作者：卫生部合理用药专家委员会
出版社：人民卫生出版社
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耐药革兰阴性菌感染诊疗手册试读：
版权页
图书在版编目（CIP）数据耐药革兰阴性菌感染诊疗手册/国家卫生计生委合理用药专家委员会组织编写. —北京：人民卫生出版社，2015
ISBN 978-7-117-21005-8
Ⅰ.①耐… Ⅱ.①国… Ⅲ.①抗药性-革兰氏阴性细菌-诊疗-手册 Ⅳ.①R37-62
中国版本图书馆CIP数据核字（2015）第170391号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯版权所有，侵权必究！耐药革兰阴性菌感染诊疗手册组织编写：国家卫生计生委合理用药专家委员会出版发行：人民卫生出版社有限公司 人民卫生电子音像出版社有限公司地 址：北京市朝阳区潘家园南里 19 号邮 编：100021E - mail：pmph@pmph.com制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司制作时间：2015年12月版 本 号：V1.0标准书号：ISBN 978-7-117-21005-8/R·21006策划编辑：高博责任编辑：杨亚超打击盗版举报电话：010-59787491 E-mail：WQ@pmph.com注：本电子书不包含增值服务内容，如需阅览，可购买正版纸质图书。序 一
感染性疾病，对于人类健康和生命安全曾经是一个重大的威胁。随着抗感染药物、尤其抗菌药物的出现，人类获得了治疗和战胜感染性疾病的有效武器，挽救了无数人的生命，被国际上公认为20世纪最伟大的发明之一。然而，世界万物都是福祸同至、利害为邻。在抗菌药物大量使用的同时，也诱发了各类细菌的耐药性，使一些原有的抗菌药物失去了效用，给人类带来新的威胁，并引起全球的高度关注。2013年，美国疾病预防控制中心发布了细菌耐药威胁报告，将危害最为严重的18种耐药细菌分为紧急威胁、严重威胁和需要引起关注的威胁三个等级。2014年，世界卫生组织向全球发布了细菌耐药报告，明确指出：耐药细菌造成的疾病负担，呈现出发展中国家高于欧美国家、耐药菌感染造成的劳动力下降等社会支出高于医疗支出的趋势，粗略估计，耐药菌感染将造成全球的GDP下降1.4%～1.6%。2015年3月，美国颁布的抗击耐药细菌国家行动计划提出，以减缓超级耐药细菌出现的速度为战略，防御耐药菌感染的蔓延，并将耐药性感染疾病作为“当今世界面临的最紧迫的公共卫生问题之一”，呼吁“尽一切力量确保抗菌药物的有效性”。美国给联邦政府在2016财年预算中，请求国会将应对这一威胁的预算拨款在上一财年的基础上翻一番，达到12亿美元。
我国是世界上面临细菌耐药性威胁最为严重的国家之一，也是应对细菌耐药性采取措施最多的国家之一，而最有效的措施就是在各类医疗机构、广大医务人员和亿万民众中，普及合理用药知识，坚持合理用药规则，反对滥用、乱用药物、特别是抗菌药物。为此，2004年原国家卫生部等三部门联合颁发了《抗菌药物临床应用指导原则》，在全国各类医疗机构普遍推行；2012年原国家卫生部发布了《抗菌药物临床应用管理办法》（部长令84号），在全国范围内开展“抗菌药物临床应用专项整治活动”，并建立了全国细菌耐药监测网、抗菌药物临床应用监测网及合理用药监测网，为推行抗菌药物的合理使用提供了基本规范、数据评价和技术支撑。同时，近几年在全国推行的医药卫生体制改革，破除“以药补医”机制，取消药品加成政策，对于促进各级医疗机构合理使用抗菌药物，提高感染类疾病的诊治水平，也发挥了一定的积极作用。
但是，我们也应当看到，我国抗菌药物的合理应用，还存在一些比较突出的问题。不仅人类滥用抗菌药物的现象比较普遍，动物乱用抗菌药物的问题也是触目惊心，直接或间接地推动了细菌耐药的蔓延和升级，使一些过去曾经有效治疗的感染类疾病，在细菌耐药面前失去了有效的手段。导致这些问题屡禁不止的原因是多方面的，既有医务人员特别是基层医务人员医术不精、能力不强，也有广大患者缺乏自我保护意识和合理用药知识，还有医药服务人员与药品销售和使用存在利益链条等，这是一个涉及面广的社会性问题。治理滥用、乱用抗菌药物，也必须采取综合性的措施，多管齐下，统筹解决，这是一项长期、艰巨的任务。其中一项基础性的工作，就是普及合理使用抗菌药物知识和技术规范，提高合理使用抗菌药物能力和水平。
2012年，原国家卫生部医政司委托合理用药专家委员会组织编写了《国家抗微生物治疗指南》，详细推介有效治疗各类感染病和各类微生物感染抗菌治疗的技术操作规范，深受广大临床医师、药师的欢迎。针对当前革兰阴性菌分离率越来越高、多重耐药菌普遍发生，广泛耐药、全耐药细菌感染不断增多的情况，为抵御细菌感染的主要威胁，增强有效治疗的手段，国家卫生计生委合理用药专家委员会最近又组织临床、临床微生物、临床药理等学科的知名专家，研究编写了《耐药革兰阴性菌感染诊疗手册》，力求解决临床面临最为棘手的“细菌耐药”及“革兰阴性菌”的诊断与治疗问题，以适应临床的迫切需求，期望对细菌感染治疗技术的拓展发挥积极的作用。
参与本手册的编者，均为活跃在感染病诊治一线的国内著名专家学者。为了增强本手册的权威性与可操作性，他们参考了国内外临床案例，查阅了国内外最新研究成果，付出了辛勤的劳动和心血，是集体智慧的结晶。国家卫生计生委合理用药专家委员会对手册的出版表示热烈的祝贺！对各位专家学者的卓越奉献表示衷心的感谢！
希望各类医疗机构和从事诊治感染病的医药工作者，准确把握专家学者们提出的诊断与治疗耐药菌感染的思路和技术要领，应用于临床实践，并总结经验、探索创新，以对人民健康高度负责的精神，不断提高细菌感染性疾病的诊断、治疗和用药的水平。2015年5月21日序 二
细菌耐药性的迅猛上升是一个全球性问题，其中革兰阴性菌的耐药问题尤为突出，表现在分离率及耐药性的上升。在我国，革兰阴性菌占所有临床分离菌的比例，已由十年前的约三分之二上升至目前的近四分之三；大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶的比例高于50%，几乎对所有抗菌药物耐药的广泛耐药鲍曼不动杆菌达20%，耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌上升至10%以上。耐药菌所致感染治疗困难，造成大量医疗资源的消耗，导致感染的病死率上升。
近20年抗菌药物的研发进入瓶颈状态，新抗菌药物上市少，耐药革兰阴性菌的治疗手段十分有限。细菌耐药性的快速上升让人类措手不及，对于广泛耐药及全耐药细菌的感染甚至面临无药可用的境地，目前临床抗菌治疗多以现有抗菌药的联合用药、增加给药剂量、延长某些药物的滴注时间等方法来解决，一些有明显不良反应的老药如多黏菌素不得不重新用于临床，但这些耐药菌的抗菌治疗方案均缺乏可靠的临床研究资料。
国家卫生计生委合理用药专家委员会组织我国专家编写这本手册是十分必要的，对临床医师提高耐药菌感染的诊断与治疗水平将起着重要的作用。浏览本手册，发现其主要特点有：
1. 以抗菌药物为主线，阐述不同抗菌药物治疗革兰阴性菌感染的用药指征、用药原则及联合用药等临床棘手的问题。
2. 编写阵容强大。参与本手册编写的作者均为活跃在临床一线的与感染病诊治相关的多学科专家，包括临床专家（感染、呼吸、血液、ICU、普外科等）、临床微生物学专家、临床药理学专家。多学科的交融必将产生智慧的火花。
3. 内容新颖实用。编写者查阅了大量的文献，结合各自丰富的临床经验，紧密围绕“耐药”、“革兰阴性菌”两个主题词阐述各自观点，简明扼要。手册是一种受欢迎的载体，方便临床医师携带，以备随时查阅。
感谢作者们为本手册付出的辛勤劳动，期待本手册成为我国临床医师喜爱的参考书籍，能在提高我国感染病诊治水平中起一定的作用。中国工程院院士呼吸疾病国家重点实验室主任2015年5月28日前 言“三十年河东，三十年河西”。用这句话来描述数十年来感染病领域的变迁是最合适不过了。最常见的感染病病原体包括细菌、病毒及真菌，细菌性感染一直被认为是相对容易处理的感染病，多数细菌感染可用抗菌药在较短的时间内治愈，但近20年来情形发生了急剧变化，细菌对抗菌药的耐药率越来越高，对于耐药菌感染可选用的抗菌药越来越少。2015年美国奥巴马总统签发了抗击耐药细菌国家行动计划，此计划的颁发背景中指出：“细菌耐药性的出现正在逆转过去80年的奇迹，许多细菌感染的治疗药物选择变得日益有限和昂贵，某些情况下甚至根本无药可用”。
本手册紧紧围绕着“耐药”与“革兰阴性菌”两个主题词，对临床最为棘手的耐药革兰阴性菌感染的诊断与治疗进行阐述，敏感细菌及革兰阳性菌感染不在此手册的范畴。本手册的内容涉及临床微生物、临床药理学、临床感染病诊治及医院感染控制的多学科内容，包括：革兰阴性菌的耐药性变迁、耐药机制及耐药菌的检测，耐药革兰阴性菌感染的病原治疗及各系统感染的诊断与经验治疗，耐药革兰阴性菌感染的常用抗菌药物及给药方案，医院感染的预防与控制。
本手册力求做到“实用”与“先进”的统一，XDR及PDR细菌感染是近年来临床出现的新现象，这些感染可选的抗菌药有限，抗菌治疗方案不确定性高，临床资料缺乏，本手册尽可能将近年来国内外有关耐药革兰阴性菌感染的新进展展现出来，以供临床实践验证。
编写本手册文献资料的引用遵循“立足国内，放眼全球”的原则，有可靠的国内数据可引用的尽量引用国内数据，以更好地反映国内情况。虽然治疗XDR、PDR细菌感染的大规模和（或）前瞻性临床试验资料缺乏，但体外的研究资料、小规模和（或）回顾性临床资料近年来国内外报道较多，写作过程中尽量予以参考、引用。
特别感谢国家卫生计生委合理用药专家委员会为本手册编写所做的大量组织工作，从而保证了手册编写的进度及质量。感谢各位编委的辛勤付出，本手册的编委均为活跃在临床一线的专家，临床医疗工作繁忙，但均以认真负责的态度参与手册的编写，每篇稿件均修改3～5次。
最后，希望此手册对临床耐药菌的治疗、抗菌药的合理应用有所帮助。本手册肯定还存在许多不足之处，新的耐药现象不断出现，治疗耐药菌感染的新抗菌药物及治疗方案一直在更新，希望各位读者能多提出宝贵意见。编者2015年5月23日第一章 革兰阴性菌耐药性变迁及耐药机制第一节 革兰阴性菌耐药性变迁
鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等革兰阴性细菌是医院感染的重要致病菌，常表现为对多种抗生素耐药，严重影响抗感染治疗效果及患者的预后。革兰阴性细菌的耐药性变迁主要集中于以头孢噻肟和头孢他啶为代表的第三代头孢菌素、以头孢吡肟为代表的第四代头孢菌素、β-内酰胺类与酶抑制剂的复合制剂和碳青霉烯类，此外以阿米卡星为代表的氨基糖苷类以及以环丙沙星为代表的喹诺酮药物。掌握这些抗菌药物的耐药动态流行病学数据，对于临床经验性治疗的抗菌药物选择极为重要。本节主要对临床革兰阴性菌包括肠杆菌科细菌及非发酵糖细菌的耐药性变迁进行分析。一、 肠杆菌科细菌
临床常见的肠杆菌科细菌有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门菌属等。产β-内酰胺酶是最主要的耐药机制，尤以产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌、产AmpC酶菌和产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌流行病学颇受临床关注。此部分介绍我国肠杆菌科细菌临床株对各类常用抗菌药的耐药性变迁，同时对产生上述3种β-内酰胺酶的情况进行分析，并与国际上其他国家进行比较。（一） 肠杆菌科细菌对抗菌药的耐药性变迁
图1-1和图1-2显示了连续9年大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性变迁情况。由图可见，大肠埃希菌对头孢噻肟和环丙沙星的耐药率基本维持于40%～70%，耐药水平居于高位，不宜作为经验用药；大肠埃希菌对阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦耐药率在9年中都波动于5%上下，对亚胺培南耐药率维持于1%左右，是临床经验性用药的优选药物。头孢他啶和头孢吡肟的耐药率从2009年开始上升，到2013年已近30%。其原因为以产CTX-M-15为代表的对头孢他啶具有水解活性的ESBL比例上升，特别是2014年美国临床和实验室标准协会（CLSI）降低了头孢吡肟对肠杆菌科细菌的敏感折点，使其敏感率进一步降低。2012年一项全国产ESBL的大肠埃希菌流行病学调查，头孢他啶和头孢吡肟的敏感率分别为33.2%和4.7%。图1-1 大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药性变迁
肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药性变迁略不同于大肠埃希菌。除头孢噻肟、头孢他啶和亚胺培南外，对其他抗菌药物耐药率呈平稳略下降趋势。目前环丙沙星、阿米卡星、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦耐药率都维持波动于10%～30%范围内，是经验性治疗的药物选择。亚胺培南耐药性从2009年始上升明显，目前耐药率约10%。图1-2 肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性变迁（二） 肠杆菌科细菌产β-内酰胺酶情况
1. ESBLs
ESBLs在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最常见。各个国家和地区产ESBLs细菌的流行情况有较大差异。日本、荷兰等国家产ESBLs细菌的检出率很低，而印度、俄罗斯等国家可有高达50%以上的克雷伯菌属细菌产ESBLs。回顾我国2005年至2013年这9年间的耐药性监测资料显示，中国大陆地区三甲医院产ESBLs大肠埃希菌的检出率介于38.9%到56.5%之间，呈缓慢上升趋势；产ESBLs肺炎克雷伯菌的检出率介于31.8%到45.2%之间，呈缓慢下降趋势；产ESBLs奇异变形杆菌的检出率介于6.0%到20.7%之间，见图1-3。碳青霉烯类耐药机制如产KPC-2酶、膜蛋白缺失等常见于肺炎克雷伯菌，这些机制常掩盖ESBL表型的检出，因此我国肺炎克雷伯菌产ESBL的发生率可能被低估了。
CLSI2010版修订了肠杆菌科细菌对部分头孢菌素类抗生素和氨曲南的敏感折点，并建议不再进行ESBL筛选和确认试验，因此目前有些医院检验报告单中不再提示ESBL是否阳性。一般而言，采用CLSI 2010版以后的药敏判读标准，对头孢噻肟或头孢曲松耐药、对头孢西丁敏感的菌株，多为ESBL产生菌。图1-3 肠杆菌科细菌ESBLs检出率的变迁
产ESBLs菌对β-内酰胺类抗生素耐药以外，还对其他种类的抗菌药如氟喹诺酮类耐药，呈现多重耐药模式，约85%的菌株对环丙沙星耐药，约50%左右对庆大霉素耐药，但阿米卡星的耐药率在20%以内，可作为联合用药的选择。根据中国细菌耐药性监测（CHINET）近3年的监测结果，在大肠埃希菌和克雷伯菌属中，ESBL阳性株与阴性株相比，耐药率差异大的抗菌药物有：头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟，差异均在50%以上，而碳青霉烯类、阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率差异不大。
近年来CTX-M基因型已取代TEM、SHV成为最主要的ESBLs基因型。美国2010-2011年一项调查显示，CTX-M型在产ESBL大肠埃希菌中已占85.4%，其中以水解头孢他啶为特征的产CTX-M-15型ESBLs占75.4%。我国学者在ESBLs流行病学研究做了大量工作，20世纪90年代首先报道CTX-M-14型ESBLs，并在随后监测中发现它是我国最常见ESBL基因型。来源于2012年我国24省市30家医院的流行病学数据显示，产ESBL大肠埃希菌90%以上的ESBL基因型为CTX-M，即以对头孢噻肟或头孢他啶耐药为特点。肺炎克雷伯菌产生ESBL的基因型情况与大肠埃希菌相似，我国也以CTX-M为主，但20%～30%菌株的基因型为SHV。
社区获得的产ESBLs肠杆菌科细菌比例增多是产ESBLs菌流行病学的新特点。美国近期的调查显示，社区来源大肠埃希菌的ESBLs检出率为10.9%，并且已成为社区发生的血行感染和尿路感染的主要致病菌。欧洲SMART监测网对腹腔感染的耐药监测显示社区产ESBLs大肠埃希菌检出率由2002年的4%上升至2007年的7.4%，而社区产ESBLs肺炎克雷伯菌为0～5.3%。社区获得的产ESBLs菌的增多主要与全球流行的ST131型大肠埃希菌传播有关，该流行株常携带CTX-M-15基因，而且有更广泛的与毒力和耐药有关的基因，尤其表现出对氟喹诺酮类耐药。我国有关社区获得的产ESBLs菌流行病学资料较缺乏。国家卫生计生委全国细菌耐药监测网在2007年1月至2008 年3月研究显示，社区获得性尿路感染的大肠埃希菌中，ESBLs的检出率为42.8%。2012年来源于我国24省市30家医院大肠埃希菌ESBL流行病学数据也显示，社区获得性ESBL和院内获得性ESBL大肠埃希菌的原发感染类型相似，约50%产ESBL大肠埃希菌来源于尿路感染，20%来源于血流感染。
2. AmpC酶
产AmpC酶菌主要见于以阴沟肠杆菌为代表的肠杆菌属细菌和铜绿假单胞菌，通常呈诱导表达；大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常由质粒AmpC酶基因介导耐药，呈持续高水平表达。产AmpC酶菌的特点是对头霉素类（头孢西丁）和第一到第三代头孢菌素耐药，对头孢吡肟敏感。但由于部分细菌可同时产AmpC和ESBL，可以导致对头霉素类、第三代和四代头孢菌素均耐药，仅碳青霉烯高度敏感。据美国一项流行病学调查资料显示，约38%的阴沟肠杆菌产AmpC酶。我国系统的流行病学资料较少。孙宏莉等对全国10家教学医院肠杆菌科细菌的流行病学调查显示，AmpC酶阳性为13.3%（149/1157），其中以阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌阳性率较高。除对亚胺培南敏感外，AmpC阳性菌株对其他β-内酰胺类药物耐药率超过50%，同时产ESBLs菌株则超过70%，均显著高于非产酶株。
3. 碳青霉烯酶
耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）的出现是近年肠杆菌科细菌耐药的新特点。其主要耐药机制为细菌产碳青霉烯酶，该类酶包括A类KPC酶，B类金属酶IMP、VIM和NDM-1，以及D类的OXA-23和OXA-48。KPC-2是最常见的碳青霉烯酶，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、黏质沙雷菌、奇异变形杆菌等肠杆菌科细菌中均有发现，以长江三角洲地区报道最多。据近9年我国CHINET监测网数据显示，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌在2008年前检出率不足1%，但此后开始逐年上升，由2009年的2.9%上升至2013年超过10%，且大多数菌株为产KPC-2阳性株，见图1-2。
产碳青霉烯酶菌株常同时产ESBL和AmpC等β-内酰胺酶，某些菌株甚至同时合并有外膜蛋白缺失，导致CRE对大多数抗菌药物都高度耐药，常为广泛耐药（XDR）或全耐药（PDR）。据CHINET 2013年资料显示，除对阿米卡星和复方磺胺甲唑的耐药率为50%左右外，对其他药物的耐药率介于70%～ 100%。
产IMP型碳青霉烯酶的肠杆菌科菌报道见于日本（IMP-1）、中国台湾（IMP-8）、澳大利亚（IMP-4）、巴西和新加坡（IMP-1）。在中国大陆，主要为IMP-4和IMP-8，涉及的病原菌主要有阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和肺炎克雷伯菌等。近年来报道较多的NDM酶属于金属酶，在CRE中的检出呈上升趋势，印度和巴基斯坦等国家的发生率为5%～18.5%。我国产NDM-1的CRE报道也呈上升趋势，杨启文等收集了全国2004-2012年的342株CRE，发现约50%产KPC-2，7.5%和7.4%产NDM-1和IMP酶，且大多NDM-1阳性株见于2010年以后。二、 非发酵糖细菌（一） 鲍曼不动杆菌
鲍曼不动杆菌常在医疗机构环境和人体表面定植，目前已成为医院内获得性感染的主要病原体之一。近年来，该菌表现出了强大的获得各类抗菌药物相关耐药基因的能力，在耐药机制中产多种β-内酰胺酶（如ESBL、AmpC、OXA、NDM-1酶）、外膜通透性低、主动外排系统等都有涉及，导致对临床常用抗菌药物，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等呈现出多重耐药或广泛耐药的特性，已经成为我国耐药性最严重的菌种。我国CHINET近9年数据显示，我国碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）检出率从2008年的49.3%上升至2013年的62.5%，见图1-4，且60%以上菌株呈多重耐药模式，在2013年，对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南和米诺环素的耐药率都超过50%。鲍曼不动杆菌XDR比例也呈上升趋势，2011年XDR达21.7%。
产OXA-23酶是介导鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药主要机制，俞云松等发现bla-like在碳青霉烯耐药株的检出率高达96.5%，且OXA-23这些菌株绝大多数为多重耐药株，并属于优势克隆CC92。图1-4 鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的耐药性变迁
值得注意的是，血流感染的鲍曼不动杆菌比例近年也呈上升趋势，据中国CHINET监测网报道，鲍曼不动杆菌在血流感染中的分离率已由2009年的2.7%增加至2011年的3.9%。据国家卫生计生委细菌耐药监测网2013年监测全国1300余家医院数据显示，血标本分离菌株中，鲍曼不动杆菌分离率居第五位（4%），且70%以上都呈多重耐药（MDR），发生后患者死亡率高达29.8%～58.6%，已给临床治疗带来严峻挑战。（二） 铜绿假单胞菌
约10%的院内感染由铜绿假单胞菌引起，该菌对多种抗生素表现为天然或获得性耐药，临床治疗十分困难。据拉丁美洲SENTRY细菌耐药监测网调查，1997-2008年的医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎（VAP）的分离菌中，铜绿假单胞菌居第二位（21.8%），仅次于金黄色葡萄球菌（28.0%）。我国NPRS监测网1994-2001年的报告也显示，在7年分析的9911株革兰阴性杆菌中，铜绿假单胞菌位居首位（21.3%），且40%以上分离自下呼吸道感染标本。CHINET 2005-2012年的8年间铜绿假单胞菌比例介于11.6%～16.9%，且主要分离于下呼吸道。近期一项我国17家ICU的VAP病原学调查也显示，铜绿假单胞菌分离率位居首位（19.7%）。
根据我国CHINET连续9年耐药监测资料显示，铜绿假单胞菌对抗菌药的耐药率趋于平稳，呈缓慢下降趋势，对碳青霉烯耐药率介于20%～30%，对阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、环丙沙星和哌拉西林/他唑巴坦耐药率相对较低，MDR株比例约40%～50%，XDR株比例1%～2%，见图1-5。图1-5 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药性变迁
铜绿假单胞菌常存在适应性耐药，主要指宿主环境刺激调节基因改变耐药基因的表达，从而导致细菌在宿主体内的耐药性和体外药敏试验检测的不一致，临床使用体外敏感药物也难于有效，导致临床难治疗、难清除病原菌的困境。（三） 嗜麦芽窄食单胞菌
嗜麦芽窄食单胞菌广泛存在于土壤、植物、人和动物体表及医院环境中，属条件致病菌。中国CHINET监测2005-2013年资料显示，该菌占所有革兰阴性菌的4.0%～5.0%，居于第5～6位。
嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类抗生素天然耐药，临床可使用的抗菌药品种少。中国CHINET监测2005-2013年资料显示，嗜麦芽窄食单胞菌对米诺环素的耐药率最低，介于1%～4%；对左氧氟沙星、复方磺胺甲唑（TMP/SMZ）的敏感率介于5%～15%，头孢哌酮/舒巴坦耐药率近年有上升趋势，见图1-6。图1-6 嗜麦芽窄食单胞菌对常用抗菌药物的耐药性变迁
生物被膜的形成是嗜麦芽窄食单胞菌新发现的耐药机制，嗜麦芽窄食单胞菌借助生物被膜不仅可以黏附于医用材料（如气管插管），也可黏附于组织细胞上，长期定植于体内，是慢性感染反复发作的主要原因。第二节 革兰阴性菌耐药机制
细菌对抗菌药物的耐药性可分为天然耐药和获得性耐药，前者是指某一种属的细菌由于其结构和生理的特殊性而对某种抗菌药物固有耐药，如嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类天然耐药；而获得性耐药则是由于细菌发生基因突变或获得外源性耐药基因所致。细菌可以通过产生灭活酶、改变抗菌药物作用靶位、降低外膜通透性或主动外排系统等多种机制获得耐药性。一、 药物灭活酶的产生
细菌可产生多种灭活酶作用于抗菌药物，使其失去抗菌活性。革兰阴性菌常见的灭活酶包括：β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶和甲基化酶等。（一） β-内酰胺酶
革兰阴性菌对β-内酰胺类药物最主要的耐药机制是产生多种β-内酰胺酶，它可与药物分子结构中的β-内酰胺环结合并使之打开，从而使抗菌药物失活。目前已发现1000多种β-内酰胺酶，主要采用两种分类方法：Ambler和Bush-Jacoby分类。Ambler分类根据氨基酸序列，将β-内酰胺酶分为A、B、C、D四类。其中A、C、D类为丝氨酸β-内2+酰胺酶，B类酶因需要二价金属离子（Zn）才能发挥活性，故又称为金属酶。Bush分类则根据β-内酰胺酶的功能将其分为1群头孢菌素酶、2群青霉素酶、3群金属酶和4群未知酶。随着β-内酰胺类的广泛使用，β-内酰胺酶的种类不断增加，其中最重要的是超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum β-lactamases，ESBLs）、AmpC型酶和碳青霉烯酶等。革兰阴性菌临床株产生的重要β-内酰胺酶见表1-1。表1-1 临床革兰阴性菌产生的主要β-内酰胺酶续表
ESBLs由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌产生，能够水解青霉素类、头孢菌素类和单环类抗生素，但不能水解碳青霉烯类和头霉素类，其活性可被酶抑制剂抑制。2000年以前，ESBLs以TEM型和SHV型为主，多见于引起医院感染的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。2000年后，CTX-M型ESBLs在全球广泛传播，成为肠杆菌科细菌ESBLs最主要的类型。社区获得性大肠埃希菌产CTX-M（特别是CTX-M-15）的报道也显著增加。
AmpC酶由染色体或质粒介导，除沙门菌属、普通变形杆菌、奇异变形杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌外，几乎所有的革兰阴性杆菌均可或多或少地产生染色体介导AmpC酶，且最常见于阴沟肠杆菌等肠杆菌属细菌。AmpC酶能够水解头孢菌素类（包括超广谱头孢菌素）和青霉素类，不能水解第四代头孢菌素和碳青霉烯类，且耐受克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等酶抑制剂。质粒介导的AmpC型β-内酰胺酶主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、MIR和ACT等，国际上以CMY型多见，我国则以DHA型和ACT型为主。
碳青霉烯类是治疗其他β-内酰胺类耐药的革兰阴性菌的最后一道防线，而碳青霉烯酶的出现无疑给临床治疗带来了巨大挑战。碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类（如厄他培南、亚胺培南和美罗培南），以及其他β-内酰胺类抗生素，包括青霉素、头孢菌素和β-内酰胺酶抑制剂等。更为严重的是，携带质粒介导碳青霉烯酶耐药菌存在潜在暴发的危险。临床常见的碳青霉烯酶包括Ambler A类（如KPC）、Ambler B类（如NDM、IMP、VIM等）和Ambler D类（如OXA-48、OXA-23和OXA-51等）。
2004年，我国浙江地区首次分离出KPC阳性的肺炎克雷伯菌，自此产KPC肠杆菌科细菌在国内开始流行。KPC-2是国内最常见的碳青霉烯酶，多见于肺炎克雷伯菌。国际上bla基因常在肺炎克雷KPC-3伯菌和阴沟肠杆菌中检出，而我国仅在大肠埃希菌和弗劳地枸橼酸杆菌中检测出该基因。
临床上较为常见的金属β-内酰胺酶为IMP、VIM、SPM和NDM。我国最先报道的金属β-内酰胺酶为IMP-4，存在于杨氏枸橼酸杆菌（Citrobacter youngae）和不动菌属，随后在克雷伯菌属中也有检出。VIM-2是我国不同医院铜绿假单胞菌中检测出的唯一一种VIM型金属β-内酰胺酶。2009年Yong等首次发现新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamases，NDM），该酶现已迅速波及全球多个国家和地区。NDM几乎可以水解所有的β-内酰胺类，大多由肠杆菌科细菌和不动杆菌属产生，特别是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。编码NDM-1的基因常位于质粒上，具有迅速水平传播的能力，可能会导致多重耐药株的蔓延。
OXA酶主要见于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，而肠杆菌科中较少见。我国鲍曼不动杆菌中以OXA-23最为常见。大多数获得性OXA酶基因位于质粒整合子上，具有快速变异和广泛传播的能力。虽然OXA酶水解碳青霉烯类的能力较弱，但它能与外排系统和孔蛋白共同作用，造成碳青霉烯类耐药。（二） 氨基糖苷类钝化酶
氨基糖苷类钝化酶（aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）是细菌对氨基糖苷类耐药的最重要原因。AMEs来源于某些细菌正常呼吸所需要的酶，主要包括三类：氨基糖苷磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferase，APH）、氨基糖苷核苷酸转移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT），以及氨基糖苷乙酰转移酶（aminoglycoside acetyltransferase，AAC）。这些钝化酶共价修饰抗菌药物的氨基或羟基，使氨基糖苷类与核糖体不能紧密结合，从而无法发挥抗菌作用。AMEs可通过可移动元件在细菌间传播，耐药基因常由整合子携带。（三） 甲基化酶
16S rRNA甲基化酶是肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动杆菌属对氨基糖苷类耐药的重要机制之一。16S rRNA甲基化酶能够作用于氨基糖苷类的靶位而导致细菌对几乎所有氨基糖苷类高水平耐药。已报道的16S rRNA甲基化酶基因包括：armA、rmtB、rmtC和rmtD等，国内临床分离株主要检测到armA及rmtB。这些基因多位于质粒的转座子上，并广泛存在于革兰阴性杆菌中，为耐药基因在细菌间的播散提供条件。二、 抗菌药物作用靶位改变
由于抗菌药物作用靶点较特异，因此靶位的任何微小改变都将显著影响抗菌药物的结合。例如，β-内酰胺类的作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），细菌通过改变PBPs的结构降低β-内酰胺类抗菌药物与其的亲和力，产生耐药性。与革兰阳性菌相比，革兰阴性菌中由PBPs改变引起的耐药较少见，主要为流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌。
喹诺酮类是治疗医院和社区感染最常使用的抗菌药物之一，它能够直接抑制细菌DNA的合成，作用靶位为两种拓扑异构酶，即DNA旋转酶（属于Ⅱ型拓扑异构酶）和Ⅳ型拓扑异构酶。前者由GyrA和GyrB两种亚基组成，后者由ParC和ParE组成。喹诺酮类药物靶位改变引起的耐药性由染色体介导。大多数高水平耐药临床菌株存在拓扑异构酶突变，且GyrA和ParC常存在不止一个突变位点。而GyrB和ParE的突变较少见。在革兰阴性菌中，质粒介导的氟喹诺酮类耐药由靶位保护蛋白Qnr、灭活酶Aac-6′-Ib-cr及外排泵OqxAB和QepA引起，尽管耐药水平较低，但它可与其他耐药机制共同起作用，使细菌产生高水平耐药。这些耐药基因位于质粒上，可使喹诺酮类耐药性在菌株间广泛传播。三、 细菌外膜通透性改变
革兰阴性菌的细胞外膜上存在多种孔蛋白，是营养物质和亲水性抗菌药物的通道。孔蛋白表达下降、类型转换或结构突变均能够减少抗菌药物进入细菌细胞内，影响药物的敏感性，进而产生耐药。β-内酰胺类抗菌药物的敏感性与肠杆菌科细菌的非特异性孔蛋白OmpC和OmpF亚类存在密切相关。细菌产生钝化酶，同时联合孔蛋白缺失可影响其耐药表型。研究显示细菌产ESBLs或AmpC酶联合孔道蛋白缺失，是导致肠杆菌科细菌对碳青霉烯类中高水平耐药的常见原因。四、 细菌外排系统的作用
主动外排系统也是革兰阴性菌多重耐药的重要机制之一。根据氨基酸序列的同源性，可将外排泵主要分为5个超家族，包括RND家族、MFS家族、MATE家族、SMR家族和ABC家族，其中以RND家族最为常见。铜绿假单胞菌的外排泵包括MexAB-OprM、MexCDOprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM等。鲍曼不动杆菌中也存在不同类型的RND外排系统，如AdeABC、AdeDE、AdeFGH和AdeIJK等，这些系统能够降低氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素和氯霉素的敏感性。AcrAB-TolC是肠杆菌科细菌最主要的外排泵，其过度表达与抗菌药物的多重耐药性有关。一项对医院中氟喹诺酮类耐药大肠埃希菌的研究表明，菌株的多重耐药情况越严重，其AcrAB基因高表达的可能性也越大；同时，多重耐药株均对氟喹诺酮类不敏感，提示氟喹诺酮类耐药与多重耐药存在潜在联系，AcrAB高表达可能将成为细菌多重耐药的生物标记。参考文献
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目前在全球范围内多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）及全耐药（PDR）的革兰阴性杆菌呈上升趋势，给临床治疗带来了巨大的挑战。耐药革兰阴性菌及时、准确的检出及药敏试验的测定是临床抗菌治疗成败的关键。本章将从革兰阴性菌的药敏测定、特殊耐药菌的检测和耐药菌的快速检测三方面进行阐述，介绍常用的实验室检测方法、各类方法的优缺点比较及其临床应用。第一节 药敏测定
进行细菌体外药物敏感性测定的主要目的：①预测药物体内抗菌活性，指导临床抗菌药物的选择；②筛选获得性耐药细菌，避免产生或加重细菌的耐药性；③评估药物对某种病原菌的体外抗菌活性或预测新型抗菌药物的临床治疗潜能以及抗菌谱；④监测细菌耐药性的变迁，掌握耐药细菌感染的流行病学，为临床经验性用药提供参考依据。常用药敏方法简述如下：一、 常用药敏测定方法（一） 纸片扩散法【原理】
在琼脂上接种待测菌后，将含有定量抗菌药物纸片贴在琼脂表面，纸片中的药物在琼脂中扩散；随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数降低，在纸片周围形成浓度梯度。过夜培养后待测菌在纸片周围一定距离开始生长，形成透明抑菌圈。抑菌圈的大小可反映细菌对所测定药物的敏感程度，并与抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即MIC越小，抑菌圈直径越大。【适用范围】
纸片扩散法是最为经典、简便、经济、选药灵活的药敏测定方法，目前在临床微生物实验室应用比较广泛。此方法只适用于大多数快生长的需氧菌。对于某些菌种（如李斯特菌属、厌氧菌等），由于需要特殊的培养基、不同的孵育环境，或者菌株间的生长速率差异较大等原因，尚没有标准的纸片扩散法操作程序及判定折点，因此必须作MIC测定。【注意事项】
①在操作过程中，应尽量挑取单一菌落，防止不同菌种间的污染；②配制菌悬液浓度应适当，一般要求0.5麦氏浊度；③不同菌种、不同药物的孵育时间、孵育温度和CO环境的需求略有不同，应严格按2照CLSI推荐条件进行；④所用纸片均为缩写，应避免药物间的混淆；⑤不同标本来源，所选取的抗菌药物组合会略有不同，如尿液、脑脊液等；⑥该方法得到的是抑菌圈直径，不是MIC值，故对临床治疗的指导作用不如MIC值更加直观可靠。（二） 琼脂稀释法【原理】
琼脂稀释法是将含不同浓度的药物混匀于琼脂平板培养基中，采用多点定量接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，MIC值为抑制细菌生长的琼脂平板所含的最低药物浓度。【适用范围】
琼脂稀释法可得到定量的MIC值，可用于没有纸片扩散法折点的菌种和药物，新抗菌药的体外抗菌活性测定，以及有关耐药性与耐药机制的科研。【注意事项】
新制备的M-H琼脂平板可当天使用或密封于塑料袋中4～8℃保存，对一些不稳定的抗菌药物，如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合制剂、氨苄西林、甲氧西林等应尽可能使用新鲜平皿。接种菌量对药敏结果MIC值可以产生明显影响，对琼脂稀释法来说最终的接种量5为每点10CFU。另外，该方法工作量较大，费时费力。该方法不适用于达托霉素的药敏测定。（三） 自动化药敏检测系统【原理】
基于肉汤稀释法，实现微生物孵育与检测的一体化。采用比浊法检测液体培养基中细菌的生长状况或者检测特殊培养基中荧光基质的水解作用。若细菌生长受抗菌药物抑制，则相应孔位浊度降低；不受抑制则孔位浊度增加。【适用范围】
自动化药敏检测系统被用于临床微生物室常规检测，近年来应用有增多趋势，相对于纸片扩散法药敏测定，节省劳动力。系统携带的药敏专家系统具有自动化、智能化、标准化等优势，并与实验室信息系统连接。专家系统可以对所得药敏结果进行自动验证，识别异常表型，提示试验中可能出现的技术错误，以便实验室工作人员进行确认。专家系统还能通过微生物药敏谱预测被检测细菌可能的耐药机制，方便实验室修正药敏报告，正确指导临床治疗。目前，国内常用的药敏检测系统有Vitek 2 compact、Phoenix 100等。【注意事项】
浊度技术出现云雾状浊度或片状沉淀物时，可被自动化阅读仪遗漏，导致结果错误。荧光法比浊度法更为灵敏，但由于荧光检测技术是间接的，检测结果可能受细菌对荧光底物的代谢能力等因素的影响。为更快地得到药物敏感性试验结果，对标准药物敏感试验方法进行改良，如提高接种细菌的浓度，使用特殊生长培养基，以加快细菌生长或利于细菌耐药检测。另外，自动化药敏检测系统存在抗菌药物种类及数量局限，某些药物折点改变不能及时更新，药敏专家系统升级延迟等缺陷。（四） 浓度梯度法（Etest法）【原理】
浓度梯度法是一种结合稀释法和扩散法原理对抗微生物药物直接定量的药敏试验技术。常用的浓度梯度法所用试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC稀释浓度的范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和折点具有较好的关联。【适用范围】
浓度梯度法适用范围广泛，并且操作简便，可直接获得菌株的MIC结果。但价格较高，临床实验室主要作为其他药敏检测方法的补充，例如，仅有MIC折点而无纸片扩散法折点，纸片扩散法不适用仅能进行MIC测定或根据临床需要在全自动药敏检测结果的基础上单独增加某种药物的药敏试验。此方法也用于科研工作。【注意事项】
药敏结果的正确读取是浓度梯度法准确可靠的前提，因此需要严格根据说明书对特殊菌属（如变形杆菌属）、药物（替加环素等）的结果进行正确判读。浓度梯度法与CLSI的稀释法获得的MIC结果呈高度相关性，CLSI MIC折点适用于浓度梯度法。二、 药敏测定的临床意义
根据抑菌圈的大小或MIC值，参照药敏折点标准“敏感（S）”、“中介（I）”、“耐药（R）”判定结果。
1. S表示通常情况下，使用推荐剂量的该药物时，感染部位所能达到的药物浓度能够抑制该菌株的生长。
2. R表示常规剂量的药物在感染部位通常达到的药物浓度，不能抑制菌株的生长或者证实菌株存在某些特定的耐药机制（如产生β-内酰胺酶等）或者治疗显示药物对该菌的临床疗效不可靠。
3. I表示血液和组织中通常可达到的药物水平接近菌株的MIC，药物治疗的反应率可能低于敏感株。I还意味着药物在生理浓集的部位具有临床疗效（如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类浓度较高）或者可以使用高于正常剂量的药物进行治疗（如β-内酰胺类）。同时，I还代表缓冲区，防止微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。
4. CLSI M100-S24（2014年）新引入肠杆菌科药敏试验的“剂量依赖性敏感（SDD）”的概念，CLSI建议报告肠杆菌科细菌头孢吡肟药敏试验时，用“SDD”替代“中介”。当菌株的头孢吡肟MIC为4或8mg/L（或抑菌圈直径19～24mm）时，报告为SDD，提示使用高剂量方案治疗感染。
体外药物敏感性测定能够预测药物体内活性，但是药物在体内的作用受到多方面因素的影响，例如宿主对药物的反应性、基础疾病、感染部位、药物代谢动力学等，导致体外药敏与体内活性不一致的现象。三、 不同菌种药敏测定的抗菌药物选择
对于分离的可疑病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。以下情况不必进行药敏试验：正常菌群与感染的关系不明确时；污染菌；已知细菌对某种抗生素天然耐药或全部敏感。不同菌种进行药敏测定时应考虑抗菌药物的抗菌谱、细菌的耐药机制、抗菌药物的药代动力学特点、流行病学资料、菌株的分离部位和天然耐药等因素。
药物的选择主要分为A、B、C、U四个组：①A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。②B组包含一些临床上重要、特别针对医院感染的抗菌药物，可用于首选试验，但只是选择性地报告临床。例如当细菌对A组同类药物耐药时，可选择性报告B组中的一些结果。B组其他报告指征包括以下几点：特定的标本来源（如第三代头孢菌素对脑脊液中的肠杆菌科菌，或者磺胺甲唑/甲氧苄啶对泌尿道的分离菌株）；多种细菌感染；多部位感染；对A组药过敏、耐受或无效的病例；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。③C组包括替代性或补充性抗菌药物，可在以下情况进行试验：某些单位潜在有局部或广泛流行的对数种基本药物（特别是同类的，如β-内酰胺类或氨基糖苷类）耐药的菌株；对基本药物过敏的患者；少见菌的感染（如氯霉素对肠道外分离的沙门菌属或耐万古霉素的肠球菌）；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。④U组包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物），这些药物对除泌尿道以外的感染部位分离的病原菌不应常规报告，主要针对一些特定的泌尿道致病菌。常见耐药革兰阴性菌不同组别的常规测试药物见表2-1。表2-1 肠杆菌科菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌常规测试的抗菌药物续表续表注意：表中同一小框内的药物类似，其结果解释和临床疗效都很接近，不必同时测定药敏，例如，对头孢噻肟敏感的肠杆菌科菌株，被认为对头孢曲松也敏感；而“或”字表示一组相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完全相同，所以通常在每个小框中”或”的药物只选择一种抗菌药物进行试验。当肠杆菌科菌、鲍曼不动杆菌对常规测试的抗菌药物均耐药，应该进行替加环素药敏试验并报告MIC值。*仅用于MIC试验；纸片扩散法不可靠。四环素敏感的菌株也被认为对多西环素和米诺环素敏感。然而，四环素中介或耐a药的某些菌株可以对多西环素或米诺环素或者两者敏感。b 分离于泌尿道的菌株不作为常规报告。c 当治疗由大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌引起的非复杂性尿路感染时，可用头孢唑林的结果去预测口服药物头孢克洛、头孢地尼、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢呋辛酯、头孢氨苄和拉氧头孢的结果。但头孢泊肟、头孢地尼、头孢呋辛酯可单独测定，因为部分菌株在对头孢唑林耐药时，可以对这3种药物敏感。d对于沙门菌属和志贺菌属，第一、二代头孢菌素，头霉素类可能会出现体外敏感，但临床治疗无效的情况，此时这些药物不应该报告敏感。对于粪便标本分离的沙门菌属和志贺菌属，只需要常规报告氨苄西林、一种氟喹诺酮类和甲氧苄啶/磺胺甲唑。对于从肠道外分离的沙门菌属应该测定并报告一种第三代头孢菌素，同时氯霉素也可根据需要测定并报告。仅对肠道或非肠道来源的伤寒样沙门菌属（伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌A～C群）进行体外药敏的测定，其他肠道来源的非伤寒样沙门菌属不需要常规测定其体外药敏。e对CSF分离株，头孢噻肟或头孢曲松替代头孢唑林进行测定。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]