作者：陈宁 编著
出版社：化学工业出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
海洋药物资源开发与利用试读：
前言
海洋是人类赖以生存的家园，孕育着地球上80% 的物种，蕴藏着巨大的生物资源。海洋世界物种丰富，科属众多，其独特的环境孕育了特有的生命现象，几十亿年来，海洋生物在高渗、低温、缺氧的环境下生存、繁衍、进化，使得它们拥有与陆地生物不同的基因组、蛋白质及代谢规律，因此，海洋生物资源成为人类研究开发海洋药物的资源宝库。
海洋中生活着大约6000万种海洋动植物及10亿种微生物，已被记载的生物大约有140万种。20世纪40年代初期，国际上科学家开始着手于海洋药物研究，兴起于60年代末70年代初，90年代形成了研究热潮，取得了一系列令人瞩目的成就，包括海洋生物技术计划、MAST计划、海洋蓝宝石计划、海洋生物开发计划等。到21世纪，海洋研究领域蓬勃发展，总计发现2万余种海洋天然产物，显示出强劲的发展势头，已成为药学、化学研究中最有活力的领域之一。
我国的海洋药物研究兴起于20世纪70年代末期，经过40余年的发展，我国在海洋医药研发方面进步巨大，包括自主研发上市的藻酸双酯钠PSS、多烯康、角鲨烯、海昆肾喜等，发现药用海洋生物1000余种，分离得到海洋小分子天然产物3000余种、海洋多糖及其衍生物500余种，还有多项处于临床研究的药物（K-001、海参多糖、河豚毒素等），表现出巨大的开发潜力。预计在20年内，我国将有一大批海洋类新药上市，主要用于抗肿瘤、抗心血管疾病等。在此研究的推动下，海洋药物学在我国多所高校和研究机构成为新的学科，主要培养从事海洋药物研究与开发的高层次人才，并相继设立海洋药物相关专业、研究方向或课程，海洋药物学已发展成为一个新的药学学科分支。但是，在海洋药物相关教学教育研究中，至今还没有一本系统阐述海洋药用动物、植物、微生物及矿物的专业性著作。《海洋药物资源开发与利用》正是在此背景下孕育而生的。
本书系统介绍了海洋药物的采集与储运方法；同时根据生物种属分类，从生物来源、化学成分、药理作用、活性成分提取及应用等方面介绍海洋药用植物、动物、微生物及矿物，梳理了国内外海洋药物筛选方法，并对海洋药物研究开发的制约因素特别是药源问题进行了深度分析，建议性地提出海洋药物未来发展的方向。
本书是作者在这些年从事海洋药物相关专业研究、同时参与药学专业本科生和研究生的教学工作而积累的大量相关知识和文献基础上，并结合自己的科研工作编著而成的，希望能够对我国海洋药物研发和海洋科学教育水平的提高，以及我国海洋药物研究的发展作出贡献。
本书的编写受到了哈尔滨商业大学在站博士后科研支撑计划（编号：2017BSH001）和哈尔滨商业大学博士启动基金的资助，在此表示感谢。
尽管作者尽最大努力完成本书，力求严谨、准确，但限于学识水平，书中出现不足也在所难免，殷切希望读者在阅读的过程中提出意见，以便完善。陈 宁2019年3月第一章 绪论
自20世纪以来，海洋科学领域蓬勃发展，取得了许多令人瞩目的成就。步入21世纪，新的化学分析手段、高精密仪器的相继出现，推动了海洋生物、海洋化学的进一步发展，同时也加速了海洋学科与药学医学学科的相互交融，使未来海洋药物的研究开发深度展开。
人类赖以生存的地球上有71% 的面积是海洋。海洋不仅是地球万物的生命之源，更是地球上生物资源最丰富的领域。相关统计显示，地球上的生物有近100万种生活在海洋之中，被发现或命名的海洋物种为25万种。这其中除了已为人类所熟知的大型哺乳动物、蟹、贝壳类等生物外，还包括低等生物如海绵、珊瑚等20多万种。这些海洋生物虽不太为人类所熟悉，但它们在海洋生物食物链中占有重要的地位，起着关键的生态作用。
由于海洋生态环境的特殊条件（高压、高盐、缺氧、避光），使得各种海洋生物物种之间存在着非常激烈的生存竞争。海洋生物为能在海洋中严酷的环境下进化、生存，迫使它们在生命过程中代谢产生一些结构特殊、生物活性显著的小分子化学物质，即次生代谢产物。这些小分子化学物质的主要作用是防范潜在天敌的进攻、避免海洋微生物及浮游杂物的附着，以及进行物种之间的信息传递，它们往往具有非常显著的药理生物活性。
由于海洋生物与陆地生物生存环境的不同，导致海洋生物次生代谢产物的生物合成途径和反应系统与陆地生物相比有着巨大的差异，因而海洋生物次生代谢产物有着更大的化学多样性。海洋生物资源的相对完整性、丰富的生物多样性以及其次生代谢产物化学结构的多样性和显著的药理活性，使之成为创新药物研究的重要源泉。特别是现代医药工业的迅猛发展以及人类对治疗重大疾病高效低毒创新药物的迫切需求，使得世界各国，尤其是西方发达国家，纷纷斥巨资用于海洋生物的资源、化学、生态学、生物活性等多方面的研究，目的是为了从海洋生物资源中寻找能有效预防、治疗严重威胁人类生命健康的疾病的创新药物。海洋生物资源是一个巨大的潜在的未来新药来源的宝库已成为一种共识。
20世纪50年代初，海洋生物活性物质研究成为新兴行业，1955年，Bergmann和他的同事Burke在加勒比海域航海研究中，发现一种海绵（Crypthoteca crypta），通过研究，从中分离得到两种罕见的海绵核苷（spon- gothymadine）和海绵尿苷（spongouridine），以此为基础研制的阿糖腺苷（Ara-A）和阿糖胞苷（Ara-C）目前仍然是活跃于临床一线的抗病毒和抗肿瘤的重要药物。1964年，日本京都第三届天然产物化学国际会议报道了河豚毒素（tetrodotoxin）的发现；两年后，抗真菌药物硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）从海洋来源的假单胞菌（Pseudomonas bromoutilis）中发现，这种抗生素目前仍在临床中应用。这一系列的重要发现，引起了广大学者对海洋药物极大的研究兴趣和重视。1967年，美国海洋技术协会（Marine Technology Society of the United States）在罗德岛大学（University of Rhode Island，Kingston）主办了题为“向海洋要药”（Drugs from the Sea）专题讨论会，美国国家癌症研究院（NCI）随后开展了海洋生物抗肿瘤活性筛选，标志着海洋药物研究已成为一门新兴学科。1969年从柳珊瑚（Plexaura homomalla）分离得到前列腺素类似物，前列腺素是具有强烈生理活性和广谱药理效应的化学物质，由于其在自然界中存量极微、合成困难、价格昂贵等，极大地阻碍了对其的深入研究。从柳珊瑚中发现含量丰富的前列腺素，不但具有重要的学术价值，而且具有极高的商业价值，成为当时具有轰动效应的重要事件，并直接导致了第一次海洋天然产物化学研究的高潮。
海洋药物化学与其他学科（海洋科学、药学、生物化学等）的关系十分密切，学科之间相互交融、渗透、关联、影响。科学家在早期的海洋药物化学的研究中，主要是沿袭和借鉴了生物化学和昆虫生态化学的研究方法和方向，以传统的化学提取分离手段进行研究，确定化合物的结构。由于海洋天然产物的分子骨架往往十分特殊、新颖、复杂，而且化合物在生物中的含量很低，从而给结构解析、确定和后期研究带来了相当大的困难，所以开始阶段的研究进展相当缓慢。
20世纪80年代，由于样品采集、储运、提取、鉴定、色谱分离纯化、波谱结构解析等新技术的出现和普遍应用，特别是各种高分辨质谱、高分辨核磁共振技术的迅猛发展，给海洋天然产物的研究带来了极大的推动，使得原来极为困难复杂、耗时耗钱的海洋天然产物结构研究工作变得相对简单，目前甚至不足1 mg的微量样品的复杂结构都能得到确定。新化合物的纯化与鉴定不再是海洋天然产物研究的障碍。而分子水平的生物活性筛选模型及高通量筛选技术的建立，为其生物学活性的发现跟踪提供了技术保障，从而使海洋天然产物研究的高效、精细、目标化和生态化成为可能。由此，以生物活性为先导的对于海洋生物化学成分的研究揭开了新的篇章。
海洋天然产物研究的范围主要包括海洋植物、海洋动物和海洋微生物三大种群，此外还有海洋矿物。由于生态环境的巨大差异，海洋生物的次生代谢产物无论是结构还是生理功能均与陆地生物有很大不同。其分子结构的特点主要表现为分子骨架的重排、迁移和高度氧化，分子结构庞大、复杂、分子中手性原子多。海洋化合物的类型包括萜类、甾体、生物碱、多肽、大环内酯、前列腺素类似物、聚多烯炔化合物、聚醇、聚醚等。海洋次生代谢产物往往结构中含有一些独特的化学官能团，如多卤素取代的化合物，含硫甲氨基的化合物，含氰基、异氰基、异硫氰基的倍半萜和二萜等；许多化合物如以maeganedin A为代表的大环二胺类海洋生物碱的生物合成途径至今仍不清楚。海洋天然产物的复杂分子结构给其结构鉴定带来了极大的挑战。迅速发展的现代波谱学与化学的完美结合与综合运用，为这些化合物的结构鉴定提供了可能的技术手段。一些著名的海洋天然产物如短裸甲藻毒素（brevetoxin B）、草苔虫内酯（bryostatin 1）和岩沙海葵毒素（palytoxin）都是通过化学手段结合波谱技术（包括单晶X衍射）成功确定结构的范例。特别是水溶性聚醚岩沙海葵毒素的结构测定历经10年才得以完成，这是综合运用光谱解析和化学方法确定复杂天然产物结构的一个成功典范，是当今天然产物化学的重大成果。而随后完成的对该化合物的全合成，则被认为是现代化学研究领域的重大进展，并直接影响了海洋天然产物及相关学科的发展达30年之久。
海洋天然产物的另一个重要特点是具有强烈的药理生物活性。以岩沙海葵毒素为例，其毒性比河豚毒素高一个数量级，是毒性最强的非蛋白毒素之一。研究表明，它具有强烈的抗肿瘤活性，以84 μg/kg的剂量给药，就能100%地抑制小鼠艾氏腹水癌；它还是最强的冠状动脉收缩剂，其效能比血管紧张素高100倍以上。令人感兴趣的是，它对离子通道通透性的作用机制与河豚毒素相反，能使钠离子（Na+ ）通道开放。许多海洋化合物显示了多种多样的生物活性，其中以抗菌、抗炎和细胞毒性尤为突出。这些显著的生物活性显示了海洋药物强大的生命力及潜在的药用前景，引起化学家、生物学家、药理学家的广泛兴趣。
美国是世界上最早开展海洋药物研究的国家。美国国立卫生研究院（NIH）癌症研究所（NCI）每年投于海洋药物研究的科研经费占全部天然药物研究经费的一半以上，他们的巨大投入已获得丰厚的回报。近期获批进入市场的3个海洋来源的新药中有2个是NIH前期资助的项目，包括芋螺毒素等目前仍在临床研究阶段，前景看好。在美国科学家的带领下，欧洲、日本及其他国家的学者相继开展了海洋生物的化学、生物学、生态学等多方面的基础研究和针对人类重大常见疾病如肿瘤、心血管疾病的基础研究。日本科学家也从海绵中发现了具有显著抗肿瘤作用的活性物质。
在过去40多年的时间里，海洋天然产物研究取得了飞速迅猛的发展，成为当前国际上一个生机勃勃的新兴学科和热点研究领域。科学家已从海洋植物、无脊椎动物等海洋生物中发现了近两万种海洋天然产物。这些海洋化合物具有多方面的生物活性，如降糖、杀虫、抗炎、抗菌、抗凝血、抗污损、抗肿瘤、抗早老性痴呆等。海洋天然产物的数量以平均每4年增加50%的速度递增。长期的系统研究和持续投入也终于取得了可喜的成果，除了美国FDA已经批准上市的6个海洋新药以外，近十年来进行临床前研究的新药先导化合物多达1450余个，至少有14个进入了临床研究。事实上，还有很多源于海洋天然产物的药物正处于临床研究的不同阶段，只是出于知识产权保护和竞争需要而没有公开。
我国是海洋大国，海域辽阔（享有产权和管辖权的海域面积约300万平方公里），海洋生物资源丰富。目前我国已有记录的海洋生物有20278种，其中生存在南海的物种就有13860种，占到总物种的约70%。我国不仅海洋生物资源丰富，而且还是世界上最早利用海洋生物治疗疾病的国家。在中国古代最早的词典《尔雅》内就有关于蟹、鱼、藻类用作治病药物的记载。而在《本草纲目》中收载的约1892种药物中，来源于海洋湖沼生物的药物有近90种。
我国虽有历史和资源两方面的优势，但由于多方面的原因，在现代海洋天然产物研究方面起步较晚。早期仅有个别学术机构开展了一些零星分散的针对海藻及珊瑚等海洋生物化学成分及生物活性的研究。由于海洋天然产物研究本身存在的困难，加之研究技术手段落后，所以开始阶段的研究与国际上发达国家相比进展相当缓慢，研究工作的深度和广度与世界先进水平相比存在着巨大明显的差距。到了20世纪80年代后期，国际海洋天然产物的研究复苏和二次崛起引起了国家对海洋天然产物研究的重视，也极大地鼓舞了我国海洋天然产物研究人员的积极性，吸引了一批优秀的天然产物化学家投身到海洋天然产物研究的领域中。到20世纪末，我国海洋天然产物研究开始逐步进入高速发展期。据不完全统计，我国迄今发表的600余篇海洋天然产物化学专业论文中，发表于1982年以前的仅50余篇，其中半数来自中国台湾和香港地区，主要都是中文文章，大陆没有英文文章发表。到1995年，中国大陆仅发表英文论文10余篇。从1995年开始，发表英文研究论文的数量逐年明显增多，仅1996年一年就发表10余篇，相当于之前所有英文论文数的总和。自2000年以来，发表的论文数量达到历史之最，英文论文达到近万篇。
21世纪初，大批国外留学科研人员的回归，在带来先进研究技术的同时也带来了崭新的科研理念，广泛开展了对海洋动物、植物和微生物活性成分的研究，取得了一系列研究成果，逐步缩小了与国际先进水平间的差距。这一时期我国海洋天然产物研究领域发表的论文在数量上急剧上升，在质量上明显提高。一个明显的特征就是文章更注重细节，论据更为充分，系统性、完整性更强。在样品的采集、储存、分离纯化及单体化合物的结构鉴定方面更加系统、有序和科学化。从年平均报道的化合物数量来看，2000年之前，中国与北美、日本、欧洲、澳洲及印度等国家和地区均有较大差距；2001—2007的七年间，中国学者每年报道化合物数量年均突破200个，一跃成为全球之首。另外，研究领域也从以活性成分为主导的传统研究模式扩展到海洋生物化学生态学方面的研究，这是海洋天然产物研究方向和理念的重要转变，但主要工作仍没有脱离海洋天然产物发现的主旋律。海洋天然产物化学合成工作相对较弱，生物合成方面的工作几乎没有涉及，而这两个领域恰恰是目前国际上海洋天然产物化学最活跃和最具代表性的领域，说明我国在海洋天然产物的研究方面与国际水平仍然存在较大差距。
海洋生物似乎能提供无穷尽的新天然产物。尤其是近年来，随着相关分析手段的提高和新生物活性筛选模型的发展，海洋生物中新化合物发现的速度和数量均超出了人们的想象，且不断有全新骨架的海洋天然产物被报道。这些研究成果极大地丰富了有机化学的内容，促进了有机化学、药理学、分子生物学等相关学科的发展。虽然海洋新天然产物的数量增长很快，但只占到了陆地生物中发现化合物数量的10%，从已研究的生物资源数量上来看，目前已被测定过的海洋生物种类仅几千种，由此可见，海洋生物的开发与研究具有巨大的潜力和发展空间，是新药发现不可替代的宝贵资源。
海洋药物研究在历经半个多世纪的曲折历程之后，正在逐步地、稳定地向前发展，同时，大量的成果也凸显出海洋中存在着巨大的资源。现代高精密仪器、现代波谱学、现代色谱学及现代分子生物学等相关研究技术的不断突破和迅猛发展为海洋药物研究带来了勃勃生机，大大加速了海洋药物的研究进程。21世纪，在不断进步的科研技术的支持下，海洋药物将继续快速发展。第二章 海洋药物研究的一般方法
海洋药物研究是20世纪中叶派生于天然药物研究的一门新兴学科，早期的研究手段和方法完全借鉴和模仿了天然药物研究方法，一般的研究方法至今也没有脱离天然药物研究的领域和范畴，但基于海洋生物生存环境的艰难苛刻（高盐、高压、缺氧、缺少光照等）以及海洋生物和生物活性物质的多样性等特点，海洋药物研究又有着自身显著的特点：海洋生物中蕴藏着大量化学结构新颖、生物活性极其强烈的物质，活性物质含量极低，导致药源问题一直是海洋药物研究与开发的制约因素之一，寻找可人工再生的、对环境无破坏的、稳定的、经济的药源已成为海洋药物研究领域最紧迫的课题；一些海洋物质活性极强但毒性较大，后续的结构改造和药理研究工作量较大。一般来讲，海洋药物研究的一般方法包括海洋生物样品的采集、活性筛选与活性先导化合物的发现、化合物的结构优化及构效关系研究、临床前药理和毒理研究及临床试验等几个主要步骤。其中，先导物的发现是海洋药物开发的基础和源泉，对于某些存在着活性较低或毒性较大的活性成分，通过结构优化以获得活性更高、毒性更小的新的化学成分。药理学研究为阐明药物作用机制、改善药物质量、提高药物疗效、开发新药、发现药物新用途和探索细胞生理生化及病理过程提供实验资料等。第一节 样品采集一、文献调研
文献调研主要是指搜集、鉴别、整理文献，并通过对文献的研究形成对事实的科学认识的方法。文献调研是一种古老而又富有生命力的科学研究方法。由于海洋生物种类繁多，在自然界36个动物门中，海洋生物就有35个门，其中13个是海洋特有的门类。地球上81% 的动物栖息在海洋中，此外，还存在大量的海洋植物和海洋微生物，因此，海洋生物中蕴藏着大量化学结构新颖、生物活性极强的物质。
我国是海洋大国，海域辽阔，纵跨暖温带、亚热带和热带3个气候带，存在的生物物种、生态类型和群落结构方面有显著的多样性特点。因此，在进行海洋生物样品的采集前，要进行必要的文献调研，主要包括调研采集样品的动物学、生态学分布；采集样品的生物资源利用度；了解生物的种属特性、外观特征、分布海域、生长环境以及采集时需要注意的事项；了解其化学成分、活性报道等学术研究方面的内容；充分调研后方可进行样品采集。二、采集方式与采样记录（一）采集方式
海洋生物样品采集与陆地生物采集的方法具有很大区别，采集样品的时候，具体的采集方法视所采集的生物种类、生物特征和生存条件的不同而异，采集方法主要包括以下几种。
1．海洋动物样品的采集
海洋动物大多生存在海平面下30～300 m的领域，这给采集带来了很大困难，特别是对于新鲜样品的采集，采集后应立即冷冻保存或加无水乙醇进行防腐，装入准备好的密封容器。在采集某些海洋动物的分泌物或毒液时，如海蛇毒液、芋螺毒液等，采集时应尽量保证捕捉到活的生物个体，并采用与其栖息环境相似的条件饲养，也可在现场即刻采取毒液等样品，如在研究毒芋螺的过程中，有人用艾本德（Eppendorf）试管挖去盖子，放入鱼鳍，再在鱼鳍上覆一层薄膜，吸引毒芋螺吮吸试管使其将毒液排入试管中。应挑选体长大致相似的个体，如果壳上有附着物，应用不锈钢刀或较硬的毛刷去除，彼此相连的个体应用刀分开，用现场海水冲刷干净后，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存。
2．海洋植物样品的采集
海洋植物大多生存在海底，少数浮游在海洋中层，也有一些漂浮在海面。采集海底植物样品后，用适量海水冲洗干净，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存或现场摊晾、晒干后包装。对于水体中的微藻类植物可直接采集海水，通过滤膜过滤（孔径0.6 μm）富集微藻；对于较大的浮游微藻可用浮游生物网（孔径10 μm）采集和浓缩；水表漂浮的微藻可用无菌的平板将表层海水转入无菌容器中获得；对于生活在生物或非生物结构表面的微藻，可用无菌小刀将微生物的表面膜刮下，也可将琼脂平板放在微生物定居的表面；微藻寄生的较小的植物和动物可潜水获得；浮游动物可用网收集；底柄型微藻可用载玻片收集，将载玻片放于水体底积物中一段时间，让附着型微藻定居在上面；对沉积物中的微藻也可采用将沉积物铺于琼脂平板表面的方法收集，或将沉积物悬液涂布于分离平板；对空气中的微藻可用敞开的液体培养基或平板收集。样品采集后必须在短时间内进行观察、鉴定和分离，因为有些重要的藻体在几小时后就开始解体，导致样品中藻类的多样性下降，存活种类减少。
3．海洋微生物样品的采集
海洋微生物主要存在于海水、海底沉积物、浸泡于海水中的纤维物质、木头、碎石、植物根部、红树植物、微藻类、海草、含有孢子的海水泡沫、海洋动物及动物尸体等。对于海水和海泥，可用采样器采集，采集后进行剥离、过滤等操作；对于纤维物质、木头等，可直接采集，进行剥离；对于植物、动物等样品最好立即或尽快进行目的菌的分离，如无条件，则要将样品暂存于4～8℃的低温环境中。（二）采样记录
采样记录是指采集样品时做的必要记录，记录的完整性对海洋资源的考察及生物样本的富集都有重要作用。首先要记录样品的地理位置（海域、深度等），这是因为很多生物活性物质受环境的影响较大，有时比受遗传的影响还大；其次，记录采样时间，因为某些海洋生物离开海洋后，由于生存条件的变化，自身可能发生相应的生理生化改变；此外，还要记录生物的性别、长度、颜色、生长阶段等，这些也是影响其代谢产物活性的重要因素。
采集样品时尽量保持生物个体不受损伤。栖息在岩石或其他附着物上的个体，要用凿子凿取；栖息在沙底或泥底的生物个体可用铲子铲取或用铁钩子扒取。如条件许可，应尽量挑选完好且大小相近的生物个体并记录体长（贝类应记录壳长、壳高和壳宽）。三、采集方法
采集方法是指对特殊的采取样本进行采集时所应用的不同的技术手段。从潮汐地带到水深千米的世界各大海洋区域均有海洋生物的存在，原料的采集常需使用船只，离海岸远的则要使用大型船只，采集深水生物甚至需要使用潜水器等设备。常用的样品采集方式主要有三种，即潜水采集、拖网采集、机械手等深海采集方式。（一）潜水采集
潜水采集必须由经过科研潜水培训且有生物学知识的潜水员或者具有丰富实践经验的渔民来完成，常受以下因素的限制：天气因素、潜水深度、每天下水次数、连续采集的人数以及潜水的危险性。海洋生物采集的危险性比陆地生物样品的采集大得多，故需要周密计划，并对人员进行专业培训。
对于浅水区域（<30 m），一般采取浮潜或者佩戴水肺等便携设备的潜水方式。过去由于技术原因，样品采集只能在浅水海域，现在这个障碍已经被突破，人工操作潜水器的应用使得采集者可以深入水下1000 m采集样品。尽管目前样品采集工作还要靠潜水员人工进行，但今后的趋势是越来越多地运用新技术，比如20世纪90年代，无人遥控潜水装置（remote operated vehicles，ROV）的应用已使采集可以到达更深的海域。（二）拖网采集
拖网采集不需要专业的科研人员进行采集，主要依靠渔民。渔民采用拖网作业时，渔网在捕捞鱼群的同时，亦可以捕获到多种多样的其他海洋生物，包括一些在海底生存的低等生物。专业人员可随船对捕获物进行辨识、捡拾及存储，以获得所需的研究样品。为了大量采集某一特定的海洋生物样品，可以雇用专门的海洋科考船到该生物富集海域进行拖网捕捞；如仅以收集多种海洋生物样本进行活性筛选为目的，研究人员可以搭乘远洋渔船，在其捕捞作业时进行收集，这可节省研究成本。
拖网采集也有一定的局限性。比如小型的鱼类虾类可以从渔网漏出，难以采集；浮游生物很容易破碎而漏出渔网，因此长期未被人们发现；还有一些大型鱼类容易挣脱渔网而逃走。直到1985年使用人工操作的潜水装置采集并进行活性筛选后，才引起科学家的兴趣。（三）机械手等深海采集
21世纪，机械自动化、机器人以及对于海洋认识程度的提升发展，对于海洋活性物质样本的研究不单单停留在浅水区域，深海区域的样本也越来越引起了科研工作者的关注，但是随着下潜深度的增加，海水产生的巨大压力以及低温环境对潜水设备的要求也越来越高，例如我国研发的“蛟龙号”载人潜水器设计最大下潜深度为8000 m，工作范围可覆盖全球海洋区域的99.8%，对于深海样本的采集研究有着重大的意义。（四）其他采集方式
所要研究的生物样品不同，采样的采集方式也会有所区别：对于一些生存于滩涂或潮汐地区的生物样品，可以在落潮时直接去捡拾、挖掘，而不必动用船只；有些生物喜附生于水产养殖的缆绳或鱼箱上，可请渔民协助收集；在某些特殊的气候条件下，如台风过后，海底的生物常会被大量卷集到岸边，可趁机去捡拾。四、样品的处理与保存
海洋生物样品采集后要进行相关记录，包括品种鉴定、处理并运输至实验室，在研究前还要经历一段储藏期，存储条件需要进行充分准备，以免发生样品腐败或者降解。（一）处理
生物样品采集后，在使用前应尽可能保持原料的新鲜状态，避免晒干或风干。在海上采集到的样品运输到实验室通常要花费较长时间，这给原料保存带来了难度。因此，采集后最好立即用液氮或干冰冻结，或保存在其他冷冻设施中，以冷冻状态带回实验室；也可以用乙醇等合适的有机溶剂浸渍保存。为了保持生物材料中的活性成分免遭破坏，最好避免长时间保存不用。
1．冷冻保存
采集过程中可携带液氮罐或干冰储器来保存样品，如无条件也可在保温桶或泡沫塑料箱中放入冰块来存放。少量样品可置聚乙烯袋中，压出袋内空气，将袋口打结，与样品标签一起放入另一聚乙烯袋（或洁净广口玻璃瓶）中，封口，冷冻保存。对于成分未知或含肽类等易变活性成分的生物样品应尽量采用此种方式。
2．有机溶剂浸渍保存
样品采集后浸渍乙醇等有机溶剂，密封入塑料袋或桶中，可防止腐败变质现象的发生，运回实验室后也可直接用于提取活性成分。此法简易，便于操作，是海洋生物样品的常规处理保存方法，但对含有有机溶剂变性成分（如多肽）的样品不适用。
3．晒干或晾干保存
晒干或晾干处理经常会损失部分有效成分，但在已知活性成分较稳定或大批量采集时也可使用。在晴朗天气采集后立即摊晾在沙滩上晒干或风干，可防腐败霉变，利于保存及运输。一些大型藻类采集时常用此法。
4．活体饲养
需用活体样品研究时，采集后应营造与生物个体生存环境相近的条件饲养，并尽早运回实验室。物种不同，饲养条件也有很大差异，有些物种可能难以饲养或饲养的代价高昂。（二）运输
样品采集后应尽早运回实验室处理。在前述现场处理的基础上，把样品放入样品箱（或塑料桶）中，封闭严实，并对照采样记录和样品登记表清点，填好装箱单和送样单，由专人负责。采用适合的交通工具，将样品运回实验室冷冻（−20℃以下的冰柜）保存或进行提取。（三）生物种类鉴定
生物材料采集后，必须确定种属。由于海洋生物种类繁多，鉴定比较困难。首先可对照文献图谱辨认，但对于非生物分类学家而言，即使有图谱亦难以确定种类，更何况很多海洋生物没有现成的图谱可供借鉴，因此，有必要请海洋生物分类学专家帮助鉴定。如无专家同行，应制作并保存好完整标本以待鉴定。第二节 活性先导化合物的发现
海洋生物活性物质是指从海洋生物中分离的具有生物活性的天然物质，探索药用活性物质是当前最活跃的研究领域之一。海洋生物活性物质有与陆地天然产物或合成产物不同的特点，如微量、高活性及活性多样性等。因此，海洋生物样品的初筛需要多种筛选模型，在活性确定后的分离纯化研究中也要尽量贯彻活性跟踪的原则，如此才会有满意的结果。一、有效部位的处理
通常采用海洋生物的提取部位进行活性筛选，而非通常的总提取物。这是因为，海洋生物中含有大量的无机盐（海水中就含有3.0%），这些无机盐会干扰某些分析结果，此外，由无机盐引起的皂化也是一个问题。
海洋生物样品的处理有其特殊性，如常用的动物性样品多需在低温下进行匀浆处理，或进行冷冻干燥粉碎等。但是，总体处理方法与陆地生物样品是相似的，其提取体系也包括水相提取体系和有机相提取体系两种，纯化过程也多用柱色谱体系，近些年来，超临界CO萃2取技术在海洋生物活性物质的提取分离中已得到应用，在分离纯化鱼油和多管藻中不饱和脂肪酸的研究开发方面已获得成功。
超临界CO萃取法（supercritical CO fluid extraction，SFE-CO）222的优点是用无毒、不残留的CO代替有机溶剂或水作为萃取介质并在2接近室温的条件下萃取；超临界CO溶剂的性质，在很广的范围内可2以调控，只要简单地改变温度或压力就可使溶质在CO中的溶解度发2生很大的变化，这为高度选择性提取和分离提供了可能性；其最大的优点是将萃取、分离、纯化和除去溶剂等过程合而为一，从而简化工艺流程、提高效率，不像有机溶剂会污染环境，又不像水的提取物有变质腐烂等问题。二、活性初筛
海洋生物种类繁多，数量巨大，它们产生的千万种代谢产物亦结构各异、功能不同。如何从中发现我们所需要的活性代谢产物是一个高度技术性、技巧性和工作量甚大的工程。可见，在海洋生物活性物质研究的过程中，活性筛选的作用至关重要。
活性筛选的发展经历了三个不同的阶段。第一阶段：仅是有目的地寻找某类已知的活性化合物及其类似物，通过测定不同生物中感兴趣的化合物的含量就可达到目的，活性测定方法仅作为参考证据。第二阶段：研究目的是寻找具有某种生物活性的物质，但这种物质可能为未知物，这需要采用某一筛选模型对大量样品进行广泛筛选，在确定样品具有活性后再开展深入研究。当前多数研究尚处于此阶段。但这种筛选模式仅采用某一特定的药理模型（如抗癌活性模型），会造成很多不具有该药理作用的活性成分被漏筛。为此，常采用高通量筛选方法（high throughput screening，HTS），即采用多种药理模型，在分子、受体水平上对大量样品进行快速、高效、低成本的活性筛选工作。近年来，人类基因组计划的成功实施，使生物医学领域进入了一个崭新的时代，高内涵筛选（high content screening，HCS）正逐步成为一种全新的新药研究手段（第三阶段）。通过研究基因编码的蛋白质在生理或病理状态下的功能变化、与其他生物大分子（如RNA、DNA等）的相互作用以及对信号转导途径的影响，有助于深入认识各种疾病发生发展的分子机制，发现新的药物作用靶点。（一）常用的筛选模型
根据所选用的材料、药物作用对象以及操作特点的不同，又可将活性筛选模型分为三大类：整体动物水平模型、组织器官水平模型、细胞及分子水平模型。（1）整体动物水平模型与传统筛选程序 用整体动物进行药物筛选，是长期以来备受重视的方法，单纯从新药筛选的角度看，此模型的最大优点是可以从整体水平直观地反映药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用。由整体动物模型获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床价值和应用前景具有重要价值。
由于整体动物的特殊性，决定了筛选过程主要依赖于手工操作，且样品量有限，特别是目前在实验动物身上复制出的病理模型太少，因此，此模型具有显著的局限性、低效率和高成本等不足之处。（2）组织器官水平模型和体外药物筛选方法 通过观察药物对特定组织或器官的作用，可以分析药物的作用原理和可能具有的药理作用。应用组织器官模型筛选药物，是药物筛选技术的一大进步。其缺点主要是规模小、效率低、反映药物作用有限、对样品的需求量仍然较大、不易实现一药多筛等，此外，人工操作技术要求高等也是影响这种方法在药物筛选中应用的主要原因之一。（3）细胞、分子水平模型和高通量药物筛选 细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学、病理学等学科的发展，为观察药物作用提供了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现并应用到药物研究和药物筛选实践中。细胞、分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选等特点，已成为目前药物筛选的主要方法。此模型的应用为自动化奠定了基础，由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选。（4）高内涵筛选 所谓高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，并获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内涵筛选技术的检测范围包括靶点激活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。虽然高通量药物筛选的结果较为准确，易于评价，但其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，如化合物对细胞产生的多种特异效应包括毒性作用。通过同步应用报告基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等高内涵筛选常规检测技术，研究人员可以在新药研究的早期阶段获得活性化合物对细胞产生的多重效应的详细数据，包括细胞毒性、代谢调节和对其他靶点的非特异性作用等，从而显著提高发现先导化合物的速率。（二）常用的筛选方法
生物活性的筛选方法各式各样，筛选效率直接与实验的设计有关，靶标越明确，越有可能获得特定活性的产物，因此，如果对病理和药理方面有越深入越具体的了解，就越有利于筛选，以下筛选模型大多已被海洋生物活性物质研究者采用。
1．抗菌活性
抗菌活性筛选是目前应用非常广泛的活性筛选方法之一，特别是在药用微生物和抗生素的筛选上，本方法起着举足轻重的作用。抗菌活性筛选主要包括抗细菌、抗真菌和抗支原体药物的筛选。（1）抗细菌药物筛选 一般根据WHO规定的标准方法，即Bauer-Kirby纸片法进行药效测定。而厌氧菌是一类对游离氧敏感的衍生物，生长需要一定的厌氧环境，目前对抗厌氧菌药物筛选尚无一种公认的标准方法。筛选中心采用微量液体稀释法筛选抗变形链球菌药物和琼脂稀释法筛选抗幽门螺杆菌药物。（2）抗真菌药物筛选 真菌是高级进化的微生物，种类多，生长发育过程复杂，菌体可分化成菌丝型和酵母型，对药物的敏感性不同。在新药筛选时，除用纸片法或稀释法测定药效、测量抑菌丝外，还要仔细观察被测物质是否阻止分生孢子萌发，抑制菌丝生长扩散，或造成菌丝畸形等。筛选中心采用琼脂稀释法进行药物筛选和活性测定。（3）抗支原体药物筛选 支原体是介于病毒和细菌之间没有细胞壁的微生物，广泛分布于自然界，能引起人类和动植物的感染以及各种组织细胞培养的污染。支原体能在特殊的培养条件下生长繁殖，引起pH变化，故采用颜色改变单位测定其生长状况。当被测物质发挥生长抑制效应或杀灭支原体时，含有指示剂的培养基不再变色，据此判断药效。
2．观察对动物的影响（l）对动物幼体的定殖或变态的抑制 环节动物、鲍鱼以及咸水虾的幼体可用于检测样品对动物的毒性或其他影响。通常把多个幼体置于样品液中，然后观察对致死性或对变态过程、定殖效果、虫室形成等方面的影响。（2）对无脊椎动物运动的影响 在加有样品的溶液中，如果一个饲养着的水螅或其他动物总是保持收缩状态，则认为是遇到了有毒性的代谢物。（3）金鱼毒性试验 样品对小金鱼的影响，可表现为致死或失去平衡等。（4）通过器官和生理系统检测 检测对心脏、血压、肌肉等的作用活性。
3．细胞水平筛选
利用多种来源清楚、病理分析明确且对药物敏感的人恶性肿瘤细胞株，在细胞培养板上观察被测物质在体外对肿瘤细胞的生长抑制或杀伤作用；采用四氮唑盐酶还原法或磺酰罗丹明B法测定化合物对肿瘤细胞的生物效应。
4．酶抑制剂筛选法
已知多种病症是因为特定酶的活性增强或减弱而引起的，以该酶为靶标筛选抑制剂或激动剂，将大大增加获得适用的活性代谢物的可能性。这是一种针对具体靶标分子的筛选方法，比起应用整个动物或整个细胞作为试验靶标有其优越之处。
应用酶抑制剂（激动剂）筛选法，可以获得具有抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗炎以及降血脂、降血压等活性的代谢物；抗肿瘤活性筛选的靶酶有DNA拓扑异构酶、芳香酶、法尼基转移酶、蛋白激酶等；抗血栓形成活性筛选的靶酶有凝血酶、血小板活化因子酰基转移酶等；抗病毒活性筛选的靶酶有蛋白酶、与复制有关的酶等；抗糖尿病活性筛选的靶酶有醛糖还原酶等；抗炎活性筛选的靶酶有溶磷脂酶、磷脂酶A、脂氨酶等；抗神经退化活性筛选的靶酶有乙酰胆2碱酯酶（需要同时筛选对丁酰胆碱酯酶不抑制的活性）；降血脂活性筛选的靶酶有鲨烯合成酶、脂酰辅酶A、胆固醇酰基转移酶（A-CAT）、p-羟基-p-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）等；降血压活性筛选的靶酶有肾上腺素合成酶、内皮素转换酶等。
5．免疫调节活性代谢物的筛选法
免疫调节分为免疫活性增强和免疫活性抑制，在医学上分别有极其重要的作用，可通过皮肤注射反应来观察样品对抗原免疫反应的增强或抑制作用，也可在体外应用淋巴细胞进行免疫试验。
6．受体拮抗活性筛选
每一生化反应系统都有严密的机制进行调控，信号分子往往需要与受体分子结合而启动生理、生化过程。如样品能与受体亲和结合，则会与正常信号分子产生竞争，从而抑制该生化过程。用于抗肿瘤活性筛选的受体包括非甾类雌激素受体或雄激素受体等；用于抗血栓活性筛选的受体包括纤维蛋白原受体；用于降血压活性筛选的受体包括内皮素受体、血管紧张素受体。
7．抗病毒的活性筛选
通过体外抗病毒实验和体内抗病毒药效得出样品的细胞毒性、细胞抗病毒作用（如以细胞致病效应及感染细胞保护率为指标）和体内抗病毒药效。
8．其他活性筛选
其他如神经系统、抗炎、心血管疾病药物、抗氧化等筛选均是采取离体实验（离体的细胞、组织和器官等病理模型）和在体实验（病理动物模型）进行多方法、多指标结合的筛选。根据筛选内容的不同在不同筛选方法上各有侧重。三、活性化合物的分离纯化
按照上述提取法得到的海洋生物粗提物通常是一种混合物，需要进一步分离、纯化才能获得单一的化合物。具体做法随着海洋生物物种及其活性物质性质的不同而异。（一）溶剂分离法
通常总提取物是一种浸膏（溶于水、乙醇或CO），这些浸膏常2常是胶状物，难以均匀地分散在低极性溶剂中而影响分离效果。此时可拌入适量硅藻土或纤维粉等惰性填料。然后低温或自然干燥，经粉碎后，选用3～4种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分别进行分离。此种溶剂分离法（solvent isolation）可使其活性物质在不同极性的溶剂中由于溶解度的差异而得到分离。
如果是水浓缩液，可以一次选择几种与水不相混溶的有机溶剂，分成若干部位，或者析出某杂质，从而达到分离纯化的目的。目前，海藻多糖和甲壳质多糖等的提取分离，多数是采用水溶解、浓缩、加入乙醇或丙酮析出的办法。此外，也可以利用某些成分能在酸或碱中溶解，又通过加碱或加酸改变溶液的pH，成为不溶物而析出，从而达到分离纯化的目的。
常用有机溶剂的极性大小顺序为：甲醇>乙醇>丙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>苯>环己烷>石油醚。（二）沉淀法
在海洋生物的水提取物中加入某些无机盐（铅盐、氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙等）或某些试剂（氢氧化钡、氢氧化铝、明矾、乙醇），可以使有机酸、氨基酸、蛋白质、酸性苷类和部分黄酮或生物碱产生沉淀，这种沉淀法（deposition）可得到有效成分或除去杂质。乙醇是使用最广泛的沉淀剂，乙醇沉淀法既可以定量回收多糖，又是一种简单的分级分离方法。如果使用铅盐要注意彻底脱除铅。脱铅的试剂有硫化氢、硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等，硫化氢脱铅比较彻底，但要设法除去溶液中过量的硫化氢。如从海人草中获得海人草酸就是使用铅盐沉淀法。（三）透析法
透析法（dialysis）是利用无机盐、单糖、二糖等小分子物质在溶液中可通过膜（透析、超滤、反渗透等），而大分子物质不能通过膜的性质，从而达到分离纯化的目的。膜分离过程具有在常温、无相变的条件下实现物质分离和可利用低品位原料以及不产生环境污染等特点，是一项高效、节能的新技术，常使用此方法分离纯化海洋生物中的多糖、多肽、苷类和蛋白质等。膜的分离效率与透析膜、超滤膜、反渗透膜的类型和质量有关。
透析膜有天然的蛋白质胶膜、动物膜、火棉胶膜和高分子合成材料的超滤膜和反渗透膜（纤维素膜、硅橡胶膜）。在透析过程中要经常更换试剂，使膜内外溶液的浓度差大，必要时可通过加热或搅拌来提高透过率。有时还可以采用点透析法，即在渗透膜等两边的溶剂上放置两个电极，接通电路，膜内带正电荷的无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电荷的无机阴离子、有机酸等向阳极移动，中性化合物及高分子化合物仍留在渗透膜内。透析法已广泛应用于制备多糖时的脱盐、浓缩工作，已成功地从海洋动物中提取分离出具有抗肿瘤作用的黏多糖和从海带中制取甘露醇等。（四）重结晶法
多数海洋生物活性物质在常温下是固体物质，可以根据溶解度的不同，使用结晶法来达到分离纯化的目的。一般被结晶出来的晶体，大部分是比较纯的化合物，但并不一定是单一化合物，有时结晶体也有混合物，此时可考虑通过多次重结晶的办法得到比较纯的单一化合物。如果结晶后的化合物纯度还不够高，就必须改用其他办法。另外，有些化合物即使达到很纯的程度，还是不能被结晶，只是呈无定形粉末状固体。例如，海洋生物中的苷类、多糖类等物质。
通常来说，将并不是结晶状的物质处理成结晶状物质的过程叫结晶，而将比较不纯的结晶体用结晶法精制得到较纯的结晶体叫重结晶。海洋生物中的活性产物通常用重结晶法（recrystallization）进行纯化。要做好这样两个过程必须选择合适的条件：①一般来说，活性物质在被结晶的混合物中含量越高越容易结晶，所以海洋生物的总提取物需要进行必要的除杂过程才能进行结晶；②要注意选择合适的溶剂和适量的溶剂，合适的溶剂最好是在热时对所需要成分的溶解度大，在冷时溶解度小，溶剂的沸点亦不宜太高；③有些化合物不易结晶，可制备成盐类（有机酸盐）或乙酰衍生物（含羟基化合物等），则变得容易结晶。
方法是使用适量的溶剂，在加热的情况下将混合物溶解，放置至室温，即达到过饱和溶液状态，让其结晶。如果在室温下还不能析出结晶体，可放置在冰箱中。有时结晶体的形成常常需要2～3天，甚至更长时间才能结晶。制备结晶溶液可以选用单一溶剂，也可以选用混合溶剂。通常是先将混合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶溶剂，直到溶液呈浑浊状态，并将此溶液微微加热，使溶液完全澄清后放置，让其结晶。（五）色谱法
1．薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）
薄层色谱法通常是将吸附剂均匀地分布在平面板如玻璃板上，用毛细管把分析的样品（少量溶剂溶解）点加到薄层上，使溶剂挥发，然后在装有合适溶剂的密封器中展开，当展开剂的前沿到达适当的位置后，取出薄层板并使展开剂完全挥发，显色检查薄层板上的斑点，判断某一化合物是否纯或者某些成分的分离效果如何。这是一种快速、微量、简便的色谱方法。如用柱色谱难以将某些混合物分离或样品较少（数十毫克）时，往往采用TCL能获得纯的化合物。
注意：①展开剂与柱色谱的冲洗剂相同；②展开时点在薄层板上的样品，切勿浸入溶剂中，展开剂的展开高度以3/4为宜；③显色的方法有紫外线灯、碘蒸气和喷洒显色剂等；④某一成分的最适分离条件通常是R=0.2～0.6。f
2．柱色谱法（column chromatography）
通常装有填充剂的柱色谱分离方法是一种广泛用于海洋生物活性物质的实验室分离纯化的方法。由于填充剂的不同，可分为吸附柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶柱色谱等。填充剂是决定柱效的重要因素，要根据被分离化合物的类型来决定选用何种类型的柱色谱法。（1）吸附柱色谱（adsorption chromatography） 吸附柱色谱一般是将分离的物质吸附在色谱柱内的吸附剂（填充剂）上，然后用冲洗剂进行冲洗，收集各种流分，按照被分离的物质的特性进行检测（可用TCL），来判断其分离效果。由于吸附剂对不同化合物的吸附、解脱能力大小不同，从而达到分离纯化的目的。吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。洗脱剂与溶剂分离法中常用的溶剂相同，多采用混合溶剂。吸附剂的颗粒直径越小，直径范围越窄，其分离效果越好。如果吸附剂的颗粒太小，冲洗剂的流速太慢，可以采用加压或者减压的方法，提高冲洗剂的流速。（2）离子交换柱色谱（ion exchange chromatography） 离子交换柱色谱用离子型的合成树脂作为固定相，用水溶液作为流动相。在洗脱过程中，流动相中的离子性物质与固定相中的交换基进行离子交换反应而被吸附，当遇到新的交换溶液时发生解脱作用，这是一个动态的平衡过程，利用各种物质的洗脱能力的不同，经过多次的吸附、解脱过程，从而达到分离纯化的目的。此方法适合氨基酸、蛋白质、多糖等化合物的分离纯化。
固定相为离子交换树脂，可分为阳离子交换树脂（含—SOH、3—COOH、—POH等基团的树脂）和阴离子交换树脂［含—32N(CH)X、—NR、—NHR、—NH等基团的树脂］。3322
固定相为大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin），这是一种不含离子交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附材料。大孔树脂分为低极性吸附树脂和高极性吸附树脂两种，这种树脂是一种吸附、洗脱能力较强的树脂，适用于水溶性的低极性和非极性化合物的分离纯化，其脱盐效果比其他树脂都好。
流动相多数是使用水，有时也使用水-甲醇混合溶剂，甚至有时还在溶液中加入乙酸、氨水等缓冲剂。（3）凝胶柱色谱（gel filtration chromatography）
① 葡聚糖凝胶G 通常是以葡聚糖凝胶G和聚丙烯酰胺凝胶作为固定相。凝胶是一种具有一定交联度的多羟基多孔三维空间网状结构的聚合物。这种凝胶柱色谱均在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当的水溶液中浸泡，待充分膨胀后装入色谱柱，加样后用相同的溶液进行冲洗。在冲洗过程中，样品较小的分子进入凝胶的网孔中，较大的分子不能进入网孔而随着流动相流动，这是一个动态平衡过程。由于被分离物质的分子量不同，所以流出液的各种组分是按照分子量的大小顺序排列的，从而达到分离纯化的目的。
② 葡聚糖凝胶LH 固定相是在葡聚糖凝胶G的分子中引入羟丙基2基团的凝胶，它既具有亲水性，又具有亲脂性，可以在多种有机溶剂中膨胀，适用于一些难溶于水、亲脂性的有机物的分离纯化。流动相使用的是甲醇、氯仿等有机溶剂。（4）高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 现代高效液相色谱法采用的色谱柱是内径为1～3 mm、长为10~30 cm的内壁抛光的不锈钢管，内装有2～10 μm微粒的固定相，用输液泵在高压（30～60 MPa）下将洗脱剂输入柱内，流动相快速（1～10 mL/min）流出。同时，配有高灵敏度的检测器和自动扫描仪及馏分收集仪。从进样品到检测过程都在一个封闭体系中进行，实现了仪器化、连续化操作。
现代高效液相色谱法与气相色谱法和经典液相色谱法相比，具有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高和应用范围广泛等优点，特别适合于大分子、高沸点、极性大和稳定性较差的海洋生物活性物质的分析和制备工作。通常是在室温下操作，只要样品在流动相中有一定的溶解度便可以进行工作，有时为了提高柱效或改善分离效果可以升高柱温，但不应超过65℃。四、活性化合物的结构鉴定
所需要的生物活性物质分离纯化之后要进行结构测定，只有确切地了解活性物质的化学结构，才可能更好地了解其结构与功能之间的关系，从而有可能对分子进行修饰，增强其活性或进行化学合成。
测定结构常用到红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振谱（NMR）、质谱（MS）、旋光谱（ORD）、圆二色谱（CD）、蛋白质和核酸序列分析，以及X射线晶体衍射分析等技术。仅靠一种分析方法通常难以确定分子结构，常常需要多种方法相互配合才有可能确定，特别是要确定一种未知化合物的分子结构更是如此。红外光谱是记录有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的吸收光谱，常用来确定各种羰基、烷基、芳环及炔烃等基团的特征吸收峰；紫外光谱是记录有机分子在吸收紫外光后产生电子振动而形成的吸收光谱，常用来测定分子内的共轭系统；质谱是研究物质粒子的质量谱，使用质谱仪，仅需几微克甚至更少的样品，就能精密地得到化合物的分子量和分子式，同时，因为各类化合物在质谱裂解中有一定的规律，从质谱的碎片及其相互关系可以得到分子结构的线索，质谱在海洋生物活性物质的结构测定中成了不可缺少的工具。近年来，质谱技术发展很快，现在已有很多种离子源的质谱技术，如电子轰击质谱（EI-MS）、场离子质谱（FI-MS）、场解析质谱（FD-MS）、化学离子质谱（CI-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。质谱除可用来确定分子量外，还可得到大量的结构信息，可用来推导结构，目前新发展的一种激光解吸飞行时间质谱（MAL-TOF-MS）对生物分子分析十分有用。
核磁共振谱也许是有机分子结构测定中最重要也是发展最快的，表现在两个方面：一是采用超导磁铁如500 MHz、600 MHz或1000 MHz等高磁场NMR技术的开发应用；二是采用脉冲傅里叶变换的脉冲技术开发。迄今已开发了数百种脉冲系列及各种二维（2D-NMR）及三维（3D-NMR）技术。有机分子一般由碳、氢组成，氢谱和碳谱1及相关谱对有机分子测定至为重要。氢谱（H NMR）提供了分子中13氢原子的数目及其化学环境以及氢与氢之间的一些关系。碳谱（C NMR）可以提供很多信息，包括碳原子数目、所处的化学环境。碳谱的一些技术，如DEPT技术能指定分子中CH、CH、CH以及季32碳、双键羰基等功能团。二维磁共振中最常用的有质子-质子相关谱11（H-H - COSY）、杂原子相关谱（如同碳的碳氢相关HMQC、远程碳-氢相关谱如HMBC等），还有NOESY、ROESY相关谱等，用这些技术可以显示分子中质子与质子、质子与碳原子等的相关系统，从而对推导分子骨架结构与功能团的位置起到重要作用。
三维共振技术是近年发展起来的最新技术。对于分子量很大又非常复杂的化合物，2D-NMR谱上各种峰之间存在严重重叠，以致无法解释和归属，3D-NMR技术的发明，极大地提高了信号的分辨率，它是在2D-NMR上引入第三领域，理想地减少2D-NMR的重叠度。利用3D-NMR技术可测定分子量近15000的蛋白质的一、二级结构。旋光
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]