作者：李云庆,吕国蔚
出版社：人民卫生出版社
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简明神经生物学实验技术手册试读：
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图书在版编目(CIP)数据
简明神经生物学实验技术手册/李云庆，吕国蔚主编．—北京:人民卫生出版社，2017
ISBN 978-7-117-24249-3
Ⅰ.①简… Ⅱ.①李…②吕… Ⅲ.①人体生理学-神经生理学-实验-技术手册 Ⅳ.①R338-33
中国版本图书馆CIP数据核字(2017)第055127号人卫智网 www.ipmph.com 医学教育、学术、考试、健康，购书智慧智能综合服务平台人卫官网 www.pmph.com 人卫官方资讯发布平台
版权所有，侵权必究!简明神经生物学实验技术手册
主 编：李云庆 吕国蔚
出版发行：人民卫生出版社有限公司 人民卫生电子音像出版社有限公司
地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号
邮 编：100021
E - mail：ipmph@pmph.com
制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司
排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司
制作时间：2018年1月
版 本 号：V1.0
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标准书号：ISBN 978-7-117-24249-3
策划编辑：兰南
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我国有一句古语总结得很好:“工欲善其事，必先利其器”。此处的“器”是指工具和方法，意思是强调工具和方法的重要性，磨刀不误砍柴工。纵观人类社会的科学发展历史，每当一种新方法和(或)设备诞生的时候，也就是该方法和(或)设备所服务学科蓬勃发展的大好时机，方法和设备的创新，是科学进步的主要推动力之一。对于神经生物学研究来说，方法的重要性也是如此。
神经生物学是近年来发展最快的生命科学领域之一。它的任务是揭示神经系统结构和工作的奥秘。20世纪以来，人们开始从各个不同的水平对神经系统进行综合探索，寻找答案。但由于揭示脑的奥秘研究的复杂性，对其研究的方法不断地提出了更高的要求，新方法也如雨后春笋般地层出不穷。熟练掌握该学科的研究方法和操作，对实验室人员和初学者来说就成了基本要求，但目前尚缺乏一册易于携带、益于学习、适于寻找、利于操作和便于掌控神经生物学研究方法的袖珍宝典。
为了满足上述需要，本书作者用简洁的文字、公式和图表，言简意赅地将生物学领域常用研究方法的原理、应用、步骤、配方、结果分析等内容编写成为袖珍使用手册。本手册的内容按照研究领域分成六个部分，分别简要介绍神经生理学、神经化学、神经组织免疫细胞化学、神经形态学、分子神经生物学和神经行为学实验方法。正是由于具备了这些特点，本手册既可供初学者学习和指导其实际操作，也可供高级技术人员参考，尤其是对那些没有神经生物学实验条件或不能全面开展实验教学单位的学生来说，通过阅读本手册的内容，便可基本了解实验过程、见到类似的实验结果、弥补教学内容和环节上的缺陷，对其学习神经生物学知识将大有裨益。
本手册中所列入的内容，均是作者们长期从事科研工作的结晶，而不是沿用他人已有的成果或著作，这更是本手册的鲜明特色。尽管如此，囿于作者的知识、水平，本手册的编写肯定存在错误和不足，恳请各位专家、同道、使用者和读者批评指正，以便使其不断完善，为促进我国神经生物学研究的发展、普及脑的知识、增强全民素质和健康水平做出贡献。编者2017年1月一、神经生理学实验(一)复合动作电位记录1.原理
神经干由许多直径不同、兴奋性不同和传导速度不同的神经纤维组成。对神经干施加最大刺激而使神经干中全部神经纤维兴奋时，可用粗电极记录到由不同纤维的动作电位共同组成的复合动作电位。当刺激电极与记录电极之间的距离足够大时，可以分辨出一系列在时间上先后不同的波峰。2.目的
(1)辨认刺激伪迹与生物信号。
(2)识别与区分复合动作电位波形。
(3)记录与测量复合动作电位参数。3.步骤(1)麻醉:
选择健康成年大鼠，4%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉，待动物麻醉后固定。(2)手术:
按常规手术方法进行颈部手术，暴露出气管，行气管插管，必要时进行人工呼吸。然后分离一侧腓神经、坐骨神经，分别安放刺激电极和记录电极。(3)调整仪器
1)刺激器:
延迟1 ms;波宽0.3～0.5 ms;频率2～5 Hz;强度根据需要调节。
2)诱发反应记录仪:
灵敏度100～200 μV/cm;高频衰减1 kHz;低频衰减2 Hz;扫描速度20 ms/cm;叠加次数32;实验中可随时根据情况进行调整。(4)实验观察
1)记录复合动作电位:
由弱渐强调节刺激强度，观察复合动作电位各波的变化。在最大刺激强度下，记录复合动作电位波形。“刺激强度”一般包括两种含义:一是刺激参数(绝对强度尺度)本身;二是用生物学指标指示的刺激效应(相对强度尺度或生物标准)。在电生理实验中，我们常用生物标准来表示刺激强度，即用刺激所引起的生物效应作为刺激强度的相对尺度，通常将引起刚可发现的(电)生理反应定为1 T，用以表示相对的生物阈值。更强的强度即以1 T的倍数表示。如果把外周神经干中的A类纤维动作电位A波中的Aα波的出现定为1 T，调节刺激强度，可以记录并计算Aβ、Aγ和C波的T值。
2)测量复合动作电位中各波的参数
a.潜伏期:首先分辨清楚刺激伪迹与动作电位波形，然后根据示波器的时间基线计算出从刺激伪迹到该波起始点之间的时间，即为潜伏期。亦可计算出从刺激伪迹到该波峰顶之间的时间，称峰-峰潜伏期。
b.振幅:自该波起始点到最高顶点之间的幅度，即振幅。
c.持续期:根据示波器上的时间基线，计算出从该波起始点至终止点之间的时间，即持续期。4.结果示例
见图1。(二)体感诱发电位记录(大脑皮质)1.原理
凡是外加一种特定的刺激作用于感觉系统或脑的某一部位，在给予或除去刺激时，引起中枢神经系统中产生可测出的任何电位变化都可以称为诱发电位(evoked potential，EP)。诱发电位是慢的电变化，在文献中有时也称为场电位，它不是单细胞放电，而主要由许多突触后电位总和而成。体感诱发电位(somatosensory evoked potential，SEP)系指给予皮肤或末梢神经刺激，在刺激的对侧头皮上记录到的大脑皮层电位活动。皮质体感诱发电位主要分为两大部分:“初发反应”，亦称“主反应”，其潜伏期较短、幅度较低，波形呈先正后负的电位变化;在主反应之后是一个潜伏期较长、幅度较高的正电位变化的“次发反应”，亦称“次反应”。有时在出现主反应或次反应之后，还会出现后发放或缓慢的电位变化。图1 大鼠坐骨神经复合电位记录(张勇等供图)2.目的
(1)观察大脑皮质SEP的记录过程。
(2)辨认大脑皮质自发电位与诱发电位。
(3)识别与区分SEP各波形。
(4)记录与测量SEP各参数。3.步骤(1)麻醉:
选择健康成年家兔，经耳缘静脉注射4%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)，待动物麻醉后固定。(2)手术
1)选定记录部位:头顶部正中切开皮肤，暴露颅骨。在顶骨矢状缝左侧旁开0.3 cm、冠状缝后0.5 cm处安放一个针形记录电极，在距记录电极2～3 cm处安放一个针形参考电极，分别用牙托粉固定。
2)按常规手术方法行气管插管术，暴露右侧腓神经，安放刺激电极。
3)将气管插管的一端与呼吸机相连，经耳缘静脉注入1%筒箭毒(0.1 ml/kg体重)制动，进行人工呼吸。
4)诱发反应记录仪开机预热5 min。①按ERASE键清除幕上的波形。②按CHANNETSELECT 1键及2键，选择所使用的输入通道。③按ELEC和MANNUL程序选择键，选择调整参数。灵敏度:200 μV/小格;高频衰减:1 kHz;低频衰减:2 Hz;扫描时间:20 ms/小格;叠加次数:32次。实验中可随时根据情况进行调整。
5)实验观察:①按MON键，此时屏幕上显示监视的输入波形，即自发脑电活动。②按STIM START键，选择刺激触发扫描状态。③按ANALYSIS START键，如果刺激触发选择为内触发时，则即刻开始叠加。如果选择外触发，则需按刺激器的触发开关。④叠加完毕，按STORE键保留，在贮存该电位前后或叠加期间均可随时按POSITION的↑或↓键，及SENS键，调整基线位置及电位幅度。
6)测量SEP各参数
a.潜伏期:按LATENCY CURSOR开关键，将屏幕上显示出两条纵向游标，分别移至待测定的两点(伪迹及待测波的波峰)，两条游标之间所经历的时间即为潜伏期数值。如果需测定多个潜伏期，则按RESET键，这时在屏幕的右下方呈现一标记，说明该数值已被贮存。最多可贮存4个数据。
b.振幅:按AMPLITUE CURSOR开关键，将屏幕上显示两条横向游标，分别移到待测波形的起始和最高点，屏幕上即显示出两条游标之间的数值，即该波振幅。
c.持续期:按LATENCY CURSOR开关键，将两条纵向游标移至待测波的起始点和终止点，屏幕上即显示出两条游标之间的数值，即该波持续期。测量按RECORD键将SEP记录下来。4.结果示例
见图2。(三)在体神经元动作电位的细胞内记录(脊神经节)1.原理
应用细胞内记录技术可获得静息膜电位、动作电位等一系列反映单一细胞电生理学特征的参数，并对之进行研究。细胞内记录通常是用由硬质玻璃管拉制的玻璃微管来进行的。玻璃微管尖端直径一般等于或小于1 μm，其中充以3 mol/L KCl，阻抗约50～100 MΩ。进行在体细胞胞内记录时，通常需将穿刺部位表面的软脑(脊)膜去掉一小块;对于坚韧的脊神经节结缔组织鞘膜性结构，有时需用胰蛋白酶或透明质酸处理，使鞘膜软化透明后，始能进行微电极穿刺。2.实验背景
脊神经节神经元属假单极神经元，从胞体发出一个突起，在胞体附近盘曲然后呈“T”形分支，一支走向中枢(中枢突)，另一支分布到外周组织(周围突)，末梢形成感受器。研究表明，脊神经节神经元的周围突或中枢突上传导的神经冲动进入或通过胞体，因此，刺激中枢突或周围突引起的动作电位可以在脊神经节神经元胞体记录到。本实验用玻璃微电极记录电刺激外周神经和自然刺激感受野引起的脊神经节神经元的动作电位。图2 家兔大脑皮质躯体感觉诱发电位(张勇供图)3.目的
(1)学习用玻璃微电极进行细胞内记录的方法。
(2)了解自然刺激感受野的方法。
(3)观察脊神经节神经元的动作电位。
(4)了解脊神经节神经元对躯体与内脏刺激的反应。4.步骤(1)麻醉与手术
1)选用健康成年Wistar大鼠，性别不限。4%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔注射麻醉，行气管插管术。
2)暴露S～S脊神经节和同侧阴部神经、盆神经。暴露的脊神经12节及外周神经周围滴加温液状石蜡。
3)腹腔注射0.1%筒箭毒(2 mg/kg体重)，接呼吸机，进行人工呼吸。
4)用脊髓固定夹固定腰骶髓。(2)调试仪器与安放电极
1)将刺激器、微电极放大器、示波器、x-y记录仪开机预热。示波器灵敏度:20 mV/cm，扫描速度:5 ms/cm或10 ms/cm。
2)将刺激电极分别置于阴部神经和盆神经，记录用的玻璃微电极(尖端直径＜1 μm，内充3 mol/L KCl溶液，电阻20～40 MΩ)固定在电极架上，参考电极刺入腰部肌肉。
3)用油丝镊子小心、仔细地剥离脊神经节表面的被膜，将微电极缓慢推至脊神经节表面，连接好刺激系统与记录系统，调节微电极放大器的高频补偿，测量电极电阻。5.实验观察(1)脊神经节神经元对外周神经电刺激的反应:
以强度为2 T、波宽0.3 ms、频率为1 Hz的电脉冲分别刺激阴部神经和盆神经。用步进微电极推进器将记录电极由脊神经节表面以1 μm/步的步幅向下推进，最深到脊神经节表面下100 μm，寻找被激动的脊神经节神经元，观察其动作电位波形，并测其潜伏期、阈值、传导速度。(2)脊神经节神经元对感受野自然刺激的反应:
刺激电极置于感受野，以1 Hz、0.3 ms、2 T的电刺激感受野，寻找有诱发反应的神经元，观察到反应后，停止电刺激。对感受野区域分别用毛刷轻刷毛发、无齿镊子和有齿镊子夹皮肤进行自然刺激，观察脊神经节神经元的反应。6.注意事项
(1)手术过程中尽量减少对神经的损伤，剥离脊神经节被膜时避免损伤神经元(神经元聚集于脊神经节的表面)。
(2)记录过程中，用温液状石蜡保护好脊神经节及神经表面;注意动物的呼吸情况。7.结果示例
见图3。图3 大鼠脊神经节神经元对单脉冲电刺激阴部神经和盆神经的多发反应Pu:阴部神经;Pe:盆神经;校正:10 ms，20 mV(Lu and Liu，1996)(四)细胞外记录——丘脑腹后外侧核的电活动1.原理
细胞放电产生细胞外电流，从膜的静息区流向活动区，用细胞外电极能记录到这种间质性电流。神经元发放的幅度是微电极尖端离活动神经元距离的函数。细胞外记录时，一般约为0.1～20 mV，变化不超过 ±5%。锋电位的形状和极性取决于微电极与活动神经元之间的距离、微电极与神经元各部分的相对位置，以及微电极的直径。持续时间1.0～1.5 ms的锋电位与胞体的兴奋有关;而持续0.5 ms者则与轴突兴奋有关，持续时间更长的、达到15～20 ms的电位一般视为树突电位。2.实验背景
丘脑内侧部分在感觉整合中的作用，已得到了深入的研究，而丘脑外侧部分，特别是特异性体感核对痛信号与制痛信号的整合作用还缺乏系统性的研究。本实验应用玻璃微电极记录丘脑腹后外侧核(nucleus ventralis posteriolateralis，VPL)神经元单位电活动，观察外周不同传入纤维兴奋对该神经元的影响。3.目的
(1)观察VPL的自发、诱发电活动。
(2)不同类别神经纤维兴奋对VPL电活动的影响。4.步骤(1)手术:
选用2.5～3.5 kg的健康家兔，性别不限，用1%氨基甲酸乙酯和1%氯醛糖混合液经耳缘静脉轻度麻醉(5 ml/kg体重)。暴露大脑皮质的有关区域，做气管插管、一侧颈静脉插管术。暴露一侧下肢腓神经，注射肌松剂，行人工呼吸。兔头固定于定位仪上，按照Sawyer图谱，标定VPL坐标。剪开硬脑膜，用琼脂封盖。(2)安放电极:
将充灌好3 mol/L KCl溶液的玻璃微电极进行尖端处理，并固定在电极移动架上。轻轻推进微电极，使其尖端接触在琼脂表面。将参考电极刺入皮肤切口处。在皮质记录电极对侧的腓神经上安置刺激电极与记录电极各一对。(3)调整仪器:
连接好刺激系统与记录系统，调整微电极放大器的高频补偿，并测量微电极内阻。(4)观察
1)VPL自发电活动:用微电极推进器将玻璃微电极按照预定的5个轨道(分别为Sawyer图谱的P4.1、L4.2;P4.1、L5.0;P4.9、L5.1;P4.9、L4.3 和 P4.5、L4.7)以5 μm的步进间距推进，仔细观察有无放电，并注意放电的振幅、频率和潜伏期。
2)VPL的诱发电活动:调节刺激器，输出1 Hz、波宽0.3 ms的单个方波脉冲。在腓神经远心端安放刺激电极，腓神经近心端安放记录电极。调节刺激强度，使腓神经动作电位上出现Aα成分。此时，仍按上述5个轨道，以5 μm的步进间距向下推进微电极，寻找对肢体神经刺激产生诱发放电的单位。观察诱发放电的振幅、频率和潜伏期。同上，调节刺激强度，使腓神经动作电位出现Aαβ波、Aδ波时，观察诱发放电的振幅、频率和潜伏期。
3)调节放大器与示波器，标定标准电压。5.结果示例
见图4。(五)全细胞记录——缺氧预适应脑提取液对ATP敏感性钾电流的作用1.原理
与电极相连的玻管如与玻管相接触的细胞膜牢牢地封接在一起，玻管下面的一小片膜即可被隔离，玻管电极电路中流动的电流即不致漏出，加到膜片上的电流也只能这样流动。这种极高的封接电阻可以精确地测定小片膜的电流，并能精确地控制该片膜区的电位梯度，从而可满足电压钳实验的基本要求。在膜片高阻封接的基础上，稍给负压，吸破膜片，即形成全细胞记录模式。由于封接电阻极高，系统的噪声也因而变得极低，从而大大提高分辨率。图4 家兔丘脑腹后外侧核诱发放电形式A.示单串(短潜伏期)放电;B.示双串(短及长潜伏期)放电;两图底线为自发放电，箭头示伪迹。校正:A:200 ms;B:400 ms(吕国蔚、于昌，1981)2.实验背景
缺血/缺氧预适应是指通过事先短暂的重复轻度缺血/缺氧动员机体内在的防护能力，从而对随后更为严重的缺血/缺氧损伤产生强大的保护作用。作为一种更积极有效的防治手段，预适应机制已成为当前抗缺血/缺氧研究的一大热点。ATP敏感性钾通道(K)广泛分布于ATP各种可兴奋细胞上，并在这些组织的生理及病理活动中发挥重要的调节作用。K在［ATP］或［ATP］/［ADP］正常或升高时处于关ATPiii闭状态;在［ATP］或［ATP］/［ADP］降低时开放。由于它的这种iii特性，使其将细胞的代谢活动与细胞的电活动联系起来，从而使机体的兴奋性水平和代谢水平相互协调，增加了机体的适应能力。因而它在缺血/缺氧及其预适应中的作用颇受关注。
海马是中枢神经系统内对缺氧最为敏感的部位之一。本实验在急性分离的大鼠海马神经元上应用膜片钳全细胞记录模式，研究了NaCN、腺苷(adenosine，Ado)和缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对全细胞钾电流的影响，并以K的特异性阻断剂格列本脲ATP(glibenclamide，GLi)为工具药鉴定其中是否含有K电流成分，由ATP此探讨K在脑缺氧及其预适应中的作用。ATP3.目的
(1)掌握膜片钳记录的原理，了解膜片钳记录的几种常规模式。
(2)熟悉膜片钳记录全细胞记录模式。
(3)了解缺氧预适应的离子通道机制。4.步骤(1)小鼠脑匀浆上清液的制备:
成年昆明小鼠(体重18～22 g)，称重后置于经过标定的含新鲜空气的广口瓶内，以橡皮塞密闭。待小鼠出现喘呼吸、翻正反射消失，计时并立即取出，转移至另一相同容积含新鲜空气的广口瓶内密闭观察。如此重复4次。1次和4次缺氧小鼠(H，H)以及作为对照的未经14缺氧小鼠(H)断头取脑。每个鼠脑放入2 ml 0℃浴槽液中，低温条件0下用超声波组织细胞粉碎机制成脑匀浆。4℃冷冻离心(15 000 r/min，30 min)。取上清液，冷藏备用。(2)大鼠海马神经元的酶-机械联合法急性分离:
将10～15天的SD乳鼠快速断头取脑，置于0℃人工脑脊液(ACSF，mmol/L:NaCl 126、KCl 5、CaCl2、NaHCO 26、23NaHPO1.25、MgSO2、Glucose 10，以NaOH调至pH 7.4)中分出244海马，沿长轴切成约500 μm厚的脑片，放入室温(18～22℃)下的ACSF中孵育1～2 h。取少量脑片置于含0.1%(1 g/L)Pronase E的ACSF中，在32℃恒温水浴中消化20 min。以上过程中持续通以95%O+5%CO的混合气。用含10 mmol/L HEPES的ACSF冲洗3～422次。用尖端火抛光的直径分别为300 μm和150 μm的Pasteur吸管吹打成细胞悬液。经200目滤膜过滤后，滴加于事先涂有0.1%多聚赖氨酸的盖玻片上。静置20～30 min以待细胞贴附。然后以浴槽液(mmol/L:NaCl 140、KCl 5、CaCl2、MgCl1、HEPES 10、G 10、CdCl 0.3，222以NaOH调至pH 7.4)冲洗去未贴壁的细胞和因活性较差贴壁不牢的细胞以及多余碎片，再加入适量浴槽液准备记录。所有液体用前均用100%O饱和。2(3)大鼠海马神经元的全细胞膜片钳记录:
玻璃微电极经抛光后尖端直径约为1～2 μm，充灌电极内液(mmol/L:KCl 130、MgCl1、CaCl1、HEPES 10、EGTA 10、22CdCl0.3，以 KOH调至 pH 7.4)后阻抗为 2～6 MΩ。记录在18～22℃2的室温下进行。采用常规的全细胞膜片钳记录。当电极尖端与细胞膜之间形成高阻封接(大于5 GΩ)后，撤除正压稍给负压形成常规全细胞模式。信号的收集处理采用pClamp 8.0软件。信号滤波为1 kHz。命令电压A:保持电压(holding potential)设为－60 mV。命令电压从－120 mV至+100 mV，阶跃20 mV，每阶测试电压持续400 ms，然后返回保持电压位持续1 s后开始下一阶测试电压。命令电压B:保持电压设为－60 mV;命令电压从－60 mV至+40 mV，并持续100 ms以失活内向电流;然后用锯齿波从+40 mV复极化－120 mV。此段电流曲线的斜率的大小可反映膜电导的大小。(4)鼠脑匀浆上清液对海马神经元K电流的影响:ATP
以NaCN复制海马神经元化学性缺氧模型，以腺苷作为标准对照，观察H、H、H鼠脑匀浆上清液的作用。在形成全细胞记录模式并014记录到稳定的电流信号后，用自制的给药装置向记录槽内分别加入5.4 mmol/L的NaCN、10 μmol的Ado或1∶5比例的鼠脑匀浆上清液，3～4 min后记录电流变化。然后再分别向记录槽内加入30 μmol的 GLi，4 min后记录电流反应。(5)数据处理及统计学检验:
实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示。统计学处理应用SPSS统计软件包。各实验因素处理前后的比较采用配对t检验。各实验因素之间的比较采用单因素方差分析，其中均数之间的两两比较采用Neuman Keuls检验。以P＜0.05作为差异具有显著性的标准。5.注意事项
(1)中枢神经元的急性分离是膜片钳记录成功的关键。只有得到分离完整、表面光滑、活性良好、存活时间较长的神经元，才能保证以较高的成功率获得极高电阻值的封接(R≥10 GΩ)，并提高信噪比seal及延长记录时间，获得大量可用于软件精确分析的信号。急性分离出的神经元在相差显微镜下的外观是判断细胞活性的重要指标。按照我们的方法急性分离出的活性较好的神经元在相差显微镜下表面光洁，膜光滑连续，胞体部分有较强的晕光。胞质透亮，折光系数均匀，无黑色颗粒状沉着。神经元直径约为5～20 μm。神经元外形多为锥形、三角形或多边形。多数细胞带有一个较长的轴突和1～3个稍短的树突。为检验细胞活性，可在浴液中加入0.1%的台盼蓝作染色，贴壁细胞不着色，说明分离的细胞活性良好。活性较差的神经元胞质暗黑，胞体膨胀变形。胞质内折光不均匀，有黑色颗粒状沉着。胞膜不完整有断裂，不够光洁。有时轴突呈念珠状。按照我们的方法急性分离出的神经元在不给予氧饱和浴槽液灌流的条件下，活性可维持2～4 h，即在2～4 h内均可以较容易的形成高阻封接。在4 h之后，细胞活性开始下降，细胞逐渐变黑变暗，高阻封接成功率开始下降。
(2)在膜片钳记录中，应该尽量选取活性好的神经元。在细胞分离出之后2 h之内，可以达到60%(n＞1000)的高阻封接率，获得5～10 GΩ的高阻封接，形成细胞贴附式膜片钳记录。高阻封接机械稳定性良好，可维持10～30 min甚至长达1 h之久。形成高阻封接后，在细胞活性较好时，由于细胞膜弹性良好，可以很容易地以负压破膜，形成全细胞模式，同时维持很高的封接电阻。在细胞活性较好时，也很容易达成内面朝外式及外面朝外式。在屏蔽条件良好时，也能获得高信噪比的单通道信号用于软件的进一步精确分析。在急性分离出的++神经元上，可以记录到Na通道及K通道的单通道信号，也可以在全++细胞模式下记录到较大的全细胞Na电流及全细胞K电流的各种成分，这说明我们的方法较温和，比较完整地保留了神经元膜的各类离子通道及电生理学特性。6.结果示例
见图5。(六)光遗传学实验——利用光遗传学技术调控小鼠大脑皮层桶状区S1BF神经元的兴奋变化1.原理
光遗传学技术(optogenetics)是一种结合遗传学与光学技术，在复杂(如自由活动个体)的生物系统中实现定点、快速地控制某一生物学过程的技术。光遗传学技术可以通过病毒载体介导的方式在某一类型神经元表达对光敏感的异源蛋白分子。通常该蛋白含有三个结构域:一是光敏感受器结构域，能够感受不同波长的光刺激;二是跨膜结构域，使蛋白定位在细胞膜上;三是功能性结构域，它或是离子通道，或是离子泵，或是某种受体结构域。通过引入光敏感蛋白的受体或通道蛋白至特定细胞中，并经特定参数的光信号控制，光遗传学技术能够关闭或激活某一类细胞的生物学功能，从而实现在细胞、环路、器官和个体等多个层面研究该细胞及其环路的生物学机制与功能性意义。2.实验背景
躯体感觉皮层包括主要躯体感觉皮层(primary somatosensory cortex，S1)和次级躯体感觉皮层(secondary somatosensory cortex，S2)。研究发现，啮齿类动物S1中的桶状皮层(barrel field)在组织学和功能学上与颊脂垫上的触须有特异的拓扑对应关系。这为感觉皮层的可塑性研究提供了很大的优势，同时，啮齿类动物S1定位在大脑浅层，便于电生理记录和基因修饰。图5 Ado 增强外向钾电流的效应被GLi 降低(吕国蔚等，1992)3.目的
(1)掌握光遗传学实验的基本方法和步骤。
(2)观察光刺激对小鼠大脑皮层神经元的影响。4.材料(1)小鼠:
本实验选用成年雄性C57BL/6小鼠。(2)仪器:
立体定位仪、小动物麻醉机、振动切片机、脑片钳系统。(3)编码光敏感蛋白的病毒:
AAV2/9-CAMK llα-CHR2-eYFP;对照组空病毒载体:AAV2/9-CAMK llα-eYFP。5.步骤(1)动物准备:
本实验使用共计8只成年小鼠，体重20～30 g，动物处于人工调控的12 h白昼(早6点至晚6点)及12 h黑夜(晚6点至次日早6点)环境中，以稳定其生物时间节律，能够自由摄取水和食物。(2)麻醉动物:
实验小鼠用4%的异氟烷诱导麻醉，将小鼠固定在立体定位仪上并用1%的异氟烷维持，用理发器剃去颅顶部的毛发，使用红霉素眼膏涂眼以防止光线灼伤，用手术刀切开头顶部皮肤，用过氧化氢溶液清理创口暴露出前囟的位置。(3)病毒注射:
根据小鼠脑立体定位图谱选择注射区(S1BF)坐标(AP:－0.9，L:3.5，DEEP:－0.75)，用颅骨钻钻孔至硬脑膜，用微量注射器吸取120.5 μl病毒(病毒滴度为5×10GC/ml)，并将注射器调整至上述坐标，刺穿硬脑膜，缓慢注射，注射速度0.1 μl/min，共0.3 μl，注射完毕置针5 min，缓慢移去注射器，缝合伤口，将小鼠置于保温垫上直至复苏，常规饲养，注射后2～4周病毒携带的基因能够获得充分的表达。(4)脑片制作:
动物断头后迅速取出脑组织，利用振动切片机在4℃的人工脑脊液中制作离体脑片，切片厚度300 μm，辨认并分离出大脑S1BF区。(5)光刺激以及电生理记录:
用可视化膜片钳寻找清楚、表面光滑、折光性较好的黄色荧光(eYFP)阳性的神经元。在加了正压后，将记录电极移入脑片视野中，并接近事先选好的神经元，然后调整电极与神经元的相对位置，利用负压形成稳定的高阻封接。用短簇的脉冲负压使细胞破膜，稳定2～3 min，观察封接测试波形起始段与基线间的差值是否在100 pA以内，封接电阻是否大于200 MΩ，选择封接电阻稳定的神经元，迅速补偿膜电阻和慢电容，舍弃膜电阻大于30 MΩ的细胞，且在记录过程中监测膜电阻的变化。使用发射蓝色激光(473 nm)的激光刺激器刺激脑片，2频率20 Hz，脉冲持续时间15 ms，功率35 mW/mm，同时记录神经元的电生理变化。6.结果示例
见图6。(七)fMRI实验——前爪刺激引起大鼠大脑皮层血氧水平依赖的改变1.原理
血氧水平依赖的功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging，BOLD-fMRI)是一种无创性探索脑神经活动机制的方法，在人体已经进行了大量研究，包括对认知活动、静息状态、视觉、运动、神经精神疾病等方面的脑fMRI研究已经取得一系列的发现和成果，动物fMRI研究则可以实现由于伦理因素在人体不能进行的基础研究，探索生理、病理状况下内在的脑功能机制。小动物fMRI可以适用于不宜在人脑进行的研究，开拓了神经科学的新领域，使我们能更好地理解脑功能活动的生理和分子机制。图6 蓝光激活大脑皮层锥体神经元A.病毒注射位点及激光照射位置示意图;B.蓝光刺激诱发神经元内向电流;C.明视野和荧光显微镜下观察钳制神经元;D.全细胞电流钳记录表达光敏感蛋白ChR2 神经元对光刺激的反应(Urban A，et al，2012)2.实验背景
BOLD信号是与脑皮层活动相关的，电极刺激大鼠前后爪的方法已经广泛用来研究BOLD信号在躯体感觉通路，特别是感觉皮层的激活模式，这些研究结果一致地显示了刺激单侧前爪引起对侧S1的激活，激活区BOLD信号增高2.1%左右;研究也发现前爪的感觉代表区位置位于后爪的代表区前方和外侧方;利用电刺激大鼠前爪显示了小脑皮层、丘脑、S1及S2的激活。3.目的
研究刺激前爪时大鼠脑躯体感觉区功能变化。
(1)掌握大鼠脑fMRI实验的基本方法及步骤。
(2)观察刺激前爪对大鼠脑功能活动的影响。
(3)理解fMRI实验的基本参数。4.材料(1)大鼠:
本实验选用成年雄性Wistar大鼠。(2)扫描仪:
一台7T BioSpec动物扫描仪(Bruker BioSpin，Ettlinggen，Germany)，配置了1套20 cm的主动屏蔽梯度系统(200 mT/m)。(3)刺激电极。5.步骤(1)动物准备:
本实验共计使用4只成年Wistar大鼠，体重350～480 g，使动物处于人工调控的12 h白昼(早6点至晚6点)及12 h黑夜(晚6点至次日早6点)环境中，以稳定其生物时间节律，能够自由摄取水和食物。(2)麻醉动物:
大鼠用4%的异氟烷诱导麻醉，并用1%的异氟烷维持，用理发器2剃去背部4 cm的毛发，用固定环将经皮血氧分析仪的电极固定在剃除毛发的皮肤处，电极温度设定在42.5℃。为进行电刺激，电极针插入大鼠双侧前爪。经皮氧分压(TcpO)和二氧化碳分压(Tcp-CO)平稳22后，皮下注射0.5 ml美托咪定(0.05 mg/kg体重)，5 min后停止异氟烷麻醉，移去面罩，在fMRI过程中允许动物能够自由呼吸。(3)fMRI:
将采集信号的亥姆霍兹线圈固定于动物头部表面，使用耳杆、大鼠上颌固定器及胶带固定。利用梯度回波扫描方式进行扫描，扫描厚度为4.7 mm，从尾至鼻部。冠状方向通过躯体感觉区皮层S1区。参数为:回波时间TE=30 ms(回波位置35%);重复时间TR=3000 ms;带宽2BW=150 kHz;视野(field of view，FOV):(2.56×2.56)cm，矩阵像素:64×64，5张连续切片的厚度为2 mm。功能性图像获取利用BOLD对比MRI，用矩形脉冲(2.0 mA，3 Hz，0.3 ms;调节前爪的刺激，每5组刺激之间间歇45 s(15 images，TR=3000 ms)，最后是45 s的静息周期，总的实验时程长为5.75 min，每一侧大脑半球功能性活化图像采集至少两次，不同刺激之间间歇至少6 min。(4)数据分析:
扫描部位激活区域的参数用软件STIMULATE进行统计，前爪刺2激的时程用成对Student t检验。两侧大脑半球S1区每mm活化区域和BOLD信号强度的增加中位数值［ΔSIB(%)］使用软件Image J和OLDOrigin进行分析。6.结果示例
见图7。图7 电刺激大鼠前爪引起大脑皮层fMRI 的变化A.单侧刺激大鼠的前爪，可引起大鼠对侧大脑皮层躯体感觉区BOLD 活化增加;B.利用单只大鼠不同层面的SE-EPI 扫描图像叠加并与大鼠脑图谱比较，可知前爪刺激所引起的脑区活化位于大脑躯体感觉的S1 区和S2 区，活化区域的边界有时可以延伸到邻近的功能区，比如主运动皮层(M1 区)和第一感觉皮质少颗粒细胞区(SIDZ)(Weber R，et al，2006)二、神经化学实验(一)微透析法——脑内腺苷的测定1.原理
微透析技术将管状透析膜置入脑内的特定区域，用类似于脑内细胞外液组分的溶液进行持续灌流，小分子和水分子能通过半透膜顺浓度梯度进行扩布，当某些物质的浓度在半透膜的两侧存在差别时，这些物质分子就会顺浓度梯度跨膜进行扩散。由于灌流液不断地流动，透析膜的流动液体不断更新，这种浓度差始终存在。因此，透析液中就可反映出脑组织细胞外液的某些变化，利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测某些成分的含量，达到随时检测脑内具体化学物质变化的目的。2.目的
(1)学习微透析技术的原理。
(2)掌握微透析技术的基本操作。
(3)HPLC的基本操作。3.步骤(1)回收率的测定:
将透析探头置于标准腺苷溶液中，用微灌流泵(TXDTS/110)以3.0 μl/min的速度向探头内灌流Ringer液，收集透析液，用HPLC测定，观察探头对腺苷的回收率。(2)麻醉:
选择健康成年新西兰白兔，体重为2～3 kg。经耳缘静脉注射4%戊巴比妥钠(1 ml/kg体重)。(3)手术:
按常规手术方法行气管插管术。将气管插管的一端与呼吸机相连。经耳缘静脉注射1%筒箭毒(0.1 ml/kg体重)制动，进行人工呼吸。(4)透析探头的植入:
将家兔置于立体定位仪上，按Sawyer的兔脑立体定位图谱，在大脑皮质区上方的颅骨上钻一个直径约3 mm大小的小孔，移去孔内的硬脑膜，暴露大脑表面，将微透析探头通过小孔垂直插入大脑皮质(AP－1.0 mm，ML+1.0 mm，DV－3.0 mm)。(5)样品收集:
以3.0 μl/min的速度连续灌流Ringer液1 h，然后每20 min在冰盒内收集动物的脑透析液。(6)样品的测定:
收集到的透析样品直接用HPLC测定。色谱柱为ODS，125 mm×4.0 mm，5 μm;预处理柱为ODS，4.0 mm×4.0 mm，5 μm;流动相A为甲醇，B为0.01 mol/L的磷酸二氢钠，pH 5.7，A∶B=1∶6，流速为0.8 ml/min;可变波长检测器，检测波长为254 nm;柱温为30℃;进样量为40 μl。以外标法定量。4.注意事项
透析探头的关键部分是探头的透析膜，因为透析膜极易破损，所以一定要将透析膜保护好。5.结果示例
见图8。(二)突触体——缺氧对大脑皮质突触体乳酸脱氢酶透出率的影响1.原理图8 HPLC 测定透析液中腺苷的含量A.标准品;B.透析液(江传玮等，2012)
脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢的细胞膜从神经元胞体上自发断裂、封闭而形成的具有一定生物活性的亚细胞结构，称为突触体。突触体包括突触前膜、突触后膜及包围在突触前膜内的突触小泡、线粒体及许多有生物活性的胞质蛋白。突触体直径大约为0.5 μm，其中含有无数大小和外观大致一样的突触小泡和线粒体。当神经末梢断裂以后，其破裂处的膜可以重新融合形成密闭的突触体膜。乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)是突触体内标志性酶之一，研究工作中常将LDH透出率作为衡量突触体膜完整性的指标。2.目的
(1)掌握突触体的提取方法。
(2)测定缺氧对突触体LDH透出率的影响。3.仪器与试剂(1)仪器:
手术器械，离心机，匀浆器，匀浆管，试管。(2)试剂:
生理盐水，蒸馏水，0.32 mol/L蔗糖，0.8 mol/L蔗糖。4.步骤
(1)取出两只昆明小鼠的大脑皮质，迅速将其置于0.32 mol/L蔗糖(9 ml)中，进行匀浆，匀浆过程要保持低温(4℃以下)。
(2)离心(1500 g，10 min)，取上清。
(3)将上清离心(9000 g，20 min)，取沉淀。
(4)沉淀溶于5 ml、0.32 mol/L蔗糖中，然后9000 g离心，15 min。
(5)取中间层用蒸馏水稀释为原来的1/3。
(6)离心(25 000 g，20 min)取沉淀即为突触体。
(7)将突触体重新溶于4 ml孵育液中待用。
(8)取两只5 ml离心管，加2 ml孵育液及0.5 ml突触体。
(9)在其中一管中通入氮气，另一管中通入氧气。
(10)经过3 h后分别测定两管中的LDH透出率。5.注意事项
(1)突触体提取过程中要保持低温，否则突触体活性会受到破坏。
(2)匀浆过程中动作要轻柔，以避免打碎突触体膜。
(3)保持突触体渗透压的稳定。6.结果示例
见图9。图9 缺氧对小鼠大脑皮质突触体LDH透出率的影响n=15，*为与对照组有显著性差异;#表示与1 h氧气组数据有显著性差异(张勇供图)三、神经组织免疫细胞化学实验(一)免疫细胞化学染色法——面口部注射甲醛溶液后大鼠延髓背角内的FOS样阳性神经元观察1.原理
免疫细胞化学是利用免疫学抗体与抗原结合的原理以及组织化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位和定量研究的技术。因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫细胞化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫细胞化学染色的抗原通常是一种肽或蛋白质，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于表面的在空间上相邻的3～8个氨基酸残基组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的抗体，这一类抗体称为多克隆(polyclonal)抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的抗体，称单克隆(monoclonal)抗体。
由于在组织和细胞内进行的抗原抗体反应一般是不可见的，需要用标记的方法将某种标记物质或荧光素结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物质或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。用这些标记的抗体可以在组织切片上鉴别是否发生了特异的抗原抗体反应，并可对与抗体结合的抗原物质进行定位。2.实验背景
延髓背角亦称三叉神经脊束核尾侧亚核(caudal subnucleus of the spinal trigeminal nucleus，Vc)，是面口部伤害性刺激信息向中枢传递的初级门户。甲醛溶液注入组织后可引起持续性、化学性的组织损伤，现采用甲醛溶液注入皮下制成的动物痛模型来研究伤害性刺激信息的传递和调控机制。3.目的
(1)掌握形态学研究的一般步骤。
(2)学习甲醛溶液痛模型的制备方法。
(3)观察FOS样阳性神经元的形态学特点。
(4)观察面口部伤害性刺激引起的FOS样阳性神经元在Vc的分布特点。4.溶液配制
(1)将瓶装的40%甲醛溶液用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)稀释8倍，配成5%的甲醛溶液。
(2)醋酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.0)，冰醋酸(乙酸)0.58 ml，醋酸钠25.84 g，加两次蒸馏水至5000 ml。5.步骤
(1)甲醛溶液痛模型的制备:将大鼠在安静、避强光、温暖的环境中饲养36 h以上，用甲氧氟烷吸入麻醉后，在一侧口周区注射5%甲醛溶液100～150 μl，在另一侧注射等量的生理盐水作为对照。动物在3～5 min内清醒，继续在同样的环境中存活2 h。
(2)灌注、固定、取材:大鼠经戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔深麻，开胸，经左心室插管至升主动脉，先以生理盐水100 ml冲去血液，再以500 ml含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)灌注固定，持续1.5～2.0 h。取延髓尾段，于上述新鲜固定液中后4℃条件下固定4～6 h，然后将组织块放入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB中于4℃条件下脱水。
(3)切片:待组织块在蔗糖溶液中沉底后，用冷冻切片机或恒冷箱切片机横切延髓尾段，片厚30 μm，隔2张取1张，分三组收集于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中待用。
(4)免疫细胞化学染色
1)取第一组切片置入羊抗FOS血清(1∶4000)，孵育48 h(4℃);再将切片置入Biotin化的驴抗羊IgG血清(1∶300)，孵育12 h(4℃);最后将切片置入Avidin结合的辣根过氧化物酶(HRP)复合物(1∶300)，孵育12 h(4℃)。
2)用DAB(二氨基联苯胺)-硫酸镍铵法行呈色反应。步骤如下:①配制溶液:A液:Tris-HCl缓冲液(0.5 mol/L，pH 7.6)5 ml，硫酸镍铵 1.25 g;B液:DAB 25～35 mg，两次蒸馏水45 ml。②混合A液和B液，混匀后将切片移入，缓慢加入0.03%的HO，每次约加5 μl，室温下反应22约30 min，边反应边观察。
3)对照实验:取第二组切片，用正常羊血清替代羊抗FOS血清，后续步骤同前，进行对照实验。
上述抗体和复合物的稀释均用含10%正常羊血清和0.3%Triton X-100的PBS。上述各步骤间均用PBS洗片(10 min/次，3 次)。
(5)Nissl染色:取第三组切片进行Nissl染色，以便定位免疫细胞化学染色的结果。
(6)将切片裱于经明胶包被的载玻片上，晾干;经梯度乙醇脱水后，用二甲苯透明;然后用DPX加盖玻片封片。
(7)显微镜观察，胞核呈蓝黑色，而胞质和胞膜不染色的为FOS阳性神经元。6.注意事项
(1)制备甲醛溶液痛模型时，尽可能避免对动物过多来源的刺激。
(2)甲醛溶液痛模型的对照实验对于解释和分析实验结果非常重要，一定要高度重视。
(3)HO一定要缓慢加入，做到边反应边观察，以免反应的背底22过深。7.结果示例
见图10。(二)免疫细胞化学双标染色法——大鼠中缝核簇内5-羟色胺样阳性神经元表达FOS蛋白1.原理
为了研究两种物质在同一神经元或其突起和终末内的共存现象，或含不同化学物质的两种结构之间的相互关系，可以用相邻切片法或免疫组织化学染色法进行双重染色。就染色结果而言，后者比前者有更大的优越性，更有利于研究两种物质的相互关系。2.实验背景
中缝核簇是内源性镇痛系统的重要组成部分。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine或 serotonin，5-HT)是内源性镇痛系统的主要神经活性物质。以往的研究表明，5-HT在吗啡镇痛、针刺镇痛等活动中发挥重要作用。甲醛溶液注入皮下后引起持续性的组织损伤，可以制成典型的急性痛模型，现采用此痛模型来研究伤害性刺激信息的传递机制。FOS是原癌基因c-fos表达的蛋白产物，它可被包括伤害性刺激在内的多种刺激诱导表达，FOS的表达已被证实与中枢对伤害性刺激的应答有密切关系，被广泛用作研究痛信号传递通路的标记物。图10 Vc 内FOS 样阳性神经元与初级传入C 纤维终末的分布Vc 浅层内有密集的FOS 样阳性神经元和初级传入C 纤维终末(A、B);B 图为A 图中方框内的局部放大像，在FOS 样阳性神经元(▲)周围有密集的初级传入C 纤维终末(△)与之相接触。Ⅰ～Ⅲ:Vc的Ⅰ～Ⅲ层;LRt:外侧网状核;MdD:延髓网状结构背侧部;t:三叉脊束;★:血管;标尺:A=350 μm;B=70μm(王智明等，1996)3.目的
(1)掌握免疫细胞化学双标染色技术。
(2)学会甲醛溶液痛模型的制备方法。
(3)观察中缝核簇内5-HT样阳性神经元与FOS样阳性神经元之间的关系。4.步骤
(1)甲醛溶液痛模型制备:将大鼠在安静、避强光、温暖的环境中饲养36 h以上，用甲氧氟烷吸入麻醉后，在双侧口周区各注射10%甲醛溶液100～150 μl。可将等量生理盐水注入正常动物双侧口周区皮下进行对照。动物在3～5 min内清醒，继续在同样的环境中存活2 h。
(2)灌注、固定、取材:大鼠经戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔深麻后，开胸，经左心室插管至升主动脉，先以生理盐水100 ml冲去血液，再以500 ml含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)灌注固定，持续1.5～2 h。取脑干，于上述新鲜固定液中后固定4～6 h(4℃)，然后将组织块移入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB中(4℃)。
(3)切片:待组织块在蔗糖溶液中沉底后，用冷冻切片机或恒冷箱切片机横切脑干，片厚30 μm，隔2张取1张，切片分三组收集于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中待用。
(4)免疫细胞化学染色
1)取第一组切片置入兔抗FOS血清(1∶1000)和羊抗5-HT血清(1∶1000)的混合液，室温孵育18～24 h。
2)将切片置入马抗兔IgG血清(1∶100)和Biotin标记的驴抗羊IgG(1∶100)的混合液，室温孵育4 h。
3)将切片置入兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(peroxidase-antiperoxidase，PAP)(1∶200)溶液中，室温孵育2 h。
4)葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法行呈色反应。步骤如下:①A液:醋酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.0)25 ml，硫酸镍铵1.25 g;B液:DAB 25～
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