作者：李莉,池景良
出版社：辽宁科学技术出版社
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秸秆生物降解技术研究与应用（辽宁省优秀自然科学著作）试读：
前言
我国设施农业自20世纪50年代起步发展，到本世纪初进入了规模快速发展阶段。2010年全国设施蔬菜面积达5020万亩，净产值5800多亿元。设施农业的发展既保障了城市农产品的供给又为提高农村经济发展和农民增收作出巨大贡献。辽宁是设施农业的发源地，截至2011年年底，设施农业面积已达1061万亩，规模居全国第一。但由于设施农业的集约化大生产造成品种单一、种植密度大、复种指数高、连做频率大、不合理施肥等因素，加之，辽宁属北方寒冷地区，2冬季大棚地温和温室中CO浓度低下，出现了设施土壤质量退化、病虫害加重等问题，从而导致蔬菜产量和质量下降，限制了设施蔬菜的可持续发展。而如何解决这些问题，也正是农业种植栽培专家所关注和重视的。辽宁省微生物科学研究院利用微生物的广泛适应性和多功能性，针对秸秆的主要成分特性研究的秸秆生物降解技术正是在此基础上深化开展来的，它可以全方位地解决上述问题，实现设施农业的增产增收。
秸秆生物降解技术是利用高效降解秸秆的微生物复合菌剂在对施入土壤秸秆定向快速腐熟，改善设施蔬菜生产环境的同时，还具有提高土壤质量、防治病虫害、促进作物生长、提高产量、改善产品品质等功能，是一项现代农业生物工程创新技术，也是一项引发“设施土壤革命”的新技术。推广应用该技术，减少了秸秆资源的浪费，实现2了CO的减量排放，减少了化肥农药的用量，实现低碳农业和循环农业。该项技术的应用，对秸秆资源化利用，提高农产品产量和改善农产品质量，保障设施农业可持续发展，加速农业产业结构调整，增加农民收入，使设施农业真正成为强农富农和城市农产品供给工程等都具有重大的意义。项目推广过程中，恰逢国家正在进行大田土壤有机质提升技术的推广，加速了该技术的推广速度和应用范围。本书是总结秸秆生物降解技术研究与应用工作，并广泛参考国内外在设施蔬菜生产、微生物对秸秆的降解、土壤有机质提升等相关研究成果的基础上编写而成的，希望能在初步总结此技术的基础上，为我国农业工作者相关工作提供一点借鉴、参考的便利，能为促进农民增收、农业增效、农业生产的良性循环和可持续发展提供科学的技术支撑作出一些贡献，并在实践中不断完善、改进、创新，从而在农业发展中发挥更大作用。
本书共分十章。第一章、第六章由李莉、王志学执笔，第二章、第四章由池景良、赵新海执笔，第三章由赵新海执笔，第五章由李鑫执笔，第七章由王志学、赵新海、桓明辉执笔，第八章、第九章由桓明辉、孙翠焕执笔，第十章由池景良执笔。全书插图由李鑫、池景良提供，全书由李莉、池景良统稿。
本项目在研究与应用过程中得到沈阳农业大学黄毅教授、孙军德教授的指导和帮助；得到朝阳市老科技工作者协会和项目转化单位辽宁宏阳生物有限公司的大力支持和帮助，在此一并表示感谢。
由于作者水平、才识所限，加之撰写时间仓促，虽经再三思考和斟酌，或仍有收罗未当、涵盖未全、叙述未清、表意未明等疏忽之处，敬请读者批评指正。
本书的出版，得到辽宁省科协优秀自然科学专著基金的资助，谨致谢意。第一章具有降解秸秆功能的微生物种类及其分离方法
秸秆生物降解技术是通过利用具有分解秸秆中大分子物质，如纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等功能的真菌、细菌，根据不同的目的及使用方法，将秸秆中的大分子进行部分或完全分解，在充分利用秸秆资源的同时大幅度提高蔬菜产量、改善蔬菜品质的现代农业生物工程创新技术，是一项引发“土壤革命”和“设施农业革命”的新技术。该项技术的应用对秸秆资源化利用、提高农产品产量和改善农产品质量、保障设施农业可持续发展、加速农业产业结构调整、增加农民收入，使设施农业真正成为强农富农和城市农产品供给工程等都具有重大的意义。本书中所指的秸秆生物降解是利用具有分解秸秆功能的各种真菌、细菌接种于种植行下人为放置在地下的秸秆表面，覆盖土壤，在其上种植各种作物，在微生物作用下秸秆中的大分子物质2被部分分解，降解为葡萄糖、短链脂肪酸、氨基酸或CO供农作物生长利用，同时提高地温、改良设施土壤，促进作物生长。一、具有分解秸秆作用的微生物（一）真菌
秸秆是成熟农作物茎叶（穗）部分的总称。通常指小麦、水稻、玉米、薯类、油料、棉花、甘蔗、蔬菜和其他农作物在收获籽实、果实后的剩余部分。秸秆主要是由碳、氢、氧等元素组成的一系列有机物质，如纤维素、半纤维素、木质素等高分子聚合物，其中纤维素占31%~40%、半纤维素35%~48%、木质素15%~25%。秸秆分解主要是分解其中的纤维素、半纤维素、木质素。
具有分解纤维素作用的真菌：纤维素酶是多组分酶，不同微生物所合成纤维素酶组分不同，对纤维素降解效果相差很大，目前国内外研究应用最多的菌种是木霉属（Trichoderma）真菌，由其产生的酶系比例协调，对纤维素分解效果最好。以下真菌都具有分解纤维素的能力：Alternaria，Aspergillus，Chaetomium，Coprinus，Fomes，Fusarium，Myrothecium，Penicillium，Polyporus，Rhizoctonia，Rhizopus，Tramentes，Trichothecium，Verticillium，Zygorynchus。
具有分解半纤维素作用的真菌：大多数具有纤维素分解能力的真菌都能分解半纤维素，并且具有很高的胞外半纤维素酶活性，如：Alternaria，Fusarium，Trichothecium，Aspergillus，Rhizpous，Zygorynchus，Chaetomium，Helminthosporium，Penicillium，Coriolus，Fomes，Polyporus。
具有分解木质素作用的真菌包括：在自然界中完全降解木质素需要各种微生物菌群的协同作用，白腐真菌是目前已知的唯一能在培养基上将木质素彻底降解为二氧化碳和水的一类微生物，目前，研究最多的白腐真菌有黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporiumburdsal）、变色栓菌（Trametes bersicolor）、烟管菌（Bjerkandere adusta），食用菌类，如：香菇（Lentinus edodes）、平菇（Pleurotus streatus）等。下列真菌也都具有分解木质素的能力，如：Clavaria，Clitocybe，Collybia，Flammula，Hypholoma，Lepiota，Mycena，Pholiota，Arthrobotrys，Cephalosporium，Humicola。（二）细菌
具有分解纤维素作用的细菌：土壤中的假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）及动物瘤胃中的瘤胃球菌（Ruminococcus）、堆肥中的诺卡氏菌（Nocar-dia）、节杆菌（Arthrobacter）、链霉菌（Streptomyces）都具有很强的纤维素分解能力，其他细菌：如：Angiococcus，Cellfalcicula，Cellulomonas，Cellvibrio，Clostridium，Cytophaga，Polyanngium，Sorangium，Sporocytophaga，Vibrio、Micromonpora，Strep-tosorangium等都有一定的纤维素分解能力。
具有分解半纤维素作用的细菌：具有分解纤维素的细菌基本都具有分解半纤维素的作用，如：Bacillus，Achromobacter，Pseudomonas，Cytophaga，Lactobacillus，Vibrio，Streptomyces等。
具有分解木质素作用的细菌：使用细菌分解木质素的研究很少，目前已知的种类有Pseudomonas，Flavobacterium。二、具有分解秸秆作用的微生物纯培养菌种筛选分离方法（一）样品选择
从土壤中有机质含量高的土壤样品、食草性动物的肠道、粪便、腐烂的秸秆、枯枝落叶、朽木等样品中进行菌种筛选，筛选出有效菌种的概率相对高。（二）筛选方法
用两种方法——稀释平板法或组织分离法直接筛选，先富集培养再进行筛选，先用富集培养基连续进行富集培养，再进行稀释平板法筛选。24244
富集培养基配方：KHPO 2.0g，KHPO 0.5g，（NH）2442SO1.0g，MgSO 0.3g，CaCl 0.3g，秸秆20.0g，蒸馏水1000mL（秸秆称量后，加水浸泡1h，将水倒掉，目的是尽量去除秸秆中多余的还原糖，然后使用）。4244
刚果红一纤维素培养基：（NH）SO 2.0g，MgSO 0.5g，24KHPO 1.0g，NaCl 0.5g，CMC-Na 20.0g，刚果红0.2g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL，pH自然。2424
愈创木酚变色反应培养基：KHPO 1.0g，NaHPO 0.2g，42B1242MgSO·7HO 0.5g，V0.1mg，CaCl 0.1mg，FeSO·7HO 0.1mg，4242ZnSO·7HO 0.01mg，CuSO·5HO 0.2mg，愈创木酚100mg/L，43NHNO 8.06mg，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH至5.0。
细菌纯化用培养基：营养琼脂培养基。
真菌纯化用培养基：PDA培养基。24
液体产酶培养基：秸秆粉10.0g，麦麸5.0g，KHPO 2.0g，
42442（NH）SO 1.4g，MgSO 0.3g，CaCl 0.3g，蒸馏水1000mL，pH自然。
固体产酶培养基：秸秆粉和麦麸按照4∶1比例混合均匀，加水至含水量为65%左右。
富集培养方法：取样品5.0g，加入到100mL富集培养基中，28℃恒温振荡培养5d，吸取10mL培养液到新的富集培养基中继续培养，连续进行富集培养3~5代，再进行产纤维素酶、木质素酶菌种的筛选。
产纤维素酶菌种初筛：吸取富集培养3~5代后的培养液1mL，加入到9mL无菌水中，做连续梯度稀释，取稀释液0.1mL分别涂在刚果红一纤维素培养基、愈创木酚变色反应培养基上，培养3~5d，纤维素产生菌选择透明圈大或者透明圈与菌落直径比例大的菌落进行纯化培养，木质素酶产生菌选择变色圈大的菌种进行纯化培养。（三）酶活性测试方法
纤维素酶活测定：采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）。
木质素酶活测定：ABTS分光光度法。三、具有秸秆分解作用复合菌种筛选方法
筛选方法有两种，一种是直接富集培养，培养后的菌种直接用来做菌种进行生产；另一种是将筛选到的菌种进行相容性试验及产酶活性试验，将能够相容且复合使用比单独使用产生酶活高的组合作为菌种进行生产。（一）富集培养法
按照菌种筛选方法中的富集培养法进行菌种筛选，筛选出的就是复合菌种，此种方法筛选出的菌种相互协调，菌种活性高，培养方法简单。但是该类菌种组成变化大，随培养条件（温度、时间等）、秸秆种类、秸秆产地等有很大的变化，并且其中的菌种种类、数量都无法确定，都属于未知，不利于产品申报。（二）纯菌种复合培养法
使用单一菌种用于秸秆降解，容易得到纯培养，生产方法简单。但是单一菌种其产生的酶种类有限，多数菌种只具备产生纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶中的1~2种酶，而秸秆中主要成分纤维素、木质素、半纤维素的完全降解需要3种酶的同时存在。因此，在秸秆降解菌种的生产中，需要对产生不同酶的菌种进行复合，以便生产出能完全降解秸秆中的纤维素、木质素、半纤维素的菌种（秸秆中除含有纤维素、半纤维素、木质素外，还含有蛋白质、粗脂肪、果胶质等物质，完全降解秸秆需要更多的菌种参与，在生产实践中很难做到，因此在秸秆降解菌种的筛选过程中，只针对其中的主要成分进行菌种筛选）。
菌种间相容性确定方法：对峙培养法。
细菌与细菌或酵母菌之间的相容性：在营养琼脂培养基平板上，点接两种菌种，两种菌种距离1cm，接种后，28~30℃培养3d，观察有无拮抗线。
细菌或酵母菌与丝状真菌的相容性：①细菌或酵母菌与真菌之间的相容性：先划线接种细菌或酵母，呈三角环围形，约占平板面积的2/3，再于平板培养基中央点接丝状真菌。28~30℃，培养3~5d，观察记录两菌间有无拮抗线。②细菌或酵母菌与真菌之间的相容性：同时点接细菌或酵母菌与丝状真菌，两点之间距离2~3cm，28~30℃，培养3~5d，观察记录两菌间有无拮抗线。
丝状真菌之间相容性：
将不同丝状真菌分别涂平板培养7d，用打孔器切下直径为8mm的菌饼，分别接种于定量培养基的平板的两端，两个菌饼之间的距离大于5cm，于25℃培养3~5d，观察有无拮抗线。
如果有拮抗线，说明两种菌种不能同时培养，或者说不能同时应用于同一个产品中；如果没有拮抗线，则说明两个菌种间可能应用于同一个产品中。
混合培养法：应用菌种筛选中使用的液体或固体培养基同时接种两个或两个以上的菌种（每个菌种提前检测活菌数），同时用相同的培养基分别接种单一菌种，25~30℃培养5d，检测其纤维素酶、木质素酶活性及每种菌的活菌数。如果复合培养物的酶活性高于各单一培养物的酶活性，并且所接各种菌的活菌数都有增加，则此组合可以应用与生产。如果复合培养物的酶活性低于各单一培养物的酶活性或所接各种菌的活菌数都下降或部分下降，则不能应用于生产。四、菌种定殖能力测试方法
秸秆中主要成分的降解需要各种相应酶来完成，而土壤中降解秸秆相应酶的数量相对少，降解秸秆需要时间长，在短时间内降解秸秆需要田间产生各种酶的微生物，添加到秸秆周围的微生物菌种正常生长繁殖，才能不断地向细胞外分泌各种酶，而添加到秸秆中的菌种受土壤抑菌作用的影响，多数菌种不能像无其他杂菌状态下一样生长，添加到土壤中后，多数菌种会被抑制而不能萌发，处于休眠状态或很快被其他土壤细菌杀死。因此，所筛选的菌种必须是在有秸秆存在的情况下，能够在土壤中长时间存活，并快速生长繁殖的菌种，才能够有效分解秸秆，也就是筛选的菌种必须是在土壤中定殖能力强的菌种，只有这样的菌种才具有使用价值。
菌种定殖力测试前需要进行菌种标记，标记方法有抗生素标记、绿色荧光标记等，具体方法详见第二章。第二章秸秆生物降解高效复合菌群的构建
秸秆含有纤维素、半纤维素、木质素等有机质及作物生长所需的大量元素和微量元素。秸秆在设施土壤中，通过秸秆高效降解微生物2菌群的作用，被定向快速分解，产生热量可以提高地温；产生CO可以提高作物光合效率；其分解中间产物可以供作物生长所需，增加土壤有机质；秸秆分解过程可以增加土壤酶活性，优化土壤微生物种群结构，提高土壤生物活性，减少病虫害发生；秸秆分解过程可以固定一定数量的氮源，实现氮肥缓释，减少化肥用量；从而改善设施农业2越冬生产的不利环境，提高作物的产量和品质，减少CO向大气中的排放，实现秸秆在设施农业中的资源化、环保化利用。本项研究根据酶工程学理论，筛选秸秆高效降解菌种；根据微生物生态学理论构建秸秆高效降解复合微生物菌群；根据微生物形态学理论、基因工程理论及遗传学理论，对秸秆高效降解微生物菌株进行微生物分类鉴定和遗传学分析。一、复合微生物菌群的构建（一）秸秆降解菌种分离纯化
秸秆主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，因此筛选高效纤维素、半纤维素、木质素分解菌，是利用微生物转化秸秆的关键。在本试验中对采集的各类样品和收集的相关菌剂进行了分离，并建立了以秸秆粉为唯一营养源的筛选模型，旨在为缩短初筛时间，快速、简单、有效地筛选到大量的产纤维素酶菌株，为进一步的复筛及今后的生产提供菌种。
1.材料与方法（1）试验材料
试验材料见表2-1。表2-1 自采样品及购入的相关产品（2）培养基
马丁氏培养基－筛选真菌用。
牛肉膏蛋白胨琼脂－筛选细菌用。
改良高氏1号培养基－筛选放线菌用。
秸秆粉培养基：称取20g秸秆粉，加水1000mL，搅拌均匀，加热，加20g琼脂，不断搅拌使琼脂熔化，防止锅底烧煳。待琼脂全部熔化时，取三角瓶和试管分装后，121℃灭菌30min，试管摆放成斜面，备用。（3）菌种分离方法
样品稀释：准确称取0.5g样品，放入已经事先灭菌的、装有玻璃珠和50mL无菌水的三角瓶中，置于振荡器上振荡30min，使细胞分散，-2-2静置1min，即成10稀释液，用移液器吸取1mL 10稀释液，移于装-3有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，连续稀释成10，-4-5-6-7-8-910，10，10，10，10，10稀释度。
涂抹平板法：先将各种培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用移液器（枪头灭菌）吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设置2次重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，由低浓度向高浓度涂抹。将涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，于27℃培养箱里培养，至菌落长出后即可分离并计数。
组织分离法：对于从外观看霉层明显，不易采用稀释法的样品，采取组织分离法分离，即先将材料先用70%酒精浸泡30 s，然后用镊子夹住在火焰上将酒精烧去，随后用灭菌的解剖刀将组织的表层去掉，剩余的部分切成小块组织，用镊子将其放入事先标记好的平板中，每平板上均匀摆放4点。每个样品2次重复。
样品中菌数的计算方法：（培养皿内菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数）/样品的重量。
2.结果与分析（1）不同培养基对分离菌数的影响
不同培养基对分离菌数的影响见表2-2。表2-2 样品在不同培养基上菌数情况比较注：表中数据为3次重复平均值。
采用秸秆粉作为唯一营养源的秸秆粉培养基上可以生长真菌、细菌、放线菌，从琼脂板空白对照上无菌落生长，可以明确能够在秸秆粉培养基上生长的菌体是利用秸秆中的某些成分才得以生存繁殖，从表2-2中可以看出，与马丁氏培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂和改良高氏1号培养基等经典微生物培养基相比秸秆粉培养基在真菌、细菌及放线菌菌数上有所减少。由于在不同的培养基上菌落的生长形态不同，不易比较菌群是否有差别，单从菌落形态上看，3种培养基的菌株种类共约有21种，而秸秆粉培养基仅约11种菌落，说明秸秆粉培养基可以筛掉大量不能利用秸秆的菌种，大大减少了工作量，因此本筛选方法可以作为秸秆降解菌的快速筛选方法。（2）菌种分离、纯化及保藏
菌种分离、纯化及保藏见表2-3。表2-3 菌种分离、纯化及保藏情况 cfu/g
3.结论与讨论
从20个样品中共分离到菌株202株，其中真菌123株、细菌52株、放线菌27株。
菌种筛选是微生物应用研究的第一步，也是最为重要步骤。为了花费最少的工作量，在更短的时间里取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。菌种分离工作以量为主，应尽可能快速、简单。本试验建立了用于降解秸秆的纤维素酶产生菌的初筛模型，将原来的前期工作量减小为1/3。（二）产纤维素酶菌种、产木质素酶菌种初筛
对从样本中分离纯化到的菌种，利用定性鉴别培养基进行产纤维素酶、木质素酶的菌种进行初筛。
1.材料与方法（1）菌株
从样品中分离的菌株，其中细菌52株、放线菌27株、真菌123株。（2）培养基
纤维素酶产生菌的鉴别：应用刚果红纤维素培养基（g/L）：2442KHPO 0.5g，MgSO·7HO 0.5g，琼脂14.0g，明胶20.0g，纤维素粉1.88g，刚果红0.2g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0。
木质素酶产生菌的鉴别：采用添加愈创木酚的变色反应培养基24（g/L）：KHPO 1.0g，NaH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，242VB10.1mg，CaCl 0.1mg，FeSO4·7H2O 0.1mg，ZnSO·7HO 42430.01mg，CuSO·5HO 0.2mg，愈创木酚100mg/L，NHNO 8.06mg，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH至5.0。（3）方法
产纤维素酶菌种确定：将菌种接种于刚果红纤维素培养基，28℃培养2~5d，根据透明圈大小对纤维素分解能力强的菌株进行初步筛选。
产木质素酶菌种确定：将初步获得的纯菌株接种在添加愈创木酚的变色反应培养基上，培养2~5d，根据变色圈大小对木质素酶活力强的菌株进行初步筛选。
2.结果
筛选获得具有纤维素酶活和木质素酶活的菌株共计45株，其中细菌12株、放线菌7株、真菌26株。其菌落形态及显微形态见表2-4~表2-6。表2-4 细菌菌株菌落形态及显微形态描述表2-5 放线菌菌株菌落形态及显微形态描述表2-6 真菌菌株菌落形态及显微形态描述（三）产纤维素酶和产木质素酶菌种复筛
对初筛确定的菌种，通过纤维素酶、木质素酶活性测定，进行复筛。
1.材料与方法（1）菌种
初筛得到的45株菌，其中细菌12株、放线菌7株、真菌26株。（2）液体复筛培养基
麸皮3.0%、玉米面3.0%、豆粕2%、稻壳1%、硫酸铵1.5%、磷酸二氢钾0.1%。（3）方法
将供试菌株接种于培养液中，28℃，培养7d。分别测定纤维素酶和产木质素酶酶活力。（4）酶活测定
纤维素酶活测定：采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）。
木质素酶活测定：室温下，用等体积0.5mmol/ L的2，2′-连氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）（简称ABTS）和稀释酶液反应，测定反应的前3min内反应液在420 nm处的吸光值的变化量，以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，以1min使1μmol/L ABTS转化所需的酶量为1个活力单位（U）。
2.结果4
已知ABTS氧化产物在420 nm处的摩尔消光系数ε为3.6×10。
产纤维素酶筛选菌种结果见表2-7，产木质素酶菌种筛选结果见表2-8。表2-7 液态发酵纤维素酶酶活的测定表2-8 液态发酵木质素酶酶活的测定
3.结论
从表2-7和表2-8可以看出，按纤维素酶和木质素酶酶活性大小，确定B-01-6，B-09-2，B-15-1，B-01-2，F-01-6，F-05-1，F-10-12，F-08-3，4225，4230，4236等11株菌种为下一步研究用菌株。（四）构建秸秆高效降解菌群所需菌种筛选
秸秆含有纤维素、半纤维素、木质素等主要成分，需要多种酶协同作用才能完全分解，单一的微生物分泌的酶系不能满足秸秆分解需要，因此需要构建能够分泌秸秆分解全酶系的复合菌群来完成对秸秆的全降解。对复筛获得的产纤维素酶、木质素酶菌种通过种间生态关系、土壤定殖能力等研究，确定组成秸秆降解复合菌群的菌株，构建复合菌群。
1.产酶菌种的种间关系研究（1）材料与方法
①菌种
B-01-6，B-09-2，B-15-1，B-01-2，F-01-6，F-05-1，F-10-12，F-08-3，4225，4230，4236。
②培养基
PDA培养基。
③方法
采用对峙法。
细菌和真菌之间的相容性：先划线接种细菌或酵母，呈三角环围形，约占平板面积的2/3，再于平板培养基中央点接霉菌。30℃、培养72h，观察记录两菌菌落交界处各自生长情况，以确定该组合菌株间是否产生拮抗作用或其他共生关系。
霉菌和大型丝状真菌之间的相容性：将活化的菌丝沿菌落的边缘切下直径为8mm的菌饼，分别接种于定量培养基的平板上，3个重复，于25℃培养3d，然后接种直径为8mm的木霉菌块，继续培养，每天观察，记录菌丝生长情况。（2）结果
①细菌和真菌之间的相容性
细菌和真菌之间的相容性见图2-1~图2-7。图2-1 B-15-1和F-10-12的拮抗性图2-2 B-01-6和F-05-1的拮抗性图2-3 B-09-2和F-01-6的拮抗性图2-4 B-01-2和F-08-3的拮抗性图2-5 B-01-6和4225的拮抗性图2-6 B-09-2和4230的拮抗性图2-7 B-15-1和4236的拮抗性
②霉菌和大型丝状真菌之间的相容性
霉菌和大型丝状真菌之间的相容性见图2-8。图2-8 F-01-6，F-05-1，F-10-12与F-08-3，4225，4230，4236之间的拮抗性（3）结论
上述实验结果表明，将相容性较好的B-01-6和B-09-2，F-01-6和F-05-1，4225和4230作为下一步研究的试验菌株。
2.菌种土壤定殖能力研究（1）室内菌种定殖率测试
①材料与方法
材料：大棚土，阴干、粉碎、过20目筛（土壤中养分含量：碱解氮165.2mg/kg，有效磷65.7mg/kg，速效钾128.5mg/kg，有机质2.6%）。
菌种：B-01-6，B-09-2，F-01-6，F-05-1，4225，4230。培养基：PDA（真菌）、营养琼脂培养基（细菌）。
培养方法：在培养皿中放10g大棚土，干热灭菌，冷却后，加80.1mL菌悬液（浓度大约10cfu/mL），用封口膜封口，室温条件下放置，每隔30d取3套平皿测试菌种存活率（阴干后测试）。
测试方法：稀释平板法。
②结果
不同菌种在无菌土中定殖率测试结果见表2-9。表2-9 不同菌种在无菌土中定殖率测试结果
测试结果表明，6种菌在30d左右达到最大活菌数，其中菌种B-09-2在30d左右达到最高，为初始活菌数的80.8倍，然后下降，到150d时存活率还有6.5%；B-01-6在30d左右时达到最大值，到150d时存活率只有0.03%，存活率较差；4230在30d左右达到最大活菌数，到150d时存活率只有0.01%，存活率较差；4225在30d时，增加了18.4倍，然后开始下降，到150d时存活率为0.01%，存活率较差；菌种F-05-01在30d左右达到最大活菌数，到150d时只有0.02%的存活率，存活率较低；菌种F-01-06在30d时活菌数达到最高，为初始菌数的18.8倍，然后开始下降，到150d时为初始活菌数的26.4%，存活力最强。上述数据说明，B-09-2和F-01-06这2个菌株在无菌土中存活能力较强，具有较高的无菌土壤定殖能力。（2）细菌抗药性菌株标记制备
①制备方法
参照童蕴慧、翁启勇等采用的含利福平（Sigma公司）肉汤梯度与平板梯度交替培养法。首先用95%酒精配成1万μg/mL的利福平母液，过滤灭菌后于-18℃保存备用。先测定了B-01-6和B-09-2两株菌对利福平敏感浓度为7μg/mL，然后配制利福平含量分别为7，14，28，56，112，224，250，280和320μg/mL的肉汤培养基及各浓度加琼脂的肉汤平板。将B-01-6和B-09-2两株菌首先在7μg/mL含药培养液中开始培养，然后逐级提高药物浓度进行诱导培养，在每一浓度培养48h后，再用相同浓度的平板进行稀释涂板，选择生长最快的单菌落，并用平板对峙法测定其对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用，确保标记菌株与出发菌株的抑菌能力没有明显的变化。每次所得标记菌株在每一浓度中传代3次，最后筛选到耐利福平320μg/mL的菌株B-01-6 ky和B-09-2 ky。将B-01-6 ky和B-09-2 ky分别经不含药肉汤平板继续交替培养4代，再回接到含有利福平320μg/mL的培养基检测，以确保耐药性的遗传稳定性。按照这种方法直至最后筛选到抗利福平标记菌株B-01-6 ky和B-09-2 ky。
②结果与分析
对B-01-6和B-09-2分别进行抗性诱导，成功获得了抗320μg/mL利福平抗性菌株。抗性菌株B-01-6 ky和B-09-2 ky转代3次以上，在菌落形态特征、生长速度等性状上，均与野生型菌株一致。（3）菌种田间定殖能力测试
①试验地点：北票蓝旗营。
②试验时间：2007年1-6月。
③试验作物：番茄百利。
④测试方法：试验前将B-09-2，B-01-6做抗菌素标记，埋入秸秆后，将B-09-2，B-01-6，4230，4225，F-05-01，F-01-06分别埋入不同处理，每隔30d取样1次，每个点取1.0kg秸秆样品。取回后，阴干、混合均匀、粉碎，取1g样品，加入到有无菌水（49mL）的三角瓶中，振荡30min，梯度稀释，涂平板，25℃培养24~72h，查菌落数、种类。对照区取土样。其他相同。
⑤结果
不同菌种在田间定殖效果见表2-10。
表2-10数据表明，B-09-2在60d时达到最高，然后开始下降，到120d时，还能检测到，150d时检测不到，说明其田间定殖能力比较强；B-01-6在30d时还能检测到，并且有一定的繁殖能力，到60d时，检测不到该菌，说明存活能力差；菌种4230，4225从施入土壤后，到30d时就没有检测到该菌种，说明该菌种田间存活能力差；F-05-01从施入土壤后到30d时就没有检测到，说明该菌种田间存活能力差；F-01-06从30d时开始活菌数不断增多，到90d左右时达到最多，然后开始下降，到栽培结束时，仍然能检测到很高的活菌数，说明该菌种田间存活率高。上述6个菌种在对照区都未检测到，说明在处理区检测到的上述菌种都是后施入的菌种在秸秆上大量繁殖的结果。根据上述结果，决定保留B-09-2，F-01-06作为秸秆降解菌种的组成菌种。表2-10 不同菌种在田间定殖效果测试（五）秸秆高效降解复合菌群构建
1.单一菌种及不同复合比例菌种对室内条件下秸秆及滤纸降解的影响研究
通过单一菌种及不同比例菌种组合对天然纤维素和秸秆的降解能力试验，确定了复合菌种的构建比例。（1）材料与方法
①菌种：细菌B-09-2，菌数25亿cfu/g；真菌F-01-6，菌数15亿cfu/g。
②新华定量滤纸，玉米秸秆。
③试验处理：空白对照，B-09-2，F-01-6及B-09-2∶F-01-6不同比例：1∶1，3∶2，6∶3共6组，用滤纸、秸秆作为唯一碳源制成液体培养基，接种量0.1%，静止培养，培养温度30℃，培养时间15d。CMC酶活力：参考农业行业标准NY/T 912-2004；木质素过氧化物酶（LiP）活力测定：藜芦醇法；降解率测定：失重法。（2）结果
在上述试验条件下，复合菌种对滤纸及秸秆的降解能力大于单一菌种，单一菌种降解能力：F-01-6>B-09-2；菌种组合对滤纸及秸秆的降解能力强弱顺序：B-09-2∶ F-01-6=1∶1>3∶2>6∶3；1∶1时降解能力最强，在培养温度30℃，培养时间15d对天然纤维素滤纸和秸秆的降解率为74.5%和34.8%。根据试验结果，初步确定B-09-2∶F-01-6复合比例1∶1。
2.菌种不同复合比例对模拟田间条件下秸秆降解影响研究（1）材料方法
①菌种：细菌B-09-2，菌数25亿cfu/g；真菌F-01-6，菌数15亿cfu/g；玉米秸秆。
②试验处理：空白对照及B-09-2∶F-01-6不同比例：1∶1，3∶2，6∶3共4组。选用同批次的250mL三角瓶，底部和顶部放置1cm厚的土，中间放50g的秸秆，接种量0.1%，加水80mL，培养温度30℃，培养周期30d。
③降解率测定：失重法。（2）结果
菌种比例为1∶1时，秸秆降解率最高，达到50.6%。
3.不同菌种比例田间应用试验效果研究（1）材料方法
①菌种：细菌B-09-2，菌数25亿cfu/g；真菌F-01-6，菌数15亿cfu/g。
②田间试验处理：设空白对照、基质及菌种比例：1∶1，3∶2，26∶3共5个处理；重复3次、随机排列、小区面积20m；
③栽培品种：黄瓜。
④田间操作：挖沟，沟深30cm、宽70cm，将25kg秸秆均匀平铺于沟底，秸秆要露出沟外，以方便通气，用脚踩结实，均匀撒1/3菌种于秸秆表面。依次平铺第二层第三层，同样用脚踩结实，将菌种均匀撒于表面，盖土25cm，并做畦。在沟的两头挖坑，在一头灌水，直到另外一头有水出现为止。畦面插温度计（插入深度为10cm），定时观察、记录温度变化情况。定植后围绕所植作物打孔，孔距为20~30cm，孔深以穿透秸秆层为准，以利通气和降解。肥水管理按常规管理。（2）结果
40d时表面观察，对照组的秸秆颜色无明显变化，只有少量秸秆表面出现黑色或绿色的菌落斑点。3个处理组秸秆颜色由原有黄绿色全部变成黑绿色，将秸秆折断，内部纤维组织也全部呈黑绿色。秸秆成分变化见表2-11。表2-11 秸秆中木质素、半纤维素及纤维素含量变化%
不同处理对黄瓜产量的影响见表2-12。表2-12 黄瓜产量调查
从表2-12可以看出，不同处理黄瓜产量有一定差异。方差分析结果表明，3个处理与空白及基质之间黄瓜产量差异均达极显著水平，重复之间差异不显著，其中菌种比例1∶1效果最佳。
4.秸秆高效降解复合菌群构建
根据上述试验结果，在细菌B-09-2菌数25亿cfu/g，真菌F-01-6菌数15亿cfu/g条件下，2株菌种复合比例确定为1∶1。二、菌种鉴定
为了确定构成复合菌群的菌种的种属和生物学特性，对2株供试菌种进行鉴定。（一）细菌菌种鉴定
菌种鉴定方法按照东秀珠和蔡妙英编著的《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌系统鉴定手册》并结合分子生物学鉴定进行。
1.材料与方法（1）菌种
B-09-2。（2）显微及菌落形态特征
①显微形态特征：在光学显微镜下观察菌种的显微形态。
②菌落特征：用划线法将菌种接在平板培养基上（蛋白胨2.0%、葡萄糖0.5%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾0.06%、琼脂1.5%、pH 7.0~7.2），30~32℃培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落和培养基的颜色等。（3）生理特征
①过氧化氢酶测定
试剂：3%~10%过氧化氢。
接种与培养：将待测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30℃培养1~2d。
试验方法：取一个干净的载玻片，在上面加1滴3%~10%过氧化氢，挑取1环培养1~2d的菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，记做过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。
②芽孢杆菌需氧性测定
培养基：酪素水解物20g、葡萄糖10g、NaCl 5g、巯基醋酸钠2g、甲醛次硫酸钠1g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
接种与培养观察：将菌种用外径为1.5mm的接种环穿刺接种在厌氧培养基，30℃培养，3d和7d分别观察，若表面生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长或下部生长者为兼性厌氧菌或厌氧菌。
③V-P测定
培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、NaCl 5g、水1000mL、pH 6.5。
试剂：40%NaOH，肌酸。
接种与培养：将菌种接种于上述培养液中。
结果观察：在培养24h后，取培养液（约2mL）和等量的40%NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡，2~5min后如培养液呈红色，即为V-P试验阳性，在培养7d后，用pH计测试培养液pH值，然后按上述方法重新进行测试。
④酪氨酸水解
将L-酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，0.06 MPa，30min灭菌。然后与100mL无菌的肉汤琼脂混合，倒10个小平板（直径6cm）。将测试菌接种于上述平板上，于30℃培养7~14d后观察菌落周围和下面的酪氨酸结晶是否被水解而变透明。
⑤苯丙氨酸脱氨试验2
培养基：酵母膏3g，NaCl 5g，NaHPO41g，L-苯丙氨酸1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.3，分装试管，0.06 MPa，30min灭菌，摆成斜面。3
试剂：10%的FeCl。
接种与观察结果：将菌种接在苯丙氨酸斜面培养基上，37℃培3养8~24h测定，将10%的FeCl溶液滴在生长菌的斜面上，变绿为阳性反应，不变为阴性反应。
⑥卵磷脂酶的测定2424
培养基：胰蛋白胨10g，NaHPO 5g，KHPO 1.0g，NaCl 2g，42MgSO·7HO 0.1g，葡萄糖2g，蒸馏水1000mL，pH 7.6，分装三角瓶，每瓶100mL，0.06 MPa，30min灭菌。
接种与观察结果：将培养液分成2组：一组加卵黄，另一组分装无菌试管，作不加卵黄的对照管中，于30℃培养1，3，5，7d后观察结果。若与对照管相比较，在卵黄胰蛋白胨液或表面形成白色沉淀者，则为阳性反应，表示卵磷脂被分解成脂肪和水溶性的磷酸胆碱，说明有卵磷脂酶的存在。
⑦硝酸盐还原试验
培养基：肉汤液1000mL，硝酸钾1g，调节pH 7.0，培养液分装试管，0.1 MPa，30min灭菌。
格里斯试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL。
B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%左右）150mL。
二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。
接种与观察结果：将菌种接种于硝酸盐液体培养基中（须做不接种的空白对照管），于30℃培养，1，3，5，7，14d后将一支试管中的一半培养液倒入另一支干净的空试管中，然后在其中分别各加1滴试剂A液和B液，在对照管中也同样加入试剂。当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现，则可加1~2滴二苯胺试剂，此时培养液如呈蓝色，则表示培养液中仍有硝酸盐；如不呈蓝色，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。
⑧碳水化合物产酸（包括葡萄糖产气）试验42442
培养基：（NH）HPO 1g，MgSO·7HO 0.2g，KCl 2g，酵母膏0.2g，糖或醇类10g，琼脂5g，蒸馏水1000mL，0.04%溴甲酚紫乙醇液20mL。
在加入指示剂前，先调节pH为7.0，然后加入指示剂，分装试管，培养基高度为4~5cm，0.06 MPa，灭菌30min。
芽孢杆菌鉴定测定的糖包括：D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露醇。
接种和观察结果：将18~24h的幼龄菌体，用接种针穿刺接种于培养基中，于30℃培养1，2，4，7d甚至14d，观察结果，指示剂由紫色变黄色，表示糖类发酵产酸。另外，还须观察含葡萄糖的琼脂柱中有否气泡出现，若有表示产气。
⑨酪素水解试验
培养基：a.脱脂牛奶制备。取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000 r/min，10min），除去上层油脂，即得脱脂牛奶。b.牛奶平板的制备，取50mL的脱脂牛奶，放入1支三角瓶中，另称1.5g琼脂置于含50mL蒸馏水的另1支三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06 MPa，灭菌20min，待冷至45~50℃时，速将两液混匀倒平板中，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。
接种与观察结果：将测试菌以三点法点接在牛奶平板上，于30℃培养1，3，5，7和14d，若菌落周围和下面呈透明，表明酪素已被分解。（10）明胶水解试验
培养基：明胶120，蒸馏水1000，调节pH为7.0，分装试管，培养基高度为4~5cm，0.06 MPa，灭菌30min。
接种与观察结果：测试菌种用穿刺法接种在试管中央，而后将试管和2支未接种的空白对照管一起置于28℃培养，期间每隔3~4d检查明胶水解情况，直到28d。（11）淀粉水解
培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶中，0.1 MPa灭菌20min备用。
试剂：卢哥尔氏碘液。
接种与观察结果：将培养基熔化后，冷却至50℃左右，凝固后取菌种点接于平板上（每皿点接2点），于30℃培养2~4d，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解淀粉能力的大小。（12）柠檬酸盐和丙酸盐的利用试验42424
培养基：KCl 1g，MgSO·7HO 1.2g，（NH）HPO 0.5g，242KHPO·3HO 1g，柠檬酸钠1g（或丙酸钠2g），0.04%酚红10mL，琼脂15g，定容至1000mL。
以上成分除指示剂外加热溶解，调节pH为6.8，再加入指示剂，分装试管，0.1MPa，灭菌20min后摆成斜面。
接种与观察结果：取幼龄菌种接种于斜面上，于30℃培养3，7，14d，培养基呈碱性（红色）者为阳性，不变为阴性。（13）产生吲哚试验
培养基：1%胰蛋白胨水溶液，调节pH为7.5，分装试管，每管约5mL，0.06 MPa，灭菌30min备用。
试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g，异戊醇75mL，浓盐酸25mL。
接种与观察结果：将测试菌种接种于上述试管培养液中，于30℃培养7d和14d，然后在每个试管培养液中加入2mL的试剂，并摇动试管，若醇层变成粉红色到红色，即为阳性反应，表明有吲哚产生；如呈黄色，则为阴性反应。（14）从甘油产生二羟基丙酮试验
培养基：酵母膏10g，甘油20mL，肉汤琼脂1000mL。调节pH 7.2~7.4，分装三角瓶，0.06 MPa，灭菌30min备用。
试剂：斐林氏溶液。
A液：结晶硫酸铜34.66g，用蒸馏水定容至500mL。
B液：酒石酸钾钠173g，氢氧化钠50g，用蒸馏水定容至500mL。
使用时，A液和B液等量混合，当日使用。
接种与观察结果：熔化三角瓶中的培养基，倒成平板，凝固后在平板上划短线接种。于30℃培养10d，然后在平板上倒入斐林试剂A，B混合液，以覆盖菌落为度，2h后若在菌落周围出现红色晕圈为阳性反应。（15）在pH 5.7的Sabouraud葡萄糖培养基中生长试验
培养基：蛋白胨10g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH5.7。分装试管，0.07 MPa，灭菌30min后摆成斜面备用。
接种与观察结果：取菌液1环，接种于上述培养基中，同时接种肉汤液（pH6.8）作对照，于30℃培养1，3，7，14d后观察生长情况。（16）生长温度的测定
培养基：肉汤液，调节pH 7.2，分装试管，每管约5mL，0.1 MPa，灭菌20min备用。
接种与培养：取幼龄菌液，直针接种于上述试管培养液中（不用接种环接种），然后与未接种的对照试管一起置于不同温度的恒温水浴中培养（指示温度的温度计应放在同样的试管和培养基内）。设置5，15，35，45，55，65℃等6个温度梯度，其中在55~65℃培养的菌种，3d后观察生长情况；35~50℃培养的菌种，5d后观察生长情况；15℃以下培养的菌种，21d后观察生长情况。
观察记录结果：目测生长情况，与未接种的对照管比较，注意混浊度、沉淀物和悬浮物等。“+”表示生长良好，与对照管相比，可明显地判定是混浊的；“-”表示不生长，在适宜的角度下观察与对照无差异。（17）耐盐性试验
培养基：含2%，5%，7%，10%NaCl的肉汤液。调节pH 7.2，分装试管，每管约4mL，0.1 MPa，灭菌20min备用。
接种与观察结果：取幼龄菌液，直针接种含上述不同浓度NaCl的肉汤液试管中，并将其和不接种的对照管一起置于30℃培养7~14d后观察生长情况。（4）16S rDNA测定
①菌体培养及基因组DNA的提取
低温保藏的细菌菌种转接到LB斜面上，30℃下活化培养。将活化的菌种转接到100mL LB液体培养基中，30℃下150 r/min振荡培养24h，收集菌体。按照佘小漫等的方法利用改良的苯酚一氯仿法提取细菌的基因组。
②16SrDNA的PCR扩增
根据细菌的16S rDNA基因的保守序列，设计一对通用引物，引物序列如下：上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR反应体系（50.0μL）：Primer 11.0μL，Primer 21.0μL；dNTP 1.0μL，10×Buffer 25.0μL，模板DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0μL，ddHO 41.0μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃40 s，54℃50 s，72℃60 s，进行35个循环；72℃10min。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
③回收片段酶连和转化
对回收条带PCR的纯化产品进行酶连接，采用10.0μL酶连体系：1.0μL ligation Buffer+1.0μL；pUCm-T+7.0μL；PCR Products+1.0μL；T4 DNA ligase，16℃下连接过夜（16~18h）。连接产物转化大肠埃希菌DH5X感受态细胞，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素、20% IPIG及2mg/mL X- gal的LB平板上37℃培养16h。挑取数个白斑单菌落于2mL含100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃过夜振荡培养，用于菌落PCR鉴定。
④阳性克隆的PCR鉴定
根据16S rDNA的特异性引物，采用菌落PCR技术对阳性克隆子进行鉴定。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。将筛选出来的阳性克隆子以15%甘油保存，送至大连宝生物有限公司进行测序。
⑤16S rDNA序列分析
将测序得到的16S rDNA基因序列进行去载体、拼接处理后得到16S rDNA目的序列。应用NCBI网站BLAST功能进行序列分析。
2.鉴定结果（1）细菌B-09-2培养及形态特征
菌体大小：菌体长×宽=（2.2~2.5μm）×（0.65~0.75μm），以单个的、成双的或成链的形式存在，芽孢在孢囊中生，芽孢椭圆形。
菌落形态：在牛肉膏培养基中，菌落为圆形，乳白色，边缘不整齐，凸起，表面不光滑，湿润，不透明（图2-9）。图2-9 菌落形态与显微形态（2）细菌B-09-2的生理生化测定结果
菌种的生理生化测定结果见表2-13。表2-13 菌种生理生化特性（3）细菌B-09-2的16S rDNA测定结果
将菌株16S rDNA基因序列提交到GenBank进行Blast搜索，结果表明与地衣芽孢杆菌同源性最高达99%，说明菌株B-09-2与地衣芽孢杆菌亲缘关系最近。将Score最高的10个菌种16S rDNA序列对齐后，用MEGA4.1软件包中的邻接法（NJ）构建菌种的系统发育树。该菌与HQ202881.1和HM854235.1为同一分支，均为地衣芽孢杆菌属（Bacillus licheniformis）。
菌株的16S rRNA基因序列（Nucleotide Sequence，1423 letters）如下：
GCTATAATGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTTAGCGGCGGA CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG GCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGCGGCTTCGGCTGC CGTTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCG ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG TACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG CGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGAC GCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATCCTCTGACACCCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGG TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTG CTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTCAGCCAATCCCACAAATCT GTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCG CGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA CGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGC。
3.细菌B-09-2鉴定结论
通过检索表可确定该菌为Bacillus licheniformis，中文名称为芽孢杆菌。收录于辽宁省微生物菌种保藏中心，菌种编号为LCCC 10768。（二）真菌F-01-6鉴定
1.材料与方法（1）菌种
F-01-6。（2）培养基
PDA培养基。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]