作者：乔杰
出版社：人民卫生出版社
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体外受精胚胎移植技术实施指南试读：
前言
自1978年Edward和Steptoe采用体外受精胚胎移植技术妊娠的世界第一例婴儿成功诞生，这一技术至今经过了近40年的发展。随着体外受精胚胎移植技术的不断深入开展和普及，以及各种衍生技术的发展，使其应用范围越来越广泛。除了治疗女性盆腔异常导致的不孕症以外，1992年比利时的Palermo等开创的卵母细胞胞质内单精子注射技术，解决了男性因素导致不孕症的窘境。配子及胚胎的冷冻技术逐渐进步，使得这一技术得到更高的成功率。20世纪90年代后胚胎植入前遗传学诊断逐渐应用于临床，解决夫妇因染色体异常而导致的不孕症或复发性流产，并成功应用于单基因疾病的阻断以及HLA配型。在这一过程中，各种测序技术不断更新发展，使得其临床应用快速有效。近年来，生殖领域专家激烈争论的卵细胞胞质置换或卵细胞核移植技术是否能够成为治疗线粒体疾病的安全有效治疗方法，以及可否进一步推广帮助卵细胞老化无法受孕的妇女等相关问题，引发社会各界的关注。所有这些，均表明人类辅助生殖这一飞速发展的学科，需要及时有效的指南保证治疗的安全和有效性，而目前在我国，尚缺乏规范统一的诊治指南。
中国医师协会生殖医学专业委员会组织生殖内分泌及辅助生殖技术专家编写了《体外受精胚胎移植技术实施指南》，客观分析了目前体外受精胚胎移植技术的应用现状，内容涵盖了从体外受精胚胎移植技术诊疗过程中的适应证和禁忌证，各种促排卵方案的应用，取卵、胚胎移植等临床操作，到配子和胚胎显微操作，辅助生殖技术相关衍生技术，黄体支持，辅助生殖并发症及其处理以及男科取精常用技术及并发症等。希望本指南可以规范我国体外受精胚胎移植技术的诊治流程。广大生殖医学工作者通过对指南的解读，可以有更好的治疗结果，并将辅助生殖并发症抑制在最低水平，使患者有更好的治疗结局。2017年1月第一章 体外受精胚胎移植技术的应用一、定义
辅助生殖技术主要包括体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）及衍生技术（ICSI、PGS、PGD、IVM等）。（1）体外受精胚胎移植技术（in vitro fertilization，IVF）：
是将不孕夫妇的卵细胞与精子取出，培养成胚胎后再移植入子宫腔内，以达到妊娠目的。（2）卵胞质内单精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）：
是伴随IVF的一种特殊的受精方式，是把单个精子直接注入卵胞质内，协助受精，这项技术解决了常规受精失败的问题，提高了IVF［1］的成功率。同时ICSI对重度少弱精子症、梗阻性无精子症以及部分非梗阻性无精子症需睾丸显微取精的男性不育症患者的治疗，具有里程碑的意义。（3）植入前胚胎遗传学诊断技术（preimplantation genetic diagnosis，PGD）：
是在胚胎着床之前对配子或胚胎的遗传物质进行分析，检测配子或胚胎是否有遗传物质异常的一种早期产前诊断方法；植入前胚胎遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）是选择染色体整倍体的胚胎进行移植，进而提高体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）［2］的成功率。（4）未成熟卵细胞体外成熟培养（in vitro fertilization and embryo transfer，IVM）：
通过取出未成熟卵细胞，采用特殊的体外培养液中培养，然后再行常规受精或ICSI，从而获得胚胎而达到妊娠。（5）辅助孵化（assisted hatching，AH）：
采用特殊的激光对胚胎透明带的打孔，可促进胚胎孵出率、提高其着床率。（6）卵细胞冷冻、胚胎冷冻与冻融胚胎移植（frozen embryo transfer，FET）及卵巢组织冷冻：
采用玻璃化冷冻及慢速冷冻技术冷冻和解冻成熟的卵细胞、胚胎及卵巢组织。二、目前国际及中国IVF的应用状况1.IVF技术的发展
1978年，世界首例试管婴儿诞生，揭开了人类辅助生殖技术研究的序幕。目前，世界上已有超过500万婴儿通过该技术出生，占全球新出生人口的2%~3%。中国内地自首例试管婴儿于1988年在北京大学第三医院诞生到现在，辅助生殖技术应用发展迅猛，到目前我国年应用量已达70万个周期，平均临床妊娠率为30%~40%，总体辅助生殖技术水平已达国际先进水平。IVF的衍生技术，中国首例ICSI及PGD试管婴儿于1996及1999年在中山大学附属第一医院完成。目前可通过PGD诊断的单基因遗传病包括常染色体遗传性疾病、性连锁遗传性疾病和线粒体疾病等30余种。随着高通量、高分辨的aCGH/SNP-array诊断技术的推广，二代测序（next generation sequencing，NGS）技术的临床准入，加上单细胞全基因组扩增技术的不断改进，产前和植入前的遗传学诊断技术正在发生巨大的变革，诊断的困境正在逐步被克服。生殖冷冻技术不仅使长期保存生殖细胞或组织成为可能，也为辅助生殖技术研究及治疗提供了更大发展潜力。
需要引起重视的是辅助生殖技术本身在社会、伦理、道德、法律［3］等方面问题日益突出，其应用安全性值得探讨。针对辅助生殖技术涉及的医学伦理及道德法律问题，我国相关部门已开始制定相应法规，实行准入制度，并加大国家法令性监督力度。2.IVF机构的发展
过去几十年，世界范围内IVF中心的数量和周期数都急剧增加，根据2013年国际生殖医学联盟（International Federation of Fertility Societies，IFFS）的报告，全球有4000多家IVF中心，美国凭借世界领先的试管婴儿技术及开放的政策和文化，使得辅助生殖技术的发展态势愈发成熟。根据中国卫生计生委的数据，目前中国经批准开展人类辅助生殖技术和设置人类精子库的医疗机构共有432所。三、本指南制定的目标
WHO全球不孕症流行病学趋势报告（1990—2010）中，数据涉及全球190个国家和地区，20~44岁妇女为主；据估算，2010年，全球未避孕而2年内未活产的妇女约12100万。据WHO评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。中国人口协会在2012年发布的调查结果显示，中国不孕不育患者超过4000万，即每8对夫妇中有1对夫妇存在生殖问题。中国自2015年全面放开二胎政策后，高龄夫妻备孕成为目前二胎备孕的主要人群，越来越多的高龄夫妻需要借助体外受精胚胎移植技术达到受孕，难治性、复杂性不孕病例越来越多，这需［4］要更多医生尽快掌握不孕不育诊治流程和进行规范化治疗。目前以IVF-ET技术为代表的人类辅助生殖技术已经比较成熟，虽然为广大妇科医生所熟悉但是未能完全掌握，导致很多药物滥用及医源性并发症，带来诸多不安全性医疗事故，编委会专家们期待通过梳理IVF-ET 及衍生技术的定义、目前应用现状、适应证、禁忌证、治疗方案和临床操作等，形成体外受精胚胎移植技术诊疗常规指南，规范辅助生殖各项技术的应用，为广大批准开展辅助生殖技术的医疗机构的医生提供临床实用性指导。（梁晓燕 熊承良）参考文献
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1978年世界首例试管婴儿诞生，随后促排卵技术在IVF中广泛应用。促排卵过程中，早发的LH峰影响了获卵率及卵母细胞质量，进一步影响了IVF-ET结局。1984年GnRH-a首次应用于IVF周期以防止LH峰的提前出现。其后的时间里，GnRH-a被广泛应用于辅助生殖技术。垂体降调节使卵巢处于相对静止的状态，通过适量外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn）可使卵巢内的多个卵泡同时发育，达到刺激周期的卵泡同步性，在同一时间点获得同步发育的成熟卵泡。避免或减少了早发LH峰的出现，降低了周期取消率，提高了IVF-ET的妊娠率。垂体降调节是辅助生殖技术（ART）超促排卵过程中的重要一环。垂体降调节方案是IVF促排卵的重要方案，也是主流方案［1~2］。
GnRH-a控制性超促排卵分为GnRH-a长方案和GnRH-a短方案，长方案根据使用GnRH-a的剂型、剂量和时机的不同又分为多种方案。长效剂型为缓释制剂，药物可有规律地均匀释放28天，短效为非控释剂型，主要通过皮下注射方式给药，给药后有效性可持续24小时。［3］1.GnRH-a降调节方案
长效和短效降调节药物均有多个有效剂量，长效降调节药物的剂量有3.75mg、1.875mg、1.25mg甚至0.75mg，常规剂量为3.75mg和1.875mg；短效降调节药物的剂量有0.1mg、0.05mg、0.03mg，常规剂量为0.1mg和0.05mg。短效剂型对垂体的抑制程度较浅，促排卵过程中LH水平不至于过低，每天注射后仍能发挥短暂的“火焰”效应，使内源性Gn短暂性升高。方案也根据临床工作中的经验总结不断地更新，包括长效长方案、短效长方案、超长方案、改良超长方案、［4］改良长效长方案等，针对患者具体病因个体化治疗。（1）GnRH-a长方案按剂型分为长效长方案和短效长方案：
主要适用于年轻、卵巢储备良好的患者。排卵正常的患者在黄体中期使用降调节药物，排卵障碍的患者可以口服短效避孕药（oral contraceptive，OC）+ GnRH-a双压方案，在OC余4~6片时使用降调节药物。①长效长方案使用1.875~1.25mg的长效GnRH-a单次肌内注射；②短效长方案每天使用0.1mg或者0.05mg短效GnRH-a直至扳机日。降调节后14~18天，通过检测血激素水平和超声来判断是否达到降调节标准：血清E＜50pg/ml，P＜1ng/ml，LH＜3mIU/ml，超声显2示子宫内膜厚度＜5mm，双卵巢卵泡直径均＜10mm或者无黄体囊肿时视为达到降调节标准。Gn的启动剂量取决于患者的年龄、窦卵泡［5］数，基础性激素、AMH、体重指数及既往卵巢的反应性。（2）GnRH-a超长方案：
适用于重度PCOS、高LH及子宫内膜异位症的患者。月经周期第2~4天使用长效GnRH-a 3.75mg或1.875mg肌内注射，28~30天后再次长效GnRH-a 3.75mg或1.875mg肌内注射，连续注射2~3支。末次注射后28~30天检测激素水平和超声，达到降调节标准后启动Gn，该方案一般会使垂体过度抑制，可以适当推迟启动Gn时机，以减少Gn天［6］数。（3）GnRH-a改良超长方案：
适用人群同超长方案。排卵正常的患者在黄体中期，排卵障碍的患者口服短效避孕药（OC），在OC余4~6片时使用长效GnRH-a 1.875~1.5mg，28~30天后再次注射相同剂量的长效GnRH-a，末次注射18~20天抽血和超声检查，达到降调节标准后启动Gn。（4）GnRH-a改良长效长方案：
适用人群同GnRH-a长方案。在月经周期第2到4天使用长效GnRH-a 3.75mg肌内注射，28~40天后检测血激素水平和超声，当达［7］到降调节标准后启动Gn。［8］2.GnRH-a短方案
GnRH-a短方案是利用GnRH-a的flare-up作用，在卵泡早期刺激垂体引起内源性Gn迅速分泌，并与外源性Gn同时作用，募集卵泡，3~5天后内源性逐步被抑制，仅由外源性Gn刺激卵泡发育。短方案主要适用于卵巢反应不良的患者。方法：月经第2天开始使用GnRH-a 0.05~0.1mg至扳机日，并同时或者推后一天使用Gn。Gn启动剂量同长方案。
在促排卵过程中检测血清激素的变化和卵泡数量，根据卵巢的反应调整Gn用量，以获得适量的同步发育的优势卵泡，当至少3个优势卵泡≥18mm，每优势卵泡（直径≥14mm）雌二醇水平达到200~300pg/ml时给予hCG扳机，hCG的剂量因雌二醇水平、卵泡数目多少、既往周期卵细胞成熟度及OHSS病史的不同而不同，剂量可以4000~12 000IU之间。二、GnRH拮抗剂
GnRH拮抗剂（gonadotropin-releasing hormone antagonist，GnRHant）是在GnRH十肽的第6号和第8号氨基酸位点上进行了修改，使其半衰期延长且与垂体的GnRH受体结合后不发挥生物学活性，从而阻断内源性GnRH的作用，使血清中的内源性FSH、LH水平迅速下降，LH峰不能出现。应用常规剂量外源性促性腺激素促排卵联合GnRH拮抗剂抑制LH升高及排卵的方案即为GnRH拮抗剂方案，是体外受精与胚胎移植的常用刺激方案。［9］1.GnRH拮抗剂方案的适宜人群
GnRH拮抗剂通过与内源性GnRH竞争，作用于腺垂体Gn分泌细胞的GnRH受体，1~2小时即可迅速抑制LH的产生，继而抑制早发型LH峰，以达到垂体降调节的作用。在控制性促排卵过程中使用的GnRH拮抗剂不影响FSH水平，在连续用药时可维持对LH的抑制作用且呈剂量依赖性，而停药后抑制作用可在48 小时内解除。GnRH拮抗剂方案适用于各类人群的控制性促排卵，包括卵巢正常反应、低反应及高反应。
对于卵巢正常反应的患者，与GnRH激动剂长方案相比，优质胚胎数相似，种植率、临床妊娠率、总体人群的活产率、持续妊娠率、流产率相当，但卵泡刺激天数缩短，Gn用量减少，OHSS发生率降低。对于卵巢低反应的患者，与GnRH激动剂长方案相比，促排卵时间短，Gn用量降低，临床妊娠率相似。欧洲人类生殖与胚胎学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）关于预防OHSS发生的指南指出，对于年龄＜35岁和OHSS高风险的患者，推荐首选GnRH拮抗剂方案，减少Gn用量，缩短用药时间，减少最后触发的hCG用量或用GnRH激动剂代替hCG诱发排卵并全部胚胎冷冻，将有效减少中、重度OHSS的发生。［9］2.GnRH拮抗剂的使用方案
从月经第2~4天开始给予外源性促性腺激素（Gn）启动促排卵，启动促排卵的Gn剂量根据患者的年龄、窦卵泡数（antral follicle count，AFC）、抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）、基础卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、体重以及既往促排卵的反应调整，常用剂量为100~300IU/d。根据GnRH拮抗剂开始使用的时间分为固定（fixed）方案和灵活（flexible）方案。固定方案多适用于正常卵巢反应及高反应患者，灵活方案多用于异常卵巢反应（卵巢反应慢或低反应）的患者，以减少使用GnRH拮抗剂产生的不良影响。（1）固定方案：
常在Gn使用第5或6天开始加用GnRH拮抗剂250μg，每天1次至hCG触发日。该方案的优点是，既可以有效控制早发LH峰，又可以减少患者的就诊次数，简化方案，同时获得与GnRH激动剂长方案类似的获卵数、优质胚胎率和临床妊娠率。（2）灵活方案：
开始添加GnRH拮抗剂的时间，可在优势卵泡直径达到14或15mm时，或在优势卵泡直径＞12mm且血清雌二醇＞300pg/ml时，目前尚无统一标准。灵活方案在给予hCG进行触发时的主要依据倾向于以卵泡直径为主，血清雌激素水平仅作为第二参考。该方案的优点是对估计可能出现异常卵巢反应的患者，可以减少GnRH拮抗剂的使用量，缩短卵巢刺激时间，同时降低OHSS的发生风险。与固定方案相比，在使用中出现LH峰的可能性增大，有可能使子宫内膜长时间暴露在高雌激素和高LH的作用下，使子宫内膜容受性下降，因此可能会降低临床妊娠率。［9］3.GnRH拮抗剂方案中触发的时机及方法
GnRH拮抗剂方案中，hCG触发的时机和剂量与GnRH激动剂长方案基本相同，建议在3个主导卵泡直径≥17mm或2个主导卵泡径线≥18mm时注射hCG触发，同时应综合考虑孕酮和雌二醇的水平。
在GnRH拮抗剂方案中还可选择GnRH激动剂触发卵细胞最后成熟。其原理是利用GnRH激动剂激发垂体释放内源性FSH和LH（LH峰），从而诱导卵母细胞恢复减数分裂。与自然周期的LH峰相比，GnRH激动剂诱发的LH峰的上升支从14小时缩短为4小时，而且无14小时的平台期，但两者的下降支均为20小时。GnRH激动剂触发的剂型和剂量尚未统一，常用有曲普瑞林0.2mg、布舍瑞林0.5mg、醋酸亮丙瑞林1~1.5mg。GnRH激动剂触发后的取卵时机与hCG触发相同。GnRH激动剂触发的主要优点是显著降低OHSS的发生风险，但目前临床研究显示GnRH激动剂触发使卵巢储备功能正常妇女的妊娠率和活产率显著降低，因此，GnRH激动剂触发适用于OHSS高风险的人群。［9］4.GnRH拮抗剂方案中的黄体支持
黄体支持在GnRH拮抗剂方案新鲜周期中是非常必要的。与GnRH激动剂方案不同，其黄体功能不全的原因还包括：①GnRH拮抗剂能够迅速抑制LH的脉冲分泌，使LH水平降低，可能导致黄体功能不足；②GnRH激动剂触发时，黄体功能不全更严重。
hCG触发时，采用常规黄体支持方案（详见黄体支持章节）。GnRH激动剂触发时如果仅采用常规黄体支持，临床妊娠率较hCG触发低，流产率相对增加，需采用强化黄体支持方案，包括以下几种：①单次添加hCG：GnRH激动剂触发后35小时补充hCG 1500IU；②多次添加hCG：取卵后1、4、7天补充hCG 1000IU；③强化雌孕激素：隔日皮贴雌激素100μg×3次，或者口服雌激素4mg/d，维持血雌二醇水平达到200pg/ml；常规或加强黄体支持，维持血孕酮水平达到20ng/ml；④补充重组LH（rLH）：取卵日起，rLH 300IU隔日使用×6次。鉴于目前GnRH激动剂触发后的黄体支持仍然存在诸多问题，建议全部胚胎冻存行冻胚移植作为弥补方法使用。三、微刺激或温和刺激
微刺激或温和刺激（mild stimulation）是与常规刺激方案相比使用较低剂量和较短时间Gn，或单独使用口服促排卵药物，或口服促排卵药物联合低剂量Gn促排卵，以获得2~7枚卵细胞为目的的卵巢刺［10~12］激方案。该方案常用于卵巢低反应患者，也可用于OHSS高［10~11］风险的高反应人群和有激素依赖肿瘤风险的患者。目前应用于卵巢储备正常人群的资料显示与常规刺激方案相比，每新鲜移植周［13］期活产率及每取卵周期累积活产率低于常规卵巢刺激方案。
1. Gn温和刺激方案
Gn启动推迟至月经周期第5~7天开始，Gn剂量不超过150IU/d，常在卵泡直径达到约14mm时每天添加GnRH拮抗剂250μ g，直至2~3个主导卵泡直径≥17mm或1~2个主导卵泡径线≥18mm时行hCG触发［11］。［12］
2.口服促排卵药物或口服促排卵药物联合Gn的微刺激方案
于月经周期第3~7天单独口服促排卵药物氯米芬50~100mg/d，或来曲唑2.5~5mg/d，也可同时联合小剂量Gn75~150IU/d应用，常在卵泡直径达到约14mm时每天添加GnRH拮抗剂250μg，直至2~3个主导卵泡直径≥17mm或1~2个主导卵泡径线≥18mm时行hCG触发。
3.如行新鲜胚胎移植，微刺激和温和刺激促排卵后建议常规行黄体支持。四、自然周期
自然周期是不用任何药物刺激卵巢诱导排卵，但必须通过临近排卵期反复监测LH峰估计排卵时间，以便获取成熟卵细胞。其最大的优点是简单经济，可重复性强，不存在卵巢过度刺激和多胎妊娠的风险，但获取的卵细胞很少，足月妊娠分娩率甚低（6%）。伴随着GnRH-ant和Gn在临床的应用，改良的自然周期方案应运而生。适宜人群为：①卵巢低反应患者；②患激素相关性恶性肿瘤或存在此类疾［14~16］病风险不能进行卵巢刺激患者；③自愿选择自然周期。［17~19］1.自然周期
自月经周期2~4天监测卵泡，监测卵泡大小及E、LH、P，若卵2泡直径≥18mm或（和）E≥200~300pg/ml，GnRH-a 0.2mg或hCG10 2000IU诱发排卵；若LH提前出现峰值（≥20IU/L），紧急取卵。［20~22］2.改良自然周期
自月经周期2~4天监测卵泡，监测卵泡大小及E、LH、P，当卵2泡直径≥14mm时，给予GnRH-ant 0.25mg/d，抑制内源性的LH峰，同时给予Gn 150IU，维持优势卵泡发育。当卵泡发育到18mm或（和）E≥200~300pg/ml时，给予注射GnRH-a 0.2mg或hCG 5000~10 000IU2诱发排卵。（张翠莲 杨冬梓）参考文献
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取卵术通常在注射hCG或GnRH-a 36~38小时后进行，经阴道超声引导下穿刺取卵术是最常用的IVF采集卵细胞的方法。1.术前准备（1）核对患者及丈夫姓名，了解患者全身体格状况及既往病史。向患者说明手术过程，获得患者术中最大配合。（2）设备准备：配套的实时超声显像仪、高频阴道探头及穿刺适配器（穿刺针支架）、单腔或双腔穿刺取卵针，控制良好的持续负压吸引器、恒温试管架装置等。穿刺取卵针的直径一般在16~22G的
［1］范围，根据本单位的操作经验和规范选择负压100~120mmHg范围，原则上尽量减少对卵丘复合物的损伤。（3）术前麻醉：根据情况可选择静脉麻醉、局部麻醉、仅镇静或不用药。
1）术前镇静：通常选择术前30分钟肌注哌替啶（度冷丁）50mg或100mg，注射前后监测患者生命体征。
2）静脉麻醉：一般采用短期麻醉药如芬太尼联合苯二氮类或咪达唑仑（咪唑安定、异丙酚）静脉麻醉，由专职的麻醉师执行。注意麻醉安全，如麻醉医师现场监测，开放静脉通路，在手术过程中心电和血氧监护等。目前并没有研究证实麻醉药物和技术的选择与IVF结局之间有明确关系。（4）体位准备：术前排空膀胱，患者取膀胱截石位，固定于手术床上。（5）阴道准备：在注射hCG日，用无菌生理盐水冲洗外阴及阴道，注意避免用力过度可能诱发卵泡破裂；对于少数患者阴道清洁度差时，可先用消毒液擦洗外阴和阴道，再用生理盐水冲洗消毒液。2.手术操作（1）按阴道手术要求铺无菌巾单，再次用无菌生理盐水冲洗外阴及阴道，全过程遵守无菌操作原则。（2）B超探头准备，选择高频探头，通常用无毒乳胶套防护和隔离，穿刺前试验检查穿刺针、试管、吸引管接头整个卵泡液引流系统的负压和连接是否正常，负压设置是否恰当。设置超声仪屏幕的穿刺引导线。（3）将装有穿刺针套管的B超探头置入阴道，检查盆腔及双卵巢情况，观察卵巢位置及大小、卵泡数目及大小，区别卵泡与血管的回声，了解子宫内膜的情况，注意周围大血管的分布，观察双侧卵巢是否存在异常的排卵迹象，盆腔是否有异常的液性暗区。（4）将阴道探头稳定在穿刺侧卵巢最近的穹隆部位，尽量避开膀胱、肠管、子宫肌层、宫颈以及宫旁血管丛，卵泡尽量显示其最大平面，接触卵泡壁后进针快而准，穿刺针进入卵泡后，启动负压抽吸，针尖平面可以各角度旋转，以彻底吸尽每个卵泡，至目标卵泡完全塌陷。（5）位于同一穿刺引导线的卵泡可自浅而深一次进针完成，对于不同穿刺线上的卵泡，可退针至接近卵巢表面，调整穿刺方向再穿刺，尽量穿刺直径10mm以上的所有卵泡，穿刺针进出阴道壁时必须停止负压吸引，进针前与出针后以含低浓度肝素的PBS液冲洗穿刺针。（6）一侧卵巢穿刺结束后再穿刺另一侧。（7）取卵结束后，检查阴道穿刺点有否出血，可置无菌纱布填塞压迫止血，数小时后取出，术毕平卧休息30分钟，生命体征平稳或无特殊不适主诉方可离院。3.注意事项（1）手术中严格执行无菌操作，避免任何环节对卵母细胞的损害。（2）手术过程中要注意观察患者的一般情况，监测相关的生命体征及患者的意识状态。术中注意避免损伤周围血管和脏器，做好应急和抢救预案。（3）患者卵泡较少时，可应用培养液冲洗卵泡腔以提高获卵率［2~3］，注意每次卵泡冲洗液量不能超过卵泡腔的体积，以免卵泡胀破，卵细胞丢失。（4）取卵抽吸过程中注意获卵数与卵泡数是否一致，相差较大时要寻找原因（负压、漏液等）。（5）穿刺中如吸出异常液体，必要时送病理检查，更换或反复冲洗穿刺针及吸管。当取卵时发现卵巢子宫内膜异位囊肿，或输卵管积水，可以在取卵结束后进行。若术中误穿异位囊肿或积水，必须洗净穿刺针，或更换新的穿刺针，以免炎性液体对卵细胞的毒性作用，术后酌情使用抗生素。（6）如果取卵困难，必须经过子宫肌层时，尽量避免穿刺子宫内膜以免对胚胎移植造成不良影响；如果经过膀胱，嘱术后多排尿，注意出现血尿，有时血尿会在一周后脱痂时发生。（7）嘱患者术后禁止性生活。4.术后并发症（1）感染：包括生殖道感染、盆腔感染，严重者可发生盆腔脓肿。手术中应严格遵守无菌操作，注意阴道隐匿部位的清洗，穿刺操作不宜反复进针。（2）出血：操作过程中如不慎穿刺血管，可以出现盆腔、膀胱等部位出血，严重者可危及生命，必要时需要手术止血。应该熟悉盆腔解剖及超声图像特征，避免穿刺卵巢以外的组织，注意勿将盆腔血管横断面误认为卵泡。（3）损伤：穿刺卵巢以外的组织及器官引起损伤，如肠管、膀胱、子宫内膜、神经丛等。二、胚胎移植1.取卵周期胚胎移植
根据各实验室的胚胎体外培养系统决定胚胎移植时间，一般在取卵后48~72小时进行，胚胎卵裂期（第3天）阶段和囊胚阶段（第5天）是最常用的移植时段，也可在原核期或两细胞期进行移植，移植的胚胎数不超过2个，推荐单囊胚移植策略。目前大多数中心采用经［4］腹B超引导下胚胎移植。（1）术前准备
1）夫妇双方姓名核对和指纹识别，核对有效婚姻证件。签署移植胚胎的文件。向患者夫妇说明胚胎移植的过程，避免紧张情绪。
2）设备准备：经腹B超仪、ET管、无菌敷料等。
3）阴道准备：膀胱处于半充盈状态有利于超声观察子宫腔。患者取膀胱截石位，铺无菌孔巾，严格按照无菌原则操作，动作轻柔以避免刺激子宫，阴道窥器充分暴露宫颈，拭净阴道和宫颈分泌物，再以小棉签拭净宫颈管内的黏液分泌物。（2）手术操作
1）培养室将移植导管的内导管接到一个高质量1ml注射器上，给内导管装载好胚胎，提交给手术医师。
2）在实时B超监测下，手术者将移植外导管沿宫颈内口位置轻轻置入到宫颈内口水平，当外管置入困难时，可考虑使用金属内芯协助，必要时采用宫颈钳牵拉宫颈前唇或后唇。避免过度牵拉宫颈引起子宫的收缩，影响受孕率。
3）再次核对夫妇双方姓名后，将装载好胚胎的内芯导管通过外套管置入宫腔内，距宫底0.5~1.0cm推注射器注入胚胎，将胚胎示踪［5~6］的气泡注入宫腔中部或内膜评估良好的区域。适当停留后退出内外导管，注意固定注射器的活塞，以免吸回胚胎导致移植失败。
4）将内外导管送回培养室，显微镜下仔细观察是否有胚胎残留，如有胚胎残留，则再次移植。（3）注意事项
1）移植前，医生、护士和实验室工作人员必须严格核对患者身份和婚姻的有效性。
2）移植操作注意动作轻柔，避免损伤宫颈管及子宫内膜。
3）胚胎移植后患者可卧床休息数十分钟后离院，无确切的证据证明卧床可以提高胚胎的植入率，但应嘱咐患者避免重体力活动。2.冷冻复苏胚胎移植
冷冻胚胎移植与新鲜胚胎移植在手术操作上是相似的。（1）自然周期：
适用于既往月经周期规则者，于月经第10~12天B超监测卵泡的生长及子宫内膜的同步增长情况，当主导卵泡直径＞18mm时，可注射hCG5000~10 000IU，以此为血LH峰出现时间，定义为0天，并开始进行黄体支持。卵裂期第3天胚胎，则解冻胚胎，第4~5天进行胚胎移植。（2）激素替代周期：
采用雌激素递增方案和恒定剂量方案，两种方案在妊娠率方面没有差别。均须行B超监测子宫内膜情况。
1）递增方案：
从月经来潮第3天起口服戊酸雌二醇3~6mg/d。在用药过程中行B超监测，当子宫内膜达到8mm或以上时加用孕激素进行内膜转化，每天肌注40~60mg，或阴道应用栓剂黄体酮阴道缓释凝胶，每天1支，或地屈孕酮20~40mg/d。于黄体支持的第4~5天行胚胎移植，黄体支持方法详见第七章。
2）恒定剂量方案：
从月经来潮第3天起每天口服戊酸雌二醇4~8mg，于周期的第12天起开始B超监测，当子宫内膜达到8mm或以上时加用黄体支持，处理同上。（3）诱发排卵周期：
可以选用来曲唑联合Gn促排卵，期间监测卵泡，当主导卵泡直径达18~20mm，内膜＞8mm时，肌注hCG5000~10 000IU，定义为0天，在第4~5天进行冷冻第3天胚胎复苏后移植。（张波 刘嘉茵）参考文献
1.Nakagawa K，Nishi Y，Kaneyama M，et al.The Effect of a Newly Designed Needle on the Pain and Bleeding of Patients During Oocyte Retrieval of a Single Follicle.J Reprod Infertil，2015，16（4）：207-211.
2.Levy G，Hill MJ，Ramirez CI，et al.The use of follicle flushing during oocyte retrieval in assisted reproductive technologies：a systematic review and meta-analysis.Hum Reprod，2012，27（8）：2373-2379.
3.Hill MJ，Levens ED.Is there a benefit in follicular flushing in assisted reproductive technology？ Curr Opin Obstet Gynecol，2010，22（3）：208-212.
4.Revelli A，Rovei V，Dalmasso P，et al.A large prospective randomized trial comparing trans-abdominal ultrasoundguided embryo transfer（UGET）with anembryo transfer technique based on previous uterine length measurement（ULMb-ET）.Ultrasound Obstet Gynecol，2016，48（3）：289-295.
5.Edris FE.Is uterine depth measurement by trans-vaginal ultrasound alone as accurate as measurement carried out by transabdominal ultrasound-guided trial transfer？ Saudi Med J，2014，35（10）：1231-1236.
6.Patounakis G，Ozcan MC，Chason RJ，et al.Impact of a prior cesarean delivery on embryo transfer：a prospective study.Fertil Steril，2016，106（2）：311-316.第五章 体外受精胚胎移植培养一、胚胎实验室工作原则
为避免或减轻体外操作对配子和胚胎生长发育的影响，建议所有的操作均应在室温25℃左右、湿度40%~60%、具有去除空气中颗粒物及挥发性有机物（volatile organic compounds，VOC）的实验室中，并在37℃百级洁净区域内进行。
接触配子或胚胎的耗材、器皿均为无毒性材质，无菌一次性使用。
各种配子和胚胎操作液、培养液均应提早配制并放培养箱内平衡过夜备用。
使用的培养皿、试管等应该在放入或转移配子胚胎前标注患者姓名和日期，操作时牢记双人核对且做好记录。二、具体实施步骤（一）捡卵
由于卵细胞阶段是对环境非常敏感的一个阶段，因此捡卵是一个要求非常高的步骤，我们不但需要熟练快速地进行操作，而且需要特别的关注温度和pH的变化。
1.取卵之前需要详细的核对患者的个人信息，最关键的信息包括夫妻双方姓名和病历号。
2.尽量缩短卵细胞在体外及培养箱外的时间。
3.各种配套仪器必须充分考虑卵细胞的正常生理条件，卵细胞始终保持在37℃的条件下。卵泡冲洗液、卵泡收集试管、捡卵使用的大皿等耗材需要提前预热。
4.穿刺出来的卵泡液在配置有恒温热板的体视显微镜下对卵细胞进行辨别挑选卵细胞，正常使用8~60×的放大倍数，尽量缩短卵细胞在显微镜光源下的暴露时间。
5.捡卵时间、获得卵细胞数目以及操作者和核对者信息需要及时记录。（二）精液处理
1.男性配偶在取卵日前2~7天手淫排精一次。取卵日手淫取精，精液收集在无菌的取精杯中，取精杯标记夫妻姓名和编号。尽快将取精杯送至精液处理室，建议在1小时内室温下对精液进行处理。
2.精液常规分析参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版。
3.精液处理方法主要有密度梯度离心法、上游法等，其目的是去除精浆及细胞杂质，优选前向运动精子并使精子获能。密度梯度离心法去除杂质较干净，回收率高，上游法回收率略低。不建议对精液标本离心后上游，建议直接上游。
4.术前多次精液常规检查正常，取卵日精液常规异常的患者，可以建议患者重新取精再决定是否改行ICSI（有部分患者取卵日过度紧张未排出全量精液或是禁欲时间过长导致精液常规异常，重新取精有可能获得理想的精液）。
5.对逆行射精、冷冻精液、睾丸和附睾取精等特殊来源及液化不良的精液处理方法参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版。（三）授精方式1.IVF授精（1）注射hCG后38~40小时，即取卵后2~4小时进行IVF授精，授精时双人核对患者信息。（2）注意调整精子浓度，每枚卵细胞平均加入5000~10 000条精子。过高的精子浓度被认为会增加多精受精率，同时会增加代谢物的浓度，不利于胚胎的发育。（3）授精方式主要分为短时授精和隔夜授精。短时授精的精卵共孵育时间为1~6小时，隔夜授精为16~18小时。2.ICSI授精（1）ICSI是有创性授精方式，应该严格掌握ICSI适应证。（2）ICSI之前需要去除颗粒细胞，在此过程中，减少透明质酸酶的消化时间及吹吸次数，避免使用过小口径的巴斯特管挤压卵细胞，减少机械刺激对卵的应激。（3）PVP常用于减慢精子的游动速度，从而有利于精子的制动，但应尽量避免PVP注入卵母细胞质内。（4）Half ICSI（部分卵细胞ICSI）用于可疑受精障碍的患者，避免IVF授精可能造成的完全受精失败。（5）ICSI的关键是精子制动和卵细胞破膜，若制动和破膜过程不充分将影响受精率。（四）胚胎培养及评价
1.为了利于胚胎的发育，我们应该尽可能地避免胚胎培养环境的波动。在日常的培养和操作过程中，需要足够重视培养液pH、温度及渗透压的稳定。为了更加有利于胚胎的发育，可以采用不同的培养方法或培养系统。（1）挑选适合胚胎发育的培养液，如：序贯培养液或单步式培养液。（2）培养箱的型号及数量需要与实验室的工作量相配套。（3）培养液覆盖油可以减少培养液温度、pH以及渗透压的变化。（4）为了更好地追踪培养的发育动态，建议单胚单滴培养。（5）放置胚胎的培养液放入培养箱内培养的时间建议不超过72小时，过长的培养时间会导致培养液中氨、有害代谢产物等物质的聚集。建议低氧培养。
2.胚胎的评价主要是为了更加准确地判断胚胎的发育潜能，其主［1］要的评价依据是胚胎的自身发育规律及模式。（1）胚胎评价应该在高倍（至少200×，最好是400×）倒置显微镜下进行，显微镜应该具有Hoffman或者等效的光学效果功能。（2）卵裂期胚胎的主要评价指标包括卵裂球数、卵裂球大小均一性、细胞碎片的比例、胞质颗粒度、空泡情况以及细胞核状态（如：［2~3］是否多核）。［4］（3）卵裂期各个观察时间点的共识（表1）表1 建议卵裂期各观察时间点（4）卵裂期胚胎对应时间的胚胎发育速度是相对更加重要的指标。（5）Time-lapse本身并不会提高胚胎的发育质量，但可以部分地［5］帮助我们发现胚胎发育过程中的异常现象。（五）囊胚培养及评价［6］
1.囊胚在一定程度上更能代表胚胎的发育潜能，但囊胚培养的前提是需要具备稳定良好的培养条件。（1）囊胚培养尽量在低氧环境中进行。（2）通常在第3天将胚胎转移至囊胚培养液中进行培养。（3）常规体外受精过程会出现部分的0PN、1PN胚胎，通过囊胚培养可以增加这部分胚胎的利用率。
2.囊胚的评价内容包括囊胚的扩张程度、内细胞团（ICM）以及滋养层细胞（TE）的形态。（1）目前常用的是1999年Gardner和Schoolcraft提出的人类囊胚［7~8］分级系统。先使用1~6的连续数字将囊胚按照扩张程度和孵化状态进行区分。进入扩张期后的囊胚再对其内细胞团和滋养层细胞进行质量分级（A、B、C三级）。（2）囊胚扩张程度处于4期及以上状态时，更加适合进行冷冻，过早冷冻的囊胚会部分影响其复苏效果。（3）滋养层细胞评级高的囊胚更容易着床。（4）没有任何内细胞团的囊胚不建议进行移植和冷冻。（康跃凡 陈子江）参考文献
1.Cutting R，Morroll D，Roberts SA，et al.Elective single embryo transfer：guidelines for practice British Fertility Society and Association of Clinical Embryologists.Hum Fertil，2008，11：131-146.
2.Holte J，Berglund L，Milton K，et al.Construction of an evidence-based integrated morphology cleavageembryo score for implantation potential of embryos scored andtransferred on day 2 after oocyte retrieval.Hum Reprod，2007，22：548-557.
3.Hardarson T，Caisander G，Sjögren A，et al.A morphological and chromosomal study of blastocysts developing from morphologically suboptimal human pre-embryos compared with controlblastocysts.Hum Reprod，2003，18（2）：399-407.
4.Guerif F，Le Gouge A，Giraudeau B，et al.Limited value of morphological assessment at days 1 and 2to predict blastocyst development potential：a prospective studybased on 4042 embryos.Hum Reprod，2007，22：1973-1981.
5.Gardner DK，Schoolcraft WB.Culture and transfer of human blastocysts.Curr Opin ObstetGynecol，1999，11：307-311.
6.Gardner DK，Balaban B.Choosing between day 3 and day 5 embryotransfers.Clin Obstet Gyn，2006，49：85-92.
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