作者：王征旭 主编
出版社：化学工业出版社
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基因修饰T细胞技术进展及临床应用试读：
前言
不同于传统化学药物的治疗模式，肿瘤免疫治疗的作用对象是免疫细胞，通过多种方法激发人体自身的免疫系统，动员自身免疫细胞去杀伤肿瘤。肿瘤免疫治疗也是近年来国际上医学领域最具前景的研究方向之一。2013年，《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为年度世界十大科技进展之首。2015年，世界生物医学领域三大杂志《Nature》《Science》《Cell》，纷纷出专辑报道肿瘤免疫治疗领域的进展。2018年度诺贝尔生理或医学奖分别授予美国得州大学奥斯汀分校免疫学家詹姆斯·艾利森（James P.Allision）和日本京都大学教授本庶佑（Tasuku Honjo），以表彰他们在肿瘤免疫负向调控领域的杰出成就。肿瘤免疫治疗在经过多年的积淀后，已经到了腾飞和爆发的时代！2011年3月，世界上第一个免疫检验点药物百时美施贵宝公司的CTLA-4单抗ipilimumab（Yervoy）上市。2014年7月，第二个免疫检验点抑制剂PD-1/PD-L1单抗获美国FDA批准上市！PD-1/PD-L1单抗药物在癌症免疫治疗过程中，产生了令人无比震惊的临床治疗效果！2017年8月30日和10月18日，美国FDA分别批准了诺华和Kite Pharma的CAR-T细胞治疗药物上市，用于治疗急性淋巴细胞白血病和成人大B细胞淋巴瘤。这两个细胞治疗药物的获批，标志着CAR-T细胞治疗全新时代的到来，推动了肿瘤免疫治疗从传统辅助性治疗，逐渐进入到现代肿瘤治疗的主流！
党的十八大以来，习近平总书记高度重视人民健康安全。在2016年8月19日全国卫生与健康大会上，习总书记说：“没有全民健康，就没有全面小康。要把人民健康放在优先发展的战略地位，以普及健康生活、优化健康服务、完善健康保障、建设健康环境、发展健康产业为重点，加快推进健康中国建设，努力全方位、全周期保障人民健康”。习总书记在2017年10月18日党的十九大上讲到：“人民健康是民族昌盛和国家富强的重要标志。要完善国民健康政策，为人民群众提供全方位全周期健康服务”。干细胞、免疫治疗等生物技术，已写进国务院制定的国家系列发展规划中，如《“十三五”国家科技创新规划》《“健康中国2030”规划纲要》《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》等。目前在Clinical Trials网站注册的CAR-T临床试验项目（截止到2018年12月，检索词：CAR-T）已有729项，其中我国有235项，处于世界前列。目前在国家食品药品监督管理总局药品评审中心（http：//www.cde.org.cn/），按Ⅰ类治疗用生物制品新药登记的临床试验（截止到2018年11月28日）有25项， 其中南京传奇生物科技有限公司（登记号CTR20181007）、上海恒润达生生物科技有限公司（登记号CTR20181354）等公司的CAR-T细胞治疗，已经获得了CFDA的临床试验申请受理。在不断增长的肿瘤患者的需求和国家政策上的大力支持以及大量资金的投入下，国内CAR-T细胞治疗产品的上市，亦是指日可待。
全书共分六章，第一章肿瘤免疫治疗技术及原理，包括：肿瘤免疫治疗简介、基因修饰T细胞技术简介、第一代CAR-T技术、第二代CAR-T技术、第三代和第四代CAR-T技术五节，主要介绍肿瘤免疫治疗的基础知识和基本原理、CAR-T技术原理和结构特征等内容。第二章CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤进展，包括：概述、CAR-T细胞治疗急性白血病、CAR-T细胞在ALL治疗中存在的问题与展望、CAR-T细胞治疗慢性淋巴细胞白血病、CAR-T细胞治疗淋巴瘤、CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤、同种异体（供体）来源的CAR-T细胞七节，主要介绍CAR-T细胞在血液系统肿瘤治疗中的应用及进展。第三章CAR-T细胞在实体瘤中的应用，包括：CAR-T细胞治疗实体瘤概述、CAR-T细胞在头颈部肿瘤治疗中的应用、CAR-T细胞在胸部肿瘤治疗中的应用、CAR-T细胞在腹腔肿瘤治疗中的应用、CAR-T细胞在泌尿及生殖系统肿瘤治疗中的应用、CAR-T细胞治疗骨肿瘤及皮肤软组织肿瘤、可用于多种实体瘤的靶点、CAR-T细胞治疗实体瘤的现状和展望八节，主要介绍CAR-T细胞在实体瘤治疗中的应用及进展和展望。第四章CAR-T细胞治疗并发症，包括：CAR-T细胞治疗并发症概述、细胞因子风暴、CAR-T细胞治疗相关性脑病、噬血细胞综合征/巨噬细胞活化综合征、其他CAR-T治疗相关并发症五节，主要介绍CAR-T所引起的并发症的原理、诊断和治疗手段等。第五章TCR-T细胞治疗研究进展，包括：TCR-T细胞的定义与肿瘤识别、TCR-T细胞治疗靶抗原的选择、TCR-T细胞治疗流程及影响因素、TCR-T细胞临床试验及存在的问题、TCR-T细胞治疗研究进展五节，主要介绍TCR-T的基本原理、临床应用及进展等。第六章CAR-T研究进展，包括：基因修饰通用型CAR-T细胞的临床应用、CAR-NK研究进展、CAR-T细胞免疫治疗临床推广所面临的工程化挑战三节，主要介绍通用型CAR-T细胞的原理和技术，CAR-NK细胞治疗的原理、现状及进展，CAR-T细胞治疗的工业化生产及进展等。
本书由该领域一线科研、临床工作人员及专家共同编写，力求全面系统地反映基因修饰T细胞治疗技术的发展及展望。本书既涉及基因修饰T细胞技术的基本原理，又较为系统、全面地介绍了该技术在临床前和临床的应用情况，尤其是重点介绍了国内外在该领域的前沿进展，希望对该领域感兴趣的一些生物医学工作者，通过阅读本书初步掌握自行制备CAR-T细胞的方法，作为专业生产制备的参考用书；希望临床医师能够通过本书的介绍，基本了解和掌握CAR-T细胞治疗技术及其临床应用，包括CAR-T细胞治疗临床并发症的诊断和防治等。由于全书各章节所属领域研究工作的深度不同，不同作者的写作风格也有差别，全书在文字上难免有一定的差异；同时，由于近年来CAR-T细胞免疫治疗领域的发展非常迅速，难免会有分歧和争议，敬请广大读者谅解。
本书的出版需要感谢各位作者的辛勤劳动，尤其是中国人民解放军总医院第七医学中心（原解放军陆军总医院）生物治疗中心曹俊霞博士、董杰博士、游嘉博士、武立华医生等同事的努力和奉献！感谢刘金龙、闫志凌、朱峰、平玉、高伟健等对于本书图表的检索及制作而付出的心血！最后，对在本书从准备到出版过程中做出贡献的所有人一并表示感谢！编者2018年12月6日于北京第一章 肿瘤免疫治疗技术及原理第一节 肿瘤免疫治疗简介一、肿瘤免疫治疗基础
1.肿瘤免疫治疗史概述
肿瘤免疫治疗开始于1891年，当时纽约外科医生William B.Coley（1862—1936）发现，细菌产物“科莱毒素”（Coley toxins）对肿瘤有疗效，他开发出了一种专治肿瘤的细菌疫苗，成功地使许多［1］患者肿瘤缩小并治愈。经历了近一个半世纪的发展，现在肿瘤免疫治疗主要包括三类：肿瘤的主动特异性免疫治疗——肿瘤疫苗（包括肿瘤细胞疫苗、DC疫苗、肿瘤多肽疫苗、独特型疫苗和核酸疫苗）、过继性免疫治疗（包括淋巴因子活化的杀伤细胞LAK、肿瘤浸润淋巴细胞TIL、细胞因子诱导的杀伤细胞CIK、供者淋巴细胞输注DLI）和非特异性免疫调节剂。表1-1列举了肿瘤免疫研究中的一些大
［2］事件。［2］表1-1 肿瘤免疫研究中的大事件
1976年， IL-2的发现激发了人们对细胞免疫反应的广泛研究。1985年，发现使用IL-2后转移性黑色素瘤和肾癌出现持久性的消退。1992年，IL-2获准用于治疗转移性肾癌。1998年，IL-2获准用于治疗［2］转移性黑色素瘤。2012年，耶鲁大学的Vincent T. DeVita和NIH的Steven A. Rosenberg联合在《新英格兰医学》杂志发表“癌症研究［3］200年”。文中肯定了免疫调节剂、过继性免疫细胞治疗和基因工程修饰的免疫细胞在癌症治疗方面的临床效果，这为今后免疫疗法治疗肿瘤提供了有力的证据。2014年，耶鲁大学等机构的研究表明，接受免疫检验点PD-1单抗nivolumab治疗黑色素瘤后，出现了令［4］人鼓舞的结果，1年生存率可达62%，2年生存率达43%。2014年，纪念斯隆-凯特琳癌症中心对16名成人难治性、复发性急性淋巴细胞白血病患者进行嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治疗后，患者的完全缓解率达88%，远高于［5］补救性化疗的完全缓解率。
2.抗肿瘤免疫应答基本原理简介（1）机体免疫系统组成 免疫系统分为天然免疫系统和获得性［6］免疫系统两部分。天然免疫是免疫系统的第一道屏障，发生应答的时间非常快。参与天然免疫反应的细胞类型有粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等。获得性免疫是一种特异性的免疫应答反应，与天然免疫相比，具有一定的优势。它能特异识别各种抗原，并对同种抗原具有记忆能力。获得性免疫和天然免疫之间没有明显的界限，两者相互关联。比如NK细胞和γδ T细胞同时兼具天然免疫和获得性免疫的特征（图1-1）。免疫系统诱发机体对外源病原体和内源异常细胞产生保护性免疫力非常重要。正常情况下，体内的某些免疫细胞能及时发现并杀伤体内经常出现的少量异常细胞。免疫细胞能够识别机体内产生的带有新抗原决定簇的突变细胞，并能及时清除这些突变细胞，进而阻止肿瘤的发生、发展。图1-1 天然免疫系统（innate immune system）和获得性免疫系统（adaptive ［7］immune system）天然免疫系统对外源物质提供了速发型应答，这一系统主要由大量的可溶性因子、蛋白质和一
系列的细胞组成，包括粒细胞（granulocyte）、巨噬细胞（macrophage）、树突状细胞（dendritic cell）、肥大细胞（mast cell）和自然杀伤细胞（natural killer cell）等。获得性免疫应++答由抗体、B细胞、CD4/CD8 T细胞组成。NK样T细胞和γδ T细胞同时具有天然和获得性免疫的特征（2）抗肿瘤免疫应答机制 无论是天然固有免疫，还是获得性［7］抗肿瘤免疫，都需要经历三个主要步骤，才能获得有效的抗肿瘤免疫应答反应（图1-2）。①免疫细胞识别、摄取、加工处理肿瘤抗原阶段。免疫应答启动阶段，专职抗原递呈细胞——树突状细胞（DC），必须首先获取肿瘤抗原。这些肿瘤抗原通过在原位被消化，或者被传递到其他组织等形式，成为治疗性疫苗的一部分。DC摄取抗原后被激活，通过对肿瘤抗原肽段的加工、处理等过程，通过MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子，将肿瘤抗原递呈到DC表面。②免疫细胞活化、增殖、分化、成熟阶段。在淋巴组织内，负载肿瘤抗原的DC刺激T细胞，产生特异性T细胞免疫应答，效应细胞以能发挥强烈细胞毒性作+用的CD8 T细胞为主。DC也可以刺激特异性抗体的产生，与NK（natural killer）细胞或者NK样T（natural killer T，NKT）细胞一起，共同参与抗肿瘤免疫应答。③免疫效应阶段。肿瘤特异性T细胞进入肿瘤组织，发挥抗肿瘤免疫杀伤效应功能，同时，Treg等免疫细［7］胞也开始发挥免疫抑制调节作用。了解抗肿瘤免疫应答的三个主要过程，可以在三个方面进行抗肿瘤免疫治疗：促进和优化肿瘤抗原的递呈过程；促进T细胞的活化；改善肿瘤免疫抑制微环境。图1-2 抗肿瘤免疫调节肿瘤细胞释放的肿瘤相关抗原，被DC吞噬、加工、处理后，进入局部引流淋巴结内。在淋巴结内，根据DC所接受的成熟肿瘤抗原的类型，和DC表面分子与T细胞表面不同受体间的相互作用，产生不同的抗肿瘤免疫应答。T细胞表面CD28或者OX40分子，通过与DC表面CD80/86或者OX40L受体的相互作用，激活T细胞产生抗肿瘤免疫应答。若T细胞表面CTLA4与DC表面CD80/86结合，或者T细胞表面PD-1分子与DC表面PD-L1/PD-L2相互作用，则抑制T细胞的免疫活性，并且可能促进Treg细胞的产生。特异性肿瘤抗原刺激活化的T细胞（与B细胞和NK细胞一起），将从淋巴结进入到肿瘤周围。肿瘤细胞通过多种机制产生肿瘤免疫抑制微环境，抵抗效应T细胞的活性。这些免疫抑制形成的机制包括肿瘤细胞表面上调PD-L1/L2，肿瘤细胞释放PGE2、精氨酸酶（arginase）和IDO（indoleamine 2，3-dioxygenase）、VEGF（通过瘤内低［7］氧环境激活），进而抑制T细胞进入肿瘤床和浸润到肿瘤组织中（3）肿瘤免疫抑制微环境 1959年，Burnet和Thomas提出了［8］“免疫监视（tumor immune surveillance）”假说，该假说认为免疫系统能够识别并清除恶性肿瘤，从而抑制了肿瘤的发生发展。尽管机体内具有一系列的免疫监视机制，但仍难以阻止肿瘤的发生和发展。少量肿瘤细胞不易引起机体应答，待肿瘤生长至一定程度，超越了机体免疫应答的能力，肿瘤细胞即得以逃逸。T细胞是肿瘤免疫监视过程中的一个重要成员，是抑制肿瘤微环境的关键因素。正常T细胞通过识别MHC-肿瘤相关抗原复合体来消除肿瘤细胞。由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，肿瘤组织中T细胞的活性明显下降。通过检验点（CTLA-4和PD-1）抑制剂降低T细胞的活化阈值，或回输一定数量［9］的活化T细胞对晚期黑色素瘤患者有明显的效果，提示解除肿瘤免疫抑制微环境能治疗肿瘤。
肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫应答的机制有许多。①可以通过下调其［7］表面MHC-Ⅰ类分子的表达、表达PD-L1等信号分子，产生免疫抑制的微环境，进而抑制T细胞的杀伤活性。②肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌作用，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。肿瘤细胞也可以通过释放免疫抑制因子IDO（indoleamine 2，3-dioxygenase）、TGF-β和IL-10等，来阻止T细胞的免疫监视功能，进一步抑制抗肿瘤免疫应答。释放的免疫抑制因子TGF-β可诱导T细胞分化成为Treg，IL-10能促进M2巨噬细胞的分化。Treg对免疫反应有负向调节的作用。有研究表明，B细胞白血病和淋巴瘤患者体内［10］Tregs水平增高，与B细胞恶性肿瘤的预后成负相关。髓源性抑制细胞MDSC（myeloid derived suppressor cell，MDSC），在肿瘤抑制的微环境中扮演着另一个重要的角色。肿瘤招募免疫抑制细胞，不仅抑制了免疫反应，而且通过释放促进血管生成的因子（VEGFA、FGFβ等）来诱导血管生成。MDSC能够直接抑制NK细胞的功能，并促进免疫抑制T细胞的数量。Tregs、MDSCs和M2巨噬细胞等一起，共同参与肿瘤免疫抑制的微环境、负向调节T细胞的功能，也是肿瘤［11］细胞免疫逃逸的一个重要原因。③血管周细胞也是肿瘤微环境中的重要细胞成分，通常与肿瘤血管的结构相关。在肿瘤组织中，周［12］［13］细胞较少，会使肿瘤组织血管出现渗漏。Hamzah等的研究表明：RGS5作为主要的调控基因，影响着周细胞的成熟，进而出现不正常的血管形态。RGS5缺乏的小鼠中，肿瘤组织中的周细胞呈正常成熟形态，且肿瘤内血管与正常组织中血管的结构类似。（4）免疫调控信号通路简介 免疫应答的精细调节是通过大量的配体、受体（包括协同刺激分子）的相互协调而实现的，它们负责扩大或者抑制初始的免疫应答。通常T细胞受体（TCR）会特异性地识别抗原递呈细胞（APC）递呈的MHC-多肽复合物，这些相互作用既可以发生在二级淋巴器官（此时幼稚T细胞第一次遇到抗原），也［14］可以发生在淋巴结外。有两个独立的信号途径参与T细胞与APC细胞的相互调节作用。第一信号通过T细胞上的TCR识别APCs上肿瘤抗原-MHC复合物。第二信号独立于肿瘤抗原，通过共刺激分子传递。除了T细胞正向调控的共刺激分子，最近也发现了越来越多的T细胞负向调控的共刺激分子， T细胞的耐受或者功能可能由这些因子［14］一起决定（图1-3）。［14］图1-3 在免疫突触中的共刺激和共抑制受体B7RP1—B7-相关蛋白1；BTLA—B和T淋巴细胞减弱子；GAL9—半乳凝素9；HVEM—疱疹病毒进入调节子；ICOS—可诱导的T细胞共刺激信号；TIM3—T细胞膜蛋白3
①T细胞正向调控共刺激分子。正向共刺激信号主要是由表达在幼稚T细胞上的CD28受体来调节的，CD28会与B7.1（CD80）和B7.2（CD86）分子结合，后者表达于激活的APCs上。这种相互作用引起T细胞的增殖并促进T细胞的活化，同时也会产生多种细胞因子++如IL-2等。小鼠实验显示，若CD4 T和CD8 T细胞存在CD28或者其配体B7.1和B7.2分子的缺陷，将会严重削弱二者增殖和产生效应细胞［15］因子的能力。除了CD28以外，ICOS也是CD28家族一个重要的［16］共刺激分子，影响T细胞的激活和功能。ICOS表达在激活的T细胞上，与表达在B细胞、巨噬细胞、内皮细胞和非淋巴结组织上的配体B7RPL结合。在基因敲除小鼠的研究中发现，ICOS与CD28不同，+仅影响T细胞一部分功能。ICOS在效应CD4 T细胞中通过提高NFATc1的表达和下游c-maf的表达，调节IL-4的表达。ICOS还参与［17］IL-21和IL-17表达的调节。最近的研究表明，ICOS也可调节Treg［14］细胞IL-10的分泌。缺乏CD28或者ICOS共刺激信号，仅会导致++免疫功能缺陷，但是观察不到绝对的CD4 T和CD8 T细胞免疫耐受［18］。没有CD28和ICOS共刺激激活的T细胞，会成为免疫耐受的T［16］细胞，并且出现基因转录缺陷。T细胞免疫耐受不仅受正向共刺激分子缺乏的调节，同时也受负向共刺激分子的调节。
②T细胞负向调控共刺激分子。目前，已发现了多种负向共刺激因子，比如CTLA-4、PD-1、B7-S1和B7-H3等。CTLA-4仅在激活的T细胞上受到诱导表达。相对于CD28，CTLA-4是T细胞激活和增殖的负向调节因子。CTLA-4缺陷小鼠在新生期便可由于大量的T细胞激活［19］和组织浸润，出现自发的自身免疫反应甚至死亡。封闭CTLA-4++的表达，能抑制CD4 T细胞的活性，但对于CD8 T细胞则无作用。大量的研究已经提示CTLA-4通过调控Treg细胞的抑制功能，在诱导免疫耐受中发挥重要作用。封闭CTLA-4的表达或者与细胞疫苗结合、放射治疗、手术切除或者热疗等，会提高T细胞介导的免疫应答［20］。ipilimumab，一种人源化的抗CTLA-4单克隆抗体，在治疗黑色素瘤的过程中，可明显提高患者的总体生存率，已经被FDA批准用［21］于治疗晚期黑色素瘤等。PD-1是表达在激活的T细胞、B细胞、单核细胞和NKT细胞表面的另外一种抑制性受体，其配体是PD-L1 ［22］（B7-H1）和PD-L2 （B7-DC）。PD-L1在血液系统、胰岛、心脏、内皮、小肠和胰腺中表达上调。PD-L2的表达则相对局限，主要表达在DC和单核细胞上，可上调激活IFN-γ、GM-CSF和IL-4。在PD-1缺失的小鼠中可以观察到明显的自身免疫反应，提示PD-1在免疫耐受中发挥重要作用。PD-1缺陷会加速NODLtJ小鼠Ⅰ型糖尿病的发生，促进C57BL/6小鼠模型出现关节炎和狼疮性肾小球肾炎。PD-1、++PD-L1信号通路通过抑制CD4T细胞和CD8 T细胞的增殖以及抑制IL-2的产生来发挥作用。PD-1配体，PD-L1和PD-L2在免疫耐受中的作用存在争议，最近的研究认为，PD-L1和PD-L2在体内能下调免疫［23］应答反应，并且维持T细胞对抗原的免疫耐受。PD-L1已经被发现在多种肿瘤中表达，并且显示可以诱导肿瘤特异性T淋巴细胞的凋［14］亡。在使用PD-1抑制剂治疗的临床Ⅰ期试验中，使用人单克隆抗体MDX-1106，已经显示可导致黑色素瘤、结肠癌和肺癌患者的肿［24］瘤转归。
B7-H3属于B7/CD28共刺激分子超家族成员，表达在人类DCs上，［25］可以刺激人类T细胞增殖和IFN-γ的产生。初期的研究提示B7-H3可作为正向共刺激分子促进T细胞活化，但后来的研究却给出了相反++的结论，认为B7-H3可抑制CD4 T细胞和CD8 T细胞的增殖并减少TCR信号激活引起的细胞因子分泌。虽然B7-H3表达于肿瘤细胞中，［14，26］但其在抗肿瘤应答调节中的功能仍存在争议。B7-S1/B7x/B7-H4属于B7超家族，并且广泛表达在淋巴组织和非淋巴组织中。类似于B7-H3，B7-S1在激活的而不是幼稚的T细胞表面有一个受体［27］++。体外研究表明，B7-S1可以抑制CD4T细胞和CD8 T细胞的增殖、细胞周期、细胞因子和毒性T细胞的产生。在体内抑制B7-S1也会导致T细胞依赖的免疫应答的增强和EAE疾病的加重。与PD-L1相似，B7-S1在肿瘤中由TAMs表达。由巨噬细胞TAMs表达的B7-+S1，可以抑制肿瘤抗原特异性CD8 T细胞的增殖和效应功能。在淋［14，巴细胞缺乏的小鼠中阻抑B7-S1，能降低移植肿瘤细胞的生长28］。
随着人们对肿瘤抗原、肿瘤免疫应答和肿瘤免疫抑制微环境等机制的理解，抗肿瘤免疫治疗已逐渐成为可能。二、肿瘤免疫治疗方法及进展简介［29］
根据作用机制，肿瘤免疫治疗分为三类：肿瘤主动特异性免疫治疗、过继性免疫治疗、非特异性免疫治疗。［29］（一） 肿瘤主动特异性免疫治疗
肿瘤主动特异性免疫治疗又称肿瘤疫苗技术，是利用自体或者异体灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞提取物、肿瘤抗原、肿瘤多肽或独特型抗体等，免疫机体和诱导机体产生肿瘤特异性免疫应答，通过机体的免疫系统杀伤肿瘤细胞，阻止肿瘤生长和复发。［30］
1.肿瘤疫苗的分类（1）肿瘤细胞疫苗 是指异体或自体灭活的肿瘤细胞作为疫苗，刺激机体产生抗肿瘤免疫应答，是研究最早的肿瘤疫苗。（2）DC疫苗 是以树突状细胞（dendritic cell， DC）为载体的肿瘤疫苗，通过肿瘤抗原与DC孵育后获得的疫苗，其中比较著名的是Provenge（sipuleucel-T）前列腺癌疫苗。1973年，Steinman和Cohn首次分离出树突状细胞（DC）。DC是主要的专职抗原递呈细胞，能产生强大的抗原递呈能力，诱导机体产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL），是天然免疫和获得性免疫的枢［31］纽。2011年10月3日，诺贝尔生理学或医学奖授予加拿大科学家Ralph M. Steinman和法国科学家霍夫曼（Jules A. Hoffmann）以及美国科学家博伊特勒（Bruce A. Beutler），以表彰他们在免疫学领域［31，32］取得的革命性研究成果。其中Steinman教授的主要贡献是发现DC及其免疫调节作用，Hoffmann和Beutler教授的主要贡献是共同发现识别微生物激活的先天免疫系统的关键受体蛋白。
2010年4月29日，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗药物Provenge上市。Dendreon公司的Provenge是由肿瘤抗原前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）融合在一起组成的。Provenge与传统的肝炎、麻疹等预防性疫苗不同，它是治疗性疫苗，用于前列腺癌患者的治疗。在一项随机、［33］双盲、安慰剂对照的临床试验中（注册号NCT00065442），512例前列腺癌患者被随机按2∶1比例分为两组，一组341例接受Provenge治疗，另外171例作为对照组。结果显示，sipuleucel-T治疗组患者的死亡风险相对下降了22%（P=0.03），sipuleucel-T治疗组与安慰剂组中位生存期分别是25.8个月和21.7个月（P=0.017），治疗组比安慰剂组生存期延长了4.1个月。治疗组的主要不良反应有发热、畏寒、疲劳和疼痛。DC疫苗也被应用于脑胶质瘤的治疗。通过对接受免疫治疗的409名脑胶质瘤患者进行分析，发现DC疫苗能明显提高患者的1年生存率、1.5年生存率、2年生存率、3年生存率、4年生存率和5年生存率，但是对患者的KPS 评分没有明显改善。 DC免疫治+疗能明显提高脑胶质瘤患者体内CD56淋巴细胞，增加IFN-γ的分+++++泌，但是对CD3CD8、CD3CD4和CD16等淋巴细胞亚群的比例［34］没有明显影响。（3）肿瘤蛋白/多肽疫苗 是以肿瘤抗原、肿瘤细胞生长所需的细胞因子为靶点的疫苗。目前国际上已有多种肿瘤多肽疫苗上市，如俄罗斯公共卫生部于2008年批准美国Antigenics公司的肾癌疫苗vitespen（Oncophage，原名HSPPC-96）上市，用于治疗肾癌复发的中危患者。古巴于2009年批准了由古巴分子免疫研究所研发的CIMAvax EGF疫苗，用于非小细胞肺癌的治疗，CIMAvax EGF能诱导机体针对EGF的免疫反应，以阻断癌细胞的增殖。（4）独特型疫苗 通过抗原与抗体结合的特异性，利用某些抗独特型抗体作为抗原的内影像来模拟抗原免疫机体。（5）核酸疫苗 又称DNA疫苗或核酸疫苗，是一种含有肿瘤抗原编码基因的真核表达质粒，通过编码基因在细胞内表达肿瘤抗原，进而诱导机体产生抗肿瘤免疫应答。
截止到2017年，与Provenge同期开展的肿瘤疫苗临床试验绝大多数已经结束，如表1-2所示，总结了进入Ⅲ期临床试验的肿瘤疫苗及其结果。针对前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤的肿瘤疫苗，在能进入到Ⅲ期临床试验的肿瘤疫苗中，绝大多数疫苗在Ⅲ期［30 ］临床试验中以未见总体生存期明显改善而失败。［ 30］表1-2 Ⅲ期肿瘤疫苗产品及试验结果
2.肿瘤新抗原研究进展（1）肿瘤新抗原简介 肿瘤新抗原（neo-antigens）存在于肿瘤细胞中，是细胞基因变异过程中所产生的新抗原的总称。肿瘤新抗原是细胞表面上的分子，通过表达在癌细胞而不是在正常细胞中的突变DNA所产生，使得新抗原成为癌症免疫治疗的理想靶标。细胞恶性变过程中由于基因突变或某些基因的异常表达，都可以产生新的蛋白质分子。这些蛋白质在细胞内被降解后，某些降解的短肽可与MHC-Ⅰ类分子在细胞内结合，并共同递呈在抗原递呈细胞（APC）的表面，+能被CD8 CTL所识别和杀伤。随着基因测序和免疫学技术的不断进步，使得寻找肿瘤新抗原成为可能。科学家可通过高通量基因测序及大数据组学分析，获得特异性针对癌细胞的新抗原序列信息；将这些新抗原体外合成多肽分子，制备个体化肿瘤多肽疫苗；免疫机体产生针对新抗原的特异性细胞毒性T淋巴细胞，进而通过T细胞实现对肿瘤细胞的识别并清除。因考虑到增强肿瘤新抗原特异性T细胞的反应性，防止发生肿瘤免疫逃逸，需要扩大特异性T细胞所覆盖的新抗原的数量，因此，人们一般使用多个特异性新抗原组合，形成针对多靶［35］点的肿瘤新抗原。（2）肿瘤新抗原临床试验进展 因大量肿瘤突变基因都是独有的，每位患者肿瘤的突变基因不同，因此，需要制备个体化肿瘤疫苗。目前肿瘤新抗原临床试验的疗效令人鼓舞，尤其是在黑色素瘤等肿瘤治疗领域。［36］
2014年5月9日，《科学》杂志报道了一例利用体外扩增、能特异性识别因细胞基因突变所产生的异常蛋白的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL），治疗一例接受多次化疗后仍出现肺等多处转移的43岁女性晚期胆管癌患者。医生切除该患者的部分肺转移灶后，从中分离得到了TIL。通过对转移灶组织的全外显子组测序，发现存在有26个基因突变，其中包括能与erbb2蛋白相互作用的ERBB2IP（erbb2 interacting protein）蛋白。将能识别ERBB2IP的TIL体外扩增后回输给患者，治疗2个月时发现患者的原发肿瘤缩小，肺、肝脏上的转移灶也逐渐缩小，治疗7个月时肿瘤体积缩小了30%，并且保持疾病稳定状态达13个月之久。对原发灶和肺转移灶肿瘤标本进行测序分析，证明肿瘤组织中存在ERBB2IP高表达和基因突变。再次输入靶向ERBB2IP的CTL细胞，治疗一个月时观察到肿瘤体积缩小，持续缓解达6个月。［35］
Carreno等测序分析肿瘤和癌旁组织基因表达，鉴别肿瘤特异性抗原。利用计算机分析及体外细胞杀伤实验等，预测出哪些肿瘤抗原最有可能激发机体的免疫反应。分析3例黑色素瘤，每位患者选择7个突变蛋白，注射到患者体内。结果提示这些特异性蛋白多肽可以激发机体特异性抗肿瘤免疫反应。
Dana-Farber癌症研究所和麻省理工学院Broad研究院的Ott等［37］于2017年7月13日在《自然》杂志上报道了靶向肿瘤新抗原的个体化癌症疫苗在黑色素瘤治疗中的应用。10 位高危黑色素瘤术后患者（Ⅲ B/C 期和ⅣM1a/b 期）入组，首先对所有患者进行全基因组测序，比较每位患者的癌细胞和正常细胞，确定每位患者的基因突变情况。在8位患者中发现了与黑色素瘤相关的高频突变，如BRAF、NRAS等。之后，为这8位患者合成了13～20种长肽疫苗（含有15～30个氨基酸）。实验证明这些个体化疫苗的安全性和能产生高度特异性的抗肿瘤免疫反应。最终有 6 位患者接受了完整的个体化抗癌疫苗治疗。4 例 Ⅲ B/C 期患者在25个月内病情稳定无复发，2 例 ⅣM1a/b 期（肺转移）患者发生了复发，但经 4 个疗程 pembrolizumab （抗PD-1抗体）治疗后，获得了完全缓解。根据常规临床数据判断，这类晚期黑色素瘤患者的复发率可高达50%，因此，该研究具有重要的意义，将为癌症治疗带来新的希望。
类似结果在另一组研究中也被发现。德国美因茨约翰尼斯·古腾［38］堡大学医学中心Sahin等通过全基因组测序比较肿瘤组织和正常组织RNA差别，寻找差异表达突变RNA，为每位患者制备了含有10种不同的编码新抗原的RNA片段，注射到区域淋巴结内。13例晚期（Ⅲ 期或 Ⅳ 期）黑色素瘤患者均产生特异性免疫应答，8例患者在接受疫苗治疗后23 个月内无肿瘤复发，其他5例患者在接受疫苗治疗时已经出现肿瘤转移，其中2例患者在接受疫苗治疗后肿瘤缩小，另外1例患者在接受PD-1抗体治疗后得到完全缓解。所有患者均耐受良好，未发生严重的不良反应，疫苗都增强了患者对特定肿瘤抗原的免疫力。（二）过继性免疫治疗
与肿瘤疫苗不同，过继性免疫治疗并不需要机体产生初始免疫应答，这对多种晚期肿瘤患者极具吸引力。以肿瘤抗原为基础的抗体治疗，主要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用以及免疫调节作用等机制调控肿瘤的发生发展。过继性免疫治疗包括过继性细胞免疫治疗和以肿瘤抗原为靶点的抗体治疗，目前已经有多个过继性免疫治疗产品获得FDA批准用于临床。
1.过继性细胞免疫治疗种类
目前已经用于肿瘤治疗的免疫细胞包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK）、NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell， CIK）、肿瘤浸润T淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte cell，TIL）和细胞毒性T淋巴细胞［39， 40］（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）等。（1）LAK细胞免疫治疗 LAK细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）是人外周血单核细胞在含IL-2的培养基中大量扩增而得到的具有肿瘤杀伤活性的免疫细胞。LAK细胞杀伤肿瘤细胞的机制主要是识别肿瘤细胞表面的特异性蛋白分子后，通过释放细胞内毒性颗粒、细胞因子或直接通过膜表面的杀伤分子（如m-LT）发挥杀伤作用。LAK细胞的杀瘤效应广谱，并与其数量和分布有关。1982年，美国NCI的Roserberg研究室首先发现了LAK细胞，用IL-2在体外刺激活化外周血单个核细胞后，可以诱导产生出具有非特异性细胞毒作用的LAK效应［41］细胞。20世纪80～90年代中期，LAK细胞曾是肿瘤免疫治疗研究领域的热点之一，是临床上应用最多的过继性细胞免疫治疗方法，最早应用于黑色素瘤等的治疗，之后在脑胶质瘤等肿瘤的治疗中也出现了大量的文献报道。（2）CIK细胞免疫治疗 CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）是人外周血单个核细胞经多种细胞因子（γ-干扰素、CD3单抗和IL-2［42］等）刺激后获得的一群异质性细胞。最早Schmidt-Wolf等于1991年用IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、CD3单抗、IFN-γ等多种细胞因子共同诱导外周血单核细胞产生的异质性细胞群，兼具T淋巴细胞样强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特性，故又被称为NK++细胞样T细胞。CIK细胞的免疫学特征主要是CD3 CD56 T细胞亚群，+++++其中CD3 CD56 T细胞中，CD3 CD56 CD8 T细胞所占的比例最+---+大，同时表达CD27 CD28或CD27 CD28。有证据表明，CD3 +CD56 T细胞内的颗粒酶含量较高，是CIK细胞的主要效应细胞，也被认为是主要的抗肿瘤活性细胞。CIK细胞在外周血中含量甚微（约1%～5%），用于临床治疗前需在体外进行大量扩增。从患者外周血、脐带血中分离出单个核细胞，加入外源性细胞因子IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、CD3单抗、IFN-γ等进行诱导扩增，通常在3～4周内细胞数达到高峰，体外扩增可超过1000倍以上。所加入的各种外源性细胞因子的作用机制不同，其中CD3单抗能刺激T细胞的增殖，IFN-γ和IL-1β能增加细胞毒活性，IL-2可通过其受体IL-2R、经JAK/STAT信［43］号转导通路促进CIK细胞的增殖。
①CIK细胞的临床应用 CIK细胞已在临床上较为广泛地应用于治疗多种类型的肿瘤，对手术及放化疗后的肿瘤患者具有一定的疗效，能清除微小残留灶、防止肿瘤扩散和复发、减轻放化疗后的毒性［44］反应、提高生活质量等。东京大学Takayama等将150名肝癌（HCC）患者随机分为两组，一组76例接受CIK治疗，另一组74例为对照组。术后6个月内输入CIK共5次，随访4.4年，CIK组术后肝癌复发率减少18%，无复发生存时间延长。结论：CIK治疗HCC安全、易行，降低术后肝癌复发和改善肝癌患者无复发生存期。CIK可以降低肝癌的复发。治疗组和对照组相比，3年内无复发率分别为48%和33%，5年内无复发率分别为38%和22%。可见，CIK治疗组能延长无［44］复发生存时间，且安全性良好。对接受CIK治疗的385例肾癌患者进行统计分析，发现能明显提高患者的1年生存率、2年生存率和3［45］年生存率，使完全缓解率提高到62%。韩国成均馆大学Lee等［46］的多中心、随机、对照CIK联合手术治疗HCC显示：230例肝癌患者在接受手术、射频等治疗后，一组60周内给予自体CIK输入16次，另一组对照。CIK组肿瘤无复发生存时间（PFS）、总体生存率（OS）［47］均提高。韩国成均馆大学Kong等的多中心、随机、对照临床试验显示：180例胶质瘤患者，91例接受CIK联合放疗，89例患者对照。CIK治疗组PFS为8.1个月，而对照组是5.4个月（P=0.0401），提示CIK治疗明显延长PFS，但是对OS无影响，治疗无明显的不良反应。［48］国内任军等分析47例胰腺癌患者CIK联合口服化疗药S-1（氟尿嘧啶类）治疗胰腺癌，结果显示，CIK治疗组患者的OS和PFS均明显升高（P<0.001），且CIK治疗无明显的不良反应。
②CIK细胞治疗的安全性 目前大量的临床试验证明CIK细胞治［49］疗的安全性，因此又被称为“绿色治疗”。Schmeel等分析CIK细胞治疗在45个注册的临床试验中的安全性和有效性。这45个临床试验共包含2729名患者、22种不同的肿瘤类型。结果提示：患者的中位应答率（response rate）是39%，患者的生存率、生活质量明显改善。治疗的副反应轻微，主要是发热、寒战、头疼和疲劳等。解放［50］军总医院Zhang等回顾性分析从2008年3月至2013年10月的5年半时间内，该科室893名患者4088次输入CIK临床治疗肿瘤的情况（平均每名患者接受CIK治疗4.578次），发现CIK治疗组的并发症发生率是5.56%。其中94.88%的患者治疗的并发症较轻微（1～2级），72.56%的患者并发症发生在治疗后24h内。最常见的CIK输入治疗的并发症是发热（0.88%）、寒战（0.56%）和疲劳（0.49%），罕见和严重的并发症包括变态反应性紫癜、肿瘤裂解综合征、过敏性休克和关节疼痛。这893名多次接受CIK治疗的患者，没有出现与CIK治疗相［50］关的死亡病例。该作者的结论：自体CIK治疗恶性肿瘤是非常安全的，并具有较好的耐受性，即使极少数患者出现严重的并发症，也没有出现与输入CIK治疗相关的死亡病例。（3）DC-CIK细胞免疫治疗 DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，DC可识别、递呈抗原，CIK细胞则通过自身细胞毒性及分泌细胞因子等杀伤肿瘤细胞，二者联合培养的DC-CIK细胞，能够产生一群可特异性识别肿瘤抗原的免疫效应细胞，具有更强的增殖和抗肿瘤活性，构成一个高效的细胞免疫防御体系。比如将肿瘤细胞裂解物、肿瘤抗原多肽等加入DC培养基中，再与CIK共同培养，能产生靶向肿瘤抗原的特异性CIK免疫细胞。陆军总医院生物治疗中心王忞、曹俊
［51］霞等统计了12篇关于临床使用DC-CIK治疗晚期非小细胞肺癌的文献，879例非小细胞肺癌患者中，对照组为435例化疗患者，治疗组444例接受化疗联合DC-CIK治疗。其中DC-CIK治疗组采用自体DC、CEA多肽致敏DC和自体肿瘤裂解物致敏DC。统计结果发现，DC-CIK免疫细胞联合化疗组的1年、2年、3年和整体生存率都有显著提高（P<0.05）。DC-CIK治疗对免疫细胞各亚群的比例有明显影++-响，免疫抑制细胞Treg（CD4CD25CD127）显著下调（P<0.05）。DC-CIK治疗后的不良反应一般表现为非感染性发热，一［52］般不需要药物治疗，物理降温1～2天后即可退热。曹俊霞等分析DC-CIK治疗乳腺癌的临床文献，共计633例乳腺癌患者接受DC-CIK免疫治疗后，能明显提高患者的1年生存率，提高KPS 评分，增++++++加CD3、CD4和CD4 CD8 T细胞的比例及CD16单核细胞和CD3 +CD56 NK细胞的比例，增加细胞因子IL-2、IL-12、TNF-α等的水平。［53］曹俊霞等还统计分析了533例结肠癌患者接受DC-CIK免疫治疗联合化疗，发现DC-CIK联合化疗能明显提高结肠癌患者的生存率。（4）TIL细胞免疫治疗 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是存在于肿瘤［54］+周围的一群抗原特异性、异质性淋巴细胞，包括CD3 T细胞、++CD4 T细胞、CD8 T细胞、调节性T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细+胞、巨噬细胞等，其中以CD8 T细胞为主。有证据显示，TIL在肿瘤+周围浸润的程度及CD8 T细胞所占的比例，与肿瘤患者的预后成明［55］显正相关。但部分TIL在肿瘤抑制性微环境中呈免疫耐受状态。基于TIL的过继性细胞治疗（adoptive cell transfer，ACT），是将浸润在肿瘤周围的淋巴细胞分离、体外培养、活化和扩增后，回输到患者体内。体外培养的TIL可以脱离肿瘤免疫抑制微环境的作用，进而再次得到活化。因TIL具有肿瘤特异性好、抗瘤谱广、杀伤活性强，以及可在体外大量扩增等优点，在肿瘤过继免疫治疗中受到较多的关注，已经用于治疗转移性黑色素瘤等肿瘤。Steven Rosenberg研究组［56］报道了一例利用体外扩增、能特异性识别突变蛋白的TIL，治疗一例晚期胆管癌患者。治疗2个月时发现患者的肿瘤开始缩小，肺、肝脏的转移灶也逐渐缩小，治疗7个月时肿瘤体积缩小了30%，并且［57］保持疾病稳定达13个月。Chandran等使用TIL治疗已有远处转移［57］的眼色素层瘤患者。在一单中心、Ⅱ期临床试验中，从手术切除的肿瘤转移灶中分离、制备TIL。共计21例患者接受自体TIL联合IL-2治疗，在可评估的20例患者中，有7例出现肿瘤缩小，其中6例显示部分应答（PR），1例完全应答（CR）。这例有多处肝转移灶的患［58］者已持续21个月无肿瘤复发。河南肿瘤医院生物治疗科将77例Ⅲ期恶性黑色素瘤患者术后分为两组，一组27例给予TIL联合CIK+ IFN-α治疗，另外一组50例给予CIK+ IFN-α治疗。结果提示TIL治疗组疾病无进展生存期（DFS）、总体生存率（OS）均明显高于对照组，提示TIL治疗能使晚期黑色素瘤患者获益。目前临床使用TIL治疗肿瘤时存在的一些问题包括：
①治疗患者的选择 因受治疗个体化TIL的获得及体外成功培养等因素的制约，只能选择部分患者接受TIL治疗。在可以接受TIL治疗的患者中，目前尚不清楚为什么有些患者对治疗反应良好，而有些患者的疗效不理想。目前在TIL治疗的多种恶性肿瘤中，黑色素瘤的疗效最明显，可能与黑色素瘤易产生突变蛋白被机体免疫系统识别有关。在对TIL治疗反应良好的患者中，也存在部分患者在TIL治疗后出现肿瘤复发的问题。
②TIL的优化问题 制约TIL临床应用的因素也包括所制备的TIL的生物学活性、在体内的持续时间、培养后细胞的数量及质量等。
③治疗方案的优化 与其他过继细胞免疫治疗一样，输注TIL治疗肿瘤也需要考虑输注的剂量、间隔时间、输注时间窗的选择、输注次数、与其他肿瘤治疗方法的联合，等等。（5）γδ T细胞免疫治疗 根据T细胞表面抗原受体（T cell receptor，TCR）的类型，T细胞可分成αβ T细胞和γδ T细胞，其中αβ T细胞主要参与获得性免疫应答过程，通过MHC限制性方式识别靶细胞。但是肿瘤细胞可能会通过MHC突变、低表达等方式削弱抗原递呈能力，产生免疫逃逸，阻断αβ T细胞的抗原识别过程。γδ T细+胞是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，占CD3 T细胞的1%～5%，大部分γδ T细胞不表达CD4、CD8分子，有特异性识别抗原功能但是无MHC限制，在机体抗感染免疫、自身免疫疾病和
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