作者：常彩红
出版社：浙江大学出版社
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病原生物学与免疫学实验教程试读：
前言
病原生物学和免疫学是临床医学专业重要的基础课程，是临床医学专业本科生的必修课。《病原生物学与免疫学实验教程》的编写结合临床医学专业实验教学改革的实际，依据新的培养目标，将医学微生物学实验、人体寄生虫学实验与医学免疫学实验的传统实验内容进行优化整合，是帮助医学生验证病原生物学与免疫学基本理论，理解病原生物致病机制和掌握免疫学与病原学检验与诊断方法的基本原理和基本操作的指导用书。
本教材适用于医药卫生院校临床医学专业本科实验教学，也可供青年教师考研和从事科研工作时参考。
尽管所有作者在进行材料收集及整理编写的过程中都很尽心努力，但限于我们的水平和经验，书中疏漏甚至错误之处在所难免，恳请广大师生和读者多提宝贵意见。编者2013年1月
高等院校临床医学专业实践类教材系列编写说明
海南医学院组织编写的这套临床医学专业五年制本科实践类教材是一套以岗位胜任力为导向，以实践能力培养为核心，以技能操作训练为要素、统一规范并符合现代医学发展需要的系列教材。这套教材包括《临床技能学》、《临床见习指南》（分为外科学、内科学、妇产科学、儿科学四个分册）、《系统解剖学实验教程》、《形态学实验教程》、《生物化学与分子生物学实验教程》、《病原生物学与免疫学实验教程》、《预防医学实验教程》、《英汉对照妇产科实践指南》，共11部。本套教材的编写力求体现实用、可操作性等特点。在编写中结合临床医学专业教育特色，体现了早临床、多临床、反复临床的教改思想，在尽可能不增加学生负担的前提下，注重实践操作技能的培养。我们希望通过本套教材的编写及使用，不断探索临床医学实践教学的新思路，为进一步推进医药卫生人才培养模式变革做出新的贡献。
本套教材适用于五年制临床医学专业的医学生，同时也是低年资住院医师作为提高工作能力的参考书。
限于编写人员的知识水平和教学经验，本套教材一定存在许多错误，敬请各位教师、学生在使用过程中，将发现的问题及时反馈给我们，以便再版时更正和完善。高等院校临床医学专业实践类教材建设委员会主任陈志斌2013年3月
第一篇 微生物学实验
实验1 显微镜的使用
【实验目的】1.掌握光学显微镜的结构和原理。2.掌握光学显微镜使用方法。【实验原理】
一、显微镜的基本结构
普通光学显微镜的构造主要分为两部分：机械部分和光学部分。
1.机械系统（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持和稳定整个镜体。（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。（5）物镜转换器：位于镜筒下端的旋转盘，可自由转动，盘上有多个物镜孔。（6）载物台：在镜筒下方，用以放置标本，中央有一通光孔；装有玻片标本推进器，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可调节标本位置。（7）调焦装置：是装在镜柱上的大小两种螺旋，可调节物镜和标本之间的焦距。大螺旋称粗调节器，移动时可使载物台作较大幅度的升降，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物像。小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，可作精密调焦，一般在高倍镜下使用，可得到清晰物像。
2.光学系统（1）目镜：装在镜筒的上端，其上刻有“5×”、“10×”或“15×”符号以表示其放大倍数，一般装的是“10×”的目镜。为便于指示图像，镜中装有一根黑丝作为指针。（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3~4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。在物镜上，还有镜口率（N.A.）的标志，它表示该镜头分辨率的大小，其数字越大，表示分辨率越高。（3）照明装置：装在镜台下方，包括光源和集光器。光源一般采用普通灯光，强度可以自由调节。集光器位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。
二、显微镜的放大成像原理
显微镜的分辨率是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率。减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高物镜数值口径是提高分辨率的理想措施。增加数值口径，一般通过提高介质折射率，以空气为介质的折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，与载玻片1.52的折射率相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载玻片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。【实验器材】
普通光学显微镜、细菌革兰染色标本、香柏油、二甲苯、擦镜纸。【实验方法】
1.取镜和放置：从显微镜柜中取出显微镜，右手紧握镜臂，左手托住镜座，放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿6~7cm，便于坐着操作。
2.对光：打开光源开关，转动旋转器，使低倍镜对准镜台的通光孔，打开光圈，上升集光器，在目镜上观察，调节光源强度至视野内的光线均匀明亮。
3.放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有标本一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。
4.低倍镜和高倍镜使用：先用低倍镜观察，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升至物镜距标本片约5mm处。并转动粗动调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到视野中出现清晰的物像为止。如果物像不在视野中心，可调节推片器将其调到中心。转动转换器，调换为高倍镜头，用左眼在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物像，可将细调节器的螺旋逆时针移动，缓慢转动，直到获得清晰的物像。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节。
5.油镜的使用方法：在使用油镜之前，先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，使镜头浸入油中，慢慢转动细调节器至物像清晰为止。油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上的香柏油擦去，再用干擦镜纸擦干净。【实验结果】
在显微镜油镜下观察到细菌形态。【注意事项】
1.持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其他地方。
2.轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。
3.保持显微镜的清洁，镜头必须用专用擦镜纸擦拭，切忌口吹、手抹或用布擦；机械部分用布擦拭。
4.使用完毕后，取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降载物台和集光器，关闭光圈，盖上外罩，放回显微镜柜内。【思考题】
1.为什么用油镜要等标本完全干后才能滴加香柏油？
2.如果显微镜视野光线太强或者太弱，应该怎么调节？（夏乾峰）
实验2 自然界环境中细菌的检查
【实验目的】1.了解细菌在空气、水、物体表面及正常人体表上细菌分布情况。
2.树立无菌观念。
一、空气中的细菌【实验材料】
琼脂平板培养基。【实验方法】
1.取5个琼脂平板培养基，在平皿底部标记检查材料的名称、日期、检查者组别、代号，分别置于室内同一平面5个不同的点（室内四个角及中间）。
2.将平板培养基的皿盖打开，使培养基面向上暴露在空气中10min后盖好，置37℃恒温箱中培养18~24h。【实验结果】
记录结果并加分析：
1.观察菌落的种类和数量。2
2.100cm琼脂培养基面积上，5min所降落的细菌数，相当于10L空气中所含的细菌数，计算公式如下：
细菌数式中：T—平皿暴露于空气中的时间（min）。
N—培养后，平皿上的菌落总数。
A—平皿的面积（cm2）。
二、水中细菌数检测【实验材料】
1.普通琼脂培养基，融化并保温50~55℃。
2.无菌平皿及1ml吸管。
3.待检水样：自来水、1∶1000污水。【实验方法】
1.无菌吸管吸取自来水及污水各1ml分别放入2个无菌的空平皿内。
2.立即倾入已融化并保温50~55℃的琼脂培养基15ml，迅速摇匀，静置凝固后，置37℃温箱内培养18~24h。【实验结果】
1.取出观察结果，计数菌落数。所得菌落数乘以该平皿中水样的稀释倍数，即为原水样每毫升中所含的细菌数。
2.比较自来水及污水中生长的菌落的种类和数量并加分析。
三、物品和皮肤的细菌检查【实验材料】
普通琼脂平板、血平板。【实验方法】
1.用记号笔在平板底面划分八格，做好标记后，打开平皿，用手指（未消毒和消毒后）分别在格内琼脂表面轻按（不能压破培养基，见指纹即可）。
2.每人用任一物品置于（或涂抹于）另四个小区内，盖好平皿，放入37℃恒温箱中孵育18~24h。
3.血平板（2人一块），用无菌棉拭子，涂抹对方咽部，再将该棉拭子画线接种血平板（了解咽部正常菌群）。【实验结果】
取出平板，观察菌落，记录菌落的种类和数量并加分析。【思考题】
1.微生物在自然界的分布有何实际意义？
2.什么是正常菌群？有何生理学意义？（夏乾峰）
实验3 消毒、灭菌、除菌
【实验目的】了解高压蒸汽灭菌法、紫外线灭菌法、机械除菌的原理。
一、高压蒸汽灭菌法
在此先介绍高压蒸汽灭菌器的构造和用法。
1.构造：高压蒸汽灭菌器是一个双层金属圆筒，外层坚厚，内层置需消毒的物品，两层之间盛水。其上方有金属厚盖，锅盖旁附有螺旋，借以将锅盖紧闭，使锅内蒸汽不能外溢，因而蒸汽压升高，温度也随之升高。它们之间的关系如表1-3-1所示。表1-3-1 不同蒸汽压所达到的温度
高压蒸汽灭菌器上装有排气阀、安全活塞，以调节容器内蒸汽；有温度计和压力表，以示内部的蒸汽压和温度。
2.用法：向器内加水至规定量，放入被消毒物品，关上锅盖，并用螺旋将其与锅体紧扣，使之紧闭，器下加热，待器内蒸汽压上升到34.48kPa时打开排气阀，使器内冷空气排除，否则压力表所示之压强并非全部是蒸汽压，灭菌将不完全。器内温度与空气排除量的关系见表1-3-2。表1-3-2 高压蒸汽灭菌器内温度与空气排除量的关系
器内冷空气先由排气阀驱出，继则蒸汽出现，待有大量蒸汽逸出时（呈白色雾状气流）即可认为器内冷空气已排尽，关闭排气阀。此后器内压强逐渐升高，直至压力表指在所需的压强数字（如1.05kg/2cm），调节安全活塞，使器内压强在此数字上（下）能自动开放（关闭），以保持在此压强情况下维持20~30min。灭菌时间到后，停止加热。待器内压强自行降至“0”，打开排气阀，使器内外压强完全一致，打开器盖取物（图1-3-1）。
高压蒸汽灭菌法是最可靠的灭菌方法。凡耐高热和潮湿的物件，如培养基、生理盐水、棉织品、传染性污物及废弃的细菌培养物等均可用本法灭菌。图1-3-1 手提式高压蒸汽灭菌器
3.注意事项：必须加足规定水量，冷空气必须排尽，器内仍有高压时不得开排气阀、安全阀，更不得松开螺旋开盖！根据物品的大小、性质，可适当增加灭菌时间，以保持彻底灭菌。
欲检查器内压力与温度是否符合，可用熔点与所需检查的温度相一致的化合物装入试管中，经减压熔封后，放入锅中一起灭菌。灭菌完毕，取出试管观察化合物是否熔化，即可判定（一般看硫碘检查器内温度是否达到121℃）。
二、紫外线灭菌法【实验原理】
波长为240~300nm的紫外线（ultraviolet ray，UV），包括日光中的紫外线，具有杀菌作用，其中以265~266nm的紫外线杀菌作用最强，这与DNA的吸光谱范围一致。其主要作用于DNA，使一条DNA链上两个相邻的胸腺嘧啶以共价键结合，形成二聚体，从而干扰DNA的复制与转录，导致细菌的变异或死亡。紫外线不仅可杀灭DNA病毒，也可杀灭RNA病毒，如对SARS-COV有灭活作用。但紫外线穿透力较弱，一般的玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线，故一般用于手术室、传染病房、无菌实验室的空气消毒，或不耐热物品表面的消毒。【实验材料】
1.大肠埃希菌肉汤16~24h培养物。
2.普通琼脂平板、灭菌的三角纸片、镊子。【实验方法】
1.用接种环蘸取大肠埃希菌液在两个普通琼脂平板上，画一“＋”形（每平板放两环），然后来回均匀涂布于整个平板表面。
2.将镊子通过火焰灭菌后，夹取无菌的三角纸片一张，置于一琼脂平板中央，然后将平板打开，平放在距紫外线灯60~100cm处照射30min（见图1-3-2右图）。
3.另一琼脂平板，在紫外线下用玻璃盖遮住平板的一半，同样照射30min（见图1-3-2左图）。图1-3-2 紫外线灭菌法
4.照射完毕，用经火焰灭菌后的镊子将纸片取出投入消毒缸中，盖好琼脂平板，放37℃温箱孵育24h观察结果。【实验结果】
经培养后，观察记录结果并加分析。
三、滤过除菌法
该法是用物理阻留的方法除去液体或空气中的细菌，达到无菌的目的。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，而大于孔径的细菌等颗粒不能通过。滤过法主要用于一些不耐高温灭菌的血清、抗生素、培养基及空气等的除菌（但不能除去更小的微生物如病毒、支原体和某些细菌L型）。滤菌器种类很多，常用的是玻璃滤菌器和石棉滤菌器（亦称Seitz滤菌器）。本实验主要使用薄膜滤菌器：由硝基纤维素膜制成，依孔径大小分为多种规格，用于除菌的滤膜孔径为0.22μm。【思考题】
根据实验阐述紫外线的主要用途及其杀菌原理。（夏乾峰）
实验4 细菌的基本形态及结构的观察
【实验目的】1.掌握细菌的基本形态；细菌的特殊结构及其常用的检查方法。
2.初步掌握细菌涂片的制作、革兰染色方法。
3.掌握油镜的原理和使用方法。
一、细菌的基本形态
细菌的基本形态有球形、杆形和螺形三大类。不同的细菌又可表现出不同的排列方式，在细菌的鉴别上有一定的参考价值。【实验材料】
1.球菌示教片：乙型溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌。
2.杆菌示教片：炭疽芽孢杆菌。
3.螺形菌示教片：霍乱弧菌。【实验结果】
使用显微镜的油镜观察上述细菌。比较各菌的形态、排列、染色性各有何特点，并将结果记录于实验报告上。
二、细菌的特殊结构
细菌的特殊结构仅为某些细菌所具有，而且特殊结构的形成受到一定条件的限制。虽然特殊结构不是细菌生存所必需的，但它们的存在将赋予细菌一定的功能，在致病性、抗原性以及细菌的鉴别上都有一定的意义。【实验材料】
1.芽胞示教片：破伤风梭菌。
2.荚膜示教片：肺炎链球菌。
3.鞭毛示教片：伤寒沙门菌。【结果观察】
使用显微镜的油镜，观察上述细菌。比较各菌的形态、排列、染色性、特殊结构，并记录于实验报告上。
三、革兰染色法【实验原理】
1.革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。
2.革兰阳性菌等电点（pI2~3）比革兰阴性菌（pI4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的碱性染料结晶紫结合牢固，不易脱色。
3.革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。【实验材料】
1.菌种：金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液。
2.染色液：结晶紫染液、卢戈碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红。
3.其他：玻片、生理盐水、酒精灯、接种环等。【实验方法】
1.工具
接种针和接种环：由环（针）、金属柄和绝缘柄三部分组成（图1-4-1）。图1-4-1 接种环和接种针结构
2.细菌涂片标本的制作（1）涂片：取洁净玻片一张，用记号笔划分两格并标记金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌；用接种环按无菌操作取1~2环金黄色葡萄球菌液在玻片上涂成直径约1cm的均匀薄膜，然后立即将接种环烧灼灭菌；同法取大肠埃希菌液于另一格中涂片。每次取菌前后注意将接种环灭菌。（2）干燥：涂片一般在室温下自然干燥，若须迅速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免将标本烤干。（3）固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰上迅速通过三次，以玻片反面触及皮肤，热而不烫为度。固定的目的是杀死细菌，并使菌体与玻片黏附牢固，染色时不被染液和水冲掉，同时固定可凝固细胞质，改变细菌胞壁对染料的通透性（图1-4-2）。
3.革兰染色步骤（1）初染：将涂片置于染色架上，滴加结晶紫染液1~2滴，1min后用水冲洗，倾去余水。图1-4-2 细菌涂片的制备（2）媒染：滴加碘液1~2滴，1min后水洗，倾去余水。（3）脱色：95%的酒精脱色，加酒精后轻轻晃动玻片，约30s后水洗，倾去余水。（4）复染：滴加稀释石炭酸复红1~2滴，30s后水洗，倾去余水。
待标本自干或用吸水纸印干后，在涂片上滴加镜油，置油镜下观察。【实验结果】
观察两种细菌的形态、排列、染色性，记录于实验报告。【思考题】
1.G＋菌和G－菌的细胞壁有何异同？这些差异与染色性、抗原性、毒性、对某些药物敏感性的关系如何？
2.简述青霉素和溶菌酶的作用机制。（夏乾峰）
实验5 细菌的生长现象的观察
【实验目的】掌握不同种类的细菌在固体、半固体、液体培养基上的生长现象及意义。【实验原理】
不同种类的细菌在培养基上生长，往往表现为不同的生长现象，可以通过观察生长现象，对细菌进行初步鉴定。【实验材料】
1.菌种：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合液、大肠埃希菌斜面菌种、痢疾志贺菌斜面菌种。
2.培养基：营养琼脂平板、营养琼脂斜面培养基、肉汤培养基、半固体培养基。3.其他：接种针、接种环、酒精灯、记号笔、培养箱等。【实验方法】
1.接种细菌（1）将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合液用分区画线法接种于营养琼脂平板上。（2）将大肠埃希菌接种于营养琼脂斜面培养基和肉汤培养基上。（3）将大肠埃希菌和痢疾志贺菌用穿刺法接种于半固体培养基上。
2.将上述接种细菌的培养基置37℃培养箱培养18~24h。
3.观察细菌的生长现象。【实验结果】
1.液体培养基：细菌生长后大多数呈均匀混浊状态，少数出现沉淀和菌膜。
2.固体培养基：形成菌落和菌苔。
3.半固体培养基：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长，无动力的细菌在半固体培养基中只沿穿刺线呈明显的线状生长。【注意事项】
1.观察液体培养基时，应注意观察液体培养基透明度，管底是否有沉淀，表面是否有菌膜及色素产生。
2.观察固体培养基时，应注意观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和黏度等特征。
3.观察半固体培养基时，应注意观察细菌是沿穿刺线生长还是向四周扩散生长。【思考题】
1.如何识别琼脂平板培养基上出现的菌落是种上去的，还是杂菌污染的？
2.具有鞭毛的需氧菌在半固体培养基和液体培养基的生长现象是怎样的？（王英）
实验6 培养基的制备和应用
【实验目的】1.掌握制备培养基的基本程序。2.掌握常用培养基的种类和应用。【实验原理】
培养基是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。培养基一般pH7.2~7.6，少数的细菌按生长要求调整pH偏酸或偏碱。许多细菌在代谢过程中分解糖类产酸，故常在培养基中加入缓冲剂，以保持稳定的pH。培养基制成后必须经灭菌处理。【实验器材】
1.试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液、蒸馏水等见培养基配方。
2.仪器及其他：天平、电炉、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、三角烧瓶、烧杯、量筒、精密pH试纸、玻璃棒、移液管、试管、试管架、试管盖、滤纸、牛皮纸、包装线、无菌培养皿等。【实验方法】
一、培养基制备的基本程序
1.称量：根据用量按配方比例依次称取成分，放入适当的三角烧瓶中。
2.溶解：用量筒取一定量（约占总量的1/2）的蒸馏水加入烧杯中，置于电炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足所需水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他原料，待完全溶解后，补足水分。
3.调pH值：根据培养基对pH的要求，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调至所需pH。
4.过滤分装：如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜；固体分装装量为管高的1/5；半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角烧瓶容积的1/2为宜。
5.包扎标记：分装完毕后，在试管口加上合适铝盖或三角烧瓶口加上硅胶塞等并包上一层牛皮纸，扎紧。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
6.灭菌和保存：培养基按配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基的灭菌方法为 121.3℃灭菌20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。培养基经灭菌后，如作斜面培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般不超过试管长度的1/2为宜；若需倒平板，则待培养基冷却至50~55℃后立刻倾倒入无菌培养皿中。待培养基凝固后放入37℃培养箱中培养24~48h，以检验灭菌的效果，确保无污染方可使用。
7.保存：制备好的培养基注明名称、制作日期，用牛皮纸包裹或装入保鲜袋内，以减少水分蒸发，存放于4℃冰箱备用。
常用培养基的种类、制备及应用
根据各种细菌生长繁殖时所需要的条件不同，培养基可分为很多种类。常用的种类按物理性状分为液体培养基、固体培养基、半固体培养；按用途不同分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基及厌氧培养基等。
1.液体培养基（1）肉膏汤培养基
①成分：牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000ml
②制法：用天平分别称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g置三角烧瓶中，加入蒸馏水1000ml，把三角烧瓶在电炉上加热，使蛋白胨等各成分熔化，并用1mol/L NaOH溶液调pH至7.4~7.6，煮沸3~5min，必要时过滤，过滤后分装于试管或三角烧瓶中，加塞，用牛皮纸包扎紧，经121.3℃高压灭菌20min后，取出冷却，置37℃温箱孵育24h，无杂菌生长，即可应用或放冰箱保存备用。
③用途：可供营养要求一般的细菌生长，主要用于增菌。（2）肉汤培养基
①成分：牛肉（去筋膜脂肪）500g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾（K2HPO·12HO）1g42
蒸馏水 1000ml
②制法：将已去筋膜脂肪并经搅碎的鲜牛肉500g，加蒸馏水1000ml，放入4℃冰箱中过夜，取出后在45~50℃加热1h，再煮沸30min后，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用水补足，其量为1000ml。于滤液中加入氯化钠5g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾1g，加热使之完全熔化，调pH值至7.6，必要时用滤纸过滤。按需要分装于试管或烧瓶内，加塞，用牛皮纸扎紧，放入高压蒸汽灭菌器内，经121.3℃20min灭菌。取出待冷却后置37℃温箱孵育24h，无杂菌生长，即可应用或放冰箱保存备用。
③用途：主要作基础培养基使用，营养比肉膏汤培养基好，可供营养要求一般的细菌生长，主要用于增菌。
2.固体培养基（1）普通琼脂培养基
①成分：肉汤或肉膏汤 1000ml
琼脂 15~18g
②制法：在肉汤中加入15~18g琼脂，熔化后调整pH为7.6，必要时用纱布过滤。于琼脂凝固前，分装于试管内或小三角烧瓶内，然后加盖扎紧，放入高压蒸汽灭菌器内，经121.3℃20min灭菌，取出将试管摆斜，待琼脂凝固后即成普通琼脂斜面。将三角烧瓶内琼脂培养基在未凝固前以无菌操作注入无菌平皿内，凝固后即成普通琼脂平板。倾注时应严格无菌操作，琼脂的温度应在50℃左右，如温度过高则平皿内凝水过多，易招致污染，过低则琼脂凝固而致培养基表面不平滑。
③用途：用于营养要求不高细菌的分离培养，纯培养或保存菌种。（2）血液琼脂培养基
①成分：普通琼脂培养基100ml
无菌脱纤维绵羊血或兔血8~10ml②制法：将制好的普通琼脂培养基加热熔化，待冷却至50℃左右时，以无菌操作加入5%~10%脱纤维兔血或羊血，混匀（注意勿使产生泡沫）后，分注于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或血液琼脂平板，放37℃温箱孵育24h，若无菌生长，即可应用或放入冰箱保存备用。
③用途：主要用于分离培养或保存营养要求高的细菌，如链球菌、肺炎链球菌等。（3）沙保弱琼脂培养基
①成分：蛋白胨 10g
葡萄糖 40g琼脂 15g
蒸馏水 1000ml②制法：将琼脂放在700ml水中，另两种成分放在300ml水中，分别加热熔化后将两液混匀，分装于试管内，经115.6℃高压灭菌10min，取出后躺成斜面，凝固后放37℃温箱中培养24h，无污染者收存冰箱中备用。本培养基不需要校正pH。
③用途：主要用于真菌的分离培养，真菌菌落总数检测等。
3.半固体培养基（1）成分：肉膏或肉膏汤 1000ml
琼脂 3~5g（2）制法：在肉汤中加入3~5g/L的琼脂，熔化后分装于小试管中（每管约2ml），加盖扎紧，然后放入高压蒸汽灭菌器内，经121.3℃20min灭菌，取出直立，待凝固后即成半固体培养基，放37℃温箱孵育24h，若无菌生长，即可应用或放入4℃冰箱保存备用。（3）用途：半固体培养基用于保存菌种或检测细菌的动力。【实验结果】
制备好的培养基灭菌彻底，无细菌生长。【注意事项】
1.蛋白胨容易吸潮，称量时要动作迅速。
2.加热时应注意控制火力，勿使培养基烧焦或溢出。
3.无特殊要求时可省去过滤步骤。
4.分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免引起污染。【思考题】
1.培养基的制备程序可概括划分为哪几个步骤来完成？
2.培养基配制时应注意什么问题？为什么？
3.培养基配好后，为什么要立即灭菌？（王英）
实验7 细菌的致病性
细菌的致病作用称为细菌的致病性。
细菌的致病性与其毒力、入侵机体的数量及其侵入部位有关。致病性的强弱取决于细菌毒力的大小。
细菌的毒力由侵袭力和毒素构成。侵袭力是指病原菌突破机体的防御功能，在体内定居、繁殖和扩散的能力，如菌毛、荚膜、透明质酸酶、血浆凝固酶等。毒素是细菌在生长繁殖中产生和释放的毒性物质，包括内毒素和外毒素。【实验目的】
了解细菌毒力及其致病作用。
透明质酸酶实验【实验原理】
乙型溶血性链球菌产生的透明质酸酶（又称扩散因子）能水解结缔组织中的透明质酸基质，使结缔组织疏松，通透性增加，有利于细菌的扩散蔓延。【实验材料】
家兔、乙型溶血性链球菌24h肉汤培养物滤液、黑墨水、肉汤及无菌注射器、针头等。【实验方法】
1.取家兔一只，将背部两侧兔毛剪去（或用脱毛剂将毛脱去）。
2.取溶血性链球菌24h肉汤培养物的滤液0.5ml，与等量黑墨水混合；另取肉汤0.5ml，与等量黑墨水混合。
3.于家兔背部一侧皮内注射乙型溶血性链球菌滤液与墨水混合液0.1ml；另一侧皮内注射肉汤与黑墨水混合液0.1ml，作为对照（注射时应注意避免漏出使表皮着色，影响结果的观察）。【实验结果】
注射后1h观察结果，比较两侧黑墨水扩散范围的大小并记录分析。
破伤风外毒素的毒性作用【实验原理】
破伤风梭菌合成并分泌于菌体外的破伤风痉挛毒素是一种强烈的外毒素，它能阻止抑制性神经介质的释放，干扰抑制性神经元的协调作用，使肌肉活动的兴奋与抑制失调，导致屈肌、伸肌同时发生强烈收缩，骨骼肌出现强烈痉挛。【实验材料】
小白鼠、肉汤管、破伤风梭菌培养物滤液、破伤风抗毒素、无菌注射器、针头、20g/L碘酒、75%酒精、无菌棉拭子等。【实验方法】
1.取第1只小白鼠，于后腿肌肉内注射破伤风梭菌培养物滤液0.2ml。
2.取第2只小白鼠，于后腿肌肉内注射肉汤0.2ml，作为对照。
3.取第3只小鼠，于腹腔内注射破伤风抗毒素0.2ml，30min后再肌肉注射破伤风梭菌培养物滤液0.2ml。
4.逐日观察结果。【实验结果】
仅注射外毒素的小白鼠发病，可见尾部强直，注射侧肢体麻痹，强直性痉挛，继而逐渐累及另一侧肢体出现痉挛，最后全身肌肉痉挛（图1-7-1）。而注射肉汤和先注射抗毒素的小白鼠不出现肌肉痉挛强直症状。图1-7-1 破伤风痉挛毒素引起的小鼠病态体征【思考题】
1.根据实验结果说明细菌毒力的构成因素。
2.试述内毒素与外毒素的主要区别。（王英）
实验8 抗菌药物敏感性实验
细菌对抗生素的敏感性测定（简称药敏实验），可以了解细菌对药物作用的敏感程度，对于临床治疗药物的选择具有重要意义。常用的方法为纸片琼脂扩散法。【实验目的】
1.理解纸片琼脂扩散法（K-B法）的原理和注意事项。
2.掌握纸片琼脂扩散法（K-B法）的操作方法、结果的判读及其临床意义。【实验原理】
将含有定量抗菌药物的纸片贴在己接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。【实验材料】8
痢疾志贺菌菌液（1.5×10/ml）、金黄色葡萄球菌菌液（1.5×810/ml）、水解酪蛋白琼脂培养基、0.5麦氏比浊标准管、药敏纸片（氨苄青霉素、庆大霉素、氟哌酸、头孢唑啉（先锋V）、头孢他唑）、无菌棉签拭子、小镊子、毫米尺等。【实验方法】
1.用无菌棉签拭子浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面使菌液均匀分布，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。
2.平板置室温下干燥3~5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
3.置35℃孵箱16~18h培养后量取抑菌圈直径阅读结果。对甲氧西林和万古霉素敏感实验结果应孵育24h。【实验结果与判读】
1.用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域），当金黄色葡萄球菌对苯唑西林的药物敏感实验或肠球菌对万古霉素的药物敏感试验围绕纸片周围只要有极少细菌生长时，均提示为耐药（图1-8-1）。
2.对另外一些细菌，在抑菌圈内有散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再进行分离鉴定及实验；也可能提示为高频突变株。图1-8-1 药敏实验（纸片琼脂扩散法）
3.根据NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径参照表1-8-1作出判断。
敏感（S）：表示当对感染部位使用推荐剂量时，该菌株通常被抗微生物药物浓度可达到的水平所抑制。
中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，但仍可用于生理性浓集部位的感染或使用高剂量药物进行治疗。
耐药（R）：表示常规剂量下，在抗微生物药通常可达到的浓度时，菌株不能被抑制；或/和标明抑菌圈直径缩小到菌株可能产生了特殊的微生物耐药机制的范围内，药物对菌株临床疗效不可靠。表1-8-1 纸片法药敏实验纸片含药量及结果解释【注意事项】
1.培养基的质量，如pH、厚度、表面湿度和保存等均会影响抑菌圈的大小。
2.药敏纸片的药量、吸水性、直径、保存等会影响测定结果。
3.接种菌量也是影响结果的重要因素。
4.采用标准菌株同时进行药敏实验作为质控。【思考题】
1.青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
2.简述细菌对青霉素类药物产生耐药性的机制。（王英）
实验9 球菌的分离培养及微生物学鉴定
【实验目的】1.了解葡萄球菌、链球菌的形态、菌落特征。
2.掌握致病性葡萄球菌的特征。
3.熟悉触酶实验、血浆凝固酶实验的原理。
4.掌握抗链球菌溶血素O（SLO）抗体的测定方法及其意义。【球菌检验程序】
球菌的检验程序见图1-9-1。图1-9-1 球菌检验程序【标本采集】
1.脓液标本的采集（1）若为开放性感染分泌物或脓液常先用无菌生理盐水冲洗表面，用2支无菌棉拭子取溃疡深处的脓液及分泌物送检，1支为涂片检查用，1支为培养用。（2）若为封闭式脓肿常于局部消毒后，无菌抽取脓液置于无菌试管送检。应注意严格遵守无菌操作。（3）如果疑为脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，则采集标本后应立即床边接种，或保暖、保湿并立即送检。疑为厌氧菌感染时，当即作床边接种或置于厌氧培养基内送检。
2.血液标本的采集
一般在病人发病初期或发热高峰期，或根据不同的发热情况在未使用抗生素前采集做细菌培养，为提高阳性率常需连续三次采血进行血培养。采血时要严格遵守无菌操作。一般在肘静脉采集血液，在采血前局部皮肤应消毒，先用碘酒消毒，然后用75%酒精擦拭。采血量为成人一次5~10ml，婴幼儿1~5ml，骨髓1~2ml。抽取的血液应以无菌要求立即注入含增菌肉汤的培养瓶内，迅速轻摇，使之充分混合，以防血液凝固。培养基与血液之比以10∶1为宜，以稀释血液中原有的抗生素、抗体、补体和溶菌酶等抗菌物质。
一、形态与培养物观察【实验器材】
1.普通光学显微镜
2.示教片：金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。
3.金黄色葡萄球菌血琼脂平板培养物。4.表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物。5.乙型溶血性链球菌血琼脂平板培养物。【实验方法】
1.在摆好的示教显微镜中观察金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的形态、排列、染色性和特殊结构。
2.观察金黄色葡萄球菌血琼脂平板培养物、表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物和乙型溶血性链球菌血琼脂平板培养物。【实验结果】
1.病原性球菌的形态。在显微镜油镜下，观察记录并比较各菌的形态、排列、特殊结构、染色性的特点。
2.培养物观察。观察3种球菌的血琼脂平板培养物的单个菌落的形态、大小、边缘、湿润度、透明度、颜色及溶血环。【注意事项】
观察示教时不要移动视野和调节显微镜的大螺旋，若感觉图像模糊可以轻微调节小螺旋。
二、生化反应
触酶实验【实验原理】
具有过氧化氢酶（即触酶）的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而生成分子氧出现气泡。该实验用于初步区别葡萄球菌和链球菌。葡萄球菌产生过氧化氢酶，而链球菌为阴性。【实验器材】
1.菌种：由血液标本中分离出来的菌株（1~3号斜面标本）。
2.3%过氧化氢试剂。
3.玻片。
4.接种环和酒精灯。【实验方法】玻片法
1.取洁净玻片一块，用记号笔划分三格。每格滴加一滴3%过氧化氢试剂。
2.用接种环从1号斜面标本中沾取少许培养物，置于第一格的过氧化氢试剂中混匀。烧灼后取2号标本置于第二格，同法取3号标本置第三格。【实验结果】
立即观察结果，过氧化氢试剂中有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。【注意事项】
取标本时注意不要取到培养基，避免出现假阳性。
血浆凝固酶实验【实验原理】
血浆凝固酶可增强葡萄球菌的致病性，是金黄色性葡萄球菌的鉴定重要指标。
金黄色葡萄球菌能产生结合型凝固酶和游离型凝固酶。结合型凝固酶，结合在细胞壁上，是菌株的表面纤维蛋白原受体，可与血浆中的纤维蛋白原结合，通过交联作用使细菌凝聚。纤维蛋白原在凝固酶作用下变成纤维蛋白而附着于细菌表面。结合型凝固酶可用玻片法测出。游离型凝固酶作用类似凝血酶原物质，可被人或兔血浆中的协同因子激活变成凝血酶样物质，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，可用试管法测出。【实验器材】
1.菌种：同触酶实验。
2.人或兔血浆（1∶2）。
3.生理盐水、玻片及酒精灯等。【实验方法】
在触酶实验中触酶实验阳性的细菌进行血浆凝固酶实验。
玻片法：取玻片一张，用记号笔各画两格。一格滴加生理盐水一滴，另一格滴加人或兔血浆一滴，用接种环挑取待测检菌分别加入生理盐水和血浆混匀，10s内观察结果。【实验结果】
10s内观察结果，出现颗粒状凝集者为阳性。【注意事项】
1.取不同标本时要充分烧灼灭菌接种环。
2.应在10s内观察结果，如超过10s可出现假阳性。
3.在临床上，血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也很常见，但是不能轻率作出其是非致病性葡萄球菌或污染菌的结论，因为血浆凝固酶阴性的葡萄球菌常常也可以引起菌血症、尿路感染和心内膜炎等。
耐热核酸酶实验【实验原理】
致病性葡萄球菌能产生耐热核酸酶，可水解DNA。水解后的DNA短链与甲苯胺蓝结合，导致甲苯胺蓝DNA琼脂显示粉红色。而非致病性葡萄球菌虽然也能产生DNA酶，但是其不耐热。故耐热核酸酶实验是鉴定致病性葡萄球菌的指标之一。【实验器材】
1.菌种：同触酶实验。
2.甲苯胺蓝DNA琼脂。
3.生理盐水、玻片及酒精灯等。【实验方法】
玻片法：将熔化好的甲苯胺DNA琼脂3ml均匀倾倒在载玻片上，琼脂凝固后，打上孔径为2~5mm的小孔6~8个，各孔分别滴加1滴经沸水水浴3min的待检葡萄球菌及阳性、阴性对照葡萄球菌培养物，放置培养箱37℃孵育3h，观察有无粉红色圈及其大小。【实验结果】
在小孔外出现粉红色圈的为阳性。金黄色葡萄球菌耐热核酸酶实验为阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌耐热核酸酶实验为阴性。
甘露醇发酵实验【实验原理】
致病性葡萄球菌多能分解甘露醇产酸，致使培养基由紫色变为黄色。【实验器材】
1.菌种：同触酶实验。
2.甘露醇发酵管。
3.恒温箱、酒精灯等。【实验方法】
将标本接种于甘露醇发酵管，放置恒温箱，35℃恒温孵育18~24h后观察结果。【实验结果】
若培养基混浊，由紫色变为黄色，则甘露醇发酵实验阳性，否则为阴性。金黄色葡萄球菌甘露醇发酵实验为阳性，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌甘露醇发酵实验均为阴性。
新生霉素敏感实验【实验原理】
葡萄球菌属中表皮葡萄球菌对新生霉素敏感，腐生葡萄球菌对新生霉素耐药。因此本实验可用于表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的鉴别。【实验器材】
1.菌种：同触酶实验。
2.新生霉素。
3.恒温箱、酒精灯等。【实验方法】
用无菌棉签取相当于0.5麦氏管浊度的待测标本均匀涂布在MH琼脂平板上，贴上新生霉素纸片，放置恒温箱，35℃孵育16~20h，测量抑菌环大小。【实验结果】
测量抑菌环直径≤16mm为耐药，＞16mm为敏感。该实验用于鉴别表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素敏感（S），腐生葡萄球菌对新生霉素耐药（R）。
血清学实验 抗O实验【实验原理】
乙型溶血性链球菌能产生链球菌溶素O（SLO），其化学成分为蛋白质，抗原性强，乙型溶血性链球菌感染患者85%~90%在感染后2~3周血清中即可检出SLO抗体。检测SLO抗体的实验即称为抗链球菌溶素O实验（antistreptolysin O test，ASO test），简称抗O实验。风湿热患者血清中抗SLO抗体显著增高，活动期增高更为显著，一般超过400IU/ml。因此抗O实验常用于风湿热及其活动性的辅助诊断。
乳胶凝集法：血清中产生的抗SLO抗体（ASO），与SLO能发生免疫反应。本实验用特殊技术制备高纯度的稳定的链球菌溶素O（SLO）致敏颗粒。当血清中ASO含量达到或高于250IU/ml时，即可引起致敏乳胶颗粒的凝集。本实验检出临界值为250IU/ml，而健康人血清中ASO含量通常低于250IU/ml，所以不会引起致敏乳胶颗粒的凝集。【实验器材】
1.待检血清标本1、2号。
2.血素“O”溶液5ml。
3.SO乳胶试剂5ml。
4.性对照血清0.5ml、阴性对照血清0.5ml。
5.其他：玻片。【实验方法】
1.实验前将试剂和血清标本恢复到室温，血清标本用生理盐水1∶15稀释。
2.在反应板上用记号笔做好标记，分别加入病人血清1号、2号、阳性对照血清和阴性对照血清各1滴。
3.各滴加溶血素“O”溶液1滴，轻轻摇动1min，使其充分混匀。
4.加ASO胶乳试剂1滴，用搅拌棒轻轻搅拌混匀或轻轻摇动3min，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。【实验结果】
阳性对照应出现明显胶乳凝集现象，阴性对照不应出现凝集。病人血清出现乳胶凝集者，即为阳性，反之则为阴性。【注意事项】
搅拌不同标本时要换不同搅拌棒。在规定时间内看结果。【思考题】
1.简述致病性葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的主要鉴别要点。
2.致病性葡萄球菌有哪些主要鉴定指标？
3.简述抗O实验的原理及应用。（陈锦龙）
实验10 肠杆菌科细菌的分离培养基微生物学鉴定
在正常人肠道内寄居着不同数量和不同种类的正常菌群，这些菌群的细菌种类受食物等因素影响。母乳喂养的婴儿肠道以革兰阳性细菌为主，成人的肠道内则以革兰阴性细菌占优。这类细菌一般不引起肠道感染，但当一些条件发生了改变，如寄居的部位发生改变、机体免疫力下降或菌群失调时，就有可能引起疾病，如腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等。
在引起感染性腹泻的病原微生物中，细菌类主要有：①引起产毒素型腹泻的霍乱弧菌、肠产毒型大肠埃希菌等；②引起侵袭型腹泻的志贺菌、空肠弯曲菌；③引起食物中毒的沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒芽孢梭菌等；④引起伪膜性肠炎的金黄色葡萄球菌、艰难芽孢梭菌等。【实验目的】
1.熟悉肠道病原菌的分离、鉴定的主要步骤。
2.掌握肥达反应的检测原理及意义。
3.掌握大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌的主要鉴定要点。【肠杆菌科细菌检验程序】
检验程序见图1-10-1。
肠杆菌科细菌的形态与菌落观察【实验原理】
S.S培养基为强选择性培养基，培养基中含有乳糖、中性红指示剂和煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等抑制剂，对大肠埃希菌有很强的抑制作用，有利于肠道致病菌的选择生长。中性红指示剂酸性条件下呈现红色，在S.S培养基上生长的菌落，若能分解乳糖产酸则显示红色，不分解乳糖不显色。若细菌可以分解培养基中的蛋白胨产2＋生HS，则HS与培养基中的亚铁离子（Fe）相结合，产生黑色的22硫化亚铁（FeS）。【实验器材】
1.大肠埃希菌和1号待检菌S.S平板分离培养物。2.大肠埃希菌和2号待检菌S.S平板分离培养物。3.接种环、玻片、酒精灯等。【实验方法】
1.观察S.S平板上三种不同细菌的菌落形态特征。
2.用接种环从S.S平板上分别取上述三种细菌进行涂片、革兰染色镜检。图1-10-1 肠杆菌科细菌检验程序【实验结果】
1.记录描述S.S平板上三种不同细菌的菌落性状特征，注意观察记录菌落颜色特征及是否有黑色沉淀。
2.描述镜下观察所见细菌的形态和染色性并画图分析。【注意事项】
1.观察描述菌落时要观察和描述菌落的大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐与否等形状。
2.涂片进行革兰染色时，要注意涂片不要太厚并注意染色时间的控制。
肠杆菌科细菌生化反应
Ⅰ.克氏（KIA）双糖铁琼脂鉴别培养【实验原理】
克氏（KIA）双糖铁培养基中含有乳糖、葡萄糖，指示剂为酚红，酚红遇酸会变黄色。本培养基可观察不同细菌对以上两种糖的分解能力。
接种细菌，37℃培养18~24h后，若底层变黄、斜面变红，为分解葡萄糖，不分解乳糖；底层和斜面同时变黄，为同时发酵葡萄糖和乳糖。产酸产气则还可见气泡或裂口现象。若细菌可以分解培养基中2＋的蛋白胨产生HS，则H2S与培养基中的亚铁离子（Fe）相结合，2产生黑色的硫化亚铁（FeS）。【实验器材】
1.菌种：S.S平板上待检菌1、2号。
2.克氏（KIA）双糖铁培养基2支。
3.接种环（针）、酒精灯等。【实验方法】
1.用接种环（针）从S.S平板上分别挑取1号菌与2号菌的单个菌落。
2.接种于克氏双糖铁培养基。
3.放置培养箱，37℃培养18~24h后观察记录结果。【实验结果】
1.观察克氏双糖铁培养基中颜色的变化、有无气泡、有无黑色沉淀。
2.根据以上现象对待检肠杆菌科细菌1号和2号做出初步判断。【注意事项】
1.挑取细菌时要挑取单个菌落。
2.观察结果时，注意观察培养基颜色的变化、是否有黑色的沉淀及培养基是否被冲击破裂。
Ⅱ.糖发酵实验【实验原理】
在蛋白胨水中加入10g/L单糖、溴甲酚紫指示剂并加入一小倒管后高压灭菌，制成单糖发酵管，溴甲酚紫在中性或碱性溶液中呈紫色，在酸性溶液中呈黄色。如细菌在单糖管中生长繁殖产酸，则培养液变黄色。如产酸产气，除培养液变黄色外，小倒管内有气泡出现。如不分解单糖则培养液不变色，小倒管内无气泡。【实验器材】
1.葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖五种单糖发酵管。
为了区别不同的单糖发酵管，国际公认用以下标记：红色（葡萄糖）、黄色（乳糖）、蓝色（麦芽糖）、白色（甘露醇）、黑色（蔗糖）。
2.菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌。3.酒精灯、培养箱等。【实验方法】
1.按照无菌操作的原则用接种环挑取大肠埃希菌。
2.分别将接种于五种单糖培养基中。
3.放置培养箱，37℃培养18~24h后观察它们对不同单糖的分解反应情况。
4.同法接种伤寒沙门菌和志贺菌。【实验结果】
1.若分解某种单糖产酸，则培养液变黄色，记录为“＋”。
2.若分解某种单糖产酸产气，除培养液变黄色外，小倒管内有气泡出现。记录为“磑”。
3.若不分解某种单糖则培养液不变色，小倒管内无气泡。记录为“－”。
Ⅲ.靛基质实验【实验原理】
有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长能分解色氨酸产生吲哚（靛基质），吲哚无色，肉眼不能观察，如加入靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）即生成玫瑰吲哚而显现红色。【实验器材】
1.蛋白胨水培养基。
2.菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌。
3.靛基质试剂。【实验方法】
1.按照无菌操作的原则将大肠埃希菌接种于蛋白胨水培养基。
2.放置培养箱，37℃培养18~24h后取出。
3.加入靛基质试剂约0.2ml，摇匀。
4.观察液体上层颜色变化。【实验结果】
若液体上层出现玫瑰红色环，即为靛基质实验阳性，否则为阴性。
Ⅳ.动力实验【实验原理】
可用半固体培养基检查细菌有无动力，无动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线生长，有动力的细菌在半固体培养中呈扩散生长，甚至使培养基变得混浊。【实验器材】
1.半固体琼脂培养基。
2.菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌。
3.接种针、酒精灯等。【实验方法】
1.将接种针经火焰烧灼灭菌冷却后，从斜面培养物上沾取大肠埃希菌。
2.用无菌操作穿刺接种，将大肠埃希菌接种半固体培养基中。
3.接种针经火焰灭菌后放回原处。
3.管口经火焰灭菌后，盖好，培养于37℃温箱18~24h后观察结果。
4.同法接种伤寒沙门菌、志贺菌。【实验结果】
观察接种后穿刺线及周围培养基，若穿刺线模糊，培养基混浊，动力实验阳性；若穿刺线清晰，培养基澄清，则动力实验阴性。【注意事项】
接种时，接种针要刺入半固体培养基的正中央，直进直出，原路返回。
肠杆菌科细菌的抗原性鉴定【实验原理】
颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应的抗体结合，在适量电解质（通常是8.5g/L NaCl溶液）存在的条件下出现凝集现象，称为凝集反应。
抗原抗体反应具有特异性，一种抗原只能与其对应的特异性抗体结合。利用凝集反应及抗原抗体反应的特异性特点，可以利用已知的抗原（抗体）检测未知的抗体（抗原）。【实验器材】
1.菌种：1号待检菌双糖铁培养基培养物、2号待检菌双糖铁培养基培养物。
2.免疫血清：沙门菌属诊断血清、志贺菌属诊断血清。
3.玻片、接种环、酒精灯、微量移液器、Tip头等。【实验方法】
1.取干净玻片一张，用记号笔在玻片上划分3格，分别加入生理盐水、伤寒免疫血清、痢疾免疫血清20μl并做好标记。
2.无菌操作用接种环取1号待检菌双糖铁培养基培养物分别加入上述3格中，混匀，轻轻晃动1~2min后观察记录结果。
3.另取一张玻片，同法取1号待检菌双糖铁培养基培养物做鉴定。【实验结果】
出现明显凝集颗粒，周围液体变澄清透明者为阳性，呈均匀浑浊状态的为阴性。【注意事项】
1.用接种环取菌时，不要太用力刮取，避免刮到培养基。
2.混匀时，不同血清标本需更换Tip头，避免血清交叉污染导致结果错误。
肥达反应（Widal test）【实验原理】
用已知伤寒沙门菌O、H抗原、甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌H抗原，检测患者血清中的相应抗体的血清凝集反应称为肥达反应。常用于辅助诊断伤寒和副伤寒。
因为隐性感染或是预防接种，机体血清中存在一定量的抗体，故一般伤寒沙门菌O凝集价≥1∶80，H凝集价≥1∶160，副伤寒沙门菌H凝集价≥1∶80才有临床意义。
血清学诊断取急性和恢复期双份血清标本进行检测，恢复期抗体效价增高≥4倍有诊断意义。【实验器材】
1.1∶10病人血清。
2.伤寒沙门菌O抗原菌液、伤寒沙门菌H抗原菌液、甲型副伤寒沙门菌H抗原菌液、乙型副伤寒沙门菌H抗原菌液。
3.生理盐水、恒温箱等。【实验方法】
1.取U型反应板，分别标记四排，每排10孔。
2.取生理盐水加入各孔内，每孔50μl。
3.于第1排第1孔内各加入病人1∶10血清50μl，吹吸混匀。从第1排第1孔中吸出50μl注入第1排第2孔中，做倍比稀释，依次稀释至第9孔，并从第9孔弃去50μl，第10孔为对照孔。
4.其他3排按同样方法稀释。
5.每排从第10孔开始，由后向前在每孔中加入菌液。第1排各孔加50μl伤寒沙门菌O抗原菌液，第2排各孔加50μl伤寒沙门菌H抗原菌液，第3排各孔加50μl甲型副伤寒沙门菌H抗原菌液，第四排各孔加50μl乙型副伤寒沙门菌H抗原菌液（如表1-10-1）。
6.轻轻震荡混匀，放置45℃恒温箱孵育1h后取出，室温静置15min，观察结果。表1-10-1 肥达反应（单位：ml）【实验结果】
1.观察前先勿摇晃，以免凝块分散。先看对照孔，后看实验孔。
2.凝集程度以“＋”、“＋＋”、“＋＋＋”、“＋＋＋＋”表示，以“－”表示不凝集（表1-10-2）。表1-10-2 肥达实验结果判定表
3.凝集效价的判定：通常以能与一定量的抗原发生肉眼可见明显凝集（2＋）的血清最高稀释度为血清凝集效价。【注意事项】
1.病人1∶10血清只加入到每排的第1孔中，然后做倍比稀释。
2.倍比稀释过程中，要注意尽量避免出现气泡。
3.倍比稀释只稀释到第9孔，第10孔是对照，不含病人血清。【思考题】
1.简述伤寒沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌的主要鉴别要点。
2.从粪便、血液、尿液中分离出大肠埃希菌分别有何意义？（陈锦龙）
实验11 呼吸道感染细菌的分离培养及微生物学鉴定
呼吸道感染细菌是指经呼吸道传播、主要引起呼吸道器官或呼吸道以外器官病变的一类细菌。主要包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、白喉棒状杆菌（C.diphthe-riae）、嗜肺军团菌（L.pneumophila）等。【实验目的】
1.熟悉齐-尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法。
2.熟悉结核分枝杆菌的形态特点。
3.熟悉白喉棒状杆菌的形态染色特点、染色方法及培养特点。
4.了解白喉棒状杆菌的毒力实验方法。
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，可从多途径进入人体，侵犯全身各脏器，其中以肺结核为多见。结核病是一种慢性消耗病，至今仍为我国重要的传染病之一，其诊断需综合临床资料、放射学检验资料及细菌学检验资料，其中确诊仍有赖于细菌学检验。【结核分枝杆菌检测程序】
检测程序见图1-11-1。图1-11-1 结核分枝杆菌检验程序【实验原理】
目前临床上常用的检查方法为涂片抗酸染色镜检：取患者痰、尿、粪、脑脊液、胸腹水标本直接涂片或集菌后涂片，抗酸染色若检出抗酸阳性分枝杆菌，结合临床症状即可初步诊断。一般涂片检查菌量需5000~50000/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果。
抗酸染色法：分枝杆菌属是一类细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，由于菌体含大量分枝菌酸故不易着色，经加温或延长染色时间才能着色，一旦着色后，能抵抗盐酸酒精的脱色作用，故又称为抗酸性杆菌。
利用PCR技术检测结核分枝杆菌DNA可用于结核病的早期和快速诊断。【实验器材】
1.结核病人痰标本。
2.抗酸染色液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精溶液、吕氏美蓝溶液。
3.普通光学显微镜。【实验方法】
1.涂片：取患者清晨咳出的痰液，用棉拭子小心蘸取痰液少许作涂片，自然干燥，火焰固定。
2.染色：（1）涂片平放，滴加石炭酸复红液，5min后水洗。（2）以3%盐酸酒精液脱色2min，随即用水冲洗。（3）以吕氏美蓝液复染1min，水洗。（4）待干后，油镜下观察。【实验结果】
染成红色者为抗酸阳性菌，非抗酸性细菌及细胞染成蓝色。【注意事项】
1.涂片时，不要涂太厚。
2.染色时，注意控制染色时间。
3.废弃标本需经高压蒸汽灭菌后方能丢弃或清洗。
4.为防止实验室造成传染，可用卡介苗代用病人痰液中的结核菌。
白喉棒状杆菌
白喉棒状杆菌是人类白喉的病原体。白喉是一种急性传染病，常见于儿童，因患者咽喉部出现灰白色假膜而得名。该菌在患者咽喉部位繁殖并分泌外毒素入血引起局部和全身中毒症状。如不及时治疗可导致死亡，因此早期快速诊断对于本病的治疗、预后及防止传播都具有重要意义。
白喉棒状杆菌具有明显的形态学特征：细长微弯，一端或两端膨大呈棒状，常排列成“V”、“L”形或栅栏状。G＋菌，菌体着色不均，有浓染颗粒，用异染颗粒染色法（如奈瑟染色法）染色可见明显的异染颗粒。取患者咽喉部假膜作涂片，用革兰染色、美蓝染色或异染颗粒染色法染色镜检，如发现有上述典型形态学特征者即刻作初步诊断。进一步可用毒力实验鉴定产毒白喉棒状杆菌。【白喉棒状杆菌检测程序】
检测程序见图1-11-2。图1-11-2 白喉棒状杆菌检测程序【实验原理】
白喉棒状杆菌在含有凝固血清的吕氏培养基上生长迅速，菌体形态典型，异染颗粒明显；呈现灰白色、湿润光滑的小菌落。在含有0.3~0.4g/L亚碲酸钾血琼脂平板上生长时，可使亚碲酸钾还原为元素碲，菌落呈黑色。【实验器材】
1.白喉棒状杆菌吕氏血清斜面18h培养物。
2.亚碲酸钾血平板白喉棒状杆菌培养物。
3.美蓝染色液、革兰染色液、奈瑟染色液。【实验方法】
1.观察白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面上的生长情况及在亚碲酸钾血平板上的菌落特征。
2.取三张玻片，用吕氏血清斜面白喉棒状杆菌培养物分别在三张玻片上作涂片，自然干燥，火焰固定后，分别用美蓝染色法、革兰染色法、奈瑟染色法染色，待干镜检（油镜），绘图。（1）美蓝染色法：滴加美蓝染色液1~2滴于固定的涂片标本，染色1min，水冲洗。（2）革兰染色法：按照本书中《细菌的基本形态及结构观察》章节中所述进行染色观察。（3）奈瑟染色法：涂片加热固定后，以甲液染色3min，水洗；再以乙液染色1min，水洗。【实验结果】
1.观察记录白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面上的生长得菌落特征。
2.观察记录白喉棒状杆菌亚碲酸钾血平板上的菌落特征。
3.镜下形态观察：用革兰染色和美蓝染色法时，菌体着色不均匀，常呈现深染颗粒。奈瑟染色时，可见菌体中被染成黑色的异染颗粒，菌体呈黄褐色。【注意事项】
1.白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面上的生长菌落较小，颜色与培养基颜色接近，要注意观察。
2.各种染色方法要严格控制时间。【思考题】
1.结核患者初步诊断的依据？如何判断抗酸阳性菌？为何结核分枝杆菌具有抗酸性？
2.白喉患者微生物检查有何重要意义？初步诊断的依据是什么？（陈锦龙）
实验12 病毒的形态与结构观察
病毒是形态最微小，结构最简单的微生物，其基本性状包括：①体积微小，能通过细菌滤器，需要电镜才能观察到；②结构简单（非细胞型），无完整的细胞结构；③只含有一种类型的核酸（DNA或RNA）；④专性活细胞内寄生；⑤以复制方式进行繁殖；⑥对抗生素不敏感。
有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞的一定部位（胞核、胞质或两者兼有）出现一个或多个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的斑块状结构，即包涵体，对病毒感染的辅助诊断具有一定的价值。【实验目的】
1.熟悉病毒的形态。
2.熟悉观察病毒包涵体的方法。
病毒包涵体观察【实验原理】
狂犬病病毒可在多种动物中感染与传播。感染后在易感动物或是人的中枢神经细胞中增殖，可在胞浆内形成一个或多个、圆形或椭圆形、嗜酸性包涵体，称之为内基小体（Negri body）。【实验器材】
1.狂犬病病毒包涵体（Negri body），H-E染色标本。2.光学显微镜或电脑等。【实验方法】
通过光学显微镜或电脑观察狂犬病毒包涵体。【实验结果】
可见其位于神经细胞胞浆内1个或数个大小不等的圆形或椭圆形，红色嗜酸性包涵体，即为内基小体。包涵体的周围有一不染色光带，称为明晕。【注意事项】
观察内基小体时，注意与细胞核区分，内基小体嗜酸性，位于胞浆内，被染成红色。
病毒电镜照片观察【实验原理】
病毒大小的测量单位为纳米（nm），需用电子显微镜观察才能看清其形态与结构。病毒的形态多种多样，大多数病毒为球形或近似球形，少数为杆状、弹状、丝状和砖块状。【实验器材】
病毒电镜照片：乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、SARS冠状病毒、登革病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、轮状病毒、痘病毒、狂犬病毒、烟草花叶病毒。【实验方法】
观察不同的病毒，并记录描述。【实验结果】
可以观察到不同形态的病毒颗粒。【注意事项】
观察时要注意观察各种病毒的特征性结构，例如，观察流感病毒时要注意观察其包膜上的刺突。【思考题】
1.何谓包涵体？检查包涵体有何实际意义？
2.病毒的形态有哪些？
3.试述乙型肝炎病毒的结构。
4.试述流感病毒的结构。（陈锦龙）
实验13 呼吸道感染的病毒学检验
呼吸道病毒是指以呼吸道作为侵入门户，并在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的一类病毒。主要包括流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠状病毒等。90%以上的急性呼吸道感染由病毒引起。对于呼吸道病毒的检测方法主要包括病毒分离培养、血清学诊断和PCR技术等快速诊断方法。【实验目的】
1.熟悉病毒严格细胞内寄生的特性。
2.了解流感病毒的分离、培养与鉴定过程。
3.掌握病毒血凝、血抑实验的反应原理及用途，熟悉其结果判断。【流感病毒分离与鉴定程序】
鉴定程序见图1-13-1。图1-13-1 流感病毒分离与鉴定程序
鸡胚的观察【实验原理】
鸡胚是培养病毒及立克次体最易得的活细胞材料，受精卵一般经21d的孵育即可发育成小鸡，用于接种培养的一般为6~12d的鸡胚，了解鸡胚的结构是进行鸡胚接种的基础。
鸡胚的结构（见图1-13-2）从内到外分为鸡胚、羊水腔、卵黄囊、尿囊腔、气室等部分，每一部分都有膜的结构将其他部分隔开，羊水腔内充满保护鸡胚生长发育的液体，一般随鸡胚发育而扩大；卵黄囊内贮备供鸡胚生长发育用的营养物质，随鸡胚生长发育，营养消耗而逐渐缩小；尿囊腔是鸡胚代谢产物的贮存室。图1-13-2 鸡胚接种方法【实验器材】
1.来抗鸡受精卵，其特点是个大、壳薄、色浅，易于在检卵灯下检视。
2.检卵箱。【实验方法】
手持鸡蛋放入检卵箱的检卵孔上，缓慢地将鸡蛋翻动，从各个方向注意观察鸡胚的结构。
1.孵育前：于检卵灯上检查鸡蛋是否受精。将受精卵用清水刷干净，用干布拭干，放入孵育箱中孵育，控制温度为38~39℃，相对湿度为45%~60%。
2.孵育3d后，每天翻动鸡蛋1~2次。
3.孵育后第4天，于检孵灯下检视，淘汰死胚，留下活胚：
活胚胎———血管清晰，可见鸡胚显影及胚动。
死鸡胚———血管模糊昏暗，胚动呆滞或不动。
未受精卵———不见鸡胚痕迹。
4.孵育后第6~12天检视。根据上述观察到的活鸡胚，继续孵育6~12d再进行观察及接种，这时观察注意气室、鸡胚及其他部分的相对位置，用铅笔将气室及鸡胚的位置画出。【实验结果】
可以观察到气室及鸡胚的位置，并用铅笔画出来。【注意事项】
1.气室为透光透亮的部位，注意观察。
2.慢慢旋转鸡胚观察胚胎，随着旋转胚胎可能会有不同程度的移动，注意观察。
鸡胚的接种【实验原理】
病毒具有严格的细胞内寄生性，必须提供活的机体、组织或细胞才能使其增殖。常用的培养方法有动物接种、鸡胚培养及组织细胞培养等。
鸡胚培养方法操作简便，适用于流感病毒、痘病毒、疱疹病毒和脑炎病毒等的培养。鸡胚培养的接种方法有很多，最常用的有绒毛尿囊膜接种法、羊膜腔接种法、尿囊腔接种法和卵黄囊接种法。可根据病毒的特性，选择适宜的接种途径。流感病毒初次分离一般采用鸡胚羊膜腔接种法或尿囊腔接种法。
Ⅰ.鸡胚尿囊腔接种方法【实验器材】
1.鸡胚（已孵育9~11d）。
2.疑为流感病人的嗽液。
3.1ml注射器、5号针头、液体石蜡（以上均已灭菌）、胶布、钻子、镊子。【实验方法】
1.孵育9~11d的鸡胚，置检卵灯上检视，画出气室及胚胎位置，同时在尿囊与气室交界边缘上约1~2mm处作一标记。
2.用碘酒消毒标记部位，用消毒针钻孔，仅破蛋壳，勿穿卵膜。
3.将鸡胚直立于卵架上，注射器垂直经气室而穿入1cm即达尿囊腔，注射流感病人嗽液0.2ml。
4.接种后，用熔化石蜡封此小孔，放入37℃温箱培养40~48h可收集。流感病毒培养一般孵育40~48h即可收获。24h内死亡者为非特异性死亡，弃去。
5.解剖及收获。收获前应先将鸡胚放于4℃冰箱过夜使其血液凝固，以免解剖时出血过多。将鸡胚直立于卵架上，消毒气室部位卵壳，用无菌镊子将壳剥去，另用一无菌镊撕开壳膜及绒毛尿囊膜，用无菌毛细管吸取尿囊液，放置无菌试管中。【实验结果】
可收获得到澄清的尿囊液约5~6ml。【注意事项】
1.无菌操作，避免污染。
2.解剖时要避免出血过多。
Ⅱ.卵黄囊接种法【实验器材】
1.鸡胚（已孵育9~11d）。
2.疑为流感病人的嗽液。
3.1ml注射器、5号针头、液体石蜡（以上均已灭菌）、胶布、钻子、镊子。【实验方法】
1.取孵育9~11d的鸡胚，灯检画出气室。
2.将卵置卵架上，气室向上，用碘酒、酒精消毒气室部的卵壳。
3.用无菌锥在气室中心钻一小孔，注射器由气室小孔向胚胎位置相反方向，沿卵中轴做20°~30°角倾斜刺入3cm，即达卵黄囊内，注入待检材料0.5ml。
4.拔出针头，用石蜡封住穿刺孔。放入37℃温箱培养40~48h可收集。【实验结果】
可收获到培养液。【注意事项】
1.无菌操作，避免污染。
2.注意注射的角度及深度。
Ⅲ.鸡绒毛尿囊膜接种法
绒毛尿囊膜接种法适用于天花、牛痘、单纯疱疹等病毒的培养。【实验器材】
1.鸡胚（已孵育9~11d）。
2.牛痘苗病毒稀释液。
3.1ml注射器、5号针头、液体石蜡（以上均已灭菌）、胶布、钻子、镊子。【实验方法】
1.取孵育9~11d的鸡胚，将气室及胎位画出。
2.在人工气室的位置，用碘酒消毒后，以小砂轮磨开一个三角形的窗口，只破掉蛋壳，但不伤卵膜，另在天然气室端的中央钻一小孔。用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出使绒毛尿囊膜下陷与卵膜分离，而形成一人工气室。
3.在形成的人工气室处，将卵膜去掉，滴入牛痘苗病毒稀释液0.2ml，迅速将胶布封于三角形卵窗上，以熔化石蜡封闭气孔。
4.接种后放入37℃温箱孵育，每日观察鸡胚生活情况，培养4~5d后放入冰箱，死亡的，随时发现随时放入冰箱。
5.将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒、酒精消毒人工气室面，然后撕去胶布，将三角形窗口扩大，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑为白色的点状，有时融合成一堆或一片。
6.左手用镊子夹起绒毛尿囊膜，右手用小剪在卵壳的圆周剪下绒毛尿囊膜，放入无菌生理盐水培养皿中洗涤2次，将膜张开，可更清楚地看到膜上的牛痘斑。【实验结果】
可收获到牛痘斑。【注意事项】
无菌操作，避免污染。
Ⅳ.鸡胚羊水囊（腔）接种法【实验器材】
1.鸡胚（已孵育9~11d）。
2.疑为流感病人的嗽液。
3.1ml注射器、5号针头、液体石蜡（以上均已灭菌）、胶布、钻子、镊子。【实验方法】
1.取孵育9~11d的鸡胚，将气室及胎位画出。
2.将鸡胚竖于卵架上，消毒气室部，用无菌钻子和镊子沿天然气室的边缘和胎位靠近处开一方形（每边1cm）小窗。
3.用无菌小镊子挑去方形卵膜，用无菌吸管吸取石蜡油滴入2滴，石蜡在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明化，这样在检卵灯下可清楚地观察到整个鸡胚。
4.用无菌1ml注射器吸取0.2ml检材（如流感病毒液），针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜、羊水囊膜进入羊膜腔，注入检材0.2ml。注意穿刺注射时勿伤鸡胚本身。
5.接种完毕，用无菌胶布封口，鸡胚放于37℃温箱培养48~72h。
接种也可以不用滴加石蜡和在检卵灯下进行。用无菌的钝尖小镊子穿过绒毛尿囊膜，轻轻将羊水囊呈伞状提起，然后用注射器针头刺入，注入检材，封闭窗口。
6.接种后孵育期间，每日灯检，24h内死亡者为非特异性死亡，弃去；2~4d死亡者为特异性死亡，收获前放冰箱。
7.收获：从冰箱中取出鸡胚，碘酒消毒气室端，撕去胶布扩大窗口，用无菌镊撕去卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细吸管吸去尿囊液，左手用镊子镊住羊膜腔，右手以毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水。收获的羊水可测定病毒血凝效价及进行进一步的鉴定。
这种方法适于分离流感、腮腺炎等病毒。【实验结果】
可收获到一定量的羊水。【注意事项】
无菌操作，避免污染。
流感病毒的鉴定【实验原理】
血球凝集实验（简称血凝实验）：流感病毒包膜上有两种刺突，以疏水末端镶嵌到脂质双层中，化学成分为糖蛋白，其中一种称为血凝素（HA），另一种称为神经氨酸酶（NA）。HA可被裂解为HA1和HA2，HA1可与红细胞表面受体及宿主细胞表面受体相结合，与病毒的吸附感染有关。多种动物（人、鸡、豚鼠）红细胞表面有HA1的受体，流感病毒通过其表面的HA1与红细胞表面的受体结合而引起红细胞凝集。该实验可用于流感病毒的鉴定。【实验器材】
1.病毒尿囊液、0.5%鸡红细胞悬液、生理盐水。2.20孔U型塑料板、1ml吸管、橡皮吸头。【实验方法】
1.取一块洁净晾干的20孔U形塑料板，用标签纸做好标记，用吸管吸取生理盐水于10个孔内各加入0.2ml。在第1孔内加入已稀释成1∶5的流感病毒尿囊液0.2ml，混匀后吸出0.2ml至第2孔，再混匀后吸0.2ml至第3孔，如此稀释至第9孔，于第9孔吸出0.2ml弃去，第10孔作对照，不加病毒尿囊液（表1-13-1）。
2.每孔加入0.5%鸡红细胞悬液和生理盐水各0.2ml，摇匀，置室温45min后观察结果。表1-13-1血球凝集实验【实验结果】
1.实验现象观察：观察红细胞凝集程度。“＋＋＋＋”：红细胞均匀铺于孔底，致密呈团，边缘不整，呈锯齿状。“＋＋＋”：基本同上，但较疏松，分布面积较大。“＋＋”：红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集颗粒。“＋”：红细胞于孔底形成小团，但边缘不光滑，四周有小凝集颗粒。“－”：不凝集红细胞沉于孔底形成一圆点，边缘整齐，似纽扣状。
2.结果判断：以出现“＋＋”凝集的最高病毒稀释度为凝集效价，亦即1个血凝单位。例如，1∶320为＋＋，即为1个血凝单位，在红细胞凝集抑制实验中需用4个单位病毒血凝集，按上例1个血凝单位为1∶320，则1∶80为4个血凝单位。【注意事项】
1.用反复吹吸法稀释混匀病毒或血清时，手法要轻、稳，尽量减少气泡出现。
2.为了实验准确，加红细胞时，应从最后一孔起向前加。
3.加样完毕，可将塑料板放光滑台面上慢慢划圈摇匀，但要防止溅出。
4.观察结果时，塑料板底部垫上白纸，减少移动并按时观察。
流感病毒型别的鉴定【实验原理】
流感病毒特异性抗体和相应病毒结合后可以抑制该病毒的血凝作用，称为血球凝集抑制实验，简称血抑实验。
应用型或亚型特异性抗体（免疫血清）与新分离的流感病毒株进行血凝抑制实验，可以鉴定流感病毒的型或亚型。
也可以用已知型或亚型的流感病毒与病人血清进行血抑实验作出血清学诊断，血清学诊断必须采取病人双份血清（急性期和恢复期）进行测定，恢复期血清效价比急性期增高4倍或4倍以上才有诊断意义。【实验器材】
1.流感病毒尿囊液（4个血凝单位）。
2.抗亚洲甲型日本亚型流感病毒免疫血清。
3.抗亚洲甲型香港亚型流感病毒免疫血清。
4.0.5%鸡红细胞悬液。
5.生理盐水、20孔U型塑料板和吸管等。【实验方法】
1.取干净20孔U型塑料板两块，用标签纸做好标记。
2.每板1~9孔内各加入生理盐水0.2ml。
3.于第一板第1孔和第8孔中各加入稀释成1∶5的抗亚洲甲型日本亚型流感病毒免疫血清0.2ml，混匀后，从第1孔吸出0.2ml加入第2孔，按同法稀释至第7孔，从第7孔吸出0.2ml弃去（血清稀释度分别为1∶10~1∶640）。
4.第二板按同法加入抗亚洲甲型香港亚型流感病毒免疫血清进行稀释。
5.于每板1~7孔和第9孔中，各加入4U流感病毒血凝素0.2ml，第8孔不加流感病毒血凝素，作血清对照。
6.每板第10孔作为鸡红细胞对照孔加入生理盐水0.4ml。
7.摇匀，室温静置10min后，于两板各孔内分别加入0.5%鸡红细胞悬液0.2ml，摇匀。
8.室温静置45min后观察结果，能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度为血凝抑制效价（表1-13-2）。表1-13-2血球凝集抑制实验【实验结果】
出现红细胞凝集完全被抑制的最高血清稀释度为红细胞凝集抑制效价。比较两块板的血凝抑制效价，对新分离的流感病毒型别作出鉴定。【注意事项】
1.抗亚洲甲型日本亚型流感病毒免疫血清和抗亚洲甲型香港亚型流感病毒免疫血清只在第1孔和第8孔中加入。
2.倍比稀释直到第7孔，第8、9、10孔是对照孔。【思考题】
1.试述血凝实验和血抑实验的原理。
2.流感病毒分型和甲型流感病毒亚型鉴别的依据是什么？
3.为何甲型流感病毒引起的流感易出现大流行？（陈锦龙）
实验14 乙型肝炎病毒抗原抗体的检测
用ELISA法检测病人血清中的乙型肝炎病毒（HBV）抗原、抗体是目前临床上诊断乙型肝炎最常用的检测方法。主要检测HBsAg、HBcAg、HBeAg及其相应抗体，由于HBcAg在血清中不易检出，故通常只检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc（俗称“两对半”）。其中HBsAg的检测最为重要，可发现无症状携带者，是献血员筛选的必检指标。这里介绍ELISA法。
HBV抗原抗体的血清学指标与临床关系较复杂，必须对几项指标同时分析，还必须结合临床及肝功能综合评价，才有助于临床诊断和治疗。【实验目的】
了解和熟悉乙型肝炎的检测方法及原理。【检测程序】
取患者血液→离心的患者血清标本→ELISA法检测乙肝“两对半”→结果判定→发报告。
ELISA（夹心法）测定“两对半”【实验原理】
1.双抗体夹心法：如HBsAg、HBeAg试剂盒。
将抗-HBs（或抗-HBe）联接（包被）到聚苯乙烯微量反应板上，加入被检血清标本，若血清中含有HBsAg（或HBeAg），则在微量反应板孔内形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的抗-HBs（或抗-HBe）与复合物中的HBsAg（或HBeAg）结合，然后加入底物，酶催化底物显色，根据显色的程度进行HBsAg（或HBeAg）的定性或定量判定。
2.双抗原夹心法：如抗-HBs试剂盒。
用HBsAg包被微量反应板，加入被检血清标本，再加入酶标HBsAg，加底物显色，用以检测血清中是否有抗-HBs。
3.竞争法：如抗-HBe试剂盒。
将抗-HBe结合于固相载体上，然后同时加入被检血清标本和中和试剂（含有一定滴度的HBeAg），如果被检标本中含有抗-HBe则和固相载体上的抗-HBe竞争结合HBeAg，被检标本中抗-HBe的含量越高，竞争结合的HBeAg越多，而与固相载体上的抗-HBe结合的HBeAg量越少，加入酶标抗-HBe与已经结合到固相载体上的HBeAg量越少，加入底物显色的颜色越浅；反之，颜色则越深。
4.竞争抑制法：如抗-HBc试剂盒。
将抗-HBc结合于固相载体上，然后加入HBcAg，形成抗原抗体复合物，再加入被检血清标本和酶标抗-HBc。被检血清标本中若无抗-HBc，则酶标抗-HBc与复合物中的HBcAg结合，被检血清标本中若含有抗-HBc，则被检血清标本中的抗-HBc与复合物中的HBcAg结合，竞争性地占去了酶标抗-HBc与复合物中HBcAg结合的机会，是酶标抗-HBc与复合物中HBcAg结合的量减少。加入底物显色，根据颜色的深浅判定结果。【实验器材】
1.患者血液标本。
2.试剂盒：分别含乙型肝炎病毒HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc（试剂盒的反应板上已经包被好相应的抗原或抗体）。
3.其他：微量移液器、吸头、恒温箱、洗涤液、吸水纸和离心机等。【实验方法】
1.患者血液离心得待检血清标本。
2.打开试剂盒，取出微量反应板。在微量反应板上依次做好标记HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc各3孔。
3.在第一排中，依次向HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc孔加入100μl待检血清标本。
4.在第二排中，分别依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc1滴阳性对照血清。
5.在第三排中，分别依次加入HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc1滴阴性对照血清。
6.分别向各孔加入相应的酶结合物1滴，振荡摇匀，置37℃恒温箱30min。
7.取出后用洗涤液洗板5次，每次冲洗后拍干。
8.加入底物A、B各1滴，置37℃恒温箱15min。
9.取出后加终止液1滴。
10.根据颜色判定结果。【实验结果】
1.先观察阳性和阴性对照孔结果。
2.与阳性对照结果相同的判定为阳性，与阴性对照结果相同的判定为阴性。【注意事项】
实验标本为患者血液标本，注意无菌操作避免污染，接触到患者血液标本的器材都要统一放置废物缸内，统一灭菌。【思考题】
1.目前乙型肝炎病毒学诊断的主要依据是什么？
2.抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc的检出有何意义？（陈锦龙）
实验15 真菌的形态与结构的观察
【实验目的】掌握真菌的形态与结构。【实验原理】
真菌是一大类细胞核高度分化，有核膜及核仁，并有完整细胞器的真核细胞型微生物。其不含叶绿素，有单细胞真菌或多细胞真菌，按无性生殖或有性生殖方式繁殖。真菌种类繁多，有10万种以上，大多数对人类有益无害，如用于酿酒、制备氨基酸、抗生素等。引起人类疾病的真菌仅有300余种，包括致病性真菌、条件致病性真菌、产毒以及致癌真菌。
真菌比细菌大几倍甚至几十倍。结构比细菌复杂，按形态可分为单细胞真菌和多细胞真菌两大类。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，常见于酵母菌或类酵母菌。对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。多细胞真菌有菌丝和孢子，且相互交织成团，称丝状菌（fila-mentous fungus），又称霉菌（mold）。菌丝和孢子的形态不同，可作为真菌诊断的依据。【实验器材】
1.单细胞真菌：白假丝酵母菌（革兰染色）。2.多细胞真菌：皮肤癣菌（乳酸酚棉蓝染色）。【实验方法】
高倍镜下观察真菌细胞的形态、排列、染色性，注意观察菌丝和孢子的形态。【实验结果】
1.单细胞真菌可观察到白假丝酵母菌为革兰阳性单细胞真菌，菌体呈卵圆形、大小不等、染色不均，可见到假菌丝呈藕节状，丛生的芽生孢子呈圆形或卵圆形。
2.多细胞真菌观察：（1）菌丝：真菌丝；假菌丝；有隔菌丝；无隔菌丝；气中菌丝；营养菌丝；球拍样菌丝；鹿角样菌丝；螺旋样菌丝；梳状菌丝和结节状菌丝等。（2）孢子：大分生孢子；小分生孢子；厚膜孢子；关节孢子和孢子囊孢子等。【注意事项】
1.观察时注意鉴别假菌丝与真菌丝。
2.注意观察不同菌丝和孢子的形态。【思考题】
1.试述单细胞真菌的形态与结构。
2.试述多细胞真菌的形态与结构。（陈锦龙）
实验16 真菌的培养
【实验目的】1.掌握真菌培养的方法。
2.掌握观察真菌菌落的方法。
一、沙保弱（Sabourand）琼脂培养基接种法【实验原理】
大多数真菌对营养要求不高，培养基有沙保弱琼脂培养基、麦芽糖培养基、葡萄糖培养基、玉米粉培养基等。沙保弱琼脂培养基中有葡萄糖、蛋白胨及琼脂可以满足真菌生长的营养要求，为真菌培养最常用的培养基。培养基为弱酸性（pH4.6~6.0），生长最适温度为22~28℃（浅部真菌），某些深部病原性真菌在37℃生长较好，需要较高的湿度和氧气。生长缓慢，需要培养1~2周才出现典型菌落，培养检查是鉴别真菌的重要方法。【实验器材】
待培养物、75%酒精、无菌生理盐水、沙保弱培养基。【实验方法】
将皮屑、甲屑、毛发标本经75%乙醇浸泡2~3min以杀死杂菌，无菌生理盐水洗净后接种于沙保弱培养基上，置室温或37℃温箱培养，每2~3d观察一次。【实验结果】
真菌种类极多，形态各种各样，但就菌落形态来说，一般可分为3种类型：酵母型、类酵母型菌落及丝状菌落。各种菌落的特点如下：
酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落形式。菌落表面光滑、柔软而致密，类似一般细菌菌落。显微镜下可见圆形或椭圆形芽生孢子，如酵母菌、隐球菌。
类酵母样型菌落：有部分单细胞真菌的菌落外观性状同酵母型菌落，显微镜下可见菌落表面在出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长，伸入培养基中，这种菌落成为类酵母菌样型落，如白假丝酵母菌。
丝状菌落：是多细胞真菌的菌落形式。由许多疏松的菌丝体构成，菌落呈棉絮状、绒毛状或粉末状。可看到伸向空间的气生菌丝和伸入到培养基深部的营养菌丝。菌落正背两面可显出各种不同的颜色，如白色、黄色、红色、紫色、绿色和灰色等。丝状菌落的形态、结构与颜色常作为鉴定真菌的参考，如毛霉菌、皮肤丝状菌。【注意事项】
观察完的真菌培养物要集中高压灭菌，避免污染环境。
二、小培养法【实验原理】
小培养法可以在显微镜下直接观察，避免取样时破坏菌丝体和孢子的形态，可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子等），还可以随时观察真菌生长发育情况，有利于菌种的鉴定。
玻片法【实验器材】
待培养物、平皿、载玻片、盖玻片。【实验方法】
在无菌平皿中先倾注10~15ml沙保弱培养基，待凝固后，无菌操2作将琼脂切成约1cm的方块，再将琼脂块移放在灭菌的载玻片上，然后在小块培养基四边接种已分纯的真菌菌种，盖上无菌盖玻片，移入有一定湿度的无菌平皿内，置22~28℃孵育。【实验结果】
动态观察生长过程，根据菌丝和孢子的特点鉴定真菌类别。【注意事项】
无菌操作，避免污染。
钢圈法【实验器材】
白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环（带有缺口）、石蜡。【实验方法】
1.用无菌镊子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈即被固定于载玻片与盖玻片之间。
2.用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。
3.培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。
4.置湿盒内，室温或37℃下培养2~3d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等特征，一般7d左右即可长好。【实验结果】
在显微镜下连续观察生长情况，可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。【注意事项】
无菌操作，避免污染。【思考题】
1.如何进行真菌的人工培养？
2.真菌的分离培养方法与细菌的分离培养方法有何不同？（陈锦龙）
实验17 其他微生物的形态学观察
一、支原体的形态学观察【实验目的】
掌握支原体的形态特征。【实验原理】
支原体（mycoplasma）是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。
支原体首先由Nocard等在1898年从牛传染性胸膜肺炎的胸腔积液中发现，当时命名为牛胸膜肺炎微生物（PPO）。1937年由Dienes首先从人体分离出此微生物，1967年，被正式命名为支原体。
支原体分布广泛，存在于人、植物、动物、组织培养物以及土壤、污水等中。支原体没有细胞壁，归属于柔膜体纲支原体目支原体科，下分4个属。4个属中和人类疾病密切相关的是支原体属和脲原体属，支原体属有119种，脲原体属有7个菌种。从人体中分离出来的支原体有16个菌种，其中对人类致病的主要是肺炎支原体（M.pneumoniae）和解脲脲原体（U.urealyticum）。
支原体体积微小，大小一般为0.3~0.5μm，可通过滤菌器。无细胞壁，不能维持菌体的固有形态，故形态上呈高度多形性，有球形、杆形、丝状和分枝状等。革兰染色阴性，但不易着色。常以Giemsa染色为佳，染成淡紫色。【实验器材】
解脲脲原体电镜照片。【实验方法】
观察解脲脲原体电镜照片。【实验结果】
观察解脲脲原体的形态特征。
二、立克次体的形态学观察【实验目的】
掌握立克次体的形态特征。【实验原理】
立克次体（rickettsia）是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，与节肢动物关系密切，是引起斑疹伤寒、羌虫病、Q热等传染病的病原体。其名称是为纪念首先发现而后在研究中不幸牺牲的美国病理学家立克次（Howard Taylor Ricketts）而命名的。
立克次体的共同特点 ：①多引起自然疫源性疾病；②与节肢动物关系密切，以其作为传播媒介或储存宿主；③大小介于细菌和病毒之间；④多形态性，主要为球杆状；⑤专性细胞内寄生。
对人类致病的立克次体主要包括四个属：即立克次体属（Rickettsia）、柯克斯体属（Cox-iella）、罗沙利马体属（Rochalimaea）与埃立克体属（Ehrlichia）。在我国分布的主要致病立克次体有：普氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、Q热柯克斯体及羌虫病立克次体等。
球杆状或呈多形态性，大小介于细菌和病毒之间［（0.3~0.6）μm×（0.8~2.0）μm］，革兰染色阴性，但不易着色。常用Giemsa及Giemenez法染色。用Giemsa法立克次体被染成紫蓝色，用Gimenez法立克次体被染成红色。立克次体在感染细胞内排列可呈单个、成双或聚集成团排列。在宿主细胞内，不同立克次体的寄居部位并不同，如普氏立克次体分散分布于胞浆中，羌虫病立克次体则多成堆排列分布于核旁，斑点热立克次体可分布于胞浆或核内，Q热柯克斯体则在胞浆空泡（吞噬溶酶体）内繁殖。立克次体的结构及化学组成与革兰阴性菌相似。【实验器材】
1.羌虫病立克次体（Giemsa染色）玻片标本。2.普通光学显微镜。【实验方法】
显微镜下观察羌虫热立克次体形态特征。【实验结果】
可观察到细胞核旁成堆排列染成紫蓝色的羌虫病立克次体。
三、衣原体的形态学观察【实验目的】
掌握衣原体的形态特征。【实验原理】
衣原体（chlamydiae）是一类严格细胞内寄生、能通过细菌滤器、并具有独特发育周期的原核细胞型微生物。
衣原体的共同特性：①革兰阴性，圆形或椭圆形；②有细胞壁，但无肽聚糖，只含微量胞壁酸；③严格细胞内寄生，有独特的发育周期，以二分裂方式繁殖；④含有DNA和RNA两种核酸；⑤有核蛋白体和独立的酶系统；⑥对多种抗生素敏感。
衣原体广泛寄生于人、哺乳动物及禽类。对人类致病的衣原体有沙眼衣原体、肺炎衣原体及鹦鹉热衣原体。衣原体感染较常见，发病率有上升趋势，应给予重视。
在普通光学显微镜下观察衣原体可见两种大小、形态各异的颗粒。一种为小而致密的颗粒，称为原体（elementary body，EB）；一种为大而疏松的颗粒，称为网状体（reticulate body，RB）。原体具有强感染性，Giemsa染色呈紫色，Macchiavello染色呈红色。网状体，亦称为始体，以二分裂方式繁殖，为繁殖型，无感染性，Macchiavello染色呈蓝色。【实验器材】
沙眼衣原体的包涵体（Giemsa染色）照片。【实验方法】
观察沙眼衣原体的包涵体照片。【实验结果】
可观察到沙眼衣原体的包涵体的形态特征。
四、螺旋体的形态学观察【实验目的】
掌握螺旋体的形态特征。【实验原理】
螺旋体（spirochete）是一类运动活泼、细长、柔软、弯曲呈螺旋状的原核细胞型微生物。基本结构与细菌相似，有细胞壁、核质，在细胞壁与外膜之间有轴丝，轴丝的屈曲与收缩使螺旋体能自由活动，繁殖方式为二分裂，对抗生素敏感。
螺旋体分布广，种类多。依其抗原性、螺旋数目、大小与规则程度及两螺旋的间距不同分为五个属，其中对人和动物致病的有三个属：钩端螺旋体属、疏螺旋体属和密螺旋体属。
钩端螺旋体（简称钩体）种类多，包括问号状钩端螺旋体和双曲钩端螺旋体。问号状钩端螺旋体能引起人和动物的钩端螺旋体病（钩体病），为人畜共患病，呈世界性分布，我国绝大多数省份有不同程度的流行，南方各省最为严重。
钩体大小长约6~20μm，宽0.1~0.2μm，其螺旋盘绕细致、规则而紧密，一端或两端弯曲呈钩状，常呈“C”、“S”或“8”字形。暗视野显微镜下可见钩体像一串发亮的细珠粒，运动活泼，革兰染色阴性，不易着色。常用Fontana镀银染色，染成棕褐色。也可以在暗视野显微镜下观察钩体的形态和运动情况。【实验器材】
1.钩端螺旋体（镀银染色）玻片标本。
2.普通光学显微镜。【实验方法】
显微镜下观察钩端螺旋体形态特征。【实验结果】
可观察到被染成棕褐色，呈“C”、“S”或“8”字形的钩端螺旋体。【思考题】
1.试述支原体与细菌L型的区别。
2.试述羌虫病立克次体的致病性。
3.试述衣原体的发育周期。
4.试述钩端螺旋体的致病性。
5.试述梅毒螺旋体的致病性。（陈锦龙）
第二篇 寄生虫学实验
第一章 实验总则
一、实验目的
寄生虫学和寄生虫学实验是医学专业的基础课程之一，它既是一门形态科学，又是一门实验性科学。本学科实验的主要目的是：①加深理解、巩固和掌握本学科的基本理论知识；②掌握寄生虫学实验的基本技能，即通过做好观察标本及操作，牢固掌握常见寄生虫，特别是与诊断有关的形态特点及其实验诊断技术。
二、光学显微镜的使用与维护
寄生虫学实验最常用的仪器是显微镜，因此应在生物学、组胚学的学习基础上进一步熟练掌握对显微镜的使用与维护。
1.显微镜使用的方法
先将电源打开，再用聚光器调节光的强度，然后将待观察标本置于载物台上用低倍镜观察，以粗螺旋调节至物像可见，以细螺旋调节至物像清晰。需用高倍镜观察时，应将待观察的部分移向视野中央，再转换高倍镜。如要求用油镜观察，应先在低倍镜下找到观察的物体平面，滴加香柏油，然后转油镜观察。需指出的是：因高倍镜和油镜对光线要求更强，所以要做相应调节。调节部件主要是聚光器（上调光增强，下调光变弱）、光阑（开大则亮，缩小则暗）和光源。
2.镜下观察标本的方法
为保证被观察的标本不遗漏，必须按一定的顺序进行观察。高倍镜下观察含粪、尿等排泄分泌物时，应加盖盖玻片，以免污染镜头。
3.维护的方法
显微镜是一种较贵重的仪器，保养不好将造成损失并影响观察标本的效果和工作效率。因此，应正确进行保养：①从镜柜中拿出或放入时，应把握好反光镜，以防掉落损坏；②镜头不干净或污染有镜油时，可用拭镜纸轻擦，绝对不能用手或粗布擦拭，以防损坏镜头或沾染油污；③接物镜或接目镜不得随便拿出或卸下，以防灰尘落入镜筒内；④使用完毕，应将物镜台上的标本取下，已使用油镜的，应用少量擦镜剂拭擦镜头；降下聚光器，把接物镜转成“八”字形，然后放入镜柜。
三、生物学绘图原则
对寄生虫标本绘图，需按照生物学绘图的原则，这是寄生虫学基本技能训练的内容之一。进行绘图前应仔细观察标本，在标本特征认识的基础上，再下笔描绘，力求做到真实准确。同时要特别注意以下几点：
1.图像正确
标本的外形和内部结构的形象要符合实际。
2.比例正确
标本的长宽，内部结构的位置和比例，以及整体安排要恰当。
3.色彩正确
绘蠕虫虫卵和虫体图要求为点线图（以线和点构成轮廓图），不得用涂阴影的方法做图。线条要光滑，无重叠现象，点要细小、均匀。一般用黑色铅笔，对某些原虫则按染色标本的实际颜色作图。
4.标字规格
标字是说明标本结构的方法，一律用平行线引出后标字。
5.注释准确
在所画图的正下方，需注明所画标本的准确名称及观察该标本时所用的放大倍数。
四、显微镜测微尺的使用（参考）
显微镜测微尺是用来测量在镜下所见物体大小的方法，检验人员应具备使用测微尺的基本技能。
1.材料（1）物镜测微尺：又称物尺或校正尺（为一片中央具有刻度的标尺，全长1mm，划分为10大格，每大格又分10小格，每1小格长0.01mm，仅作校正用。）（2）目镜测微尺：又称目尺（为一直径约为2cm的圆形玻片，其上刻有0~100的刻度，分成10大格每格又分10个小格）。目尺在使用时被放在目镜的光阑上。
2.校正目尺的格值（1）将物尺置于镜台上，先用低倍镜在较暗的光线下找物尺上的标尺，然后，移动物尺，使目尺的刻度与物尺的左端刻度完全相重叠。此时，从右边找完全相重叠的刻度，记录两标尺在重叠区范围内各多少格数。对高倍镜也应作同样的校正。（2）应用以下公式计算目尺的每格长度（格值）：（格尺单位由mm转为μm，将数值×1000即可）
3.测量标本
为了减少测量误差，应对每一目尺的格值测量三次，求其平均值。此外，镜上目尺如要用在另一显微镜测量时，必须重新校正。用已校正格值的目尺即可测出镜下物体的大小。例如：当用低倍镜测出某种寄生虫卵的长度为目尺的4格，而已知每格等于15μm时，则该虫卵长度为15μm×4＝60μm。
五、寄生虫标本的类别和实验方法（一）标本类别与观察方法
寄生虫标本一般分为大体标本（福尔马林固定标本或浸制标本）、针插标本和玻片标本（包括封片标本和染色标本）。观察时应分别采用不同的方法：
1.大体标本
主要为较大的寄生虫虫体及其所引起的病理标本，可用肉眼或放大镜观察，观察时首先要辨认是何种寄生虫、何阶段，然后仔细观察其形态、大小、颜色和结构，结合致病与诊断，达到系统掌握。如为
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