作者：段钢
出版社：中国轻工业出版社
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酶制剂在大宗生化品生产中的应用试读：
前言
我国是发酵法生产大宗生化品的大国，是名副其实的“世界工厂”。如氨基酸中的谷氨酸、赖氨酸等，有机酸中的柠檬酸和葡萄糖酸发酵生产量毫无疑问地高居世界第一；淀粉、结晶葡萄糖、麦芽糖、低聚糖的生产量也同样占世界首位，果糖的生产量虽然现在位居第二，但超过美国只是时间问题。这些大宗生化品的生产，如果技术不进步，会持续地对环境造成很大影响，并耗费大量的资源和能源。希望科学和技术的不断进步，可以尽快减少这些不良的影响而造福中国社会。工业生物技术是其中重要的寄托，而酶制剂又是其中最重要的一环。
虽然关于酶制剂的有关书籍和文章不少，但有时工业酶的概念还是不很清楚，本书所指的工业酶是指医药用酶之外的工业规模用酶，包括食品用酶等。工业酶制剂的应用很广泛，本书不试图涵盖工业酶的广泛应用，而着重于在几种重要的大宗化学品的生产上酶制剂的应用。在具体介绍不同应用之前，第一章先简单介绍工业酶近期的发展情况，特别是市场状况和未来的展望。在第二章中介绍由于分子生物学和生物信息学的快速发展和大通量筛选等工具的进步，使工业酶的发现、发展和生产都有相应很快的发展。虽然有关纤维素转化的研究非常多，但如今大宗生化品的生产原料仍来源于淀粉。第三章介绍了淀粉生产，叙述了如何应用酶制剂来提高提取效率并减少能量的使用和对环境的影响。葡萄糖是生产绝大多数生化品的底物，糖浆质量的好坏直接影响到下游发酵的转化，因此第四章单独讨论葡萄糖的生产，可为下面各章打下良好的基础。果糖的发展是中国近两年淀粉深加工中最快的一个，然而工厂设计、生产和用酶情况还有待大大提高。第五章结合我国现状提出改进的机会和具体措施。我国是麦芽糖和低聚糖等功能糖的生产大国，第六章新型酶制剂的出现带来了新的功能糖，或对现有的功能糖生产有所改进。在第七章中，主要介绍生料制糖对特殊糖醇生产过程的影响和麦芽糖醇的生产要点。第八章介绍了一代和二代酒精生产的现状和进步。第九章则介绍新型酶制剂在传统的白酒和黄酒上的新应用。第十章介绍了主要有机酸的发酵和酶法生产。第十一章介绍了氨基酸发酵生产和小品种氨基酸的酶法生产。最后一章较详细地介绍了现代分析对大宗生化品生产和研发过程中的指导作用。
参编作者的具体分工如下：前言由段钢编写；第一章由段钢、姜锡瑞编写；第二章由段钢、姜锡瑞编写；第三章由段钢、钱莹编写；第四章由钱莹、张晓萍、段钢编写；第五章由段钢、张晓萍编写；第六章由钱莹、张晓萍、段钢编写；第七章由段钢、钱莹编写；第八章由许宏贤、段钢编写；第九章由姜锡瑞编写；第十章由姜锡瑞、许宏贤编写；第十一章由许宏贤、王欣、周鹏、段钢编写；第十二章由张晓萍、刘佳、钱莹编写。
在本书完成之际，首先感谢姜锡瑞先生的协调，这么多年的帮助和鼓励，没有他的不懈努力，本书不可能成文。同时也由衷感谢本书其他作者，我的同事钱莹、许宏贤研究员，张晓萍博士，王欣，周鹏，刘佳等在非常繁忙的工作外，利用业余时间和假期来完成本书的相应章节。除了提到的每章作者外，周红伟、刘飞、陆冬佳等同事也对本书的一些内容有特殊贡献，在此表示感谢。特别感谢作者家人的理解、支持、忍耐和鼓励！
本书主要集合了作者的最新研究成果，同时也包括行业理论和实践的进步。然而当今世界发展很快，书籍和文章的书写总是赶不上变化，但我们还是要在适当的时间停下来总结，以达到温故知新的目的。
由于时间仓促、知识和经验有限，疏忽和错误难免，希望专家和读者能多提宝贵意见（gang.duan@dupont.com），也可反馈给编辑部（jiangjuan1982@sina.com），如果将来有机会再版，则可更新和更正。非常希望本书的一些观点能为行业的进一步发展和提高有所贡献。段钢2013年9月第一章工业酶的应用与市场第一节 酶和酶制剂
酶是一种蛋白质，是各种氨基酸的线性聚合物。由于有20种氨基酸，因此有很多不同的组合。通常酶分子由300个或更多的氨基酸聚合而成。已发现的酶有几千种，但应用于工业化生产的只有不到100种。工业化生产的酶产品被称为酶制剂或工业酶。酶制剂是生物催化剂，可以在温和的条件下加速特别的反应。
随着人口的增加和人们生活习惯的改变，世界面临的巨大挑战有：能源危机、资源枯竭、环境恶化等。21世纪被预测为生物科技的世纪，人们对生物科技寄予厚望，希望生物科技能给世界带来可持续发展的解决办法。世界处在从碳氢化合物的石油经济到碳水化合物的生物经济的转型过程中。
酶制剂作为高效生物催化剂，无疑是生物技术中主要的组成部分之一，是生物技术的一类特殊产品。酶制剂与其他生物产品不同的是，很多时候，或者是本书讨论的酶制剂并不是最终面对消费者的产品，而是用于其他产品的加工过程。第二节 酶制剂的市场图1-1 世界酶制剂的市场
世界酶制剂的市场见图1-1，全球酶制剂和工业酶制剂的市场见图1-2。特别值得指出的是食品工业用酶也是工业酶制剂的范畴。工业酶通常指的是除用于医药、研发、诊断行业外的酶制剂。
工业酶依Freedonia的分类可分为：食品与饮料行业用酶，洗涤用酶，生物燃料生产用酶，饲料用酶，其他工业用酶（包括淀粉加工、纺织和皮革等），特殊用酶如医药、诊断用酶不在这个统计中。工业酶约占所有酶市场（58亿美元，2010年）份额的近60%，如图1-2所示。在过去的10年里，工业酶的市场稳步增长，生物燃料、饲料和食品行业都是增长主要的驱动行业。图1-2 全球酶制剂和工业酶制剂的市场估计（依参考文献1 数据作图）
一、按行业分的市场规模
虽然不是所有工业酶的应用都是本书的讨论内容，读者还是有必要了解工业酶制剂市场的大体情况。下面就几个主要市场做简单介绍。工业酶市场按使用行业，可分为以下几个大部分。（1）食品与饮料行业用酶 主要是焙烤酶，该类酶应用是为了增强焙烤时面包的体积和面团的强度，及增强货架期等。其次就是乳品用酶，用来生产奶酪和除去牛乳中的乳糖。在饮料的制造中，啤酒、白酒、果酒和果汁中也都涉及酶的应用。其他食品加工如点心、可乐、咖啡、鸡蛋、蔬菜、肉类和油脂加工等。2010年的市场为12亿美元，预计2020年达到27亿美元。（2）洗涤用酶 洗衣粉用酶、自动洗碗机用酶和其他洗涤用酶。预测该市场将以每年5.2%的速度增长，到2015年达到11亿美元。（3）饲料用酶 全球市场仍然在以近10%的速度增长，到2015年达5亿美元以上。主要饲料用酶为禽类和猪饲料中用的植酸酶；非淀粉类多糖（NSP）水解酶的使用依然在增长。随着中国饲料中小麦比例的加大，这个市场增长加速。（4）淀粉加工用酶 淀粉加工制糖的市场在美国和欧洲基本没有增长，但却是中国过去十年里增长最快的领域之一。特别是中国淀粉糖的生产，包括结晶葡萄糖、口服糖、注射糖、麦芽糖和近两年发展飞快的果糖，大大促进了酶制剂的供应。据估计2010年全球市场约1.4亿美元。未来的增长主要来自亚洲，特别是中国，预计不远的将来中国的果糖生产（2011年，300万吨）会超过美国（1200万吨），就像发生在啤酒生产中的情况一样。另外中国的生化品发酵也需要大量高质量的葡萄糖供应。中国主要的生化品发酵皆居世界前列，味精（200万吨）、柠檬酸（100万吨）、赖氨酸（80万吨），这些生产仍然在稳步增长，会同时带动酶制剂的使用量。另外酶制剂在玉米浸泡和湿磨过程中的应用，在木薯淀粉分离上的应用，也会在很大程度上扩大酶制剂的使用量。（5）生物酒精用酶 在经历了21世纪初，特别是2005—2010年的飞速发展后，美国的燃料酒精生产和中国的生物酒精生产（包括燃料酒精、工业酒精和饮料基酒）使酒精生产用酶量增加了几倍，达到约5亿美元。（6）纺织品和皮革行业用酶 此行业2010年全球约1.3亿美元，但随着纺织品行业的变化和变迁，在过去10年左右，纺织品用酶的市场从欧美转移到中国，但很快就从中国转移到印度、巴基斯坦和孟加拉。同时由于纺织品用酶的特性，使用的酶制剂主要是纤维素类酶，还有少量的淀粉酶和蛋白酶，但比较低端，因此竞争激烈，市场混乱，市场还在缩小。
以上几大行业的情况在图1-3中列出其所占比例。图1-3 2010年全球工业酶市场主要分项及比例（单位：百万美元）
二、按酶种类分的市场规模
如果按酶的种类来分类酶制剂的应用，最大的两类酶是：碳水化合物酶（38%）和蛋白酶（29%），具体见图1-4。碳水化合物酶主要包括 α-淀粉酶和β-淀粉酶，纤维素和半纤维素酶，木聚糖和戊聚糖酶，糖化酶、糖苷转移酶、普鲁兰酶和葡萄糖异构化酶等。这类酶主要用于淀粉加工和生物酒精的生产，2010年的市场大约为21亿美元，且仍然在快速增长，预计到2020年达到40亿美元。
蛋白酶的市场在逐渐萎缩，主要是由于洗涤用品、乳制品和皮革用品市场在缩小或缓慢增长，而酶制剂厂商之间的竞争仍在继续。
1.碳水化合物酶
碳水化合物酶中不同工业用酶所占的比例如图1-5所示。2010年碳水化合物酶的市场销售额为1.66亿美元。图1-4 世界酶制剂市场按产品类别划分比例图1-5 2010年碳水化合物酶应用于各工业的比例
可以看出碳水化合物酶主要是在食品和生物燃料行业上使用。具体食品行业使用碳水化合物酶的情况及发展预测如图1-6所示，生物燃料上使用碳水化合物酶的情况见图1-7。图1-6 食品行业碳水化合物酶市场情况（2010年5.85亿美元）
2.蛋白酶
蛋白酶主要使用在洗涤剂生产上，其次是食品行业。洗涤剂市场使用的主要是碱性蛋白酶，其市场在2010年约是6亿美元。图1-8给出了从2000年至2010年的数字及对2015和2020年的预测，增长还是相当明显的。图1-7 生物燃料上使用碳水化合物酶的情况（2010年4.85亿美元）图1-8 洗涤剂行业使用蛋白酶的情况及预测（2010年6亿美元）
食品上使用的蛋白酶种类比较广泛，酸性、碱性和中性蛋白酶皆有。2010年的市场也有约4.15亿美元。其近来历史和未来发展预测见图1-9。图1-9 食品行业使用蛋白酶的情况及市场预测
3.酶制剂服务的行业
虽然工业酶制剂的行业本身不大，但其涉及和服务的行业可能百倍于其价值。表1-1引用了世界经济合作与发展组织OECD2009年报告中关于未来化学品生产的预测和生物过程所占比例及增长的统计表。表1-1 世界范围内化学品的生产 单位：10亿美元
注：医药品不包含在此统计中（由OECD统计改编，2009）。
虽然这里提到的与生物有关的份额不全是由酶制剂直接催化的，但很多过程都与酶制剂的应用有关。
笔者把现在我国大规模生产的生化品的信息及酶制剂成本与产品的价值进行了比较，列于表1-2中。表1-2 酶制剂成本与所生产产品价值对比
淀粉糖相对容易生产，因此创造的价值相对低，而发酵产品的生产线比较长，因此大多产品的价值与酶制剂的消耗比大于100。发酵产品中乳酸相对价值高，主要原因还是生产厂家相对少，竞争不像味精和赖氨酸那么激烈。如果按照表1-1中2010年的数据，所有化学品的产值14000亿美元，其中约10%与生物有关，假设全部生物过程都使用酶制剂，那么再按100∶1来估算酶制剂，则酶制剂的产值为140亿美元。虽然现在的酶制剂市场还没有这么大，造成估算差距的原因是有些高附加值的产品其价值与使用的酶相比远远大于100，另外也说明酶制剂的发展空间还很大。第三节 工业酶的应用
酶制剂的应用在实际中可分为两大方向，直接应用于产品中和作为加工助剂/催化剂。前者比较简单，主要是替代化学品和增加产品性能，如在洗涤中的加酶洗衣粉、焙烤中的真菌淀粉酶和葡萄糖氧化酶等。后者作为加工助剂/催化剂的情况就较为复杂。工业酶在这些过程中起到很关键的作用，通常带来的益处如：减少单元操作、代替机械能量、增强脱水效果而减少干燥用热能、提高副产物价值、减少化学品的使用和减少污染物的排放，当然最重要的是增加过程的转化效率。由于工业生物技术的不断进步，酶制剂的性价比越来越高，以前一些不可能/不经济的过程由于酶的效率和使用成本的降低而变得经济而有竞争力。下面简单介绍酶催化的发展。
1.生物催化和酶催化
几个重要的（如果不是偶然的）因素加快了近二、三十年酶催化的快速发展，其中包括有机相酶催化的发现、手性药物［美国食品药品管理局（FDA）政策的改变］的需求和生物技术的进步。Klibanov等在1984年的革命性工作大大拓展了酶的应用范围，使得很多研究者，包括化学工程师可以使用商业化的酶制剂，特别是脂肪酶和蛋白酶来进行研究开发；同时酶在有机相中的功能大大改变了科学家设计反应的思路。FDA关于手性药物政策的改变，使得对手性药物的需求提高，一种相对容易的方法就是对现有的混旋药物进行动力学拆分，这也使得酶制剂可很好地发挥作用。期间，分子生物学的进步，特别是定向进化和理性改造等工具的使用，也造就了一些成功的例子，如脂肪酶和蛋白酶等在合成上的应用，在手性化合物的生产和拆分上也有很成功的例子。关于生物催化，不单单是酶催化的综述，国内外在2000年左右有不少很好的综述。2001年，Schmid、Dordick 和DSM、BASF和LONZA的三位专家在Nature上写了一篇综述，介绍了工业催化的现状和未来展望，详细地给出了生物催化成功的具体例子，包括底物和反应类型、涉及的酶制剂类型或菌株、反应的规模和产量。DSM和BASF的例子中产量大体在千吨规模，而LONZA的例子仍处于发展阶段。BASF 的实例主要是光学活性酰胺、醇（脂肪酶）和酸（腈水解酶），基本上是动力学拆分反应。DSM则在氨基酸、（半）青霉素的生产上领先，同时L-氨基丁二酸（天冬氨酸氨裂解酶）和阿斯巴甜（天冬酰苯丙氨酸甲酯）的酶法生产也颇具规模。Ogawa和Shimzu在2002年详细介绍了日本使用酶制剂在大规模生产上的应用，其中包括：酶制剂在氨基酸生产上的应用，包括不同的D-氨基酸、L-脯氨酸和L-多巴（二羟基苯丙氨酸）等；酶在核苷酸生产中的应用；手性化合物的拆分和合成；腈水解酶在大宗化学品生产上的应用；脂肪酸转化酶系统用于聚合不饱和和共轭脂肪酸的生产；环境方面的应用等。Straathof（2002）和Yazbeck等（2004）统计了大约150个商业生产过程使用单独的酶制剂作为催化剂。Woodley则从反应工程的角度讨论了催化剂选择的建议。CODXIS的科学家在合成阿托伐他汀（Lipitor）时通过分子生物学的方法改变了3个酶，使两个中间体的生产成本降低，并减少了硼试剂的使用，减少了85%的溶剂，减少废物60%，并增加了产率和立体选择性。国内的学者在此领域也有不错的建树，并进行了很好的评论和总结。
综合这些文献，工业化过程生物催化的类型大体有以下几种：脂肪酶和蛋白酶对底物的手性拆分和水解，氧化还原酶对酮的不对称还原等；腈水解酶催化的腈水解反应和醇腈酶催化的氰醇合成反应；其他已取得较大进展而且有较高工业化应用价值的反应有转氨基反应、烯酸还原反应、羟基化、单加氧酶催化的拜耳-维立格反应、环氧化物水解、环氧化、卤化反应等。表1-3中列出了一些由酶制剂直接催化生产的产品和规模、使用的酶和酶制剂的供应商。表1-3 由酶制剂直接生产的化学品的重要例子
在几篇关于生物催化综述中，都把杰能科（Genencor）和杜邦合作生产的1，3-PDO（丙二醇）当成酶催化或生物催化的一个好例子，实际上，把这个过程当成代谢工程的重大进展更合适。
有趣的是，工业酶制剂的巨头杰能科（Genencor，现杜邦工业生物科技）和诺维信（Novozymes）在特殊化学品和药品有关的生物酶制剂发展上倒没刻意花很多精力，然而却有不少研究者使用有些商业化的脂肪酶和蛋白酶。近来，关于生物催化的研究仍不少，但关于生物催化的综述相对减少，特别是涉及新的大规模工业化用的酶制剂的例子更少。
近十几年来，由于生物催化技术的发展，相当多新酶的出现，便有一些相当乐观的观点，认为现在市场的酶越来越多，可以像常规的化学试剂一样供使用者挑选。然而，从工程实用的角度来看，还远远没有达到这种理想程度。化学工程师对于酶制剂的应用似乎更乐观和积极，国内外很多生物催化的领先研究者/研究团队都是在化工系统。他们不只是做过程的设计和优化，也很努力地用各种现代生物技术的方法来改变酶的性质使其更利于在工业条件下使用。有机合成化学家的想法和化学工程师有些不同，许建和的文章中提到AstraZeneca的科学家曾说：“我们仍然把有机化学能作为核心，包括路线设计、优化和放大。我们把酶当作是工具箱中的一种重要催化剂。”他们并没有菌种保藏中心，也没有能力对酶进行修饰或是生产。也许有机化学家“可能”更愿意用传统的非对称合成的方法解决问题，因为那可能是他们更熟悉的领域，这样也更具有“挑战性”。
另一点要说明的是，生物催化（biocatalysis or Biotransformation）是指使用商业化酶制剂和全细胞帮助一步或几步反应的过程，生物催化过程中，酶制剂或全细胞不再生长，而生物转化（bioconversion）或生物发酵则不同。在此过程中涉及的酶有两类，一种是酶制剂（商业化的产品），另一种是发酵菌株本身的酶系。外加酶制剂的功能对过程（enzyme-mediated processes）的影响也很大。这些影响包括：产生/增加高质量的可发酵糖（淀粉酶、糖化酶和纤维素酶等）、改善体系的营养供应（蛋白酶）和改善体系的传质并产生更多的发酵糖（非淀粉类多聚糖水解酶水解非淀粉类多糖而降低黏度，且可能产生一定量的可发酵糖）。
2.酶制剂如何解决大宗生化品生产中的问题
下面通过几个产品生产过程的变化来阐述酶制剂给生产和市场带来的变化。（1）酒精生产，浓醪发酵及能源的降低 酒精生产在蒸煮、蒸馏和 DDGS 干燥等单元操作中需要消耗大量的能量。特别是蒸馏，因此加入体系的水越少，蒸馏消耗的能量就会相应减少。但实际中因为物料黏度的问题，以前的发酵浓度都比较低，得到约10%（体积分数）的酒精。过去的十年里，由于生物燃料酒精的发展需求，新的高性能液化酶的出现，能处理36%的干物，快速降低料液的黏度而通过换热器进入发酵罐，最后得到18%（体积分数）的酒精。当然，也需要有新型复合糖化酶来配合，不然在这么高的浓度下，残淀粉会升高。（2）果糖生产，异构酶的效率对市场竞争力的影响 中国的淀粉糖工作者曾经在20年前试着生产果糖，虽然引进了国外的一流设备，但失败了。除了蔗糖价格和其他各种各样的因素外，一个很重要的原因就是异构酶的性能。笔者做了个比较，异构酶的生产率与20年前相比提高了几倍，但价格却随生产水平的提高而下降，结果列于表1-4中。表1-4 异构酶生产率和价格的比较
值得提出的是，当时的酶800元/kg，考虑到当时的消费能力，是相当昂贵的。从这个简单的分析，大家可以看出果糖生产中酶制剂这个因素的变化。虽然淀粉和糖的价格都在上涨，但由于酶制剂等水平的提高，使得现在果糖的发展非常迅速而广泛，国内生产能力已达500万吨，2012年实际生产250万吨左右。（3）葡萄糖酸酶法生产，生产过程简化、产品纯度提高 工业酶法生物催化代替发酵法生产化学品的商业化实例。
葡萄糖酸/盐由于其特殊性质而在食品、医药和建筑等领域广泛应用，我国已成为世界上最大的生产国，年产超过10万吨。传统的葡萄糖酸钙的生产方法很多，但实际中主要采用发酵法。发酵法是以黑曲霉为生产菌种，经菌种逐级扩大培养，发酵代谢的酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，再经碳酸钙中和精制而成。然而发酵法受到菌种质量、扩培、染菌、工艺变化以及气候条件等多种因素的影响，生产波动性大，步骤多，限制了其产量、收率、品质的提高。
由于反应过程相对简单，直接使用商品化的葡萄糖氧化酶来生产葡萄糖酸和盐一直是工业界的梦想。然而由于葡萄糖氧化酶的成本很高，并且由于反应过程产生过氧化氢，因此反应体系中需要脱氢酶来配合分解过氧化氢成为对体系无毒的水和氧气。这更增加了酶制剂应用的成本，因此，很长时间商业化生产成本不过关。酶法转化，从最初的专利申请到工业化生产，期间用了至少20年的时间。从有了商业化的酶制剂到最后实际真正工业化使用，酶制剂的提供者（杰能科）和葡萄糖酸/盐的生产商瑞邦制药共同合作，仍然又花了大约3年时间，才完成了这个技术的商业化。经过不懈的努力，杰能科（现杜邦工业生物科技部）成功地通过基因改造把葡萄糖氧化酶和脱氢酶的成本大大降低。即使工业应用上使用量非常大，近1%（一般的工业酶制剂的添加量为千分之几或万分之几），商业上仍可操作。与发酵法相比，酶法不需要种子培养，免去了微生物和培养基等原辅材料对反应体系的干扰，提高了反应产物的纯度，给提取和精制带来方便。没有了种子培养，反应更加容易控制，生产也变得更加平稳。对生产者而言，酶法工艺简便，设备简单，操作方便，没有染菌的危险，而且产物单一，纯度高，易于分离和精制，产品质量和收率显著提高，产品等级完全达到食品级和注射级标准。这些下游过程的简化大大节省了时间、能源和操作成本，废水废渣也大量减少。此外，对于新建厂，可以省去种子罐和一部分提取设备，降低了设备投资。在过去的几年里，我国主要的葡萄糖酸钙的生产绝大部分已从发酵法转向酶法。除了葡萄糖酸钙，葡萄糖酸锌/酸镁的生产也转成酶法。
3.淀粉质原料与木质纤维素的选择
由于全球经济危机及食品和燃料的争论，使得以谷物或淀粉物为原料的生物酒精生产发展势头受到遏制，预计下面几年的增长有可能在个位数。实际上，对于生化品的生产，未来相当长的时间，可能是10～20年内，淀粉质原料仍然会是主要的原料来源。一个原因是玉米的产量，无论是单产量还是总产量，不论是美国［图1-10（1）］，还是中国［图1-10（2）］，都在增加，即使不考虑转基因，其他的改良技术也会不断地提高单产；另一个原因是现在的纤维素原料预处理技术和糖化/发酵技术还需要进一步地提高，才能更加经济。图1-10 美国和中国玉米单产量历史记录数据
∗ 布舍儿，美国常用来量立米体积的单位，1 布舍儿＝35.2L。
在后面的一些章节里会讨论纤维素酶的发展和有关纤维素原料的利用。对于酒精的生产，情况相对简单些，如果纤维素原料经过预处理然后糖化用于糖的生产，无论这种糖是用于进一步加工还是用于发酵，其纯化过程可能比现在淀粉质原料生产的糖困难得多。对于发酵过程，困难的克服可能要从发酵菌的抗毒性、利用C5～C6糖和边糖化边发酵（SSF）过程的改进等几方面来进行。
随着杜邦和POET分别开始建造商业化的纤维素酒精厂（两个厂能力都在年10万吨左右），燃料酒精或从纤维素类原料生产化学品用酶制剂的市场可能成几十或百倍地增加。笔者做了个预测，如图1-11所示。图1-11 生物酒精用酶制剂情况及预测
对于生物质纤维类原料生产任何产品，如果采取预处理然后酶制剂水解或SSF过程，酶制剂的消耗量非常大，甚至从某种程度上来讲，在这些过程里，酶制剂已不像传统的生物催化剂，而更像反应的原料之一，因为添加量要达到百分之几，是淀粉类原料过程的上百倍。因此商业操作模式一定会与传统的酶制剂供应有很大的区别。到底情况会怎样，我们拭目以待。
4.应用与技术服务在商业化过程中的作用
大部分工业酶制剂的研发与生产（除国内一些糖化酶和纤维素酶的生产厂）是在高科技范畴，而其服务的行业却大多数是大宗产品（commodities）的加工生产商，如淀粉糖、生物燃料、生化品发酵和食品加工等。酶制剂生产商在这些供应商中如果不是唯一的高科技供应商（有些设备和工程公司也是高科技企业），也一定是最特别的供应商。因为酶制剂是消耗品，因此酶制剂供应商的销售人员和技术服务人员要不时地、不停地面对顾客。不论在国外，还是在国内的大客户，酶制剂的主要供应商如杜邦生物科技（原杰能科）和诺维信的角色远远超过普通供应商的角色，给客户提供不计其数的培训。培训的内容从简单的如什么是酶、酶制剂应用注意事项，到结合顾客具体如何优化酶的使用，更进一步还有与顾客一同进行发展项目来提高生产率、降低成本，还有共同开发新产品等。
酶制剂整个商业化过程用简单的流程示意图（图1-12）表示。之所以把应用（Applied Innovation）放在最先，而且在整个过程以其结束，是因为应用连接研发和市场（顾客、工业的需求），而且应用不只是在推向市场的过程中重要，即使在最初的酶的发现和改造过程中及后续的稳定生产中也非常重要，因此用两个大箭头表述Applied Innovation贯穿整个工业酶制剂的各个过程中。爱因斯坦说：“To raise new questions，new possibilities–to regard old problems from a new angle-requires creative innovation and mark real advances.”在酶制剂应用中，这些人是行业真正的专家，他们通常是在公司不同的业务部中，而不是像研发的科学家们是公司共享的资源。为了了解顾客和市场的需求，更好地应用和发展酶制剂，通常需要酶制剂以外的知识和功夫，特别是工厂的实践和工程方面的修养，因此相当多的应用研究人员是化学工程或生化工程教育出身。
毫不夸张地说，酶制剂供应商的应用和技术服务工程师，很多都可以担任顾客工厂的工程师，因为他们非常了解顾客的生产过程和应用，或者其中有些人在受雇于酶制剂公司前就在那个行业的工厂工作。
酶制剂的应用，笔者认为主要有以下几个作用：①定义工业中的问题，把顾客的需求反映给市场和研发部；②把研发得到的新的酶分子根据实际应用条件试验核证；③把新产品应用到具体的顾客环境中；④发掘产品（在同一领域/不同领域）的新用途。图1-12 酶制剂商业化的流程示意图
虽然在分子水平上的各种技术进步很快，但离实际的工业应用还是有相当的距离。应用环节在最初酶的开发和最后实际应用过程中，都起着十分关键的作用。应用研究或试验与基础研究的一个重要区别就是试验样品量大和试验周期较长。
关于图1-12中提到的酶的性质的提高、酶的发现和生产等问题，将放在第二章讨论。
2010年我国工业酶制剂年需求量为40亿元人民币，相关行业需求量见表1-5。表1-5 2010年各相关行业对酶制剂的需求量
注：其他主要指味精、氨基酸、有机酸、抗生素等发酵工业和其他领域用酶。
进入新世纪，我国酶制剂市场空前活跃。1980—2010年不同时期我国市场对酶制剂的需求量见表1-6。表1-6 不同时期我国市场对酶制剂的需求量
5.“十二五”我国市场对酶制剂需求的增长点
现在，我国进入“十二五”发展时期。市场对酶制剂的需求量有如下增长点。（1）食品工业 现代人们重视食品的安全性，酶作为食品工业加工助剂有如下特性：来源于微生物或植物、动物的酶是一种蛋白质，无毒无害；酶具有催化化学反应的功能，反应专一，不生成副产物；采用酶法工艺取代化学法工艺，可以替代那些对人体有害的化学物质；酶的反应条件温和，对营养物质破坏低，可以保证食品营养。因此，酶在食品工业的应用发展迅速。被列入国家标准GB2760—2011的食品用酶制剂及其来源名单已达到52种。目前食品工业的谷物食品加工、淀粉糖生产、蛋白质加工、氨基酸和有机酸生产、各种酒类生产、油脂加工、功能食品、果汁生产、肉类加工、乳制品生产等几乎所有的领域均已涉及酶制剂的应用。酶制剂在食品工业的应用将持续增长。（2）造纸工业 造纸工业是我国重要的支柱产业之一。人们常以纸产品的消费水平作为衡量一个国家经济发展和文化水平的标志。但是，造纸又是能源、资源消耗高，用水量大，污染严重的行业，造纸废水主要污染物COD排放量占全国工业废水总排放量达35%。
目前已用于造纸工业的酶制剂有：①α-淀粉酶，用于生产变性淀粉，作为纸张的表面施胶，改善纸张的印刷性能和强度特性。②木聚糖酶，用于纸浆生产漂白工序中的辅助漂白，降低漂白剂（液氯）的使用量，减少漂白废液污染，降低生产成本。③脂肪酶，用于木浆生产中解决天然树脂沉积物使纸机需要频繁停机进行清洗的问题，并提高纸浆白度；脂肪酶与半纤维素酶复配，还用于废纸再生脱墨。
我国2010年纸浆总产量5300万吨，其中禾本科纸浆1297万吨，占25%。酶法生产禾本科植物纸浆，可实现减少烧碱等化工原料用量，减少废液中COD总量，减少废弃物白泥的产生，为造纸行业清洁生产创造条件。（3）纤维素燃料乙醇 将玉米秸秆、稻草、麦草、甘蔗渣、木屑等纤维素采用酶法转化成糖并进一步发酵成为燃料乙醇，可替代车用汽油10%～15%，起到缓解不可再生的石油资源的紧张供应状况。玉米秸秆等纤维素原料，是地球上数量最多的可再生资源。
20世纪90年代，美国能源部提供资金组织世界上一些著名的跨国公司进行开发纤维素原料生产燃料乙醇的研究，内容包括纤维素预处理方法，发酵葡萄糖和五碳糖的酵母研究，高活力低成本的纤维素酶研究。21世纪初，国内有多家企业和大学、研究所在政府的支持下进行研究。
我国是石油消费大国，重视发展可再生能源。我国纤维素燃料乙醇发展还处于起步阶段，面临许多问题。应做好有利于发展纤维素燃料乙醇的投资、价格和税收政策，充分发挥大型能源企业的带头作用，广泛吸收民营企业参与，形成较完整的生产、配套和销售体系，推动纤维素燃料乙醇的发展。
我国市场在“十二五”期间对酶制剂的需求每年以10%增长，到2015年预计市场对酶制剂的需求量将达到65亿元人民币。
参考文献1.段钢.工业酶的现状和未来发展.生物产业技术，2012（4）：66～73.2.Freedonia World Enzyme Report，2011.3.段钢.酶制剂对生物化学品工业生产过程的影响.生物产业技术，2013（1）：69～75.4.段钢.新型工业酶制剂的进步对生物化学品工业生产过程的影响.生物工程学报，2009，12：1808～1818.5.Organization for Economic Co-operation and Development（OECD）.The bioeconomy to 2030：designing a policy agenda.paris：OECD publishing，2009.6.段钢.酶和生物技术在生物燃料生产中的应用.生物产业技术，2012（5）：60～70.7.OECD.The Bioeconomy to 2030.OECD，paris，20098.USDA.US Biobased products：Market potentials and projections through 2025.http：//www.usda.gov/oce/reports/energy/BiobasedReport2008.pdf.9.Klibanov A M，Zak S A.Enzymatic catalysis in organic media.Science，1984，244：1249～1251.10.Klibanov A M.Improving enzymes by using them in organic solvents.Nature，2001，409：241～246.11.段钢，陈家镛.光学活性物质的工业生产方法.化工进展，1995（3）：32～36.12.许建和，杨立荣，孙志浩，徐岩.迅速发展中的不对称生物催化技术.生物加工过程，2005，3：1～6.13.Bommarius A S，Riebel B R.Biocatalysis.Weinhem：Wiley-VCH，2004.14.Schmid A，Dordick J S，Hauer B，Kiener A，Wubbolts M，and Witholt B.Industrial biocatalysis today and tomorrow.Nature，2001，409：258～268.15.Ogawa J，Shimizu S.Industrial microbial enzymes：their discovery by screening and use in large-scale production of useful chemicals in Japan.Current Opinion in Biotechnology，2002，13：367～375.16.Straathof A J J，panke S，and Schmid A.The production of fine chemicals by biotransformations.Curr.Opin Biotechnol，2002，13：548～556.17.Yazbeck D R，Martinez C A，Hu S，and Tao J.Challenges in the development of an efficient en-zymatic process in the pharmaceutical industry.Tet Asym，2004，15：2757～2763.18.Woodley J M.Microbial Biocatalytic processes and Their Development.Adv Appl Micorbiol，2006，60：1～14.19.Ma S K，et al.A green-by-design biocatalytic process for atorvastain intermediate.Green Chem，2010，12：81～86.20.许建和，谢谚，赵丽丽，刘旭勤.工业生物催化前线动态及名家观点.生物加工过程，2007，5：1～7.21.林章凛，曹竹安，邢新会，刘铮.工业生物催化技术.生物加工过程，2003，1：12～16.22.段钢，陈家镛.微环境对有机相中酶催化过程的影响.化学通报，1996（2）：23～26.23.欧阳立明，许建和.生物催化与生物转化研究进展.生物加工过程，2008，6：1～8.24.李祖义，陈颖.生物催化技术在化学工业中的应用.精细与专用化学品，2003（13）：3～5.25.Sanchez S，Demain A L.Enzymes and bioconversion of Industrial，pharmaceutical，and Biotech-nological Significance.Organic process Research ＆ Development，2011，15：224～230.26.Nestl B M，Nebel B A，Hauer B.Recent progress in industrial biocatalysis.Current Opinion Chem Biology，2011，15：187～193.27.Ritter S K.Growth of commercial enzyme-mediated processes points to the future of chemical industry.Chem Eng News，2006，84：69～71.28.周红伟，姜锡瑞，段钢.酶法生产葡萄糖酸钙的新工艺.食品与发酵工业，2007，33：99～101.29.周红伟，耳延龄，姜锡瑞，刘飞，钱莹，李燕萍，段钢.一步酶法直接生产葡萄糖酸锌.食品与发酵工业，2009，35：77～80.30.段钢.工业酶的现状和未来发展生物产业技术.生物产业技术，2012（4）：66～73.31.ZL03805100，从碳底物生产终产物的方法，杰能科，2009.32.段钢.果糖工厂设计和生产中的问题.食品与发酵工业，2011，37：166～168.33.陈坚，刘龙，堵国成.中国酶制剂产业的现状与未来展望.食品与生物技术学报，2013，31：1～7.34.曲音波等.木质纤维素降解酶与生物炼制.北京：化学工业出版社，2011.第二章工业酶的发现、发展和生产第一节 酶性质的改造
一、概述
随着世界面临的挑战越来越大，对生物科技的发展要求越来越高，希望有更多更好的新型酶制剂出现。酶性质的改变，从应用的角度不外乎是活性、专一性和稳定性的改变，表现在反应条件上是更温和、适应条件更广泛和更容易使用；表现在产品中是纯度提高、副产物减少、生产成本降低和对环境造成的影响减少等。酶性能的变化对反应条件和产品的影响如图2-1所示。图2-1 酶性能的变化对反应条件和产品的影响
本章从酶的发现开始，利用自然的生物多样性，包括从自然的传统分离筛选到新的应用反向基因学的分子筛选，到对不可培养微生物使用的环境基因的筛选和基因组筛选；然后讨论酶的改造和发展，其中包括使用直接进化方法来人工快速创造生物多样性或者采用基于对蛋白质结构了解而进行的理性设计等方式结合生物信息学的进步和大通量筛选而得到高性能酶分子的方法。最后讨论酶制剂生产的一些策略和方法。
二、酶的发现（酶的筛选，利用自然界的生物多样性）
1.传统的自然分离筛分
尽管生物技术发展较快，但利用自然界长久积累的生物多样性仍然是寻找特殊酶的非常重要的手段，而且是其他发展方法不能简单代替的。在火山、温泉、深海、高浓度盐湖和极地等地方分离到具有独特性质的极端酶，可在高pH、低pH或高温下仍起催化作用。从自然界的极端嗜热菌分离纯化的酶的基因，直接或在此基础上进行进一步改造，然后在其他生产菌系统中表达而进行工业化生产。实际成功的例子包括洗涤剂使用的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等。
2.分子筛选
如果已经确定某一物种产生某种酶，就可从相关的物种中寻找同源酶。这个过程要应用反向基因学。酶是氨基酸以一定序列结合的聚合物，而这个序列可以用N-端序列分析来得到。因为基因码是通用的，因此可以从一定基因码中核苷酸碱基的顺序来推断某种酶。用这些信息可以作为探针构建15～20个核苷酸（引物对）。通过应用引物对相关有机体中的染色体DNA进行PCR处理，同源基因就被放大和转移到宿主中，从而表达了同源体酶，打开了进化中隐藏的基因。这种方法可以得到具有功能性相同但氨基酸序列大大不同的酶。因此在实际应用中，这些酶的性质如温度、pH的稳定性可能很不同。通过这种方法可以完成相关的全部物种的筛选。这种方法的缺点是只能和已经存在的数据进行比较。但实际上，自然中只有少于1%的微生物被分离出来，被表征和描述的更是少之又少。
3.环境基因组筛选技术
由于从环境中得到的微生物只有低于25%的可以在实验室培养，此法利用环境基因组技术可从环境样品中提取DNA，直接回收16S rDNA序列，根据其序列来分析样品中是否包含新的细菌，也包括古细菌。对于真菌，则测定18S rDNA序列。这对于那些（实验室）不可培养微生物中的酶种发现有着重要意义。
4.基因组筛选技术
宏基因组技术的发展极大地扩展了微生物资源的利用空间，提高了获得新酶或新基因的效率。一些特殊或极端环境宏基因组文库已经构建，大部分文库为公共资源，对许多公用数据库如Gene Bank和 Swissport等进行搜索，是获取基因序列、基因功能和各类酶的结构和功能信息的最重要手段之一。文库的构建结合特定的筛选方法可以高效批量地获得新编码基因。
关于各种筛选方法的详细介绍和综述可参照相关文献。
三、酶性质的改造（人工创造多样性）
虽然人们从自然界已经成功地筛选得到很多各种各样的酶，但这些酶还是很有限制性，这些酶还是不能满足工业上要求的一些极端操作条件，如更高的热稳定性、pH和其他化学品的耐受性等。进一步提高酶的性能的方法主要分成两个方向，直接进化和理性设计，创造出（更确切地说是制造出，因为有可能在自然界已经存在，只是我们不知道）更多的、我们可以把握的多样性。
在讨论对自然界的酶进行进一步改造之前，首先让我们来看一下酶分子的组成。酶是20种氨基酸组成的线性分子，一般的酶分子由300个以上氨基酸组成，因此组合的可能性是无限的。氨基酸链形成不同的空间构型如螺旋和折叠等，如图2-2所示。不同的氨基酸和氨基酸残基都会对结构和功能有不同程度的影响。图2-2 酶分子结构和空间构型示意图
下面介绍酶分子性能改造的两种方法，直接进化和理性设计。
1.直接进化
自从20世纪90年代初，美国科学家Arnold 发明了在试管内对目的酶基因进行随机突变的快速改造的方法。在接下来的20年间，定向进化技术在基因突变文库的建立和突变体筛选方法方面均获得了很大的发展。在实验室中模拟自然选择过程来进化人工环境中的酶，使其在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短到几年、几个月甚至更短，加速了选择所需性能的酶的进化过程。这种方法通常不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，理论上适用于任何蛋白质分子。该法是迄今为止最为有效的改造和获得新酶的方法。具体做法：通过从随机突变产生的大量突变体中筛选出理想的突变体。
基因突变文库容量大小及突变质量等是蛋白质定向进化的基础，高效筛选方法的确立，如高灵敏度、低筛选成本、相对较少工作量等是定向进化成功与否的关键。
2.理性设计（蛋白质工程）
理性设计需要对酶蛋白分子的三维空间结构和催化机理有非常充分的了解，通过改变个别氨基酸而对酶的结构进行精确的调控，从而获得具有所需催化活性的新酶。与“定向进化”相比，理性设计目的性更强，更为高效和快捷。
理性设计的方法真正始于20世纪80年代，杰能科科学家Estell等1985年在生物化学杂志（J.Biol.Chem.）上发表了文章Engineering an enzyme by site-directed mutagenesis to be resistant to chemical oxidation。该文章被业界公认为蛋白质工程用于酶制剂改造的真正开始。文章在以前蛋白质结构研究的基础上启示关键氨基酸残基蛋氨酸222对于枯草杆菌蛋白酶的氧化失活有主要作用，作者采用通过定点突变的方法，用其他19种氨基酸代替蛋氨酸，来改变关键的氨基酸残基从而达到抗氧化的作用。特别是用丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸代替蛋氨酸的情况下，枯草杆菌蛋白酶可耐1 mol/L双氧水而不失活。典型的成功例子还有：耐高温的、低pH的α-淀粉酶。α-淀粉酶的改造以提高其热稳定性和低pH稳定性的努力最引人注目。过去二十多年间，杰能科、诺维信不断推出性能优越的酶制剂，如SPEZYME FRED、Termamyl SUPRA（混合）、GC 358等。
理性设计最受关注的进步是α-淀粉酶的定点改造。第一个成功的例子是1998年杰能科推出的SPEZYME FRED。利用蛋白质工程、位点定向诱变及核苷酸变更，杰能科对地衣芽孢杆菌产淀粉酶（Bacillus licheniformis alpha-amylase，BLA）的研究发现代替N188 S可提高该菌产的α-淀粉酶的热稳定性。同时蛋氨酸和苏氨酸残基的删除或代替，M15、W138或M197也对热稳定性有很大帮助。
图2-3中是用Molscript和Raster3 D模拟的BLA的分子构象。可以带来稳定的突变位置以箭头示意出（M15，H133，H156，A181，N190，A209，M197，Q264）。R124和删除的两个氨基酸以箭头示意。图2-3 地衣芽孢杆菌α-淀粉酶构象及稳定突变点示意
杰能科（丹尼斯克，现杜邦工业生物科技）对AmyS 嗜热芽孢杆菌进行了如下改造：在242位置相对应的氨基酸位置进行替换，包含以下一项或多项变化：①一个或多个在如下位置的替换：349位置的半胱氨酸，428位置的半胱氨酸，97位置的谷氨酸，精氨酸，319位置的谷氨酸、精氨酸，358位置的谷氨酸、精氨酸，443位置的谷氨酸或精氨酸；②在与97，318，349，358，428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处的其他序列修饰；③在 F178、R179、G180、I181、G182 或K183位置或其成对位置处的一个或多个氨基酸的缺失；④在178、179、180、181、182或183氨基酸位置的一个或多个氨基酸的其他修饰；⑤N193 F或V416 G或这两者的替换；⑥在193、416或这两个位置处的其他修饰；⑦用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替代在经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基；⑧用另一种天然存在的氨基酸残基替换经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基；⑨用丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替代亲本AmyS样α-淀粉酶中存在的一个或多个半胱氨酸残基；⑩用另一种天然存在的氨基酸残基替换经修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个半胱氨酸残基。其他改变细节请参考USP7541026，Alpha-amylase variants with altered properties。
使用差示扫描量热法比较几种变体和野生型酶在添加和不添加钙时的耐热性。在不另添加氯化钙的情况下，野生淀粉酶的热熔点为100.8℃，而变体S242A、S242E和S242Q的T分别为106.5℃、m107.8℃和110.1℃，比野生淀粉酶最高提高9.3℃。在2 mmol/L 氯化钙存在的情况下，野生淀粉酶的热熔点为106.8℃，而变体S242A、S242E和S242Q的T分别为111.8℃、112.2℃和113.8℃，比野生淀m粉酶最高提高7℃。两种的区别也表明钙的存在对该淀粉酶的影响相对小（表2-1）。表2-1 野生淀粉酶SPEZYME Xtra和变体热稳定性比较
商业化非常成功的酶是GC358。GC358 的优越性为其降黏度性质，当提及降黏度时，提及两个参数，除了最终黏度外，峰值黏度也是个非常重要的参数，峰值黏度过高，反应罐中的搅拌或喷射液化在处理高浓度物料时会造成较严重的后果，反应器或喷射停止（图2-4）。
事实上，实际应用中两种方法在新酶的发展过程中通常是互补的。酶的理性设计只有对酶分子催化机理的理解和空间结构的整体把握后才可以进行，因此虽然定向进化这样的非理性设计方法操作相对繁琐且目的性不强，但依然是获得新酶的主要方法。对直接进化结果中有益突变进行分析有利于加深对酶分子催化机理的理解，为进一步理性设计提供了条件，丰富了新酶设计的思路。相信未来理性设计方法与非理性设计方法继续相互融合与发展，会更快地得到更好的酶分子。图2-4 GC358 与其他商业化酒精用S 型液化酶比较（峰值黏度和最终黏度）
越来越多新酶的发展，要依靠直接进化和理性设计两种方式的结合，如图2-5所示。图中的箭头所示的这些改造通常要反复进行几轮，才有可能得到希望的性质。
酶的理性设计方法主要分为两种：基于实验结果的设计和计算机辅助设计。前者主要针对活性中心进行人为改造；近来随着计算机技术和生物信息学的发展，计算机辅助设计已经成为酶的理性设计的主要发展方向，尤其近期在酶的从头设计（de novo design）方面取得了一系列有趣的进展，但大规模、具有普遍意义的应用还有很多困难。
关于这方面的介绍，国内外有不少很好的综述可参考，曲音波对于纤维素酶的发现和改造也有很详细的讨论，在这里不再赘述。
在改造酶的过程中，一定要与实际的过程相结合，Woodley最近提出了要把蛋白质工程和过程工程结合的思路，如图2-6所示。
实际中，到底采取什么样的策略，时间和经济性是决定因素。举例，如一个酶分子由200个氨基酸组成，如果随机改变两个点，其可能性就是7183900；如果改变3个点则实验的数字增加到9008610600。
21世纪第一个10年，酶蛋白的点突变数目通常在1～5个；2010年以后，这个数字可能增加到30～40个。如LIPTOR曾经对含254个氨基酸的酶中的35个氨基酸进行了改造。依现在最好的情况，DNA 合成的成本，每对碱基0.35 美元，大约1000 核苷酸基因300 美元。要大规模操作仍然很昂贵。因此，在完全不知道结构的情况下，用直接进化来产生多样性，不但过程本身昂贵，后续的大通量筛选工作也非常耗时耗财。折中的办法是做一些努力在一定程度上了解酶的结构或表面结构，这样下面的工作就相对有针对性了。当然要在某种程度上弄清酶的结构，也同样要花费精力和财力。因此项目的紧迫性和预算都会影响具体采取的策略。图2-5 理性改造和直接进化在酶性质改造上的结合图2-6 获得有效的与过程有关的催化剂的方法
20世纪90年代后，工业酶的发现和发展随着生物科技和计算机技术的发展和成熟，开发周期越来越短。90年代时，随着分子生物学、生物信息学和大通量筛选的进一步发展，一个新酶从研究到商业化，需要5～10年时间；进入21世纪后，这个过程缩短到2年左右；现在这个过程只需要几个月或几个星期。不论怎样，充分利用自然的多样性进行直接改造，要有更有效的筛选方法，结构与定点改造的结合应该是未来发展的有效方法。
四、大通量筛选的优缺点
不论是采用理性设计还是直接进化，大通量筛选都是最后确定高性能酶分子的检测方法。虽然随着计算机技术、生物信息学和电子器械的发展，应用机械手每天可以处理成百上千甚至几十万上百万的样品分析，这极大加快了酶的筛选过程。然而大通量筛选中的潜在问题
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