作者：贺号
出版社：电子工业出版社
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飞秒激光生物光子学试读：
前言
生物光子学是一门交叉性、前沿性极强的新兴学科，近年来，在激光技术的推动和生命科学及医学发展的促进下，取得了一系列突破性成果。生物光子学涉及光学、激光技术、生命科学等较多领域，方向繁杂，全面阐述较为困难，且很难进行有效的逻辑梳理和内容组织。飞秒激光是近年来发展较快、较为新型的激光技术，具备一系列特有的光学特性，在生物光子学的应用中呈现出巨大的潜力和独特的特征。目前，国内外还没有书籍对以飞秒激光技术为核心的生物光子学领域进行梳理、总结。
飞秒激光具有一系列独特的性质，使得基于飞秒激光技术的生物光子学呈现出一定的独立性。本书试图以飞秒激光为切入点，根据笔者的研究经验与研究方向，研讨和阐述基于飞秒激光技术的一系列生物光子学问题，探讨最前沿的应用研究——飞秒激光在脑科学、细胞的信号通路与功能中的调控，以及在临床医学领域的主要科研突破与实际应用，对由飞秒激光技术推动的生物光子学领域中涉及的基本理论、基本方法、最新研究进展等进行全面总结和系统分析。由于研究范围和对领域内诸多方向理解的限制，本书对一些新兴进展缺少涉及，对一些过往领域缺少认知，对一些研究进展的理解也可能存在疏漏。且本领域的技术发展较快，一些研究进展与结论也在不断刷新，随着时间的推移，可能会出现与本书中的某些结论不完全一致的情况，请广大读者进行批判性的阅读。
本书侧重于介绍基于飞秒激光技术的生物光子学理论的核心技术。这些技术在生命科学和医学上的实质性应用解释了相关生物医学问题的主要脉络和潜在的发展前景。本书着重阐述飞秒激光技术是如何解决相关生命科学的具体问题和医学需求的。
全书共7章。
第1章对生物光子学的主要领域进行简要介绍，并建立基本的概念与框架。
第2章在解释光与生物学样本相互作用基本过程的基础上，对飞秒激光的主要非线性过程进行了阐述。
第3章着重介绍飞秒激光在生物光子学领域最主流、最重要的应用，即多光子荧光显微成像技术及其在肿瘤和神经科学领域的重要进展。
第4章探讨飞秒激光对细胞分子信号的调控这一全新的应用领域。
第5章综述飞秒激光在精密细胞手术中的应用。
第6章简单介绍飞秒激光在医学上的应用，并列举三个临床应用。
第7章对飞秒激光生物光子学的未来发展趋势进行分析和展望。
本书是在我国飞秒激光领域的专家和前辈，天津大学王清月教授的敦促、指导下完成的。本书在撰写过程中，得到了诸多师长、前辈、同行们的多方面帮助。天津大学超快激光研究室的全体成员、上海交通大学生物医学工程学院的同事们都对本书提出了宝贵意见。特别感谢天津大学王清月教授、胡明列教授，上海交通大学魏勋斌教授，深圳大学屈军乐教授，福建师范大学李步洪教授，浙江大学钱骏教授等对本书的诸多指导。感谢王艺森、王胤涛、王劭阳、程攀、唐莞屹、胡宇豪、王海鹏、田晓莹、赵小惠、余正英等学生所做的资料整理和校对工作。本书在撰写过程中参考了大量国内外已发表的文献、著作，在此向原作者表示衷心感谢，向他们富有开创性的研究工作致敬。
本书可以作为生物医学工程、光学工程等专业的教学参考书及相关研究领域的工具书。由于笔者水平有限，成书过程较为仓促，加之生物光子学领域又始终在迅猛发展，因此错误和遗漏之处在所难免，恳请同行、老师和同学们批评指正。第1章飞速发展的生物光子学
本章主要结合生物光子学的发展历程，介绍生物光子学领域里的重要成果和主要研究方向，着重描述生物光子学的基本理论和基本概念，力图给读者建立一个较为宏观和全面的生物光子学领域的基本结构。1.1 生命科学与光学的交叉与相互促进
任何生物（包括人类）的个体都是一个复杂的系统，均由复杂的器官和系统组成。而器官和系统都是由最基本的功能结构单位——细胞组成的。细胞由细胞膜、细胞质、细胞器以及细胞核等结构成分构成。而这些结构成分又由分子构成，例如，细胞核由DNA（分子）和蛋白质等构成。分子是化学过程和生命过程的最小单元。生命科学是一门涉及范围很广的科学，从宏观的个体到微观的组织（细胞、蛋白质、DNA、RNA等）都是其研究对象，从而揭示相应的生命过程。2从尺度上来说，手指尖上的一小块皮肤的面积约为200 mm，细胞的直径约为20 μm，而DNA和RNA的直径为纳米级的。而光学研究的对象是微米级的，所以只有精密的技术工具才可以用于生命科学的研究。
光的范围很广，有波长小于400 nm的X射线和紫外线，波长从400 nm到750 nm的可见光，还有波长大于750 nm的近红外光、中红外光和远红外光。光学的研究范围一般为可见光和近红外波段。光学理论发展也经过了一个很长的过程，例如牛顿发现了光谱、惠更斯的理论、普朗克的辐射量子论等。光是一种电磁波，在物理学中，电磁波由电动力学中的麦克斯韦方程组来描述；同时，光具有波粒二象性，光的粒子性则需要用量子力学来描述。
细胞及分子的研究是很细微的，需要光学显微镜作为研究手段。光学显微镜作为一种光学工具用于生物学的研究，也是光学领域很重要的一个发展方向。光学的发展很好地推动了现代生物学的发展。
1665年英国发明家胡克（R. Hooke）设计出了第一台显微镜，如图1.1（a）所示，他采用凹面镜聚集烛光来照明样本，再通过望远镜系统进行观察。胡克用它观察了树皮的软木薄片，并将观察到的植物细胞（如图1.1（b）所示）命名为Cellua，这是历史上第一次成功观察到细胞。这也是将光学和生物学联系在一起的重要一步。自显微镜被发明以来，光学技术就为生物学打开了微观世界的大门，成为生命科学的基础技术。因为普通显微镜有衍射极限，分辨率低，于是在20世纪初出现了荧光显微技术，使分子水平的直接观测成为可能。荧光显微镜（Fluorescence Microscope）用紫外线作为光源照射物体，使物体受激发出荧光，通过在显微镜下观察荧光的变化来研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布和定位等。荧光显微镜的出现和应用，使得生命科学从原始松散的博物学、分类学和经验性科学状态，发展成为一门系统、严谨、缜密的现代化科学。图1.1 第一台显微镜（a）和第一幅植物细胞图像（b）
从1911年德国的Oskar Heimstädt提出荧光显微成像技术，到20世纪60年代共聚焦扫描显微镜的出现，光学技术一步步有力地促进了生命科学的发展，也一步步与生命科学结合得愈发紧密。共聚焦显微镜与传统光学显微镜的不同，是在反射光的光路上加上了一块半反半透镜，将已经通过透镜的反射光折向其他方向，在其焦点上有一个带有针孔的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管，如图1.2所示。可以想象，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住，于是光度计测量的就是[1]焦点处的反射光强度。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了传统显微镜图像模糊的缺点。直接观测、定量化和特异性靶向成像，使得生命科学的研究从经验科学向实证科学迅速转化。图1.2 传统显微镜和共聚焦显微镜的成像光路
由于观测是生命科学里最根本的需求，观测能力从某种意义上决定了生命科学的研究水平，因此光学必然会一步步与生命科学交叉结合。在经典光学研究基础之上，诞生于20世纪60年代的激光技术，使生命科学获得了全新的进展，特别是把共聚焦激光扫描显微成像技术推向了巅峰，让“所见即所得”成为生命科学研究中无法缺失的一环，其优美的显微图片（如图1.3所示）深刻地诠释了“科学即是美”（Science is beauty）的基本法则。图1.3 共聚焦激光扫描显微镜所得图片
在激光技术大发展的20世纪60—80年代，由于冷战的特殊时代背景，激光的定向发光和能量密度高等特性使其始终被赋予了军事用途的重任。因此，当时的美、苏两国投入了大量人力、物力研究激光与生物个体的相互作用，以期获得可以实现对人类形成软杀伤的军事武器。例如：1978年3月，世界上第一支激光枪在美国诞生，随后苏联研制了“反卫星”陆基激光武器；在1982年的英阿马岛战争中，英国在航空母舰和各类护卫舰上就安装了激光致盲武器。激光武器研究的方向主要有两个：一是将激光与各种高能射线结合，开发所谓的“死光”，可以瞬间导致目标人类死亡或产生严重的杀伤效果；二是研究激光是否有可能取代放射线，对人类进行软杀伤的同时而不引入放射污染。在今天看来，这些研究方向毫无疑问是非常原始、粗陋且毫无意义的，但也说明了激光技术在生命科学中应用的核心特点：可以精确、洁净地将光子能量投递到生物样本中。
事实上这种军事上的思想对于科学界的影响是非常大的。出于激光是一种高能定向精密武器的思维定式，科学家们首先想到的是用激光来替代手术刀以切削各种生物样本。于是，在20世纪80年代，美国医生Stephen Trokel首先发现Nd：YAG激光可以精密切削眼球的角膜组织，而切削效果可能矫正近视。1985年，对后世影响深远的第一代激光近视矫正手术技术诞生了，即屈光性角膜切削术（Photorefractive Keratectomy，PRK），德国的Theo Seiler医生使用深紫外准分子激光实现了对角膜外表面的直接切削，首次实现了对近视的有效矫正。在此基础上，20世纪90年代，Pallikaris、Buratto及Camellin医生分别提出了更加安全有效的激光角膜原位磨镶术（Laser in Situ Keratomileusis，LASIK）和激光角膜上皮瓣下磨镶术（Laser Epithelial Keratomileusis，LASEK），这成为目前主流的屈光不正矫正手术。由此可见，激光技术作为一种医学领域的工具，其发展也大大促进了相关激光医学领域的发展。
由于激光诞生于物理领域，因此激光在与生命科学相互交叉发展的过程中，经常带着浓厚的物理色彩，即在技术上追求极限，而并没有直接面向解决明确的生命科学问题。例如著名科学家朱棣文（Steven Chu）和他的同事Arthur Ashkin在研究冷原子时，提出通过光子动量的改变来束缚一个原子以获取绝对零度的冷原子的光镊（Optical Tweezer）思想（光镊原理图如图1.4所示）。这个思想迅速应用在生命科学中，通过激光束缚一个细胞，像镊子一样捕获一个细胞的自由移动。图1.5所示为利用光镊控制26个直径为0.99 μm的二氧2化硅（SiO）分子的位置。这个技术在物理法则的指导下迅速发展到极致，从简单的样本捕获或束缚，发展为一种极端精密的测量方法，可以获取大量生物样本的精密物理参数，包括力学性质和机械性质。尽管光镊技术并没有直接解决生命科学的问题，但是为生命科学的研究开启了激光这扇全新的窗户：激光将带来一系列新技术、新方法，为生命科学的新发现、新理论提供了可能。在随后众多的光镊技术发展中，以S. M. Block为代表的科学家利用光镊测定了包括肿瘤细胞、DNA分子在内的众多生物样本的极限物理特性，特别是杨氏模量等机械性质。虽然这些未知的发现依然没有为人类带来直接的实际应用，但这也正是物理学这样的基础科学的特点和本质——探索未知。图1.4 光镊原理图2图1.5 光镊控制直径为0.99 μm的SiO分子移动
在现代科学体系中，类似于光镊这样的基础科研对于技术的促进是间接的、缓慢的，然而生命科学与光学的交叉却是迅速的、深刻的。这主要是因为生命科学对于显微成像的巨大需求和光学显微成像技术对生命科学研究的快速促进。在激光共聚焦扫描显微技术诞生之后，生物学家们一度认为（直到现在，依然有大量的细胞生物学家认为）这已经是一种完美的、对生命科学研究完全足够的显微成像技术了，甚至直到2010年，激光共聚焦扫描显微镜依然是世界绝大多数生命科学研究机构中最高级、最先进的成像设备。但在此之前，随着生命科学研究的深入，大量的课题都出现了对体组织显微成像和单分子显微成像的需求。激光共聚焦扫描显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外线或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。光学技术的进步很快让科学家们研究出了相应的成像技术。例如，诞生于1990年的双光子显微成像技术，其原理是荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子。双光子显微镜系统如图1.6所示。图1.6 双光子显微镜系统
光学显微镜的分辨率被认为是有极限的，它不可能超过光波长的二分之一，1994—2006年逐渐发展的超分辨荧光显微成像技术从原理上打破了原有的光学远场衍射极限对光学系统极限分辨率的限制，在荧光分子帮助下很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级分辨率，如图1.7所示。经历十几年技术上的优化，超分辨荧光显微成像在2010年之后迅速普及，并取得了一系列重大成果。图1.7 超分辨荧光显微成像（a）全内反射显微镜和Blink显微镜的成像对比；（b）宽场照明和超分辨显微成像对比
激光在微观尺度上为生命科学和医学带来了一系列巨大的技术进展，特别是在亚微米到10纳米量级尺度的单细胞、亚细胞水平的研究中展现了无可比拟的优势。然而，生命科学和医学除对高分辨率的要求之外，往往还需要高通量检测。针对这个需求，流式细胞仪应运而生。从光学角度来看，流式细胞仪本质上依然属于显微镜系统，其核心的改进在于进样方式，通过高速液流系统形成一个高速单细胞流，在细胞经过显微物镜时，并不记录图像信息，而仅仅抓捕荧光强度信息以及散射光信号特征，以分析大量细胞的结构信息和某些特定分子的信息。如图1.8所示，应用体内流式细胞仪和体内流式细胞术检测循环肿瘤细胞，将激光聚焦到小鼠耳朵的毛细血管上来激活肿瘤细胞内的GFP。在血管中的循环肿瘤细胞流过由物镜聚焦的垂直方向的激光时，细胞中的荧光蛋白就会因被激发而产生荧光信号。在一个检测时间段内，这些荧光信号会在时间序列上形成一系列的信号峰。这些信号峰意味着血管中流过了一系列循环肿瘤细胞或其团块。图1.8 基于荧光的体内流式细胞分析仪和体内流式细胞术检测循环肿瘤细胞
进一步地，使用多功能微球取代细胞，通过微球表面的分子耦联和荧光检测，可以实现高精度、高通量的分子检测，这就是目前最先进的“液相悬浮芯片”分子检测技术。液相悬浮芯片的系统组成如图1.9所示，该系统主要由四部分组成：微流控芯片、荧光激发和检测、弱电信号放大与数据分析系统、自动控制电路。光学可视化流式细胞技术和液相悬浮芯片技术在医学检测领域已经得到了极其广泛的应用，而且在价格、精度、多指标检测上具有非常巨大的潜力和前景。图1.9 液相悬浮芯片的系统组成
简而言之，随着激光技术的发展，激光为生命科学和医学提供了大量的全新技术。一方面，这些技术为相关研究带来了新方法、新发现、新理论；另一方面，生命科学和医学也不断地向光学提出新需求、新方向，例如突破衍射极限的远场光学成像技术，就是在生命科学的重大需求之下，通过结合照明光或荧光分子的物理特性产生的。光学和生物医学的结合在共同的交叉发展中一步步深入。在20世纪末，科学家们逐步开辟了生物光子学（Biophotonics）这个交叉领域，一个独立于光学和生物学的新型学科。2014年，生物光子学中的重要进展——Eric Betzig、Stefan W. Hell、William E.Moerner因发明了超分辨显微成像技术而获得诺贝尔化学奖（如图1.10所示），标志着生物光子学已经成为一门成熟的前沿学科。图1.10 以超分辨显微成像技术获得2014年诺贝尔化学奖的三位得主1.2 生物光子学简介
生物光子学（Biophotonics）是由光学（特别是激光科学）和生命科学交叉形成的新兴前沿学科。对于这个交叉学科，很难精确地界定其研究范围。在内涵上，生物光子学包括生物中和光相关的研究，以及光学中和生物相关的研究。例如，光学已经在细胞生物学、分子生物学、组织生物学、神经科学、基因工程、干细胞研究、癌症科学、蛋白质组学，乃至大量的病理科学、重大疾病研究与治疗、临床诊断、再生科学以及特殊医疗器械等领域中快速发展和广泛应用。因此，人们也习惯把生物光子学称为生物医学光子学。而在外延上，由于生物光子学在大量研究中已经达到了单分子和单光子水平，它已经广泛地与纳米科学、材料科学、量子信息科学等相关领域紧密结合，出现了进一步的学科交叉。一个较为有趣的现象充分说明了生物光子学的交叉性和多样性，那就是世界上的生物光子学实验室会设立在高校的各类院系中，如物理（物理光学与生命科学交叉）、生命科学（生物学与光学交叉）、生物医学工程（生物学与光学工程交叉）、电子工程（光电子科学与技术）、材料、化学、物理化学等院系。同样，与生物光子学相关的科学论文也广泛分布于以上各领域的学术期刊中。
正如很难界定生物光子学的研究范围，我们也同样无法精确地以某个标志性事件作为其发展的起点。如前所述，不少科学家以显微镜的出现作为生物光子学诞生的象征，主要因为显微成像是第一种与生命科学结合非常深入的技术。然而，在激光技术出现之前，显微镜作为一种生物研究的基本工具，一直没有实质上的技术进步。此时的“生物光子学”仅仅是生物领域的一个附属技术方面或光学研究的技术应用，远未达到独立学科的程度。类似地，将采用光合作用的研究作为生物光子学发展的起点同样不合适。光合作用更多的是一种光化学过程，参与其中的光子除了提供能量，并不具备光学的其他特性。
随着分子特异性荧光标记概念的提出和应用，相关生物学领域得到了前所未有的发展，并从根本上促进了整个生命科学的进步。在此之前，透射型显微镜基本上只能获得生物样本的结构信息。即使通过对照明和传导部分的改进，人们研究出了相衬（Phase Contrast）成像、微分干涉对比（Differential Interference Contrast）成像、暗场（Dark Field）显微镜成像等成像方法（其中相衬成像和偏光显微镜成像如图1.11所示），也仅仅只能提高成像的反衬度等参数，而不能给显微成像提供更多的信息。因此，对于折射率几乎均匀、非常透明的细胞而言，这些成像方法很难带来实质性的进展。与之相对的，特异性分子荧光标记，使人们可以直接在活体条件下观测亚细胞的精细结构以及细胞内的特异性分子等，这为相关的生物学发展提供了前所未有的重要工具。图1.11 口腔上皮细胞的相衬成像和卵母细胞的有丝分裂偏光显微镜成像
生物荧光激发和观测在客观上要求有更好的激发光和检测手段，也使得激光的众多可控特性获得了充分应用。激光技术的出现将荧光显微领域推向了巅峰，激光共聚焦扫描显微镜就是其中的代表，它使人们首次在三维空间尺度上直接观测到分辨率达到光学衍射极限的特异性标记的荧光图像，由此进一步衍生出了各种荧光激发、转换和测量技术，使得细胞和分子生物学紧密地与激光技术联系起来，大大促进了这些领域的研究。其中，全内反射荧光（Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF）成像、荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，FLIM）、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）成像、荧光自相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS）测量等，都在特异性分子之外提供了更多的分子的时间、空间信息，人类对于生命现象、结构和过程的理解首次达到了亚细胞和分子级别。TIRF成像和FRET成像如图1.12所示。值得注意的是，荧光成像检测方法也大量地进入了基因组学和蛋白组学中，为分子生物学和生物医学分子检测的发展提供了极其重要的关键技术。这些发展也使得人们逐步对激光与生物学的交叉问题重视起来，并有一批科学家从各个领域转入到这个交叉领域进行更加专门和深入的研究。显微成像技术在近30年内，一直是生物光子学领域最核心、最前沿、最主流的方向，也是取得进展最多、在生命科学中影响最大的方向。
光子的粒子性为激光在生物中的应用提供了新的方向。光镊技术的出现，使得生物光子学进入了爆炸式的发展阶段，是生物光子学成为一门独立学科的里程碑。不同于过去依附于生物研究的工具，光镊更多的是一种不同于以往的全新的研究思路和研究切入点，从而使得生物光子学发展为一门真正的独立学科成为可能。光镊技术充分体现了激光的粒子性和空间精度的特性。由于光镊的强度与聚焦程度相关，人们由此转而研究光束的紧致聚焦特性，而这正是大部分生物光子学研究的实验基础。由于长时间的关注，人们大大加深了对细胞光损伤的理解，并开始重视一系列生命细胞对光的应激反应，从而更加深入地探讨光子在生命系统中的传播、吸收、荧光转换等基础问题，这为今后生物光子学的全面发展打下了理论和实验基础。图1.12 TIRF成像（a）和FRET成像（b）
紧致聚焦的激光带来了超高的光子密度，让聚焦的局域空间的电场强度达到了非常高的量级，这会使焦点内物质的分子结构被破坏。因此，人们尝试用激光取代传统的物理手术刀，让它成为一种洁净、精密、无接触无侵入的对细胞进行操控的“手”。随着激光输出波长向紫外波段的拓展以及调Q脉冲激光器的出现，人们开始尝试用激光对细胞做精密的手术。例如，对两个细胞做融合，在细胞膜上钻孔，甚至直接在细胞内部切断一个染色体。在传统的机械手术刀时代，这种精度的手术是无法想象的。调Q形成的纳秒级的脉冲也让生物样本中的非线性过程成为可能。尽管当时这些尝试都不太成功，大量生物样本往往由于受到过多的激光损伤而死亡或失活，但这些早期技术探索也为后续的研究奠定了重要的前期基础。
光镊概念的引入很快就在技术上发展到了极限。随着飞秒激光技术的出现和成熟，超高的飞秒脉冲的峰值功率带来了高效的非线性，使得生物光子学出现了又一次突破。在20世纪90年代初，人们已经开始将飞秒激光的非线性过程用于细胞成像的荧光激发。一系列的非线性成像技术很快在细胞和组织中得到了广泛的应用。由于飞秒脉冲优异的时域特性，它在组织中具备了比连续光或长脉冲好得多的传播优势。所以，组织中的荧光非线性成像随着飞秒激光技术的发展而取得了很多重要的成果，特别是表征生物样本内部分子信息的谱线探测技术，在生物分子信息、癌症以及重大疾病的检测上得到了非常好的发展和应用。
进入21世纪，越来越多的物理概念和思想被引入到生物研究中。例如，传统的流式细胞仪结合散射和荧光谱线探测等技术，可以同时检测多种生物信息。通过激光在电介质表面形成的等离子体对光相位的影响，可以测量到生物分子对介质折射率的微小改变。这些研究又进一步与纳米科学和材料科学相结合，促进了生物传感的飞速发展。而在相关生物医学应用方面，基于激光激发的光动力治疗技术，逐渐在临床上做出了相应的尝试，并在某些疾病的治疗上取得了不错的结果。在人的组织水平上，利用激光相干性探测组织结构的光学相干断层扫描（Optical Coherent Tomography，OCT）技术也迅速地在临床应用方面发展。角膜的OCT成像如图1.13所示。图1.13 角膜的OCT成像
近年来生物光子学领域最重大、最引人瞩目的成果，则是一系列超分辨率成像技术，包括随机光学重建显微（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）技术、光激活定位显微（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）技术、受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）显微技术。通过特殊的荧光转换蛋白或荧光分子，巧妙地把空间问题转换为时间问题，远场荧光显微镜的分辨率已突破衍射极限，达到并突破了10 nm的量级。此外，利用激光受激辐射的概念和飞秒激光精密的时域特性，科学家们用纯光学的手段也获得了10 nm量级的成像分辨率。这一系列成像技术的突破，给细胞分子生物学和神经科学的研究带来了许多重要的结果。图1.14所示为整个动物细胞中线粒体的3D STORM成像。图1.14 整个动物细胞中线粒体的3D STORM成像
与成像对应，利用飞秒激光对细胞的精确手术和离子调控也在近年取得了很多重大的突破。飞秒激光的长脉冲间隔和波长对于生物样本较为安全，可以对生物样本进行较长时间的照射，因此具有衍射极限精度的精密细胞手术在转基因、细胞生理过程和骨架的研究，以及细胞融合、神经组织再生、分子信号调控等众多领域都取得了很好的进展。
目前，生物光子学处于史无前例的高速发展时期。美国、欧盟、日本正在进行的脑计划，其中生物光子学（特别是光学显微成像技术）都是关键部分。此外，美国在荧光蛋白的荧光转换、激光诱导神经再生、激光控制基因表达等领域取得了NSF和军方的5~10年期的重点资助。德国、英国、俄罗斯等国家也纷纷加大了对生物光子学领域研究的投入。我国近年来在生物光子学领域的支持也显著增强，无论是大科学的脑计划，还是生物光子学的关键技术，例如各种新型的生物光子学成像方法、面向医学应用的多模态成像等，都获得了国家一系列的重大支持。可以想象，在现在以及不久的将来，生物光子学将会进一步高速发展，取得更多、更重要的成果，为探索生命科学的奥秘做出重要的贡献。1.3 飞秒激光的技术与特点
自20世纪开始，光学研究者们就一直面临着一个非常难以解决的问题——光源。当时的理论和实践研究中很难得到同时具备单色性与高亮度的光源，这也限制了一系列研究工作的进展。随着爱因斯坦光电效应和受激辐射理论的建立以及Arthur Schawlow等人微波激射器的发明，Theodore Harold Maiman于1960年5月16日利用闪光灯泵浦的红宝石产生了同时具有高相干性和高亮度的脉冲激光。由于其具有高光子简并度的巨大优点，激光技术一经面世就得到了光学领域的广泛关注和产生了新的研究方向，其中一个非常重要的研究方向就是如何获得具有更高峰值功率的脉冲激光，这样的想法促进了锁模脉冲技术的建立与发展。
从激光器的发明开始，光学研究者们就开始在激光器的设计和理论研究方面进行了各种尝试，同时也建立起了一套比较完备的激光器设计的理论基础，这为后来的锁模理论的产生打下了良好的基础。20世纪70年代中后期，多种激光脉冲理论被提出并逐步完善，其中最具代表性的就是各种锁模方式和理论（如主动锁模、被动锁模、同步泵浦锁模等）的提出。研究者们同时也将上述理论在具体实践中加−12以利用并搭建了输出脉宽在皮秒（10 s）量级的脉冲激光器，特别是从被动锁模激光器诞生之日起，在皮秒、亚皮秒、飞秒的超短光脉冲的脉宽新纪录的突破方面，被动锁模激光器一路领先，并广泛应用在染料激光器、固体激光器、光纤激光器等多种激光器中。早先的被动锁模激光器（主要是染料锁模激光器）获得了最大成功和最广泛的应用。20世纪六七十年代染料激光器的被动锁模集中在闪光灯抽运的脉冲运转方式，脉冲宽度为皮秒量级，运转波长多在蓝、绿光波段。1980年左右，碰撞脉冲锁模（Colliding Pulse Mode-Locking，CPM）−12−12激光器的出现，将超短脉冲技术从皮秒（10 s）和亚皮秒（<10 −15s）推进到了飞秒（1fs=10 s），成为超短脉冲激光技术发展的一个里程碑；其特殊结构和由此形成的特殊锁模机理，使得这种激光器能够稳定地运转在飞秒量级。当时由振荡器在中心波长630 nm处直接产生了脉冲宽度为27 fs的飞秒脉冲，而经腔外可以将脉冲压缩至6 fs，这一纪录保持了10年之久。
染料激光器机构复杂，调整困难，染料需要循环，而且具有毒性，虽然可以得到极窄的脉冲输出，却难以普及。20世纪90年代初，超短激光脉冲技术得到了非常迅猛的发展。在这一时期，飞秒激光的产生介质和原理都有了比较大的改进与发展：1990年，D. E. Spence等人通过利用Ar离子激光器泵浦掺钛蓝宝石（Ti: Sapphire）介质，成功地实现了利用非线性光学中的克尔透镜原理作为锁模机制的被动锁模激光器，得到了60 fs的激光脉冲输出，如此使得运转稳定、能够实现小型化和实用化的固体飞秒激光器进入了一个新的发展阶段。钛宝石具有超宽的增益线宽，使其可以支持短到4 fs的超短脉冲，正因如此，10多年来，由钛宝石振荡器直接产生的飞秒脉冲宽度不断被刷新。1993年，M. T. Asaki等人在掺钛蓝宝石激光器中采用石英棱镜进行色散补偿，得到了10.9 fs的脉冲输出。1994年，J. P. Zhou等人使用2 mm的钛宝石晶体和双石英棱镜对获得了8.5 fs的激光脉冲。1999年，U. Morger利用低色散棱镜对和一对啁啾镜对钛宝石激光器系统内的色散进行了补偿，使得其输出脉冲宽度可以被压缩至两个光学周期以内，其脉冲光谱宽度约为350 nm，重复频率为90 MHz，已经达到了当时飞秒激光器输出时域窄脉冲的极限。同年，A. V. Sokolov等人提出了利用超薄气体介质引起激光脉冲频率调制的理论，并估算出使用该方法能够产生小于1 fs的超短脉冲。
克尔透镜锁模（Kerr-lens Mode-locking，KLM）是一种利用非线性光学中的光学克尔效应（Optical Kerr Effect）对激光腔内模式进行锁定的技术。图1.15所示为典型的克尔透镜锁模的计算模型。克尔透镜效应是一种二阶电光非线性效应，最早由John Kerr于1875年发现。在较高的光子密度下，材料的折射率会随着强光电场的改变而出现明显的空间分布差异，与泡克耳斯效应（Pockel's Effect）的线性关系不同的是，克尔效应中光学参量的变化与电场强度呈二次方关系。大多数材料均可以观测到克尔效应，但只有少数的液体及其他材料能够表现出较强的非线性。克尔透镜锁模方式采用迄今为止响应速度最快、工作带宽最宽的类饱和吸收体，因此可产生宽度只有几个飞秒的光脉冲。如今，克尔透镜锁模的钛宝石激光器仍保持着被动锁模激光器最短脉冲纪录。图1.15 典型的克尔透镜锁模的计算模型3+3+
与固体锁模激光器同步发展起来的掺Er、Yb光纤锁模激光器3+是一种新型超短脉冲光源，掺Er光纤锁模激光器的发射波长位于1 3+550 nm波段，被广泛应用于光通信；掺Yb光纤锁模激光器工作在1 060 nm波段，具有超过80%的抽运光−激光转化效率，多适用于开发高功率光纤激光器系统。从本质上讲，光纤激光器也属于固体激光器。然而，它具有很多块状或棒状固体激光器无可比拟的优势：（1）光束完全被封闭在纤芯中，不再受周围环境的影响。这将飞秒激光器从超净、恒温和防震的高级实验室中解放出来，使其适用于更多的复杂环境；而且对于具有全光纤结构的光纤激光器，可以省去空间光路的精密调节，结构紧凑、易于维护。（2）光纤具有很大的表面积−体积比，具有极好的散热效果，在大功率运转时甚至不需要冷却装置，实现了激光器的小型化。（3）光纤激光器可以获得衍射极限的光束质量。（4）光纤的单次通过增益高，具有最佳的抽运光−激光转化效率。光纤激光器具有比固体激光器更强的色散和非线性（克尔效应），使得光纤激光器与固体激光器相比具有更丰富的锁模机制，例如：利用在光纤激光器中插入半导体可饱和吸收镜（Semiconductor Saturable Absorber Mirror，SESAM）实现锁模的自启动；利用非线性偏转效应（Nonlinear Polarization Evolution，NPE）实现超宽脉冲的形成；利用在谐振腔呈反色散的情况下，光纤中色散与非线性效应平衡产生的光孤子效应实现脉冲宽度的压缩（即孤子锁模，Soliton Mode-Locking）等。图1.16所示为Er、Yb共掺二氧化硅的能级图，图1.17所示为包层泵送原理。泵浦激光耦合入光纤包层，通过包层传输泵浦激光，激励纤芯的掺杂的稀土离子，最终产生激光。图1.16 Er、Yb共掺二氧化硅的能级图图1.17 包层泵送原理
利用各种锁模技术和脉冲压缩技术，人们可以获得飞秒级的超短脉冲激光，这为微观世界的超快过程的研究提供了前所未有的可能性和广阔前景。但是，直接由锁模激光器输出的超短脉冲能量通常是很−9小的，一般在10 J量级或更小，这对利用物质非线性产生高次谐波689以及拉曼效应等需要光脉冲峰值功率在10 W甚至10 W或10 W以上的应用是远远不够的。因此，在20世纪七八十年代，随着超短脉冲激光技术的不断完善及其应用的飞速发展，超短光脉冲放大技术也得到发展并逐渐成熟起来。其中，掺钛蓝宝石由于其非常宽的增益带宽和极大的调谐范围，在超短光脉冲放大技术中具有广泛的应用前景。1985年，G. Mourou等人借鉴了二战时期发展起来的啁啾雷达技术，并将这一思路应用在脉冲激光的放大中，提出了啁啾脉冲放大（Chirped Pulse Amplifier，CPA）方案，使得放大后的脉冲功率迅速达到了太瓦（TW）量级，这项技术也于2018年获得了诺贝尔物理学奖。1991年，Sullivan等人利用四级钛宝石多通放大器构成的CPA系统，获得了重复频率为10 Hz、脉冲宽度为95 fs、单脉冲能量为450 mJ、峰值功率为3 TW的脉冲输出，由此飞秒激光进入太瓦时代。1998年，Charles G. Durfee等人利用多通放大技术获得了17 fs、输出峰值功率为0.26 TW的激光束。同年，Yamakawa等人利用两级钛宝石CPA系统获得了10 Hz、16 fs、160 mJ、10 TW的脉冲输出，之后他们在原有的放大系统上加以改进，采用三级钛宝石放大系统获得了10 Hz、19 fs、1.9 J、100 TW的脉冲输出。2003年，Aoyama等人在100 TW钛宝石CPA系统的基础上，又加上了一级倍频钕玻璃放大器抽运的大口径钛宝石三通放大器，得到了峰值功率达0.85 PW的脉冲输出。
使用条件较低、应用范围极广的光纤激光器由于早期受到光纤拉制工艺的限制，没有得到较多的发展，直到1986年南安普顿大学的3+S. B. Poole等人拉制出第一根低损耗掺Er增益光纤，才使得光纤放大器走向实用化。而在1988年Snitzer等人提出了双包层光纤，打破了光纤激光器低功率的桎梏，开创了大功率光纤激光器发展的新局3+面。1994年，H. M. Pask等人首先实现了掺Yb双包层激光器的运转，得到了最大功率为0.5 W的输出。2000年A. Galvanauskas首次获得了平均功率为10 W以上的飞秒光纤激光器，并且超过了当时钛宝石飞秒激光器系统的最高平均功率。而随着大模场面积光子晶体光纤的出现，飞秒光纤激光器的输出功率又获得了进一步提升。2005年Limpert小组利用掺YB的大模场面积双包层光子晶体光纤的CPA放大系统，得到了平均功率为131 W、重复频率为73 MHz、脉冲宽度为220 fs的输出。2007年，该小组又利用纤芯直径为80 μm的大模场面积光子晶体光纤得到了单脉冲能量为1.45 mJ、重复率为50 kHz、脉冲宽度为800 fs的输出，这是目前飞秒光纤激光器输出的最高单脉冲能量。以钛宝石和双包层掺杂光纤飞秒激光啁啾脉冲放大器为基础的高单脉冲能量、高峰值功率的飞秒激光系统被普遍应用于材料加工、生物光子学等领域。1.4 飞秒激光生物光子学
飞秒激光技术在生物研究中逐步获得了越来越多的交叉和应用。超短的飞秒脉冲使得人类首次可以对生物样本实现在分辨时间上达到飞秒量级的无创式精确操作。同时，飞秒脉冲内超高的峰值功率使得光与物质的相互作用以非线性过程为主，这种相互作用的有效范围仅仅是非线性区域，使得空间分辨率突破了衍射极限而达到了百纳米量级。
从20世纪90年代开始，人们首先将飞秒激光的非线性过程用于细胞成像的荧光激发。显微成像是研究生物学（特别是细胞生物学和分子生物学）最为核心的技术手段，高分辨率的显微成像在一切与生物相关的研究中都有重要的应用和研究价值。成像分辨率是显微成像最为重要的指标。传统的荧光成像和共聚焦扫描显微镜提供了衍射极限的分辨精度（500 nm附近），但对于若干生物大分子和细胞结构仍显不足；而近场和扫描电子显微镜则无法保持对生物样本的活体观测和荧光标记。此外，由于可见光波段在组织中会被散射和吸收，传播深度会随之降低，因此严重限制了组织的荧光成像。飞秒激光的超高峰值功率为生物中的非线性激发提供了技术基础，在在体动物成像和组织荧光显微成像中可能会有一些成像深度和分辨率上的优势。但是，基于飞秒激光的多光子成像系统昂贵而庞大，在很多细胞水平的研究中并不比共聚焦扫描显微镜具有明显的优势。因此，在较长的一段时间内，飞秒激光在生物领域的应用主要停留在技术研究的层次，而缺少实际意义上的应用，没有真正去解决一些生命科学中的重大问题。
在2005年光遗传学技术出现后，脑科学和神经科学研究发生了革命性的变化，而对活体动物的脑神经荧光成像的需求急速增加。基于飞秒激光的多光子显微成像技术与神经科学的研究快速结合，并获得了广泛的应用，取得了一系列重大突破。图1.18所示为鼠的大脑皮层和海马区的三光子显微成像。由于飞秒脉冲具有优异的时域特性以及近红外波段的散射和吸收特性，它在组织中具备了比连续光或长脉冲好得多的传播优势。近期，通过飞秒激光对脑中的神经元成像，以及飞秒激光对神经元内光遗传蛋白的双光子激发，哈佛大学医学院的课题组首次发现了视觉皮层神经元的竞争机制。而斯坦福大学的Karl Diesseroth组首次通过少数几个神经元的刺激调控，以及通过飞秒激光的双光子激发刺激，实现了对视觉的植入。哥伦比亚大学的Yuste小组使用飞秒激光对小鼠的运动神经元进行观测和刺激，实现了只通过几个神经元的双光子刺激即可控制小鼠的行为。
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