发酵工程(txt+pdf+epub+mobi电子书下载)

作者：蒋新龙

出版社：浙江大学出版社

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发酵工程试读：

1.1.1发酵与发酵工程的定义

发酵（fermentation）的英文术语最初来自拉丁语“fervere”（发泡、沸涌）这个单词。它是指酵母菌作用于果汁或发芽谷物，产生二氧化碳的现象。被称为微生物学之父的法国科学家巴斯德（Louis pasteur）第一个探讨了酵母菌酒精发酵的生理意义，将发酵现象与微生物生命活动联系起来考虑，并指出发酵是酵母菌在无氧状态下的呼吸过程，即无氧呼吸，是生物获得能量的一种方式。也就是说，发酵是在厌氧条件下，原料经过酵母等生物细胞的作用，菌体获得能量，同时将原料分解为酒精和CO2的过程。从目前来看，巴斯德的观念还是正确的，但也不是很全面，因为发酵对于不同的对象具有不同的意义。

对生物化学家来说，发酵是微生物在无氧时的代谢过程。而对工业微生物学家来说，发酵是指借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体本身或代谢产物的过程。

如今，人们把利用生物细胞（指微生物细胞、动物细胞、植物细胞、微藻）在有氧或无氧条件下的生命活动来大量生产或积累生物细胞、酶类和代谢产物的过程统称为发酵。

发酵工程是指利用生物细胞的特定性状，通过现代工程技术手段，在反应器中生产各种特定有用物质，或者把生物细胞直接用于工业化生产的一种工程技术系统。发酵工程涉及微生物学、生物化学、化学工程技术、机械工程、计算机工程等基本原理和技术，并将它们有机地结合在一起，利用生物细胞进行规模化生产。发酵工程是生物加工与生物制造实现产业化的核心技术。

发酵工程技术主要包括提供优质生产菌种的菌种技术、实现产品大规模生产的发酵技术和获得合格产品的分离纯化技术。发酵工程主要内容包括：发酵原料的选择及预处理，微生物菌种的选育及扩大培养，发酵设备选择及工艺条件控制，发酵产物的分离提取，废弃物的回收和利用等。

1.1.2发酵工程的内容、发酵方式和特点

发酵工程是生物反应过程，其本质是以生物细胞为催化剂的化学反应工程。但长期以来，发酵工程仍然是微生物工程的代名词。因此，发酵工程的内容和特点也就是微生物工程的内容和特点。

1.发酵工程的内容

发酵工程主要包括菌种的选育和培养，发酵条件的优化，发酵反应器的设计和自动控制，产品的分离纯化和精制等。发酵工程涉及食品工业、化工、医药、冶金、能源开发、污水处理等领域。发酵工程的产品可大致分为以下几大类：（1）传统发酵产品

①发酵食品：面包、馒头、包子、发面饼、火腿、发酵香肠、豆腐乳、泡菜、咸菜等；②酒类：葡萄酒、啤酒、果酒、黄酒、青酒、白酒、白兰地等；③发酵调味品：酱、酱油、豆豉、食醋、酵母自溶物等；④发酵乳制品：马奶酒、干酪、酸奶等。（2）微生物菌体细胞

①饲料用单细胞蛋白：酵母、细菌、藻类、丝状真菌和放线菌等；②活性益生菌类：活性乳酸菌、双歧杆菌、食用和药用酵母菌等；③大型真菌：食用菌和药用真菌；④微生物杀虫剂：苏云金芽孢杆菌、虫霉菌、白僵菌等；⑤生物增产剂：固氮菌、钾细菌、磷细菌等。（3）微生物酶类

包括各种酶类、酶制剂和各种曲类的生产。目前，由微生物生产的工业用酶制剂主要有糖化酶、α淀粉酶、异淀粉酶、转化酶、异构酶、乳糖酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶、过氧化氢酶等。（4）微生物代谢产物

①初级代谢产物：氨基酸、有机酸、有机溶剂、核苷酸、蛋白质、核酸和维生素等；②次级代谢产物：抗生素、生物碱和植物激素等。（5）微生物的转化产物

微生物的产物转化是指利用微生物代谢过程中的某一种酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能基团产物的生物化学反应。这种转化一般是通过脱氢、氧化、羟基化、脱水、缩合、脱羧、氨基化、脱氨、异构化等的酶促反应。例如，利用微生物转化技术将甘油转化为二羟基丙酮，将葡萄糖转化为葡萄糖酸，将山梨醇转化为L山梨糖等；利用微生物细胞将甾体、薯蓣皂甙转化成副肾上腺皮质激素、氢化可的松等。（6）工程菌发酵产物

生物工程菌的发酵，是指对利用生物技术方法所获得的“工程菌”以及细胞融合等技术获得的“杂交细胞”等进行培养。这是一种新型发酵，其产物多种多样，如用基因工程菌生产的胰岛素、生长激素、干扰素、疫苗、血纤维蛋白溶解剂、红细胞生成素等，用杂交细胞生产的用于诊断和治疗的各种单克隆抗体等。（7）动物、植物细胞大规模培养的产物

如利用木瓜细胞大规模培养生产木瓜蛋白酶，利用紫草单细胞培养技术生产天然食用色素等。

2.发酵方式

发酵是一个错综复杂的过程，尤其是大规模工业发酵，需要采用各式各样的发酵技术，发酵的方式就是其中最重要的发酵技术之一。发酵方式可从多个角度进行分类：根据发酵过程对氧的需求分，发酵分为好氧发酵和厌氧发酵；按发酵培养基的相态分，发酵可分为液态发酵和固态发酵；按发酵培养基的深度或厚度分，发酵分为表面发酵和深层发酵；按发酵过程的连续性分，发酵可分为分批发酵、补料分批发酵和连续发酵；按菌种生活的方式分，发酵分为游离发酵和固定化发酵；按菌种的种类分，发酵分为单一纯种发酵和多菌种混合发酵。在实际工业生产中，大都是将各种发酵方式结合进行的。目前应用最多的是需氧、液体、深层、分批、游离、单一纯种相结合的发酵方式。下面是几种常见的发酵操作方式：（1）分批发酵

分批发酵也叫间歇式发酵，是指在灭菌后的培养基中按比例接入相应的菌种进行发酵，发酵过程不再添加新的培养基或新的菌种，直至发酵结束的发酵方式。其特点是每次发酵过程都要经过装料、灭菌、接种、发酵、放料等一系列过程，非生产时间长，生产效率低，成本较高。（2）补料分批发酵

补料分批发酵即半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的发酵方式。目前，它的应用范围非常广泛，几乎遍及整个发酵行业。补料分批发酵的理论研究在20世纪70年代以前几乎是空白，在早期的工业生产中，补料的方式非常简单，采用的方式就仅仅局限于间歇流加和恒速流加，控制发酵也是以经验为主。直到1973年日本学者Yoshida等人提出了“fedbatch fermentation”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，补料分批发酵的研究才进入理论研究阶段。近年来，随着理论研究和应用的不断深入，补料分批发酵的内容大大丰富了。

和传统的分批发酵相比，补料分批发酵可以有效地减少发酵过程中培养基黏度升高引起的传质效率降低，解除降解物的阻遏和底物的反馈抑制，很好地控制代谢方向，延长产物合成期和增加代谢积累。（3）连续发酵

连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。

连续发酵可分为单罐连续发酵和多罐串联连续发酵等方式。其优点有：简化了菌种的扩大培养，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，操作管理方便，便于自动化控制，同时， 产物稳定，人力物力节省，生产费用低，使产品更具商业竞争力。缺点有：①对设备的合理性和加料的精确性要求甚高；②营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低，产物提取成本较高；③杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生衰退。（4）固定化酶和固定化细胞发酵

固定化酶和固定化细胞发酵是酶工程中固定化酶技术在发酵工程中的应用。其优势在于固定化酶和固定化细胞可以重复使用，酶活力稳定，反应速率快，生产周期短，产品的分离和提纯也比较容易，易于机械化和自动化。（5）多菌种混合发酵

多菌种混合发酵与传统的混合菌发酵不同。它是指利用两种以上的纯菌种按一定比例，同时或按顺序接种到同一培养基中进行发酵的过程。它的主要特点是可以形成多菌共生、酶系互补，不但可以提高发酵效率和产品数量、质量，甚至还可以获得新的发酵产品。它是一种不需要进行体外DNA重组也能获得类似效果的新型发酵方式。

3.发酵工程的特点

微生物具有种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强的特点，而且往往可以通过人工诱变获得有益的突变株。微生物酶的种类也很多，能催化各种生物化学反应。此外，微生物能够利用有机物、无机物等多种营养源，一般可以不受气候、季节等自然条件的限制，通过室内反应器来生产多种多样的产品。因此，从传统的酿酒、酿酱、酿醋等技术上发展起来的发酵工程技术发展非常迅速，而且形成了与其他学科不同的特点：

①发酵过程以生物体的自身调节方式进行，多个反应就像单一反应一样，在单一发酵设备中完成。

②反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备比较简单，对场地要求不高。

③微生物本身能有选择性地摄取所需物质，因此，其发酵原料往往比较广泛。原料通常是以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主的农副产品，也可以是工业废水或可再生资源，如植物秸秆、木屑等。

④容易合成复杂的化合物，能高度选择性地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入等反应。

⑤发酵过程中需要防止杂菌污染。生产设备及其附件需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤除菌等。

发酵过程的这些特征体现了发酵工程的种种优点。在目前能源、资源紧张，人口、粮食及污染问题日益严重的情况下，发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一，得到越来越广泛的应用。  第2章 发酵工程发展简史

1.2.1传统发酵技术

人类利用自然发酵现象生产食品已有几千年的历史。酿酒是最传统的发酵技术之一。大约在9000年前，就有人开始用谷物酿造啤酒。在4000年前的龙山文化时期，我国就出现了黄酒酿造技术。豆酱、醋、豆腐乳、酱油、泡菜、奶酪等传统食品的生产历史也均在2000年以上。这些产品都是数千年来人类凭借智慧和经验，在没有亲眼见到微生物的情况下巧妙地利用微生物所获得的。当时，人们不知道发酵的本质，也就不会人为地控制发酵过程，生产只能凭经验，因此这个时期也称作天然发酵时期。现在，传统发酵技术仍然广泛应用于食品生产。

1.2.2近代发酵技术

1.微生物纯培养技术时期

1680年，荷兰商人、博物学家列文虎克（A. Leeuwenhoek）用自己发明制造的显微镜发现了微生物世界，这是人类第一次看到了微生物。19世纪中叶，巴斯德(L. pasteur)通过实验证明了酒精发酵是由活酵母引起的，并指出发酵现象是微生物进行的化学反应。巴斯德通过一系列发酵现象的研究，发明了著名的巴氏消毒法，并因此被后人誉为微生物学鼻祖、发酵学之父。 1872年，布雷菲尔德（Brefeld）创建了霉菌的纯粹培养法，科赫（R. Koch）完成细菌纯粹培养技术，从而确立了单种微生物的纯培养技术，使发酵技术从先前的凭借经验的天然发酵转变为可以靠人类控制和调节的纯培养发酵。

2.深层发酵技术时期

1928年，弗莱明（A. F1eming）发现了青霉菌能抑制其菌落周围的细菌生长的现象，并证明了青霉素的存在。20世纪40年代，第二次世界大战爆发，由于前线对抗生素的需求量非常大，从而推动了青霉素的研究进度。青霉素发酵从最初的浅盘培养到深层培养，使青霉素的发酵水平从40U·mL-1效价提高到了200U·mL-1。现在常采用通气搅拌深层液体培养，100～200m3大型发酵罐的青霉素的发酵水平可达5×104～7×104U·mL-1。青霉素发酵技术的迅速发展推动了抗生素工业乃至整个发酵工业的快速发展。1944年，人们发现了用于治疗结核杆菌引起的感染的链霉素，随后，又陆续发现金霉素、土霉素等抗生素。此阶段的发酵工程表现出的主要特征是微生物液态深层发酵技术的应用。

1.2.3现代发酵技术

1.代谢调控技术的应用

随着基础生物科学，如生物化学、酶学、微生物遗传学等学科的飞速发展，再加上新型分析方法和分离方法的发展，发酵工程领域的研究及应用有了显著进步，特别是在微生物酶转化技术、微生物人工诱变育种技术以及微生物代谢调控技术等方面取得了可喜的成果。如采用微生物进行甾体化合物的转化技术，成功地将甾体转化成副肾上腺皮质激素、性激素等。如利用代谢调控为基础的新的发酵技术，使野生的生理缺陷型菌株代谢产生谷氨酸。又如可通过人工诱变育种技术，选育获得谷氨酸高产菌株，从而大大提高了谷氨酸产量，实现了谷氨酸的工业化生产。由此也促进了代谢调控理论的研究，推动了其他氨基酸，如L赖氨酸、L苏氨酸等的工业化生产步伐。由氨基酸发酵而开始的代谢控制发酵，使发酵工业进入了一个新的阶段。随后，核苷酸、抗生素以及有机酸等也可通过代谢调控技术进行发酵生产。

2.基因工程技术的应用

1953年，沃森（J.Watson）与克里克（F.Crick）提出了DNA的双螺旋结构模型，为基因重组奠定了基础。20世纪70年代，人们成功实现了基因的重组和转移。随着重组DNA技术的发展，人们可以按预定方案把外源目的基因克隆到容易大规模培养的微生物（如大肠杆菌、酵母菌）细胞中，人为制造我们需要的“工程菌”，通过“工程菌”的大规模发酵生产，可得到原先只有动物或植物才能生产的物质，如胰岛素、干扰素、白细胞介素和多种细胞生长因子等。微生物菌种从过去繁琐的随机选育朝着定向育种转变，从而达到定向改变生物性状与功能的目的，通过发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物，大大地丰富了发酵工业的范围，使发酵技术发生了革命性的变化。  第3章 发酵工程的发展前景

生物技术是当前迅速发展的学科产业，世界各国都把它列为发展的重要内容。生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和发酵工程。发酵工程是生物工程的重要内容之一，是生物细胞产物通向工业化生产的必经之路。发酵工程发展至今，经历了半个多世纪，已形成一个产业，即发酵工程产业。当前发酵工程的应用已深入国计民生的方方面面，包括农业生产、轻化业、医药卫生、食品、环境保护、资源和能源开发等领域。随着生物工程技术的发展，发酵工程技术也在不断改进和提高，其应用领域也在不断拓宽，显示出了强大潜力。

我国发酵工程产业的发展除了要引进和消化吸收国外先进技术之外，更需要具有国际竞争力的专业人才及具有自主知识产权的高水平的生产菌种和发酵工艺、产品后处理工艺。具体发展目标和方向有以下几个方面：

①开发和利用微生物资源。首先是设计和开发更多的自动化、定向化、快速化的菌种筛选技术和模型，筛选更多的新型菌种和代谢产物；其次是利用基因工程等先进技术，进行菌种改良。

②改进和完善发酵工程技术。例如，为了提高生产能力，将发酵工程与固定化技术相结合是发酵生产的一个趋势。将发酵工程与酶工程相结合，会起到更加有效的催化作用。将发酵与提取相偶合是当今的一个热门课题，例如将萃取与发酵相偶合的萃取发酵。超临界CO2萃取发酵以及将膜过滤与发酵相偶合的膜过滤发酵等都会在发酵过程中把产物提取出来，避免反馈抑制作用，以提高产物的产量。生态发酵技术（混合培养工艺）不但可以提高发酵效率和产品数量、质量，甚至还可以获得新的发酵产品，它是一种不需要进行体外DNA重组也能获得类似效果的新型培养技术，它的意义并不逊色于基因工程，其前景也是十分广阔和诱人的。生态发酵技术的类型很多，主要有联合发酵、顺序发酵、共固定化细胞混合发酵、混合固定化细胞发酵等。

③研制和开发新型发酵设备。发酵设备正逐步向容积大型化、结构多样化、操作控制自动化的高效生物反应器方向发展。其目的在于节省能源、原材料和劳动力，降低发酵产品的生产成本。

④重视中、下游工程的研究。发酵工程的中、下游加工由多种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，如沉淀、萃取、吸附、干燥、蒸馏、蒸发和结晶等传统的单元操作，以及细胞破碎、膜过滤和色谱分离等新近发展起来的单元操作。一些新技术、新工艺、新材料、新设备的使用，大大提高了生物技术产品的产量和质量。但对于高水平的后处理技术和设备的研究还有待加强，尤其是对有关基础理论和应用理论的研究。例如，絮凝机理、离子交换的动力学和静力学理论、双水相萃取机理、超临界流体萃取原理等，都需要大批生物学家和化学家联合研究，协同作战。此外，对于新型分离介质，如超滤膜、均孔离子交换树脂、大网格吸附剂、无毒絮凝剂、亲和层析中的新型分离母体和配位体等，也应进一步深入研究。

生物工程的迅速发展提供了多种生物细胞，而这些生物细胞必须通过发酵才能转化为商业化的产品。因此，发酵工程是生物技术实现产业化及加快研究成果转化为现实生产力、获得经济效益的必不可少的手段。随着生物技术的快速发展，发酵工程必将发生新的变化，为人类创造出更大的经济效益。  第4章 菌种的来源

微生物是发酵工业生产成败的关键，因此，工业生产用菌种应该满足以下要求：遗传性稳定，可长期保存；对诱变剂敏感；容易产生营养细胞、孢子或其他繁殖体，种子培养时生长旺盛，快速繁殖；能抵抗噬菌体的污染；发酵周期短，毒、副产物少；下游工程易于操作。

具有上述特征的微生物可从自然界中筛选，也可以从有关科研单位或工厂索取。自然界筛选菌种的样品来源主要包括土壤、水、动植物、新鲜或腐烂的食物、昆虫的排泄物等。

2.1.1菌种类型

工业发酵生产中常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

1.常见的细菌（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）

大肠埃希氏杆菌简称大肠杆菌，是最为著名的原核微生物。革兰氏染色阴性，短杆状，大小为（0.5~1.0）μm×3.0μm；运动或者不运动，运动者周生鞭毛。多数大肠杆菌对人体无害，是常见条件致病菌。大肠杆菌生长迅速，营养要求低，是最早用作基因工程的宿主菌。工业上常将大肠杆菌用于生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。此外，一些基因工程表达产物，如干扰素、人胰岛素、人生长激素等，已实现大肠杆菌的高密度发酵生产。（2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属（Bacillus）。革兰氏染色阳性，大小为（0.3~2.2）μm×（1.2~7.0）μm；周生或侧生鞭毛；无荚膜；芽孢中生或近中生，大小0.5μm×（1.5~1.8）μm。菌落形态不规则；表面粗糙，不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、核苷酸酶、氨基酸和核苷等。（3）北京棒状杆菌（Corynebacterium pekinensis）

革兰氏染色阳性，短杆状或小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或呈“八”字排列，无芽孢，不运动。北京棒状杆菌是我国谷氨酸发酵的主要生产菌种之一。

2.常见的放线菌（1）链霉菌属（Streptomyces）

菌丝发达无隔膜，直径约0.4~1μm，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分。链霉菌属是抗生素的主要生产菌。常用的抗生素，如链霉素、土霉素、博莱霉素、丝裂霉素、制霉菌素、卡那霉素、井冈霉素等，都是链霉菌属产生的次级代谢产物。（2）诺卡菌属（Nocardia）

诺卡菌属又称原放线菌属（proactinomyces）。菌丝体能产生横膈膜，多数种只有营养菌丝，没有气生菌丝。菌落一般比链霉菌属小，表面崎岖多皱，致密干燥。诺卡菌主要分布在土壤中，能产生30多种抗生素，如利福霉素、间型霉素等。此外，有些诺卡菌还用于石油脱蜡、烃类发酵及腈类化合物的转化。

3.常见的酵母菌（1）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

细胞多为圆形或卵圆形，长宽比约1~2。它是发酵工业上最常用的菌种之一。它除了用于传统的酒类(如啤酒、葡萄酒、果酒和蒸馏酒）的生产之外，工业上还用于酒精的发酵。（2）产朊假丝酵母（Candida utilis）

细胞呈圆形、椭圆形或圆柱形，大小为（3.5~4.5）μm×（7~13）μm。它是人们研究最多的生产单细胞蛋白的微生物之一。以无机氮为氮源，以五碳糖或六碳糖为碳源，在培养基中不需添加生长因子，它即可生长。它既能利用造纸工业的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、土豆淀粉废料、木材水解液等生产出人畜可食用的单细胞蛋白。

4.常见的霉菌（1）毛霉属（Mucor）

属接合菌亚门，毛霉目。菌丝无色透明，无横隔，菌落初期为白色，后为灰白色、淡黄色或淡褐色，气生，不产生匍匐菌丝，有孢子囊，能产生孢囊孢子。有性生殖时可形成球形的接合孢子。毛霉中的许多种分解蛋白质能力很强，因此，豆腐乳、豆豉的制作均用毛霉。（2）根霉属（Rhizopus）

属接合菌亚门，毛霉目。菌丝无色透明，无隔膜，不长气生菌丝，只产生弧形的匍匐菌丝，有假根，有子囊，能产生孢囊孢子。根霉可分泌多种酶，如淀粉酶、蛋白酶等。它常用于酿酒业中淀粉的糖化。（3）红曲霉属（Monascus）

红曲霉菌落开始为白色，成熟后变为红紫色，能向培养基中分泌红色色素。红曲霉能产生淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶、柠檬酸、琥珀酸、乙醇，以及天然食用色素，从而用于黄酒、醋、红腐乳等的制作。（4）青霉属（penicillium）

青霉在自然界中分布很广，是造成水果腐烂、粮食等工农业产品霉变的主要菌。不同菌种可形成不同的代谢产物，如有产青霉素的菌种，产灰黄霉素的菌种，产柠檬酸、延胡索酸、草酸等有机酸的菌种，产纤维素酶、糖苷酶的菌种。个别青霉菌还能产生致癌的霉菌毒素。（5）曲霉属（Aspergillus）

曲霉为多细胞菌。菌丝有分隔，营养菌丝大多匍匐生长，无假根，能产生分生孢子。此属在自然界分布极广，是引起多种物质霉腐（如面包腐败，煤生物分解及皮革变质等）的主要微生物之一。其中，黄曲霉具有很强毒性。绿色和黑色的具有很强的酶活性，在食品发酵中广泛用于制酱、酿酒。曲霉在现代发酵工业中用于生产葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶等酶制剂。

2.1.2菌种的分离筛选

微生物是地球上分布最广、种类最丰富的生物种群。为了适应环境压力，微生物常常能产生许多特殊的生理活性物质，所以微生物是人类获取生理活性物质的丰富资源。微生物菌种筛选包括采样、富集培养、纯种分离、初筛和复筛。

1.采样

采集微生物样品时，材料来源越广泛，越容易获得新的菌种。土壤具备微生物生长所需的营养、水分和空气，是微生物菌种的主要来源。在实际采样过程中，应根据分离筛选的目的，选择不同区域、有机质含量、酸碱度、植被状况的土壤去采集样品。采土样时，先用铲除去表层土，取5~25cm深处的土样10~15g，装入事先准备好的信封或塑料袋，并对其进行编号，记录采样地点、时间、土质等。取样后，应尽早分离，以避免不能及时分离而导致微生物死亡。

同时还可以根据所筛选微生物目的、特殊生理特点等进行采样。如筛选纤维素酶产生菌，可选择有很多枯枝落叶、富含纤维素的森林土；筛选蛋白酶产生菌株，可选择肉类加工厂、饭店排水沟的污泥；筛选淀粉酶产生菌，可选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；筛选酵母菌，可选择果园土壤或蜜饯、甘蔗堆积处。在高温、低温、酸性、碱性、高盐、高辐射强度的特殊环境下，往往能筛选到极端微生物。温泉、火山爆发处、堆肥处，往往能筛选到高温微生物；南极、北极地区、冰窖、海洋深处，往往能筛选到低温微生物；海洋底部往往能筛选到耐压菌。

2. 富集培养

在自然界采集的土样，是多种类微生物的混合物，目的微生物通常不是优势菌，数量较少。通过富集培养增加待分离微生物的相对或绝对数量可增加分离成功率。富集培养是根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，将样品加到培养基中，经过一段时间的培养，目的微生物迅速生长繁殖，数量上占了一定的优势，从中可有效分离目的菌株。在富集培养中，既可以通过控制营养和培养条件增加目的微生物的绝对数量，也可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，增加目的微生物的相对数量，从而达到富集的目的。如筛选纤维素酶产生菌，可选择以纤维素为唯一碳源的培养基，使目的菌迅速生长繁殖，而其他不能利用纤维素的非目的菌不能生长或生长缓慢。从土壤中筛选芽孢杆菌时，先将样品在80℃加热10min，以杀死不产芽孢的微生物，再进行富集培养，就可以达到目的菌优势生长。

富集培养在那些样品中目的微生物含量较少的情况下是必要的。但是如果样品中已含有较多数量的目的微生物，则不必进行富集培养，将样品稀释后直接在培养基平板上进行纯种分离即可。

3.纯种分离

纯种分离常采用稀释法和划线法。稀释法是将样品先用无菌水稀释，再涂布到固体培养基平板上，培养后获得单菌落。划线法是用接种环挑取微生物样品在固体培养基平板上划线，培养后获得单菌落。稀释法能使微生物样品分散更加均匀，更容易获得纯种；而划线法更简便、快速。

纯种分离中通常使用分离培养基对微生物进行初步的分离。分离培养基是根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反应而设计的培养基，可显著提高目的微生物分离纯化的效率。常用的分离方法包括透明圈法、变色圈法、生长圈法和抑菌圈法等。

4.初筛和复筛

在纯种分离过程中，对于有些微生物，可通过代谢产物与指示剂、显示剂或底物的生化反应在分离培养基平板上直接定性分离。对于这一类微生物，纯种分离后可直接在琼脂平板上进行初筛。但并不是所有的微生物都可以用琼脂平板定性分离，往往需要采用摇瓶培养法进行初筛，再对生产性能进行测定。初筛要求筛选到尽可能多的菌株，工作量很大，因此，设计一种快速、简便的筛选方法往往会事半功倍。

初筛得到的菌株需要进一步通过复筛，以获得较好的菌株。复筛通常采用摇瓶培养法，产物的检测通常采用更为精确的定量测定方法。  第5章 菌种的选育

要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选取性能优良的生产菌种。菌种选育包括根据菌种的自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法利用诱变育种技术、原生质体融合技术、基因工程技术而进行的诱变育种、细胞工程育种、基因工程育种等。

2.2.1诱变育种

诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。诱变育种操作简单、快速，是目前被广泛使用的育种方法。当前发酵工业所使用的生产菌株，大部分都是通过诱变育种提高了生产性能。

诱变育种的基本过程包括出发菌株的选择、单细胞或单孢子悬浮液的制备、诱变方法的选择、诱变处理、筛选等。

1.出发菌株的选择

用于诱变处理的起始菌株称为出发菌株。诱变的目的是提高代谢终产物或中间产物的产量、质量，或改变原有代谢途径，产生新的代谢产物。出发菌株的选择直接关系到诱变效果。出发菌株应选择具备一定生产能力或某种优良特性的菌株，其遗传性状应该是纯的，有较高的生产能力，遗传性状稳定，并对诱变剂敏感。

以下几类菌株常用作出发菌株：第一类是从自然界直接分离得到的野生型菌株。这类菌株的特点是酶系完整，对诱变因素敏感，容易发生正突变（即产量和生产性状向好的方向改变），但是他们的生产性能通常较差；第二类是经历过生产条件考验的菌株。这类菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，容易发生正突变，在诱变育种中经常采用；第三类是已经历过多次诱变处理的菌株。这类菌株的某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已达到一定的水平，继续诱变容易产生负突变，产量和性状向差的方向改变。在实际生产过程中，一般可选择第一类和第二类菌株，第三类菌株的应用情况比较复杂，如果将每次诱变处理后选出的性状较好的菌株作为出发菌株，继续诱变处理，也有可能得到好的结果。

2.单细胞或单孢子悬浮液的制备

菌悬液一般要求菌体处于对数生长期，保持悬液的均一性，并采取一定的措施使细胞尽可能处于同步生长状态。为了保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产芽孢的细菌最好采用其芽孢制备悬液；对放线菌和霉菌最好采用其孢子。

一般真菌孢子或酵母菌细胞悬液的浓度为106~1010个·mL-1，放线菌或细菌为108个·mL-1。菌悬液一般用生理盐水或缓冲溶液稀释。对于会引起ph变化的诱变剂，一般使用缓冲溶液稀释。

利用单细胞或单孢子悬浮液进行诱变处理的优点是能使分散状态的细胞均匀地接触诱变剂，尽可能避免出现表型延迟现象，从而避免出现不纯的菌落或者一些优良的变异菌株在筛选时被错误淘汰。

3.诱变方法的选择

诱变方法的选择通常是根据经验。对于之前已发生过诱变的菌株，改变诱变剂的种类或许会有较好的效果。在众多的诱变剂中，亚硝酸、硫酸二乙酯等会引起碱基置换，较易发生回复突变；紫外线、60Co和吖啶类物质等会引起染色体畸变、移码突变，不易回复，可得到突变性状较稳定的菌株。

诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，这种处理方法往往能使它们产生协同效应，一般较单一处理效果好。这是因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可重复使用同一诱变剂。

4.诱变处理

诱变剂的作用一是提高突变的频率，二是扩大产量变异的幅度，三是使产量变异朝正突变或负突变的方向移动。凡是在高突变率基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正突变范围的剂量，就是合适的剂量，需多次试验后确定。

不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感性不同，所以在诱变处理前，一般应先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。一般以导致微生物的死亡率在70%~80%为最佳诱变剂量。死亡率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。不同诱变剂的剂量有不同表示方法，如紫外线和X射线是以强度来表示，化学诱变剂以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。但是，仅仅采用理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯的质量及其预热时间，灯与被照射物的距离，照射时间，菌悬液的浓度、厚度及均匀程度等诸多因素的影响。

2.2.2原生质体融合育种

细胞壁被酶解剥离，剩下的由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生全重组子的过程。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。原生质体融合技术的运用，使细胞间基因重组的频率大大提高，基因重组亲本的选择范围也得以扩大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多更优良的生产菌种提供了可能。原生质体融合技术已广泛应用于细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的育种。

微生物原生质体融合分为以下五大步骤：

1.选择亲株

为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记。常用营养缺陷型或抗药性作为标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态等作为标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，则不宜采用。

2.原生质体制备

为了制备原生质体，去除细胞壁是关键。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶解法。一般都采用酶解法去壁，根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等。

放线菌肽聚糖溶菌酶革兰氏阴性菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和EDTA霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶

在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解，甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。在菌体生长阶段添加蔗糖，扰乱菌体的代谢，也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。因为青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，能使细胞对溶菌酶更敏感。

3. 原生质体融合

聚乙二醇（pEG）能有效地促进原生质体融合。其助融作用可能与下列过程有关：开始时，由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大。细胞膜结构发生紊乱，加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。pEG对细胞尤其是原生质体也有一定的毒害作用，因此，作用的时间一般不宜过长。pEG有不同的聚合度。在细菌原生质体融合中，多采用高相对分子质量的pEG（如pEG 6000）；对放线菌则可采用各种相对分子质量的pEG。pEG的使用浓度范围一般在30％~50％，但随着微生物种类的不同而异。此外，物理融合剂，如电场和激光也能有效促进融合。

4.融合体再生

融合体再生就是使原生质体融合体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3％~10％；真菌再生率一般在20％~80％；链霉菌再生率最高可达50％。若要获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力动作而使原生质体破裂。在将原生质体悬液涂布在再生培养基平板上前，宜预先去除培养基表面的冷凝水。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体融合体的再生。

5.筛选优良性状融合重组子

重组子的检出方法有三种：直接法、间接法和钝化选择法。直接法是将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子。间接法是把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上，检出重组子。钝化选择法是在融合前使亲本中的一方（野生型）原生质体代谢途径中的某些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷型）原生质体融合，融合体在基本培养基上分离。

以上获得的还仅仅是融合重组子，尚需进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定是否符合育种的要求。

2.2.3基因工程育种

20世纪70年代出现的基因工程技术给微生物育种带来了革命性的变化。基因工程育种是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的一门新兴应用科学，是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法，所创造的新物种是自然演化中不可能发生的组合。因为基因工程的实施首先需要对生物的基因结构、顺序和功能有充足的认识，而目前对基因的了解还十分有限，蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物）的产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径没有被发现，所以就目前而言，基因工程的应用仍存在着很大的局限性，基因工程产品主要是一些较短的多肽和小分子蛋白质。

基因工程育种的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。近年来出现的运用基因工程定向育种的新技术主要有以下几种。

1.基因的定点突变

定点突变（sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis）是指在目的DNA片断（如一个基因）的指定位点引入特定的碱基对的技术，包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以pCR为基础的定点突变。pCR的定点突变技术由于具有突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而备受关注。因此，近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术，如重叠延伸pCR法（overlap extension pCR,简称EOpCR）、大引物pCR法（megaprimer pCR）、一步重叠延伸pCR（onestep overlap extension pCR，简称OOEpCR）、单管大引物pCR（singletube megaprimer pCR）、快速定点诱变法、多位点环状诱变法和TAMS（targeted amplification of mutant strand）定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物pCR和TAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。

2. 易错pCR

DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用pCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错pCR（errorprone pCR，简称EppCR）。

利用Mn2+替代天然的辅助因子Mg2+，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTp的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1%。另外，还可以在该反应体系中加入dITp等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率提高至20%。从易错pCR的操作过程可以看到，此法与传统诱变育种技术之间的差别就在于，前者是基因水平上的随机突变操作，而后者则是细胞水平上的随机诱变技术。此外，易错pCR一般只产生点突变，因此其产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。但作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体的技术，易错pCR仍有广泛的应用领域。

3.DAN重排

DNA重排（DNA shuffling）技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，是由Stemmer于1993年首先提出的。DNA重排的基本原理是，首先将同源基因（单一基因的突变体或基因家族）切成随机大小的DAN片段，然后进行pCR重聚，那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次pCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。

DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。由于可以产生丰富的重组突变体文库，因此该技术已经在许多领域得到广泛应用，其中包括：改善生物分子的活性和稳定性，在非天然环境下改善蛋白质的活性和稳定性，开发酶抑制剂，提高抗生素抗菌活性或开发抗生素新功能，扩大酶作用的底物范围及改变底物特异性，发现新型疫苗和药物分子，提高抗体亲和力，以及开发新的代谢途径等。

4.基因组重排

基因组重排（genome shuffling）技术是受DNA重排的启发，于21世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选出表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术（即将各种亲本制成原生质体-融合-再生，再制成原生质体-融合-再生……），即递归原生质体融合（recursive protoplast fusion）的方法。与DNA重排技术相比，该法的最大特点是不必了解菌株的遗传背景，在细胞水平上即可进行定向进化。在人们对微生物的遗传特性尚未完全掌握的今天，利用基因组重排技术可快速实现基因的突变与筛选，其有可能成为现代工业微生物育种的一种有效手段。  第6章 生产菌种的保藏

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本资料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。因此，菌种保藏是一项重要的工业微生物学基础工作，优良的菌种来之不易，所以在科研和生产中应设法减少菌种的衰退和死亡。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活能力，不被其他杂菌污染，形态特征和生理性状应尽可能不发生变异，以便今后长期使用。

2.3.1生产菌种的衰退与复壮

因自发突变而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变和质变的现象称为菌种衰退。衰退可以是生理上的，如产孢子能力、发酵主产物比例下降等，也可以是形态上的，如原有典型性状的消失。就产量性状而言，菌种的负突变就是衰退。具体体现有：①原有形态性状变得不典型了，如芽孢和伴孢晶体变小甚至丧失等；②生长速率变慢，产生的孢子变少；③代谢产物生产能力下降，这种情况极其普遍；④致病菌对宿主侵染力下降；⑤抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力减弱等等。

菌种衰退是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程。首先，在细胞群体中出现个别发生负突变的菌株，这时如不及时发现并采取有效的措施，而一味地移种传代，则群体中这种负突变个体的比例逐渐增大，最后占据了优势，整个群体发生严重的衰退。因此，开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”，但也是不纯的，即其中还会有少数尚未衰退的个体存在。

定期使菌种复壮（rejuvenation）是防止菌种衰退最有效的方法。菌种复壮就是在菌种发生衰退后，通过纯种分离和性能测定，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。

狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未衰退的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。而广义的复壮应是一项积极的措施，是在菌种尚未衰退之前定期地进行纯种分离和性能测定，使菌种的生产性能保持稳定。广义的复壮过程有可能利用正向的自发突变，在生产中培育出更优良的菌株。

1.菌种衰退的防止

微生物都存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的，减少传代次数就能减少自发突变和菌种衰退的可能性。因此，不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的传代次数，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率（10-9~10-8）。

各种生产菌株对培养条件的要求和敏感性不同，培养条件若有利于生产菌株，就可在一定程度上防止衰退。例如，在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退的效果。

在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理，可以减少分离回复现象。在实践上，若用无菌棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种，就可避免菌丝接入。另外，有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，而改用其子囊孢子接种则能避免衰退。

在用于工业生产的菌种中，重要的性状大多属于数量性状，而这类性状恰是最易衰退的。斜面保藏的时间较短，只能作为转接和短期保藏的种子用，应该在采用斜面保藏的同时，采用沙土管、冻干管和液氮管等能长期保藏的手段。

2.菌种的复壮

在衰退菌种的细胞群中，一般还存在着保持原有典型性状的个体。通过纯种分离法，设法把这种细胞挑选出来即可达到复壮的效果。纯种分离方法可以分两类：一类是采用平板表面涂布法或平板划线分离法可达到“菌落纯”水平；另一类是用较精致的方法，如用“分离小室”进行单细胞分离，用显微操作器进行单细胞分离，或者用菌丝尖端切割法进行单细胞分离，可达到“菌株纯”的水平。

对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动植物宿主体中，通过各种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。

2.3.2生产菌种的常规保藏方法

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。人们在长期的实践中，对微生物种子的保藏建立了许多方法，一般有下面几种：

1.定期移植保藏法

将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，待其生长成健壮的菌体后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植。定期移植保藏法是最早使用而且至今仍然普遍采用的方法。该法简单易行，但是保藏的时间较短，菌种容易衰退。斜面保藏是一种短期的、过渡的保藏方法，一般保存期为3~6个月。

2.液体石蜡保藏法

在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌液体石蜡，液面高出培养基1cm左右，然后保存在冰箱中。液体石蜡可以防止水分蒸发，隔绝氧气，所以能延长保藏的时间。此法适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存，保存期约一年左右。

3. 沙土管保藏法

这是国内常采用的一种方法。它的制备方法是，取河沙过24目筛，用10％~20％的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先斜面培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口，可以室温或低温保藏。其特点是干燥，低温，隔氧，无营养物。此法保藏的效果较好，制作也简单，比液体石蜡法保藏时间长，适合于产孢子或芽孢的微生物，保藏时间可达数年，甚至数十年。

4.冷冻干燥保藏法

真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。该方法保藏效果好，对各种微生物都适用，国内外都已较普遍地应用。该法是将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。该法同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，使微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，所以，可使微生物菌种得到较长时间的保存，一般可以保存5年左右。这种保藏方法需要一定的设备，技术要求比较严格。

5.液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一，在国外已普遍采用。它也是适用范围最广的微生物保藏法，尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用此法保藏。液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可使用该法。液氮的温度可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），所以用液氮能长期保存菌种。

由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不至于破裂，一般用95料或GC17的玻璃管。因为菌种要经受超低温的冷冻过程，常用10%（体积分数）甘油为保护剂。液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。因此，在细胞接触低温前，应使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35~40℃水浴中迅速解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。

6. 甘油保藏法

甘油保藏法与液氮超低温保藏法类似。菌种悬浮在10％甘油蒸馏水，置低温（-80~-70℃）保藏。该法较简便，保藏期较长，但需要有超低温冰箱。实际工作中，常将待保藏微生物菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10％~30％左右，再分装于小离心管中，置低温保藏。基因工程菌常采用该法保藏。

2.3.3国内外菌种保藏机构

菌种保藏机构的任务是在广泛收集、生产和科研菌种、菌株的基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。

中国微生物菌种保藏管理委员会成立于1979年，它的任务是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展，以便更好地利用微生物资源，为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。  第7章 微生物的基本代谢及产物

微生物的新陈代谢途径错综复杂，代谢产物多种多样。按照代谢活动与生长繁殖的关系，人们习惯将微生物的代谢分为初级代谢和次级代谢。

3.1.1初级代谢及产物

细胞主要由C、h、O、N、S和p六种元素组成，另外细胞还需用于维持酶活和体内平衡所需的微量元素（如K、Na、Cl、Mg、Ca、Fe、Zn、Mo等）。细胞的组成分子主要是核酸、蛋白质、多糖、脂质等生物大分子，它们源自一些低相对分子质量的前体（核苷酸、氨基酸、单糖、磷脂等）。除这些生物大分子和前体外，细胞的生长还需要约20种辅酶和电子载体。微生物通过各种代谢途径提供细胞生命活动所需要的能量，并利用各种原料构建其细胞组分。

初级代谢是与生物的生长繁殖有密切关系的代谢活动，在细胞生长繁殖期表现旺盛且普遍存在于一切生物中。营养物质的分解和细胞物质的合成构成了微生物初级代谢的两个主要方面。在代谢过程中凡是能释放能量的物质（包括营养和细胞物质）的分解过程被称为分解代谢；吸收能量的物质的合成过程被称为合成代谢。细胞的分解代谢可为微生物提供能量、还原力（NADh、FADh2和NADph）和小分子前体，用于细胞物质的合成，使细胞得以生长和繁殖。而合成代谢必须与分解代谢相偶联才能满足合成代谢所需的前体和能量。生长和产物合成所需的前体决定了细胞所需养分的种类和数量，细胞生长速率也基本上和生物合成的净速率相等，整个代谢过程呈现出复杂性和整体性。

初级代谢产物是初级代谢生成的产物，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、多糖、脂肪酸、维生素等，它们与微生物的生长繁殖有密切关系。这些代谢产物往往是各种不同种生物所共有的，且受生长环境影响不大。

微生物的初级代谢产物不仅是菌体生长繁殖所必需的成分，同样也是具有广泛应用前景的化合物。例如，氨基酸、核苷酸、脂肪酸、维生素、蛋白质、酶类、多糖、有机酸等被分离精制成各种功能食品、医药产品、轻工产品、生物制剂等。

3.1.2次级代谢及产物

次级代谢是与生物的生长繁殖无直接关系的代谢活动，是某些生物为了避免初级代谢中间产物的过量积累或由于外界环境的胁迫而产生的一类有利于其生存的代谢活动。例如，某些微生物为了竞争营养物质和生存空间，分泌抗生素来抑制其他微生物的生长甚至杀死它

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