用寿命；化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。图1-2 卫生微生物实验室平面布局设计

2）微生物检验操作室。微生物操作室是微生物培养与检验主要操作室，根据需要将细菌、病毒、真菌等不同微生物检验室分开，一般不要混用。主要设施是实验台，无菌操作设施（生物安全柜或超净工作台，或单独的无菌室），培养设备。对实验台的要求：实验台面积一般不小于2.4×1.3m；实验台位置应在实验室中心位置，要有充足光线，也可以做边台。实验台两侧安装水盆与水龙头；实验台中间设置试剂架，架上装有日光灯与插座；实验台材料要以耐热、耐酸碱为宜。生物安全柜应具备1级或2级生物安全级别，有些实验室可能以超净工作台代替，有的具有专门的无菌室，微生物操作在无菌室内进行，这是最好的。根据检验的微生物的特性应设有普通、生化、二氧化碳和厌氧培养箱，一般靠墙放置，或放到边台上。装有供空气消毒的紫外灯或嗅氧机。

3）无菌室。无菌室也称接种室，是处理样品和接种微生物、纯化菌种的专用实验室，应与微生物检验操作室紧密相连，或在操作间中隔封一个密闭空间。根据本实验室所涉及的生物安全等级，无菌室的设计和建设应符合GB 50364和GB 19489的相关要求。

Ⅰ．无菌室的设置。无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：

a．无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。无菌室大小应能够满足检验工作的需要为宜（最小内间面积2 × 222.5=5m，外间面积1 × 2=2m，高以2.5m为宜）；缓冲间应有足够的面积以保证操作人员更换工作服及鞋帽。内外间都应有天花板。

b．内间应当设拉推门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉推门，要设在距内间门最远的位置上。无菌室入口避开走廊，可设在微生物检验操作室内。

c．在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作为接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。

d．内墙为浅色，地面应光滑，墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，无死角，易于清洁和消毒。

Ⅱ．无菌室内设备和用具。

a．工作台应表面光滑和台面水平，无渗漏，耐腐蚀，易于清洁、消毒。有的在无菌室内还安装生物安全柜或超净工作台（细胞培养室或P3/P4实验室）

b．在内室和外室都要安装紫外灯，数量由空间大小决定。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。无菌室应具有适当的通风和温度调节的条件。无菌室的推荐温度为20℃，相对湿度为40%～60%。

c．外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%苯酚溶液等。

d．内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。

4）培养基制作室。培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为边台与药品橱。边台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；边台材料要耐高热、耐酸碱；-药橱分门别类存放一些一般药品及试剂；危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放；边台上要放天平，以称取药品用。因经常用水，所以最好配有蒸馏水装置。

5）洗刷消毒室。洗涮消毒室用以消毒洗涮待用与已用玻璃器皿，2培养基及污物，其面积应大于10m。为满足洗涮消毒的功能，洗涮消毒室应设有：1～2个洗涮池，洗涮池上下水网要畅通；器皿橱或工作台，以放置洗涮好器皿；高压灭菌锅，其所用电源应满足用电负荷；室内安有通风装置或换气扇；有条件的单位还可在该室内，设供日常检验用水蒸馏水器装置。这个区域要求相对独立，最好以房间间隔，因为这个区域处理废物，有一定的污染和湿度。

6）仪器室（如果没有条件，这个可以和微生物常规实验室合并）。用以放置显微镜、电子天平及理化分析用小型仪器；要求清洁干燥、防潮防虫、避光；仪器台要稳固、牢靠。

7）动物实验室。做动物试验，根据可能饲养的动物种类划分不同区域，设置不同动物的笼具，动物架，有自来水，和粪尿等废物处理设施，饲料存放处等。1.1.3 微生物实验室基本设备及质控要求1.1.3.1 无菌室、生物安全柜和超净工作台

此三种设备是微生物检验实验室的核心部分，主要功能都是为样品提供保护，保证实验结果的准确和人员的安全。只是安全级别有差别。（1）无菌室：无菌室通过空气的净化和空间的消毒为微生物实验提供一个相对无菌的工作环境。无菌室应设有空气自净器、传递窗和紫外灯等。（2）超净工作台：超净工作台作为代替无菌室的一种设备，使用简单方便，为实验的开展提供一个相对无菌的操作环境，主要以保护样品不被污染为目的，一般对操作者没有保护作用。超净工作台根据风向分为水平式和垂直式。（3）生物安全柜：生物安全柜是较高级别的生物安全设备，对样品、操作者和环境均有保护作用。1.1.3.2 培养设备

主要用于实验室微生物的培养，为微生物的生长提供一个适宜的环境。（1）普通培养箱：一般控制的温度范围为：室温+5～65℃，又分为电热恒温培养箱和隔水式恒温培养箱。（2）生化培养箱：一般控制的温度范围为：5～50℃。用于微生物的生化鉴定培养。根据条件可以用普通培养箱替代。（3）恒温恒湿箱：一般控制的温度范围为：5～50℃，控制的湿度范围为：50%～90%。可作为真菌培养箱。（4）二氧化碳培养设备：用于某些细菌的培养和细胞、病毒的分离培养。常用的有二氧化碳箱和蜡烛罐，要求二氧化碳浓度为5%～10%，箱内或罐内保持湿度，并用淋病奈瑟菌作培养效果监测。（5）厌氧培养设备：用于厌氧菌的培养。主要有厌氧箱、厌氧罐、厌氧袋。混合气体组分要求二氧化碳10%、氢气10%和氮气80%。厌氧箱与厌氧罐内部要每周清洁，定期更换催化剂。每次使用培养设备均应用亚甲蓝指示剂或铜绿假单胞菌检测厌氧效果。1.1.3.3 冰箱和低温冰箱

用于保存菌种、毒种和一些试剂、样品等。普通冰箱冷藏温度为4℃±2℃，冷冻温度为-20℃±5℃，定期清洁。尽量减少冰箱开启次数，减少温度的波动。每隔3个月除霜1次。低温冰箱的温度为-40℃±2℃或-60℃±2℃。低于-86℃±2℃的为超低温冰箱。用于菌毒种的长期保藏，要定期除霜。1.1.3.4 水浴箱

用于部分需要水浴培养的微生物（如大肠菌群、大肠杆菌纸片法检验）的培养和琼脂培养基恒温保存。根据需要设置温度，允许的温度波动幅度为0.5℃，用时检查水位，记录温度。每月擦拭箱体内部并换水，所用水应为加蒸馏水。1.1.3.5 高压灭菌器

用于微生物器皿、物品、培养基的消毒灭菌或有害生物的灭菌处理。控制温度121℃，每次使用前观察并调整水位，记录使用时间、温度或压力。定期用嗜热芽孢杆菌检测灭菌效果，并检测密封圈的密封效果。每月清理内部及换水，所用水应为加蒸馏水。1.1.3.6 天平

一般要求具备精度达到万分之一的分析天平。天平的放置要调整使底座水平，并保持刀刃光滑而锋利、称盘清洁，并定期校正。1.1.3.7 pH计

培养基、缓冲液配制中酸碱度的测定。要求误差不超过0.02，并定期校正。1.1.3.8 显微镜

显微镜是观察细菌形态和动力、微生物和微小物品结构的必备仪器。最常用的是光学显微镜，应注意保护油镜。每次使用后应用擦镜纸擦去油镜头上的镜油。每天工作结束后，应用含少量二甲苯（或酒精乙醚）的擦镜纸擦拭油镜，再用洁净擦镜纸擦干。另外，微生物学实验室还用到暗视野显微镜、荧光显微镜等，均应按规程清洁和保养。1.1.3.9 电导率仪和浊度仪

用于测定菌液的浊度，计算含菌量。1.1.3.10 酒精灯

微生物接种、转移等过程中无菌工具。加入酒精的量不要超过总体积的2/3，禁止两个酒精灯相互对接点燃。1.1.3.11 电炉（电热套）

制作培养基时加热。1.1.3.12 均质器

用于均质样品，有旋转刀片式和拍击式可以选择。用完后要及时清洗干净。1.1.3.13 接种器具

分为接种针和接种环两种。应选用传热散热快、耐用和不生锈的材料，早先使用的白金丝由于价格昂贵，目前多用比较经济的镍铬丝代替。一般要求接种环长5～8cm、直径0.2～0.4mm，定量接种环要定期校正其容量，接种针长5～8cm。1.1.3.14 电热干燥箱

用于吸管，平皿类玻璃器皿的干热灭菌和高压、或清洗后的器皿的烘干。干热消毒时注意温度过高引起包装物的燃烧。1.1.3.15 常规玻璃器皿（1）吸管。用于吸取少量液体，常用的吸管为0.01刻度1mL及0.1刻度的10mL吸管。（2）培养皿。为硬质玻璃双碟，常用于分离培养，盖与底大小应合适，常用规格为90mm。（3）三角烧瓶与广口瓶。多用于盛培养基及配制溶液，常用的规格有250mL、500mL、1000mL。（4）烧杯。供盛液或煮沸用，常用的规格为100mL、250mL、500mL、1000mL（5）量筒。用于液体测量，常用规格为100mL、250mL、1000mL（6）试管。用于细菌培养，有多种规格。（7）载玻片盖玻片。细菌涂片观察用。（8）试剂瓶。装试剂用，常用棕色避光。

此外，微生物学实验室还需一些配套设备如：通风柜、离心机、纯水器、PCR仪、振荡器、菌落计数器、高速离心机、磁力搅拌器、铁架台、升降台、滴定台等。分光光度计、折光仪、定氮装置、杂质度过滤机。

其他实验室耗材还有：枪头、离心管、枪头盒、细胞培养板、酶标版、过滤器、移液管、比色皿、PCR管、镊子、搅拌子、玻璃棒、各种刷子、药勺、滤纸、三脚架、支架，试管架、毛刷等。1.2食品卫生微生物检验室技术操作及要求

为了防止试验操作中人为污染样品，保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染，许多微生物试验都要在无菌条件下进行。因此食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念和扎实的无菌操作技能。1.2.1 消毒灭菌技术及要求1.2.1.1 消毒灭菌技术

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。常用的灭菌技术有干热、湿热、间歇灭菌等方法。（1）干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。③ 灭菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5～2h。④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。（2）手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行。① 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）。② 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10～15min）。④ 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤ 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行。① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至规定时间。④ 自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气阀，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。⑤ 使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。

压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间一般为121℃，维持20min。根据灭菌物品种类和性质，可以对灭菌温度的时间进行适当调整。（4）间歇灭菌方法。该方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。①将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。②关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。③灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此3次，即可达到灭菌目的。（5）血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成分时，因高热会破坏其营养成分，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。① 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。②将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌3次。（6）煮沸消毒。可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2%苯酚煮沸5 min，加入0.02%甲醛，80℃煮60 min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。（7）熏蒸。这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行熏蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫黄熏蒸。（8）喷雾。在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞扬，并有杀菌作用。可用5%苯酚喷雾。（9）紫外线照射。在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外灯照射15～30min。1.2.1.2 消毒灭菌的注意及要求（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开；装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。（2）在干热灭菌器内装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁；大型高压蒸气锅内放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。（3）灭菌前应检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整；检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞；对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。（4）灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用；取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用；培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃；启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭；取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用；取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放；凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限；每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。（5）熏蒸消毒时要注意消毒剂的剂量和浓度，根据消毒的容积计算后配制；喷雾消毒应注意雾化的粒度不要太大，一般要将表面擦洗干净再消毒。紫外消毒时就注意光照的距离要合适，光的强度要足够，定期更换灯管。1.2.2 无菌操作技术及要求1.2.2.1 无菌操作技术

无菌操作是微生物学的核心技术，微生物检验人员就具备扎实过硬的无菌作技能。（1）无菌接种技术。培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

1）接种环的火焰灭菌方法。接种环或接种针每次使用前后，均须火焰灭菌。通常右手持接种针或接种环于酒精灯火焰上彻底烧灼1次（烧红），金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰3次，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。用后烧灼时，先将近环处镍丝置于火焰中，使热导向接种环，如直接将环烧灼，则环上残余菌液可因突然受高热而暴裂四溅，待环上菌液蒸发干涸后，再将接种环以垂直方向于火焰中烧灼灭菌，最后再将金属棒或玻璃棒部分往复通过火焰。接种针用后灭菌时与接种环同。接种环（针）经火焰后，需待冷却后再蘸取标本或放置于工作台上，以防烫死微生物和烧损桌面。

2）吸管的无菌操作方法。无论纸包的还是金属套管中灭菌的吸管，取出时手握管底部（严禁管头部和管身触及其他物品），从管头向管身在火焰上消毒，边移动边转，来回三次。在管底口套上吸耳球或助吸器，移取样液或菌液接种培养基。

3）涂布器的灭菌方法。先用酒精棉球将涂布器擦拭干净，手握柄最末端，在火焰上灼烧消毒，要从涂布器开始烧到柄部，来回三次，灼烧要充分。

4）试管或三角瓶等具棉塞的器具无菌方法：一般左手拿器皿，先过火焰消毒瓶（管）口，用右手小指或指缝夹住棉塞并拔开，再过火焰消毒瓶（管）口，等取菌或接种完备后，再过火焰消毒棉塞和瓶（管）口并塞紧棉塞，放下器具。若两个试管间的转种，可将两试管夹于拇指和二三指之间，管口向外于火焰附近，接种时同时拔开棉塞，从菌种管中取出菌种，立即接种到培养基试管中，再过火焰，塞上各自的棉塞。

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