作者：凌沛学,何兆雄
出版社：中国轻工业出版社
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硫酸软骨素试读：
前言
硫酸软骨素是一种结构复杂的糖胺聚糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，主要以与蛋白质结合的蛋白聚糖形式存在。目前，硫酸软骨素在国外主要应用于骨关节炎的预防和治疗，国内则多用于心血管疾病和眼科疾病。硫酸软骨素作为症状慢作用药物和膳食补充剂的普及应用，有效地改善了骨关节炎人群的生活质量，减少了非甾体抗炎药的消耗和不良反应。近年来，对其生理功能的深入研究表明，硫酸软骨素具有多种独特的生物活性，使其在抗寄生虫和病毒感染、再生医学、抗肿瘤、组织工程等领域有着引人瞩目的应用潜力。
不同来源的硫酸软骨素的结构呈现出高度的不均一性，表现在硫酸化位置、硫酸化程度、相对分子质量、葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的相对量等。来源于不同物种或同一物种不同组织的硫酸软骨素，其结构不一定相同，甚至同一组织内的硫酸软骨素，其结构也会随生理、病理状态及发育阶段而变化。硫酸软骨素二糖序列测定的方法和结构的完整解析尚不成熟，是其结构-功能关系和生理作用机制研究中有待突破的挑战性课题。
硫酸软骨素的生化性质、药理活性和临床功效与其结构有着密不可分的关系。商品硫酸软骨素是从动物的软骨组织经提取纯化过程制备的，其来源多样，结构不一。制备工艺和杂质等许多因素也会对硫酸软骨素的临床效果产生影响。硫酸软骨素的生物利用度目前仍存在争议，治疗骨关节炎的作用机制尚有待确切诠释。这些都是当前阻碍硫酸软骨素的开发和应用的亟待解决的问题。
我国是全球药物成分和膳食补充剂成分硫酸软骨素的主要供应国。此前，国内尚无针对硫酸软骨素的专著出版。为了使医药科技工作者能够较全面、深入地了解硫酸软骨素的结构、性质、功能及开发、应用前景，在张天民教授的指导下，以山东省药学科学院凌沛学研究员和烟台东诚生化股份有限公司何兆雄高级工程师为首的专家和科技工作者合作编著了《硫酸软骨素》一书，以期为硫酸软骨素的研究和开发提供帮助。本书主要包括以下几部分内容：硫酸软骨素的结构和理化性质、分离纯化工艺和分析检验策略; 低分子硫酸软骨素和硫酸软骨素钙的制备工艺; 硫酸软骨素的微生物发酵; 生物合成路线; 抗炎抗氧化作用及免疫活性; 对神经系统的作用; 硫酸软骨素与疾病的关系; 在心血管疾病、骨关节炎和眼科疾病防治中的应用; 在组织工程中的应用及在医药领域中的潜在应用等。为了提高我国硫酸软骨素产品的质量，有效地解决硫酸软骨素临床效果的差异问题，本书密切联系硫酸软骨素的生产和应用实践，在国内外最新研究成果的基础上，对硫酸软骨素的开发策略提供了有价值的建议。
本书的每一章均独立自成系统，但各章都有必要的相互联系，一些基本概念会重复出现，以便于读者阅读。各章对提及的问题探讨的角度不同，在叙述上会有一些差别，不宜强求统一。
科学的任何领域都有一个逐步发展的过程。在硫酸软骨素的研究前期，曾将其分为硫酸软骨素A和硫酸软骨素 C 等，这种提法在目前的文献中仍在沿用。现常用的另一较合理的提法是依据硫酸软骨素经酶解产生的不饱和二糖单位来划分。如果其二糖单位中4 位硫酸基者最多，可称为硫酸软骨素 A; 如果6 位硫酸化二糖含量最高，可称为硫酸软骨素C; 还可进一步描述其不饱和二糖单位中硫酸软骨素A和硫酸软骨素C等各占多少。
概括而言，宜从历史发展的角度来分析问题，其中涉及产品名称、生产工艺、检验方法、药理作用和临床应用等。
希望《硫酸软骨素》一书能为多糖药物领域的科技工作者提供有意义的指导，为促进我国多糖类药物的发展做出贡献。
由于编委会成员学术水平有限，本书难免有缺点甚至错误，我们诚恳地欢迎读者提出批评和建议。
最后，对山东省药学科学院和烟台东诚生化股份有限公司在本书编著过程中给予的配合和大力支持表示衷心的感谢!本书编委会2012年2月1 硫酸软骨素的发展简史1.1 引言
硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一类硫酸化的酸性黏多糖（acid mucopolysaccharide），黏多糖现多称糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。根据单糖组成的不同及硫酸基位置、数量的不同，CS可分为CS-A、CS-B、CS-C、CS-D和CS-E 等类别。[1]有些文献记载，CS的首次发现始于1884年Krukenberg等的研究。实际上早在1861年Fischer 和Boedeker（Fischer G，Boedeker C.Ann [2]Chem Pharm，1861，117：111-118）就从软骨中提取分离出CS，因此CS的研究至今已有150年的历史。但不同类别CS的结构直至20世纪60年代才初步明确。[3]1.2 CS的结构解析史[4]
1889年，Mörner鉴定出 CS-A 分子结构中有硫酸基存在。1891[5]年，Schmiedeberg将从软骨中提取的CS-A命名为“chondroitin schwefelsäure”，即chondroitin sulfuric acid，并推断该物质分子结构中含有乙酰基、硫酸基、葡糖醛酸和氨基己糖。后来认为CS-A中的[6]氨基己糖是氨基葡糖，直到1914年，Levene等才正确解析出该氨基己糖的具体结构，并命名为chondrosamine（软骨糖胺），即现在通常使用的galactosamine（半乳糖胺）一词。
现在，CS分子结构中的二糖重复单位已经明确，但这些结构的[7]解析过程却是漫长的。1914年，Hebting从 CS 的酸水解液中分离到一个二糖，命名为 chondrosine（软骨二糖），即现在所知的CS的[8]脱硫酸化或脱乙酰化二糖。1951年，Masamune等发现软骨二糖呈Elson-Morgan阳性反应，因此确认CS结构中在还原末端含有氨基己糖，因为只有还原末端的氨基己糖才能呈现该反应。基于这一点及高碘酸氧化降解产物，推测出了CS的正确结构。但决定性的结论出自[9-10]1954年和1955年Davidson和Meyer的研究。1954年，Davidson和Meyer将软骨二糖中的氨基己糖还原为hexosaminitol（己糖胺醇），在后续的羧基酯化反应中，己糖醛酸被还原为葡萄糖。然后发现被还原的二糖只能被β-糖苷酶断开，却不能被α-糖苷酶断开。这些结果确证了软骨二糖中葡糖醛酸和氨基己糖的存在，且两者是以β-糖苷键连接的，并通过茚三酮和高碘酸盐对还原型软骨二糖的系统性降解研究得出，该β-糖苷键分别连接于葡糖醛酸的1-位及氨基己糖的3-位。[11]1960年，Wolfrom和Juliano提供了一些实验数据再次确证了软骨二糖的结构。
CS主链中硫酸基的位置是由Meyer研究小组和Mathews等推断出[12]来的。Meyer小组等的研究表明，CS降解四糖产物中的糖醛酸因对β-葡糖醛酸酶敏感从而未被硫酸基取代，因此表明硫酸基连接于氨[13]基半乳糖残基上。Mathews对CS-A和CS-C的红外光谱进行了研究。CS-C的红外光谱中硫酸基处于平位（equatorial sulfate），而氨基己[14]糖结构中只有6位有此可能，因此推断CS-C是6 位硫酸化。CS-A的红外光谱表明，硫酸基处于轴向，因此推断CS-A是4位硫酸化。[13]Mathews发表于Nature的论文，题目为“Isomeric chondroitin sulfate”，即《同分异构的硫酸软骨素》，涉及的CS-A和CS-C为isomer（异构体）。1.3 CS在组织中分布及含量的研究史
早期的研究多从软骨中提取分离CS，但随着众多研究者的不断介入和研究范围的不断拓宽，发表于20世纪30～50年代与CS有关的论著揭示，CS存在于人和动物的很多组织器官中，且不同种属、不同组织中CS的含量差异较大。[15]
1956年，Meyer，Davidson，Linker和Hoffman小组曾系统性地研究了不同组织中酸性黏多糖的种类，不同类别的CS是根据提取物在钙盐中的沉淀情况及旋光度的不同来鉴别的。在他们所研究的不同组织中，健康的软骨、成骨、腓骨及人骨肿瘤组织如软骨肉瘤（chondrosarcoma）、脊索瘤（chordoma）等含有CS-A和（或）CS-C，成年结缔组织、肌腱和心脏瓣膜中含有CS-B和CS-C。此外，CS-A还存在于韧带、角膜、牛主动脉中，CS-B存在于猪皮中，CS-C存在于脐带中。[16]
猪鼻中隔中含有41%的 CS，牛或马的鼻中隔或气管软管中含[17]有36%～39%的CS，而羊气管软管中CS占12.6%，羊鼻中隔中CS[18]占19%～23%。1.4 我国CS的发展简史
1958年，我国于重庆西南制药厂投产CS，后产地增加至多个省[19-20]市，产品别名康得灵。1977年，成都制药三厂投产CS-A。1973年，上海医药工业研究院根据成都制药三厂、上海市食品公司制药厂、沈阳市食品公司生物制药厂及江西省和吉林省有关厂家的资料整理硫酸软骨素钠（CS-Na）的生产工艺，列入汇编，相对分子质量（M）r[21]定为20 000～50 000。
在CS的质量控制方面，我国最初执行的是地方标准，后被国家[22]卫生部的部颁标准收录，2002年列为国家药品标准，现被收载于[23]《中华人民共和国药典》2010年版二部。2002年的国家药品标准中收载的CS原料药有硫酸软骨素A钠（CS-A-Na）和供注射用的CS，并规定其来源应为猪喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织; CS制剂有CS注射液、CS-A-Na胶囊和CS滴眼液。2010年版中国药典中收载的CS原料药是CS-Na，包括CS-A和CS-C，制剂包括CS-Na 片和CS-Na 胶囊，规定来源与国家药品标准相同。1.5 国外CS产品的应用简史
在国外，CS于2003年被美国药典-处方集（USP-NF）第一增补本收载，2006年被欧洲药典（EP）5.6收载，在英国药典（BP）中也有收录。在欧洲，CS作为处方药用于治疗骨关节炎已有超过20年的历史。1992年，美国Nutramax Lab.，Inc.的CS和氨基葡糖的复合产品Cosamin DS®被美国FDA批准为膳食补充剂（dietary [24]supplement），用于改善关节疾病。
20世纪90年代中期以前，欧洲、北美等地所用CS的原料主要来自当地饲养的牛、羊等动物。后来由于疯牛病的影响，欧美等国家开始在全球市场采购以猪、鱼和禽软骨加工生产的CS。参考文献
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[24] 张天民. 国外硫酸软骨素膳食补充剂现状及其对我国相应产业可持续发展的启示[J]. 食品与药品，2008，10（01）：4-7.2 糖胺聚糖概述[1]2.1 引言
糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是重复二糖单位组成的线性多糖，此二糖单位由一个己糖胺（D-葡糖胺或D-半乳糖胺），通过糖苷键连接一个糖醛酸（D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸）或D-半乳糖组成。GAG如在其结构中含硫酸基和（或）糖醛酸的羧基则带负电荷，有聚阴离子本性。在早期的文献中，GAG称为黏多糖[2]（mucopolysaccharide），而具酸性者，也称酸性黏多糖。近年的文献中，黏多糖一词较少使用，但仍在用。
根据己糖胺的类型，GAG可分为葡糖胺聚糖（glucosaminoglycan，GlcAG）和半乳糖胺聚糖（galactosaminoglycan，GalAG）。前者有透明质酸（HA）、硫酸乙酰肝素（HS）、肝素（Hep）和硫酸角质素（KS），后者有硫酸软骨素（CS）和硫酸皮肤素（DS）。如此，GAG由于己糖胺和不含氮糖的类型，硫酸化的程度和位置，及二糖间和二糖内糖苷键的类型等而分为多种。在CS，DS，HA和KS中的己糖胺多为N-乙酰化，在Hep中的葡糖胺多为N-硫酸化，而在HS中N-乙酰化和N-硫酸化均存在。
本章对GAG进行概述。2.2 GAG的结构特征[3-4][5]
20世纪80年代初期即有人主要参考Rodén等的文章并结合[6-7]个人的生产实践对GAG进行了概述，现再结合近年的文献对GAG进行概述性论述。
2.2.1 组成GAG 的单糖
组成GAG的单糖一般为己糖和己糖的衍生物，主要有氨基葡糖（葡糖胺，glucosamine）、氨基半乳糖（半乳糖胺，galactosamine），葡糖醛酸（glucuronic acid）、艾杜糖醛酸（iduronic acid）、半乳糖（galactose）、甘露糖（mannose）、岩藻糖（fucose）和木糖（xylose）等，以及这些单糖的乙酰基和单硫酸基或多硫酸基衍生物。几种单糖的结构式见图2.1。图2.1 组成GAG的几种单糖的Haworth结构式
糖苷键的类型，以两个葡萄糖分子经1→4 糖苷键连接（即一个葡萄糖分子的C-1和另一个葡萄糖分子的C-4连接）为例，见图2.2。图2.2 糖苷键的类型
2.2.2 GAG 的结构
GAG基本由特定的重复二糖单位构成，GAG的结构特征见表[1]2.1。表2.1 GAG的主要结构特征续表
注：∗所有单糖，除艾杜糖醛酸为L-构型外，其他均为D-构型。
GAG的组成见表2.2。[7]表2.2 GAG的组成
注：∗己糖胺中是否有乙酰基未涉及，乙酰化情况见表2.1。[7]
现列出几个GalAG的二糖结构，见图2.3。
CS是由重复的二糖单位 [→4 GlcUAβ1→3 GalNAcβ1→] 组成的GAG。此二糖单位中的GalNAc通常在C-4或C-6位硫酸化（见图2.3）。CS-A通常指富含 [GlcUA-GalNAc（4S）] 的CS，CS-C则指富含 [9][GlcUA-GalNAc（6S）] 的CS。图2.3 GalAG的主要二糖结构
图中GlcUA：葡糖醛酸; GalNAc：N-乙酰半乳糖胺; 4S：4位硫酸基; 6S：6位硫酸基; IdoUA：艾杜糖醛酸[3-4，7，10]2.3 GAG 的提取
2.3.1 GAG 在组织中的存在形式
GAG在动物组织中多为由多糖链与蛋白质组成的蛋白聚糖（proteoglycan，PG），即蛋白质-GAG复合体（HA除外）。在PG分子中，GAG通过一个糖链与核心蛋白共价结合。到目前为止，已报道在哺乳动物和禽类物种的20种以上的PG中，10种以上含CS或DS。聚集蛋白聚糖（aggrecan）是软骨组织中一种主要的PG，研究较3多。其核心蛋白的相对分子质量（M）约为230×10，与核心蛋白共r3价结合的GAG链包括约100条M为（10～25）×10的CS链和30～60r3条M为（3～15）×10的KS链。r
2.3.2 GAG 的提取方法
软骨组织是CS的主要来源，而非软骨的结缔组织中（如皮、腱等）则同时含有CS和DS。如果从组织中先制取PG，再由PG制得GAG则成本必然较高，故均由组织直接通过蛋白质水解制得总GAG，再由总GAG中分离得到CS或DS。
2.3.2.1 碱水解法
GAG可由碱水解法从组织中提取。如从软骨中提取CS，在氯化钠存在下用碱水解，可使CS等GAG与其核心蛋白分离。此法的缺点是，GAG分子可能从断裂的一端被碱进一步降解。如果希望药物成分在特定的范围内保持分子完整，则不宜用浓碱，尽可能地使用稀碱并避免高温。提取其他GAG时，同样要注意碱水解导致糖苷键断裂的可能。实验室制备用碱提取可在硼氢化物存在下进行，硼氢化物可使木糖残基还原为木糖醇，阻止进一步降解。
2.3.2.2 蛋白酶酶解法
蛋白酶消化是从组织中提取GAG的常用方法之一。蛋白酶酶解常用的酶有木瓜蛋白酶、胰脏来源的酶和微生物来源的酶。酶的特异性低者适用，也可选用多种酶，效果较好。酶解后，常加热灭活蛋白酶。[3-7]2.4 GAG的回收
通过蛋白质水解制得的GAG，可通过以下方法进行回收:（1）在氯化钠或醋酸钠存在下用乙醇沉淀;（2）用季铵盐沉淀，常用的季铵盐有氯化十六烷基吡啶（cetylpyrydinium chloride，CPC）和溴化十六烷基三甲基铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）等;（3）用阴离子交换剂吸附，如Amberlite 或Dowex 品牌的强碱性阴离子交换树脂，DEAE-纤维素等均可使用。
1%～2%的GAG溶液用乙醇沉淀可提高回收率。浓度过低，所需乙醇的量增多。如果使用充分过量的乙醇，GAG浓度小至0.1%也可基本完全沉淀。GAG浓度过高时，沉淀趋向于呈糖浆状则难以操作，且分级分离难以完成。为使GAG完全沉淀，需要有足够浓度的盐，即应有足够的离子强度。组织消化液一般都含盐，但当乙醇反复沉淀使盐浓度降低时，再加入乙醇则溶液保持澄清而无沉淀生成。此时，加醋酸盐可使GAG从溶液中析出。盐的最终浓度小于5%即可，大规模制备时，盐的浓度还可降低。醋酸盐在乙醇中的溶解度比其他盐高，使用过量乙醇时也不会沉淀析出，而氯化钠有析出的可能。如果GAG浓度适当，且有足够的盐存在，则4～5倍的乙醇可使组织中的GAG完全沉淀。但从蛋白质水解液沉淀GAG，乙醇用量一般不超过2倍为宜，以免一些非所需的消化产物一起沉淀。
对于低GAG含量的溶液，阴离子交换剂可用作吸附剂。季铵盐化合物还可从组织消化液和其他溶液中回收GAG总体，由于生成的络合物溶解度低，可能从稀至0.01%或更稀的溶液中沉淀GAG。用3CPC不能沉淀的低MGAG也可用阴离子交换剂吸附，如M小于5×10rr的KS。[3-10]2.5 GAG的分离
回收的GAG可按以下方法分级分离:（1）利用GAG在不同浓度乙醇中的溶解度差异分级分离，即乙醇分级分离;（2）利用不同浓度氯化钠溶液中GAG与CPC或CTAB络合物的溶解度不同分级分离，即季铵盐法;（3）在阴离子交换剂柱吸附GAG后，利用不同浓度氯化钠溶液洗脱，即阴离子交换色谱法。非硫酸化的GAG（如HA）与硫酸化的GAG（如CS）可通过季铵盐法或阴离子交换色谱法分离，此因CS较HA带有较多的负电荷，与季铵盐或阴离子交换剂结合能力较强有关，M也有一定影响。r
2.5.1 乙醇分级分离
乙醇分级分离是分离 GAG 混合物的常用方法，适用于大规模分离，尤其适用于CS/DS与CS分离和KS与CS分离。在适合的条件下，此法可直接用于组织消化液。如有多种GAG存在，可先将混合物用季铵盐或离子交换剂分离后，再用乙醇分级分离，效果更佳。如性质类似的CS-A、DS和CS-C，用其他方法难以完全分离时，可用乙醇分级分离法。
在二价金属离子，如钙离子、钡离子或锌离子存在下，用乙醇分级分离更有效。方法是在搅拌下，缓慢加入乙醇至以5%醋酸[11]钙-0.5mol/L醋酸为溶剂的1%～2% GAG溶液中，4℃过夜，离心收集生成的沉淀，上清用较高浓度的乙醇再沉淀，即达到分级分离的目的。乙醇浓度达18%时，分离产物CS/DS共聚物中IdoUA的量最高，KS在65%乙醇中才被沉淀分离，而在40%和50%乙醇中未能分离。用[7]此法可从CS中分离DS或从CS中分离KS。凝胶过滤色谱的研究表明，终浓度为50%乙醇沉淀的GalAG，其分子较小，而18%～40%乙醇沉淀者分子较大。
2.5.2 季铵盐法
GAG的聚阴离子与某些表面活性物质如CPC、CTAB等形成络合物，在低离子强度的水溶液中不溶解。离子强度大时，这种络合物可解离并溶解。使络合物沉淀解离的最低盐浓度称为临界盐浓度，这取决于GAG聚阴离子的电荷密度和酸根（硫酸基和羧基）的解离度。不同GAG聚阴离子电荷密度及酸根不同（表2.3），使其络合物溶解时所需的临界盐浓度也不同，电荷密度越高，硫酸化程度越高，临界盐浓度就越高，据此可进行分级分离。表2.3 不同GAG的电荷密度和酸根（均值）
用季铵盐沉淀GAG，是分级分离复杂GAG混合物的最有效的方法之一，在某些情况下，本法能达到GAG混合物各个组分的完全分[12]离纯化。Garnjanagoonchorn等在研究从鲨、鳄和魟鱼以及鸡制取CS时，用木瓜蛋白酶消化得到的总GAG与CPC络合沉淀，然后用0.4mol/L和2.1mol/L氯化钠连续洗涤CPC-GAG络合物，最后得到GalAG。分离CS和KS时，使用2.5mol/L甲酸钠先洗脱CS，再用2mol/L氯化钠洗脱KS。
2.5.3 阴离子交换色谱法
GAG由于具有酸性基团，在溶液中以聚阴离子的形式存在，可用阴离子交换剂进行交换吸附。可采用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、Q-Sepharose Fast Flow、Amberlite FPA94 Cl、Dowex1-Cl等。将一种牛软骨的粗制品用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换剂柱吸附，用1mol/L 氯化钠洗脱被吸附的 GAG 进行分级分离，可得几乎只存在 [13]CS 的级分。
GAG通常以水溶液上柱，有时会有一部分不易被吸附的GAG，为了交换吸附完全，一般用含低浓度盐（如0.03～0.05mol氯化钠/L）[14]的溶液上柱，再用逐步提高盐浓度的方法进行梯度洗脱。
2.5.4 其他方法
凝胶过滤色谱也用于分离GAG，GAG洗脱部位取决于其分子大小。色谱固定相包含特定大小范围的孔隙，GAG根据其分子大小，被排出在孔外或在孔内与孔外的流动相中保持平衡。选用合适的分子筛，如葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。选用Sephacryl S-300从猪脂肪组织中分离GAG，级分中包含HA和CS/DS混合物。
电泳法一般用于分析检测和研究，是根据GAG酸根及电荷密度不同，采用区带电泳法进行分离。通常使用醋酸纤维素薄膜。[10，15]2.6 GAG 的鉴别
采用能特异降解GAG 的酶，可明确鉴别不同的GAG，见表2.4。某一种酶对某种GAG敏感，生成降解产物，然后通过色谱法检测，明确GAG的种类。∗[10]表2.4 GAG特异性解聚用酶续表
注：∗+敏感;-抗性; 乙酰肝素酶和肝素酶均指源自Flavobacterium的产品。
如下酶解条件供参考：GAG溶解于0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲液（pH 7.4）中，加入1mmol/L 氯化钙溶液和每1mg GAG 0.002 IU酶，37℃酶解2～6h。如CS或DS约200μg，37℃，在80μL pH 7.9的50mmol/L Tris缓冲液中经50mU软骨素酶ABC酶解2h; HS 或Hep 约200μg，37℃，在80μL pH 7.0 含2mmol/L 醋酸钙溶液的20mmol/L醋酸盐缓冲液中经20mU乙酰肝素酶Ⅰ/Ⅱ和20mU肝素酶一起酶解2h。加热至沸终止酶解反应。
GAG酶解得到的大多数二糖，可采用纸色谱法、纸电泳法、薄层色谱法和高效液相色谱法检测。一种高效液相色谱法分析HA、CS、DS、HS以及Hep的酶解产物时，采用氨基键合硅胶柱，并用磷酸二氢钠线性梯度洗脱（磷酸二氢钠 16～ 800mmol/L，>60min），检测波长230nm。对于硫酸软骨素类化合物和硫酸乙酰肝素类化合物，二糖随着盐浓度的增加以非硫酸化二糖、单硫酸化二糖、二硫酸化二糖、三硫酸化二糖的顺序依次洗脱，所有三硫酸化二糖的保留时间几乎相同。非硫酸化二糖的保留时间也几乎相同。若多硫酸皮肤素的二糖不能被有效分离，可用硫酸酯酶处理后再测定。与对照品对比保留时间鉴别和确认各个色谱峰。2.7 结语
本章介绍了几种提取分离GAG的方法。在实际工作中不能只依靠一两种即达到分离纯化GAG的目的，硫酸化程度、IdoUA含量和Mr均能影响提取分离过程，只有通过实验选取适宜的方法和合适的条件才能获得高产量和高纯度的产品。探索低成本大规模生产GAG是重要的研究方向之一。参考文献
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硫酸软骨素（CS）是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖（PG）的一类糖胺聚糖（GAG）。CS广泛分布于动物组织的细胞外基质（ECM）和细胞表面，糖链由交替的葡糖醛酸（GlcUA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc，又称N-乙酰氨基半乳糖）二糖单位组成，通过一个四糖连接区连接到核心蛋白的丝氨酸（Ser）残基上。在糖醛酸水平高度修饰的CS链称为硫酸皮肤素（DS）。长期以来，CS/DS仅被认为是PG的主要组分，作为细胞的惰性结构元件，参与维持组织结构的稳定。其重要的生理功能一直少受关注，其应用也并不广泛。近些年来，这类糖胺聚糖的分离纯化、工业制备、结构表征、生理功能研究和临床应用，发生了激动人心的变化，成为人们关注的焦点。
CS/DS主链的结构虽然较为简单，但CS/DS分子是复杂的，如GlcUA和GalNAc残基中羟基的硫酸化，某些GlcUA残基差向异构化为艾杜糖醛酸（IdoUA）以及这些己糖醛酸（hexuronic acid，HexUA）在链内的分布等，这使得CS/DS 分子足以携带大量的生物信息，从而拥有多种多样的生理功能。越来越多的证据证实，CS/DS糖链在细胞分裂、细胞增殖、分化、迁移、组织形成、器官形成、感染、创伤愈合和中枢神经系统发育等生理过程中发挥中心功能。CS/DS可与许多关键分子，如生长因子、细胞因子、趋化因子和黏附因子等，通过[1]链内特殊的糖结构域相互作用，参与调节许多细胞事件和生理过程。这些相互作用的生理意义，正在被揭示出来。[2]
本章介绍CS/DS的结构，特别是CS/DS整链，包括四糖连接区、重复二糖区和非还原端的结构不均一性。[3]3.2 GAG的结构
GAG是线性、可硫酸化、带负电荷的多糖，相对分子质量（M）r3范围（10～100）×10。GAG主要有两类：非硫酸化的 GAG，包括玻璃酸（HA，又称透明质酸）; 硫酸化的GAG，包括CS、DS、硫酸角质素（KS）、肝素（Hep）和硫酸乙酰肝素（HS）。GAG主链由重复二糖单位组成。重复二糖单位由糖醛酸（D-GlcUA 或 L-IdoUA）和氨基糖（D-葡萄糖胺或D-半乳糖胺）或中性糖（D-半乳糖）组成。GAG可根据其所含的己糖醛酸、己糖胺或己糖单位的类型，以及这些单位间糖苷键的几何构型来区分。CS/DS含半乳糖胺，也称半乳糖胺聚糖（GalAG），而 Hep 和 HS 含葡糖胺，亦称葡糖胺聚糖（GlcAG）。氨基糖可以在C-4或C-6或在非乙酰化氮上硫酸化。然而GAG的糖主链还可以在不同位置被硫酸化，一个简单的八糖可以有超过1 000 000 种不同的硫酸化序列。GAG也可在糖苷键的几何构型（α或β）发生变化。在生理pH，所有羧基和硫酸基皆去质子化，赋予GAG很高的负电荷密度，Hep是已知生物分子中负电荷密度最高的分子。
GAG的主要结构特征见图3.1。图3.1 GAG的结构3.3 CS/DS的基本结构和二糖异构体
3.3.1 CS 的基本结构和二糖异构体
CS早在1884年就被分离出来，但其单糖的性质和结构直到1925年才由Levene做了报道，其组成成分是等摩尔比的D-葡糖醛酸、D-[4]半乳糖胺、乙酸和硫酸。
CS的重复二糖单位是 [→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→]。哺乳动物的CS常在GalNAc的C-4或（和）C-6上硫酸化。CS的正确结构见图3.2A。术语CS-A系指富含[GlcUAGalNAc（4S）]（A-单位）的CS; CS-C则系指富含 [GlcUA-GalNAc（6S）]（C-单位）的CS。在动物世界，特别是海洋非脊椎动物中，除了这些常见的A-单位和C-单位外，还发现硫酸化型式多样和中性糖分枝的多种二糖单位。这些二糖单位文献上称为CS的二糖异构体（isomeric form）或变体（variant），笔者认为称“变体”较为妥当，这些二糖的名称和结构见图3.2 B的CS单位。图3.2 CS/DS的二糖单位及其结构
A CS 和DS 的主链分别是由重复二糖单位 [-4GlcUAβ1-3GalNAcβ1-] 和 [-4IdoUAα1-3GalNAcβ1-] 组成的线性多聚体。DS是CS的立体异构体，CS链中部分GlcUA被IdoUA所取代。这些糖残基可在不同位置被硫酸基酯，化用“”表。示
B CS 和DS 的二糖单位，DS 单位前的i 代表IdoUA。
C CS/DS 经软骨素酶ABC 消化后的产物。 用软骨素酶消化释出的二糖单位具有多种硫酸化型式的不饱和二糖骨架ΔHexUA-GalNAc（ΔHexUA 代表4，5-不饱和糖醛酸）。Fuc，Glc，2S，3S，4S 和6S 分别代表 D-岩藻糖、D-葡萄糖、2-O，3-O，4-O和6-O-硫酸基。∗这些单位尚未鉴定。∗∗这些单位不稳定并降解成硫酸化的GalNAc。其他单位都经HPLC测定。
无硫酸化的 O-单位 在牛、 猪和鸡的商品 CS 样本中的相对含量报道为 6.0%～8.0%，鲸鱼为9.0%。在某些软体动物，如泥蜗牛中则高达50%，也是秀丽隐杆线虫（Caenorabditis elegans）和哺乳动物血液中低硫酸化PG（bikunin）的主要二糖单位。
一硫酸化的A-单位和C-单位 这是大多数 CS 链的主要二糖单位，其相对含量则随物种变化。牛、猪和鸡的商品 CS 样本中，A/C 比值分别为1.5～2.0、4.5～7.0 和3.0～4.0，A单位高于C单位，是主要的二糖单位。鲨鱼软骨CS的A/C比值为0.45～0.70，C单位则高于 A 单位，是主要的二糖单位。鳐鱼软骨 CS 的 A/C 比值为1.00～[5]1.40，又与鲨鱼的不同。
二硫酸化二糖单位有B-、D-、E-、K-、和L-单位等。
D-单位 [GlcUA（2S）-GalNAc（6S）] 这是鲨鱼软骨 CS 的表征组分（20%）。 鲨鱼CS有时也称CS-D。D-单位和B-单位 [GlcUA（2S）-GalNAc（4S）] 常不予区分。
E-单位 [GlcUA-GalNAc（4S，6S）] 这是乌贼软骨CS 的主要或表征性二糖单位（>60%），在乌贼角膜和海参体壁中也含存。哺乳动物肥大细胞亚族、天然杀伤细胞和嗜碱性白细胞具有富含E-单位的CSPG。脑组织的PG如淀粉样蛋白聚糖（appican）也含存这种表位（抗原决定部位）。
K-单位 [GlcUA（3S）-GalNAc（4S）] 和L-单位 [GlcUA（3S）-GalNAc（6S）]两者皆为葡糖醛酸C-3位上硫酸化的二糖单位。早在1960年就有人报道含存于鲨鱼软骨的CS链中。在皇蟹、海参体壁和乌贼软骨中也含存。
M-单位 [GlcUA（3S）-GalNAc（4S，6S）] 或 T-单位 [GlcUA（2S）-GalNAc（4S，6S）] 两者是三硫酸化的二糖单位，也见于乌贼软骨CS链中。
F-单位 [GlcUA（3-α-L-Fuc）-GalNAc（4 S）] 和G-单位 [GlcUA-GalNAc（4S）（6β-D-Glc）] 两者皆为中性糖分枝的二糖单位。F-单位的分枝糖是L-岩藻糖，可见于皇蟹和海参，G-单位的分枝糖是D-葡萄糖，在乌贼软骨和皮肤中含存。
3.3.2 DS 的基本结构和二糖异构体
DS链（曾称CS-B）具有低修饰（CS）和高修饰（DS）结构域[4]组成的杂化共聚结构。修饰包括GlcUA的C-5差向异构化成L-艾杜糖醛酸（IdoUA），GalNAc的C-4、C-6和IdoUA C-2的O-硫酸化。IdoUA赋予DS构象柔性，改变硫酸基的形状和空间取向，糖链比含较多[6]GlcUA的CS链有更高的负电荷含量。链中IdoUA的含量范围，从CS链的0%到各种DS链的80%～90%，皮肤PG具有最高的百分含量。DS链中不同硫酸化型式的二糖异构体，如iA、iB、iE等与CS链的相对应，见图3.2 B的DS单位。
iE-单位 [IdoUA-GalNAc（4S，6S）] 这是八目鳗脊索 DS 的表征[7]组分（68%）。主要含有iE-单位的DS也称CS-H，猪肠和海胆中也含存。猪小肠商品肝素中杂含的DS链中，可能富含iE-单位。
iD-单位 [IdoUA（2S）-GalNAc（6S）] 和iB-单位 [IdoUA（2S）-GalNAc（4S）]两者存在于哺乳动物组织、鳝皮、海鞘和八目鳗脊索的DS链中。相同的表位发现于鼠脑。
iK-单位 [IdoUA（3S）-GalNAc（4S）] 和iL-单位 [IdoUA（3S）-GalNAc（6S）]两者也存在于鳝皮中，核磁共振（NMR）光谱显示，也存在IdoUA（2S，3S）。
iT-单位 [IdoUA（2S）-GalNAc（4S，6S）] 或 [IdoUA（3S）-GalNAc（4S，6S）]是三硫酸化的二糖单位，在八目鳗脊索中有相当的含量。
3.3.3 CS/DS 链的二糖组成及分析测定
CS/DS糖链中二糖异构体含存的比例，主要取决于来源的物种和[1]组织。各种来源CS/DS链的二糖组成见表3.1。表3.1 CS/DS链中的二糖组成
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