作者：吴艳玲,丛黎明
出版社：人民卫生出版社
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手足口病新进展试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
手足口病新进展/吴艳玲，丛黎明主编.—北京:人民卫生出版社，2014
ISBN 978-7-117-19956-8
Ⅰ.①手… Ⅱ.①吴…②丛… Ⅲ.①手足口病-诊疗 Ⅳ.①R512.5
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版权所有,侵权必究!手足口病新进展
主 编：吴艳玲 丛黎明
出版发行：人民卫生出版社有限公司
人民卫生电子音像出版社有限公司
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制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司
排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司
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格 式：mobi
标准书号：ISBN 978-7-117-19956-8/R•19957
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手足口病是一种全球性传染病，由肠道病毒引起，多发生于5岁以下儿童，表现为口痛，厌食，低热，手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿自愈，少数患儿可引起并发症甚至死亡。全球很多国家和地区曾发生手足口病暴发，我国自1980年发现手足口病以来，每年都有人患病。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），其中以柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型最为常见。目前尚缺乏安全有效的疫苗与抗病毒治疗药物，给本病的预防控制及重症患儿的救治带来严峻的挑战。
该书系统讲述了手足口病的相关知识，包括手足口病的病原学、临床表现、流行病学、发病机制、传播途径、实验室检测、治疗、预防、消毒隔离措施、新型疫苗研发等。全书内容丰富翔实，图文并茂，文字流畅，新颖实用，深入浅出。同时，书中列举了一些案例，具有较强的实用价值。
参加该书编写的作者多是从事手足口病基础研究、实验室检测以及传染病预防控制的一线专家，具有深厚的理论基础和丰富的实践经验。他们查阅了国内外大量有关手足口病的最新文献，并结合自己多年来积累的实践经验，经过去粗取精、由表及里的归纳分析写成此书。因此，对从事疾病预防控制的专业人员、临床医生、科研人员有较高的参考价值，也可供家长、托幼机构和学校老师参考使用。
我衷心祝贺该书的及时面世。相信本书的出版必将为我国手足口病防治工作者和有志于手足口病研究事业的学者和学生提供有关手足口病的系统知识和国内外研究的最新动态，这将对我国手足口病基础研究及防治队伍业务素质的提高起到良好的推动作用。2014年10月前 言
手足口病是由多种肠道病毒引起的一种急性传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病。主要发生于5岁以下婴幼儿，严重时可引发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性瘫痪等并发症甚至死亡。近年来手足口病疫情不断发生，其较高的病死率和致残率，严重危害儿童身体健康和生命安全，被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。
自1969年首次从美国加利福尼亚一名患有中枢神经系统疾病的手足口病婴儿粪便标本中分离出EV71型病毒以来，手足口病在世界各地出现多次大流行。中国内地自1980年在广州出现此病后，多个省市均发生过手足口病的流行。特别值得注意的是，近年来本病流行有蔓延增长趋势。本书作者比较系统全面地阐述了该病在发病和防治方面的理论知识和实践经验；同时通过阅读大量国内外有关文献资料，融入了该疾病研究领域的最新研究成果。全书共分为8章，详细阐述了手足口病的肠道病毒病原学、致病机制、流行病学、实验室检测、治疗、预防与控制、手足口病疫苗等内容，同时也涉及手足口病的一些新观点、新方法和新技术，内容简洁、实用性强，可供广大同行参考。
近几年国内部分地区发生多起手足口病暴发流行。然而由于许多卫生医疗单位，尤其是基层卫生机构对该病的认识不足，难以有效应对肠道病毒感染的及时诊断治疗。为此我们组织从事手足口病临床、疾控、科研一线防治工作的专家、教授编写了本书，以便为广大读者提供一本较全面、实用的参考工具书，旨在为读者提供详尽的手足口病相关知识，帮助解决手足口病感染防治和研究中的实际问题，同时帮助读者了解手足口病的最新研究进展。
由于手足口病是由20多种肠道病毒引起的，传染性强，传播途径复杂，传播速度快，病毒存在变异现象。另外，关于手足口病的发病机制、治疗预防措施和疫苗的研究工作还在不断探索更新中，加上作者的学术水平和编写能力有限，工作经验不足，难免出现文字和内容上的错误，恳请广大同仁和读者批评指正，以便我们在今后的修订中予以完善。
本书的编写得到了浙江省科技厅“公共卫生监测与突发事件处置关键技术研究科技创新团队”的资助，在此表示衷心的感谢！此外，本书的编写得到了李兰娟院士的热情帮助与支持，她对本书的编写提出了很多宝贵的意见，谨在此表示衷心的感谢！吴艳玲2014年10月第一章 肠道病毒病原学第一节 肠道病毒概述
人类肠道病毒（human enterovrius，HEV）属于小RNA病毒科（picornaviridae），肠道病毒属。根据基因组组织结构、序列相似性和生物学属性，可将人肠道病毒划分为脊髓灰质炎病毒（poliovirus）、柯萨奇病毒（coxackieviruses）、致肠细胞病变人孤儿病毒（entero cytopathic human orphanvirus，ECHO，简称埃可病毒）及新型肠道病毒（enteroviruses）4类。
研究者最初根据病毒对人类、实验动物的致病性和培养组织的细胞影响，将肠道病毒分为4类：脊髓灰质炎病毒（3种血清型），柯萨奇病毒A组23种（1～22，24型），柯萨奇病毒B 组6种（1～6型），埃可病毒30种（1～7型，9型，11～27型，29～33型），19世纪70年代人类肠道病毒逐渐以分子序列命名，最早应用这种方法命名的是人［1］肠道病毒68型，分子型分类逐渐取代以前的分类方法，现在人类肠道病毒分为A、B、C、D四种类型，由100多种亚型构成，其中肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A组16型（coxackievirus A16，CoxA16）属于肠道病毒A型（见表1-1）。
肠道病毒颗粒小，呈20面体，直径24～30nm，不含类脂体，核心有单链核糖核酸。由于肠道病毒在病毒学上的分类是属于无外套膜（non-envelop）的病毒，因此它对于周围环境的抵抗力很强，可以耐酸达pH 2，故不会被胃酸破坏，可以通过胃酸到达肠道繁殖，这也是它被命名为肠道病毒的原因之一；肠道病毒对乙醇也具有耐受性，酒精对肠道病毒并无抑制作用；肠道病毒甚至可以对抗一般的清洁剂，故一般家庭用的洗手乳及肥皂对肠道病毒无杀菌效果；因肠道病毒可在下水道污水中存活3～5天之久，在肠道病毒大流行期间甚至可由下水道污水中分离出肠道病毒。目前已知需浓度1%～3%的漂白水才能有效地消灭肠道病毒，因此在大流行期常用此浓度的漂白水对病患所接触过的物品及环境进行喷洒消毒。表1-1 肠道病毒分型
肠道病毒通常寄生于肠道，仅在少数情况下，进入血流或神经组织。正常的病毒携带者不多见，隐性感染甚为普遍，人感染后出现临床症状的也是少数。肠道病毒的流行与季节转换、环境变异有着极大的关联性，肠道病毒只在夏季及初秋流行，每年6～9月为高峰期，气温过低的地区并不利于肠道病毒生存。根据流行病学调查，肠道病毒的传播途径主要为粪-口传播（stool-oral），感染肠道病毒的患者经由粪便排出病毒，这些含有高浓度肠道病毒的粪便会污染环境甚至地下水源，在公共卫生条件不佳的地区，极易经由污染的水源而散播该病毒。由于肠道病毒除了在肠道外亦可在扁桃腺增殖，病患的唾液或口鼻分泌物也会带有高浓度的病毒，所以不排除经由空气或接触等传染途径。因此防治肠道病毒流行除了重视个人卫生外，公共卫生及环境卫生也不容忽视。
肠道病毒属病毒引起的传染病，临床表现轻者为倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。第二节 手足口病病原构成
手足口病可由多种肠道病毒血清型引起，但最主要的病原体为EV71和CoxA16，均归为人肠道病毒A型，基因组为单股正链RNA，长约7405 bp，仅有1个开放阅读框，编码4个结构蛋白（VP1、［2］VP2、VP3和VP4）和7个非结构蛋白。EV71引起的症状较重，而CoxA16引起的手足口病症状相对于EV71要轻，重症和死亡患者较少。另一部分如埃可病毒则归为人肠道病毒B型，还未发现肠道病毒D型与手足口病相关的报道。
偶尔也有CoxA6或CoxA10引起的手足口病暴发报道。例如，2008年新加坡的手足口病暴发中，CoxA6和CoxA10的检出率为35. ［3］3%。2008年芬兰，CoxA6和CoxA10的检出率分别高达71%和［4，5］28%，2010年法国，检出率分别高达28%和39. 9%。2010年［6］中国台湾也有CoxA6引起的手足口病暴发。然而，系统进化树很少分析这两种病毒。CoxA6和CoxA10的高检出率，暗示了这两种病原在手足口病中的重要性。此外，2008年甘肃的手足口病流行中，［7］除了EV71和CoxA16病毒，还分离到CoxA4病毒。
Xu等通过对2010年5月至2011年4月间上海复旦大学附属医院的手足口病住院病人中收集的粪便样本进行检测，发现由EV71、CoxA10、CoxA6、CoxA16、CoxA12、CoxA4、Cox-A14、ECHO6和［8］HEV-C等多种病原体组成，与中国其他地区、韩国和新加坡报道［9，10］类似。同时，通过基因库中的序列比对分析，发现上海的CoxA6株与日本、中国台湾和其他地区的分离株紧密相关。上海的CoxA6株属于两个进化簇，伴有高的核酸同源性，然而所有的CoxA10株与中国山东省和云南省的分离株紧密相关。
CoxA4和CoxA12在引起手足口病发病中虽然不占主要地位，但也是引起手足口病的病原。2006—2008年间，CoxA4引起中国台湾的学前教育孩子高的感染率，然而只有1例Cox-A4感染在2009年的韩［11］国报道。2008—2009年，中国其他地区也有零星的关于［9，12］CoxA12引起的手足口病病例发生。值得一提的是，感染CoxA12的病人的发病年龄往往是最小的，比其他非EV71感染更有可能引起并发症的发生。
此外，也有关于埃可病毒、新型肠道病毒和部分柯萨奇病毒的不同型别的报道。1997年马来西亚手足口病暴发中同时检出了ECHO1［13］病毒和CoxA9病毒。2000年，马来西亚大学医学中心在马来西［14］亚半岛的手足口病暴发中分离到ECHO7。2002年日本首次在山［15］形县分离到ECHO13。ECHO19引起2003年山东省泰安市发生肠道病毒感染暴发，表现为手足口病症状，同时还分离到ECHO29、［16］［17］ECHO9等多种型别。2008年，施海晶等发现重症病例也可由阜阳CoxB3变异株引起。2009年，中国山东省临沂市手足口病流行期间，对患者进行肠道病毒筛查中，发现近20%的患者咽拭子为CoxB5阳性，检出率超过了Cox-A16，仅次于EV71，这说明CoxB5可［18］能会成为手足口病的另一主要病原。这些病毒相对于肠道病毒CoxA16和EV71引起的手足口病数量要少，还不是主要病原，但也应引起重视，很多重症病例也可以从这些病原进行解释。第三节 肠道病毒71型一、EV71病毒学分类
肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）归属于小RNA病毒科（picornaviridas），肠道病毒属（enterovirus），人类肠道病毒A型。目前，能够引起手足口病的以CoxA16与EV71最为常见。但EV71是目前肠道病毒群中最晚被发现的病毒，具有感染性强且致死率高的特点，尤其是可以引发一系列神经系统方面的并发症，而备受人们关注［19，20］，目前已被公认为是继脊髓灰质炎病毒被消灭以后最重要的嗜神经性肠道病毒。
EV71于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞（rhesus monkey kidney cell，RhMK）及人胚二倍体细胞（human fetal diploid cell）中。若样本取自病人粪便及组织即以人胚肾二倍体细胞（diploid strain of human fetal kidney cell，HFDK）培养；若为咽喉拭样本则选用人胚肺二倍体细胞（diploid strain of human fetal lung cell）培养。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠道病毒所致的细胞病变（cytopathetic effect，CPE）现象，电子显微镜下观察其形态及物理化学特性都与当时已知的其他肠道病毒类似，但进行中和抗体试验（neutralization test）或免疫扩散试验（immunodiffusion test）后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象。1970年，国际病毒命名委员会将这种病毒定为一种新型肠道病毒。二、EV71病毒颗粒的形态结构
EV71病毒颗粒为直径约24～30nm的二十面体立体对称的球形结［21］构，由含有大约7411个核苷酸的单股正链RNA和病毒衣壳组成，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富（A + U =52. 8）。外周无包膜和突起，晶格状排列。和大部分小RNA病毒一样，EV71病毒颗粒衣壳蛋白组成复杂，首先由病毒基因组中的开放阅读框（open reading frame，ORF）直接翻译出一个由2194个氨基酸组成的多聚蛋白，多聚蛋白在合成的同时，不断被其本身水解产生的蛋白酶所切割，产生P1、P2和P3三个前体蛋白。P1前体蛋白经过一系列的加工，最终形成VP1（293个氨基酸），VP2（254个氨基酸），VP3（245个氨基酸）和VP4（69个氨基酸）四个病毒外壳蛋白。P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白，P2前体蛋白的切割产物包括2A（特异性蛋白水解酶，150个氨基酸），2B（99个氨基酸）和2C（329个氨基酸）；P3前体蛋白利用非浓度依赖性的自身切割等机制产生3A（86个氨基酸），VPg（5＇-末端结合蛋白，22个氨基酸），3C（特异性蛋白水解酶，184个氨基酸）和3D（RNA聚合酶，462个氨基酸）。4个外壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4通过拼装成原聚体，再由5个原聚体再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，最后由12个五聚体通过各自的结构域相互连接组成具有20个三角形和12个顶点的二十面体（见图1-1和图1-2）。图1-1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构（图片来源：http：/ /image. baidu. com）图1-2 EV71病毒整体结构注：a）成熟的EV71病毒粒子图，二十面体2倍轴俯视图。b）EV71的成熟粒子和空粒子，表面根据与颗粒中心的距离着色。c）EV71衣壳蛋白结构。（图片来源：Wang et al. Nat Struct Mol Biol. 2012；19（4）：424-429.）
最近研究人员利用X射线衍射分析技术确定了EV71病毒的精确结构。发现EV71除与其他相关肠道病毒如脊髓灰质炎病毒具有相似特征外，还具有其独特的结构特征：一种叫做“口袋因子”的分子，通常定位在病毒保护壳口袋内，在EV71病毒中部分暴露出来。当病毒与人类细胞结合时，这一口袋因子会被挤出口袋，导致病毒颗粒稳定性消失，随后衣壳分解并将其遗传物质释放到感染细胞内进行复制［22］。
EV71病毒基因组结构和编码区排列顺序为：从基因组的5＇-末端至3＇-末端依次排列着含有746个核苷酸的5＇-末端非编码区（5＇-untranslation region，5＇-UTR），编码区VP4，VP2，VP3，VP1，2A，2B，2C，3A，VPg，3C，3D，3＇-末端非编码区（83个核苷酸）以及多聚腺苷酸尾（见图1-3）。病毒RNA正链和负链的5＇-末端和3＇-末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号，VPg蛋白通过其酪氨酸残基的羟基基团与RNA 5＇-末端的pUpU形成的磷酸二酯键与基因组RNA结合。图1-3 EV71基因组结构及其表达产物形成示意图
EV71病毒基因组5＇-UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译过程中发挥重要作用，此外5＇-UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。3＇-UTR区可能与病毒的感染性有关，如果去除3＇-末端的多聚腺苷酸尾或基因组出现断裂，感染性便消失。
在4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子衣壳内与病毒核心RNA紧密连接以外，其他3种结构蛋白VP1、VP2和VP3形成一个独立的区域，并裸露于病毒颗粒的表面，因而，病毒的抗原决定簇主要位于VP1～VP3上，其中VP1直接决定病毒的抗原性，主要的血清特异［23，24］性中和位点也存在于VP1上。［25，26］
VP1基因是EV71分子流行病学主要的研究内容，这是因为：①VP1蛋白包含了许多重要的中和抗原；②VP1基因具有与病［27，28］毒血清型完全对应的遗传多样性；变异快速（其年进化率-2［29，30］为1. 35×10/核苷酸）；③VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，也可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。除VP1基因外，VP4也已用于EV71分子分型和流行病学监测。三、EV71分子流行病学
虽然EV71病毒在1969年首次获得分离，但回顾性分析显示，此病毒在1963年已在荷兰传播。最近的分子进化研究显示EV71在人群［31］中出现大约为1941年（见图1-4）。图1-4 人类EV71病毒起源（A）EV71基因型和柯萨奇病毒A组16型间的系统发育关系。（B）利用放松分子钟模型和人口指数增长模型估计EV71最近的共同祖先（MRCA）出现年份大约为1941. 0（95%CR，1928. 8-1952. 2）。注：MRCA，most recent common ancestor（图片来源：Tee et al. Journal of Virology. 2010；84（7）：3339-3350.）
EV71分子流行病学的研究始于1984年，主要基于对病毒衣壳多肽（capsid polypeptide）的序列分析。系统进化树分析表明EV71约［32］在1940年起源于柯萨奇病毒A组16型。目前EV71分子流行病学主要研究的内容是VP1基因、VP4基因和5＇非编码区（5＇-UTR）的［33］变异，其中VP1基因最具研究价值（见表1-2）。Brown等首次对EV71分子流行病学进行研究，系统分析了113株世界各地的EV71分离株的VP1基因的核苷酸序列的同源性，根据结构蛋白VP1核苷酸序列的系统进化树分析，将EV71分为A、B、C三种基因型，不同基因型之间核苷酸的差异为16. 5%～19. 7%，相同基因型之间核苷酸的差异≤12%，三型之间氨基酸同源性至少可以达到94%。EV71的平均-3［34］［35］进化率为4. 6×10替换/（位点•年），和流感病毒相当，-2［36］但比脊髓灰质炎病毒要低（1. 03×10）。另据文献报道，曾分［37，38］离到印度分离株R13223-IND-01，该病毒株属于D基因型。表1-2 EV71病毒株系统进化分析续表续表（数据来源：Yip et al. Emerg Health Threats J. 2013；6：19780.）
A基因型只有一个成员BrCr，为EV71的原型毒株，该株流行于［39］1969年的美国加利福尼亚州，1970年在美国被首次定义，直到［40］2008年再次被检测到。在2008年一项对中国中部暴发的手足口病调查研究中，Yu等定义了5种EV71分离株，根据VP1基因序列分析，［41］发现它们与A基因型紧密相关。A基因型在中国中部再次出现的原因不明，需要对分离株进行全基因组序列分析。
B基因型可分为B1-B5亚型。B基因型主要在马来西亚和新加坡流行。20世纪70年代，美国和欧洲的手足口病流行主要为B1和B2亚型；20世纪80年代，B2亚型成为主要流行的基因型，并在日本、中国台［42］湾、美国、荷兰和澳大利亚等地传播。过去的十几年中，其他亚型陆续在亚太地区被发现。1997—2001年期间在马来西亚、新加坡、中国台湾和澳大利亚西部等地区分离到B3、B4 2个新亚型，其中B3亚型在1997—1999年间为东南亚地区的流行株，但1999年之后再也没有分离到该亚型；B4亚型曾在新加坡（1997年）、马来西亚（1997—1998年）和中国台湾（1998年）小规模流行，而2000年在［43］马来西亚和新加坡大规模流行，成为流行株。1999年澳大利亚西部的EV71流行株来源于亚洲，因为VP1核苷酸序列测定表明，其B3亚型与1997年马来西亚流行的B3亚型的同源性高于99%。B5亚型是2003年首次在日本和沙捞越被分离出来，是2006年文莱、沙捞越［44，45］和中国台湾的流行株，该亚型在2008—2009年显著增加，近几年在马来西亚、新加坡、中国台湾和泰国暴发流行。
C基因型目前也分为5个亚型C1～C5。C基因型多出现在东亚，特别是中国大陆和越南。最早的C1亚型毒株1986年发现于澳大利亚，此后取代B1和B2亚基因型成为美国和澳大利亚的主要流行形式；C2亚型直到1995年后才见报道，主要在1996—2006年流行；C3亚型主［46，47］要在1994年的日本和2000年的韩国流行。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的［48，49］分布和传播，日本、越南和中国台湾也有报道。2005年越［50］南报道分离到新的亚型，即C5亚型。1997—2005年，亚太地区发生了较为频繁的EV71流行，通过对当地流行株VP1和/或VP4核苷［51，52］酸序列分析发现C基因型有逐渐取代B基因型的趋势，这可能是流行后人群免疫屏障压力下病毒变异引起的。从中国大陆现有的数据资料分析，1998—2004年间流行的EV71型均为C4亚型，未引起［53］大规模的流行，即使在与我国台湾、马来西亚、新加坡等流行地区邻近的东南沿海地区，也未受周边不同型别流行的影响，这是否与中国大陆地区特殊的地理位置、环境气候及生活习惯等因素有关，［51，54］还需要进行深入研究。2004—2005年C4亚型再次流行，［55］2006—2007年流行B5、C5亚型。2007—2008年中国山东、香港、北京、湖北、安徽、广东、浙江、河北、湖南等地均发生流行［56，48，57］［58］，从山东分离的EV71为C4亚型。目前全世界范围［2］内正在流行的主要为B3-B5、C4和C5亚型，而中国从1998年至今，暴发的手足口病中EV71的基因型主要是C4。通过进化树分析，［58］EV71的C4亚型又可被分为两个进化枝C4a和C4b。C4b链只在2004年前被检测到，C4a主要从2005年开始被分离到，也有一些在2002—2004年间被分离到。C4亚型在中国显示出3个主要的进化期：第一期，1998—2001年，所有分离株均属于C4b进化株；第二期，2002—2004年，C4b和C4a进化株共同存在；第三期，2005年以后，只有C4a被检测到。遗传进化显示，与中国第一个C4分离株SHZH98（AF302996）相比，遗传距离随着时间推移不断增大，表明［34］了C4亚型在中国不断进行进化。研究显示，近几年在中国暴发的手足口病都是通过本地病毒传播，而非新基因型的引入。与其他国家和地区相比，中国的EV71基因型变化小，有利于疾病的预防和控制（EV71基因型和亚基因型的地理分布见图1-5）。图1-5 1960—2011年EV71基因型和亚基因型的地理分布注：三角形代表单一病毒株的分离（图片来源：McMinn et al. Curr Opin Virol. 2012；2（2）：199-205.）
日本1973年和1978年分离的EV71毒株具有强噬皮肤性和噬神经性，但经中和实验检测，与原型株EV71BrCr并无不同。中国武汉1995年从成人手足口病人分离出1株EV71H，血清分型类似于EV71BrCr，肠道病毒通用引物Ⅱ可扩增出一段154bp的5＇非编码区片断，EV71H与EV71BrCr在此有12个碱基的差别，分别位于第43-61和第120-131位点处。
一项对日本健康小孩的血清学调查研究显示，A基因型和B5基因［59］型病毒间存在部分抗原差异，对初期感染B5亚型的小孩进行检测，发现基因型B型和C型之间存在部分抗原差异，相同基因型间无［60，61］差异（B4与B5亚型间）。Huang等在基因型B型与C型间和［55］B4 与B5亚型间均检测到病毒差异。由于不同研究所采用的人类血浆和实验室程序的不同，尤其是中和分析实验中细胞系的使用，使得结果很难进行比较，因此需要标准的实验程序包括标准血浆和病毒进行实验。有关抗原变异的临床和流行病学显著性差异分析需要进行纵向血清学研究与分类。
肠道病毒经常发生重组事件，重组主要发生在EV71病毒中，偶［62，55］尔也发生EV71与其他肠道病毒重组，如CoxA16和CoxA8。基因组内和组间的重排和阳性选择导致了遗传和抗原的多样性［63］。因为重组最常发生在非结构蛋白基因或非编码区，应用聚合酶链式反应方法（polymerase chain reaction，PCR）扩增VP1区基因，被认为是确定EV71的最好方法。四、EV71理化特性
EV71病毒由于没有类脂膜，所以在宿主环境内较稳定，在胃肠道能耐受胃酸、蛋白酶和胆汁作用。室温下也可以存活数日，在污水或含有机物的水中可长期存活。EV71可以在地表水、地下水和温泉［64］中检测到。EV71对有机溶剂（如乙醚、甲烷）、脱氧胆酸盐、弱酸以及冷冻有抵抗性。病毒的耐酸性决定了其可通过粪-口传播，耐热性决定了其在较高温度下仍可自我复制。手足口病病毒在外环境中可长期存活，4℃可存活1年，在-20℃可长期保存。
此外，该病毒还能抵抗乙醚、75%乙醇和5%甲酚皂溶液（来苏尔）等常见的消毒剂，但是对氯、甲醛、高锰酸钾等氧化剂比较敏感，［65］高温超过56℃30分钟，紫外照射可以很快将病毒灭活。1mol/L浓度二价阳离子环境可提高其对热灭活的抵抗力。五、EV71病毒感染过程
人类是肠道病毒已知的唯一宿主，像大多数肠道病毒一样，［66］EV71的复制周期与脊髓灰质炎病毒类似。病毒进入易感宿主细胞依赖于特定受体，人类不同肠道病毒的7种特异性受体已被确定，特异性受体包括脊髓灰质炎病毒受体（CD155），三个整合蛋白（α2β3，αvβ3和αvβ6），衰减加速因子（CD55），柯萨奇-腺病毒受体和细胞内黏附分子1。唾液酸连接糖苷大量表达在呼吸道和消化道，树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-攫取非整合素（CD209）特异［67-69］表达在淋巴组织的树突状细胞，这些受体也已被鉴定。某些肠道病毒感染宿主细胞时，不止作用于一个受体。EV71的一些特异性受体已被鉴定，在白细胞表面一个多处表达的受体，人类P选择素［70］糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）和人清道夫B类受体2型（scavenger receptor class B typeⅡ，SCARB2）［71］是EV71的特异性受体。
PSGL-1是一种唾液黏蛋白膜蛋白，广泛表达于白细胞中，在早期炎症反应过程中起重要作用。根据结合PSGL-1的能力不同，EV71分离株可分为PSGL-1依赖型和PSGL-1非依赖型。SK-EV006（B3），C7/Osaka（B4），KED005（C1），1095（C2）和75-Yamagata（C4）属于PSGL-1依赖型病毒株。BrCr（A），Nagoya（B1）和02363（C1）［70，71］属于PSGL-1非依赖型病毒株。PSGL-1参与EV71感染淋巴细胞过程。
SCARB2，也称溶酶体膜蛋白2，具有2个跨膜区域，N端和C端分别位于细胞质中。它在许多组织中表达，参与跨膜运输、溶酶体重［72］组和高密度脂蛋白的内吞作用。一些病毒株，如BrCr（A），Nagoya（B1）和Isehara（C），已被证实利用SCARB2作为受体。人类SCARB2受体在非敏感细胞系中的表达有利于EV71和CoxA16病毒［73］株的感染，从而引起细胞病变。同时SCARB2特异性抗体无法抑制EV71感染细胞，EV71受体抑制剂也不能引起病毒不稳定和脱衣壳，是否存在其他未知的可能参与EV71感染过程的细胞受体还需进一步研究。
EV71进入细胞涉及病毒黏附、受体结合、内吞吸入、基因组释放到衣壳外、基因组通过膜包涵体运输到细胞质等一系列过程。有观点认为，细胞表面的唾液酸在早期细胞表面的黏附中起着重要的作用。病毒表面的VP1蛋白上形成的峡谷（canyon）样结构是与细胞受体结合的位点。病毒感染时，首先与细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，然后导致病毒空间构型改变，丢失VP4，最终脱去衣壳，［74］基因组RNA进入胞浆。病毒基因组的复制在胞浆中完成。由于宿主细胞内缺乏EV71基因组RNA进行复制的RNA聚合酶，所以病毒进入细胞浆后必须首先进行基因组的转录和翻译。病毒的单链RNA为感染性核酸，进入细胞后，可直接起mRNA作用，合成病毒蛋白。由它转译出一个含2194个氨基酸的大分子多聚蛋白（polyprotein），经酶切后形成病毒结构蛋白VP1～VP4和功能蛋白，如依赖RNA的RNA聚合酶。以病毒RNA为模板在病毒RNA聚合酶的作用下转录成互补RNA（负链），再以负链RNA为模板在细胞内质网内进一步合成大量的正链RNA。肠道病毒基因组复制可能有两种模式：①末端结合蛋白VPg结合于所有新合成的正链和负链RNA的5＇-末端，然后以VPg-pUpU作为引物进行RNA链的合成；②宿主细胞的末端尿苷酸转移酶将多聚尿嘧啶核苷酸尾加到模板的3＇-末端，所形成的发卡结构能够作为自身引物合成新的RNA链。一般情况下，原肠道病毒颗粒无感染性，经过蛋白酶的加工，水解切割后产生VP1～VP4多肽，才产生感染性的病毒颗粒（见图1-6）。图1-6 EV71在宿主细胞中的复制过程（图片来源：Yi et al. Crit Rev Microbiol. 2011；37（4）：313-327.）
随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒逐渐进入子代病毒的包装过程。该过程比较复杂，一般首先由5个未切割的P1蛋白相互凝集，P1前体蛋白切割后形成5个形状相同的凝集体，即五聚体（pentamer）；然后12个五聚体沿着一个二十面体的12个顶点形成前衣壳，即具有接受RNA分子能力的前毒粒；最后1AB经宿主酶切割成VP4、VP2，以进一步稳定其结构，产生完全成熟的子代病毒粒子。关于病毒颗粒释放的机制尚不清楚，一般认为是随着细胞的死亡而释［75］放出子代病毒。
EV71基因组突变快速，由于它的RNA依赖的RNA聚合酶低保真［76］度。病毒基因组复制是在RNA依赖的RNA聚合酶3D区完成，这个聚合酶极易出错。据推测在每个基因组复制的过程中，聚合酶会错误插入1～2个碱基，这就解释了为何病毒会出现如此快的突变和进-3化。每年每个位点VP1基因内有4. 2-4. 6×10的碱基替换，这与脊髓［76，77］灰质炎病毒类似，但高于流感病毒的突变几率。六、病毒感染机制
病毒主要通过内吞作用和病毒内膜融合进入宿主细胞，从而使病毒基因组在宿主细胞质中进行传递。流感病毒（influenza virus）［78］［79］、乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）、呼吸道合胞体病［80］毒（respiratory syncytial virus，RSV）、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-coronavirus，SARS-［81］［82］CoV）、狂犬病毒（rabies virus，RV）、水疱性口炎病毒［83］（vesicular stomatitis virus，VSV）、黄头病毒（yellow head ［84］disease，YHV）和鸡新城疫病毒（newcastle disease virus，［85］NDV）等已被证实通过内吞途径进入细胞。脊髓灰质炎病毒利用CD155，免疫球蛋白超家族成员作为受体感染宿主细胞，通过网格［86］蛋白和内涵体酸化进入细胞。RSV病毒在中性pH情况下通过网［80］格蛋白介导的内吞途径进入细胞。流感病毒通过网格蛋白依赖［87］型和非依赖型的内吞途径进入靶细胞。病毒通过网格蛋白或小窝介导的内吞途径或网格蛋白和小窝蛋白非依赖途径也已有报道［88］。
目前，EV71病毒通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞已有报［89］道。网格蛋白介导的内吞是病毒进入细胞最普遍的模式。首先是病毒与受体的结合，包括同时或连续发生的不同受体之间的相互作用；之后，病毒在细胞膜上旁向扩散，通过细胞内吞作用，将毒粒用细胞质膜包起来形成带外膜的泡状物被吞饮至胞内。网格蛋白在这一过程中起到形成囊泡的包被作用。这种囊泡被转运到早期内体。内体中的酸性环境触发了病毒外膜与囊泡膜的融合，或者破坏囊泡膜和病毒的外壳而使病毒毒粒或病毒基因组释放到胞质，病毒在细胞中得以复制。Lin等表明EV71进入宿主细胞主要依赖网格蛋白和动力蛋白实［90］现内吞过程，同时伴随内涵体的酸化。一旦发生内吞，原始的包含有基因组病毒RNA的病毒颗粒形成135S的亚病毒“A颗粒”，在pH≤5. 6情况下，通过内吞作用的载体囊泡和内涵体，经构象改变形成80S的亚病毒“B颗粒”。病毒RNA从“B颗粒”的蛋白质外壳中的［91］释放有利于病毒复制。这种低pH介导的抗原转换在钾离子缺陷细胞中减弱。因此，内涵体的酸化能提高EV71“B颗粒”的转换，释放病毒RNA，引起病毒衣壳蛋白在EV71感染阶段的表达提高。利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）中断SCARB2的表达能干扰EV71感染和随后的病毒衣壳蛋白在RD细胞和3T3-SCARB2细胞中的表达。对网格蛋白介导的内吞途径中的网格蛋白、动力蛋白或化学抑制剂等具有特异性的siRNA都能干扰EV71进入3T3-SCARB2。此外，小窝蛋白介导的内吞过程中小窝蛋白特异的siRNA或抑制剂却没有干扰效果，表明了在EV71感染中，SCARB2激活网格蛋白介导的内吞途径。此外，研究还确认了EV71入胞属于pH依赖型的内吞过程，需要内涵体的酸化和完整的膜胆固醇。在网格蛋白介导的内吞过程中，［92］分子量为100 kDa的GTP酶参与新生囊泡从母体膜的分离。最近研究发现，人类SCARB2中142-204区域的氨基酸序列，在EV71与宿［93］主细胞的结合和感染过程中至关重要。七、系统进化树
系统发育（phylogeny），即系统发展，是与个体发育相对而言的，它是指某一个类群的形成和发展过程。系统学分类描述了不同生物之间的关系，通过系统学分类分析可以使人们了解生物的进化历史过程。这一过程并不能够真实看到，只能通过相关线索了解历史上曾经发生了什么，而研究者们就是用这些线索建立各种假说、模型。最常用的简明表示进化关系的方法，就是绘制系统发育进化树（phylogenetic trees），用一种类似树枝状的图形来概括各种类生物之间的亲缘远近关系。通过比较生物基因或蛋白序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树（molecular phylogenetic tree），这个进化树描述了分子（氨基酸或DNA）、物种以及两者之间遗传关系的谱系，是目前公认的一种方法。进化树由结点（node）和进化分支（branch）组成，每一结点代表一个分类学单元（属、种群、个体等），进化分支表示分类单元（祖先与后代）之间的关系，一个分支只能连接一个相邻的结点。进化树分支的图像称为进化的拓扑结构，其中分支长度表示该分枝进化过程中变化的程度，标有分枝长度的进化分支叫标度枝（scaled branch）。这样的树通常根据某一或部分基因的理论分析而得出。进化分支可以没有分支长度的标注（unscaled），没有被标注的分支其长度不表示变化的程度，虽然分支的有些地方用数点进行了注释。
进化树分为“有根树”（rooted）和“无根树”（unrooted）两类。有根树是具有方向的树，包含唯一的节点，叫做根（root），用来表示所有物种的最近共同的祖先，由该点通过唯一途径可产生其他结点；无根树只是指明了种属的相互关系，没有确认共同祖先或进化途径。确定树根的最常用的方法是使用一个或多个的同源物种作为“外群”（outgroup），这个外群要足够近，以提供足够的信息，但又不能太近以致和树中的种类相混。把有根树的根去掉即成为无根树。一棵无根树在没有其他信息（外群）或假设（如假设最大枝长为根）时不能确定其树根。无根树是没有方向的，其中线段的两个演化方向都有可能。
基因重组指由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的，整段DNA或RNA在细胞内或细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，并在新的位置上复制、转录和翻译。基因重组是遗传的基本现象，在进化、繁殖、基因表达、病毒感染以及致癌基因激活等过程中，基因重组都起重要作用。基因重组也归类为自然突变现象。
病毒基因重组是指病毒基因片段通过模板切换方式获得不同来源的遗传信息从而提高病毒的生物学适应能力。许多病毒如人类免疫缺陷病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒均为重组病毒，可发生型间重［96］组或型内重组，重组的病毒可能导致发病的机制改变。
EV71也是重组病毒，有报道称B3、B4、C1和C2亚型存在基因［94］重组现象，且均为非结构区的重组，但结构区是保守的。中国台湾在1986年和1998—2003年间分离的EV71病毒株为B基因型病毒，而1998年，2002年，2004年和2005年分离的EV71病毒株为C基因型病毒，均为重组病毒，P1区为EV71 C基因型重组，P2区为B基因型［95］重组，其他区未见明显重组。从荷兰分离的1963—2010年间的［96］EV71病毒株，为B2或C2亚型，也为重组病毒。2008年安徽阜阳流行株为C4亚型，P1区为EV71 A基因型原型株BrCr重组，P2和P3［48］区为CoxA16原型株G10重组。第四节 柯萨奇病毒A组16型
柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）基因组为单股正链RNA，长约7410bp，仅有1个开放阅读框，包含5＇-和3＇-非转录区（UTRs），此区域对于RNA的复制和表达非常重要。5＇-UTR包含大约740个核苷酸，组成了内部核糖体的进入位点，与基因组RNA的复制和启动翻译有关。开放阅读框含有6579个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白，由P1，P2和P3 3个前体蛋白组成。P1多聚蛋白前体加工成4个结构蛋白VP1～VP4，P2和P3为2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D这7个非结构蛋白的前体。
第一株原型株，CoxA16-G10于1951年在南非首次被分离，并于［97］1994年测序。CoxA16长久以来一直进化缓慢。通过部分病毒测序（如病毒蛋白VP1区域）和血清学特征分析显示，从手足口病病人［98］中分离的10%-50%病毒与原型株CoxA16-G10相关。肠道病毒A型的全基因组分析表明非结构区的重排在一些肠道病毒A型的进化中［99］起了重要的作用。先前通过已获得的部分序列分析，表明CoxA16和其他A型肠道病毒血清型（Cox-A4，EV71等）在非结构区［100］存在重排现象，然而，由于缺乏全基因组序列，重排分析受到限制。
通过GenBank数据库中完整VP1序列分析，发现除了CoxA16原型株属于A基因型外，其余的所有CoxA16病毒株均属于B基因型。B［101］基因型又分为B1和B2型，其中B1型包括亚基因型B1a、B1b和B1c。B2基因型只在1981—2000年引起日本和马来西亚的手足口病流行。亚基因型B1a和B1b链分别于1995年和1988年在日本首次被分离。B1a和B1b两个基因型属于重组病毒，包含了来自其他肠道病毒5［102］＇-非转录区和P2、P3非结构蛋白编码区的序列。Chen等通过对1988—2011年间的35个CoxA16全基因组序列、593个CoxA16 VP1序列进行分析，表明亚基因型B1a和B1b是全球主要的流行株，2000年以来一直在亚洲许多国家流行，尤其是中国大陆，已流行了至少13年，在大多数省份都能被检测到。单一亚基因型B1b只在上海、陕西、吉林、福建、天津和黑龙江被检测到。亚基因型B1c的流行（总共20株）只在2005—2007年的马来西亚和2010年的法国被分离到，该亚型在中国还未被检测到，因此对于此亚基因型需要继续加强监视（见图1-7，A基因型未显示）。
系统进化分析表明此35条CoxA16链在所有被分析区域高度聚集，表明这些序列具有高度同源性，只存在少量的内部差异。CoxA16可能单独进化，并且进化速率缓慢，但起源于相同的祖先。［103］中和抗原主要存在于衣壳蛋白上，尤其是VP1蛋白。在他们的研究结果中，35条CoxA16链在P1和VP1区域的氨基酸序列同一性分［104］别为99. 5%和99. 6%。CoxA16可与EV71发生交叉免疫反应。在他们的研究中，CoxA16株与EV71亚基因型C4代表株（JN256060）在P1和VP1～VP4区域的氨基酸序列同一性分别为79. 3%，71. 9%，84. 2%，85. 4%和78. 1%。因此，交叉反应的中和抗原可能存在于VP2 和VP3蛋白上，表明重排主要在P2和P3区域频繁发生，P1区域较少，可能是因为结构蛋白在病毒复制和组装成合适病毒衣壳过程中［105，106］非常重要。结构蛋白的遗传稳定性和单基因型在中国的播散对设计CoxA16流行株的血清学诊断实验和疫苗研究是非常重要的。图1-7 CoxA16亚基因型全球分布（图片来源：Chen et al. PLoS One. 2013；8（12）：e82861.）
基因重组有时能引起肠道病毒毒力的改变，从而引起严重的公共［107］健康问题。由于P2和P3区域种内重排发生在很久以前，基因库中CoxA16的全序列很少，因此系统进化分析非常困难，很难确定与其发生重组的病毒株。
Hosoya等对1983—2003年来自日本不同地区及中国的175株毒株的VP4基因序列分析显示，按流行的年代可分为3组，同一年代流［108］行株可波及较大范围，近期流行株有取代早期毒株的特点。Perena等通过对VP4和VP1 2个基因序列同时分析后认为，现代流行的CoxA16虽然其传播地域广，时间跨度大，但与同期EV71变异相比，其病毒变异较小（VP1变异为13. 4%，VP4为16. 3%），只能将Li等的［100］B和C基因型归于同一B基因型下两个分支，Cox A16标准株A基因型在20世纪70年代后就未发现。但是由于对CoxA16的研究较少，缺少基础数据资料，其他方面的研究仍较少见。
CoxA16和EV71的单一流行或共同流行可导致手足口病的暴发。CoxA16在中国大陆肠道病毒引起的手足口病病例中占了大约［109，110］50%，由于严重或致命的病例往往由EV71引起，因此研究主要集中于EV71。然而，1994年英国暴发的最大一次手足口病由［111］CoxA16引起。中国台湾1999—2006年间的手足口病也主要由CoxA16引起（2579个病例），病例数超过EV71（1760个病例）（http：/ /www. cdc. gov. tw）。2001—2007年，新加坡监测数据显示，在2002年，2005年和2007年3个流行年中，主要的流行病毒为［112］CoxA16，而EV71只在2006年流行。与EV71感染相比，CoxA16引起的感染常常病症较轻，但是偶尔也可引起严重并发症如［113］心肌炎甚至死亡。参考文献
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