作者：潘晓东 主编
出版社：化学工业出版社
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实用神经变性疾病生物学实验方法与技术试读：
实验前该准备哪些试剂？怎么配制实验试剂？实验前该准备哪些仪器？怎么培养海马神经元？怎么观察神经元的形态学？怎么鉴定神经元？怎么培养小鼠中脑多巴胺能神经元？怎么培养神经干细胞？怎么培养原代神经胶质细胞？怎么测定小胶质细胞趋化、迁移、吞噬功能？怎么测试实验动物的学习和记忆？怎么检测基因芯片？怎么做神经免疫组织化学和免疫荧光染色？怎么应用Image J 神经生物分析软件、GraphPad Prism 6.0软件、SPSS软件？……本书图文结合予一一介绍。实验流程严格按照美国国立卫生研究院（NIH）、国立老化研究所（NIA）的标准、规范执行。内容实用，具有可操作性。
本书适合从事神经病学研究的人员，如神经内科、神经外科医师、研究生、医学院校基础研究人员，特别适合初学者阅读参考。书名：实用神经变性疾病生物学实验方法与技术作者：潘晓东主编CIP号：第158890号ISBN：978-7-122-27601-8责任编辑：戴小玲 杨燕玲 邱飞婵出版发行：化学工业出版社（北京市东城区青年湖南街13号 100011）购书咨询：010-64518888售后服务：010-64518899网址：http://www.cip.com.cn版权所有 违者必究编写人员名单
主 编 潘晓东
副 主 编 张 静 戴晓曼
编写人员
王燕萍 李子婧 张 静 宋 悦 叶 冰 余尔涵
何饶丽 郑建明 陈枝挺 肖乃安 曾育琦 吴锡林
蔡国恩 詹周伟 林丽珍 潘晓东 魏 振 戴晓曼
张 康 楚 楚 辛佳蔚 林宝平 洪朝翔 周 梦
学术秘书 宋 悦 何饶丽
主 审 陈晓春前言
神经变性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类由于脑和（或）脊髓神经元结构和功能渐进性退变、缺失所导致的神经系统疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等。随着全球社会人口老龄化进程加速，神经变性疾病患病人数逐年上升，已不再是少见病。神经变性疾病的早期诊断与识别困难，目前尚无有效的根治手段，加强其病因和发病机制研究成为国际神经科学领域的热点。除了年龄老化外，遗传和环境因素也是本类疾病的主要致病因素。神经变性疾病以运动功能和认知功能障碍为主要临床表现，组织病理学显示特定部位神经元缓慢渐进性丢失，并大多在神经细胞内出现蛋白质异常聚集、形成包涵体。此类疾病可能具有相似的发病机制，包括：蛋白的错误折叠；细胞器中蛋白降解紊乱，线粒体功能障碍，轴突转运异常；细胞程序性死亡（凋亡、自噬）；线粒体DNA突变和氧化应激等。
2013年我得到医院公派出国留学的机会，有幸来到世界著名的美国国立卫生研究院（NIH）、美国国家衰老研究所（NIA）进修学习。这里有二十几个研究机构，汇集了全世界的科学精英从事医学科学研究。之前我虽是个神经内科大夫，但始终无法忘却在攻读硕士、博士研究生期间从事神经科学实验过程所经历的痛楚和乐趣。原以为自己掌握了许多神经生物学的基本实验技能，但来到NIH之后才知道国内与这边的差距。NIH的神经科学家们做实验的规范程度和完成实验的效率让我惊叹不已！我认为这些很大一部分归功于规范的实验操作流程和有序的分工协作。有感而发，心中萌动编写一部规范、实用的神经变性疾病相关的实验技术操作和方法的手册。于是乎，尽我所能，尽力在NIH把标准规范的实验流程一一学到，每项亲自操作，并由此将所学实验经历和经验融汇记载于书中，一来作为督促自己学习的动力，二来将其中的经验与其他学者分享。但更为重要的是，本书的编写旨在帮助国内从事或感兴趣神经生物学领域的研究人员（尤其是初学者）在实验操作方面尽可能少走些弯路，提高一些实验效率，多一点时间去观察和发现真实的、新的实验现象，多一些时间去思考实验设计、训练自己的科研思维，并碰撞出更多、更富有创新意义的思想火花。
同时，本书编写包含了神经变性疾病临床数据登记体例和数据库建设要点，并介绍了本单位团队自主研发的神经心理认知测试系统及其应用，以及我们在临床和基础科研过程中十分常用的图像和数据处理软件，如Image J、GraphPad Prism、SPSS的应用范式、Endnote文献编辑等。相信，无论是从事神经病学的临床还是基础科研人员都能从本书中获得许多十分有用的帮助。
本书的编写过程得到福建医科大学附属协和医院陈晓春教授、黄品华教授提出的宝贵意见。同时由衷感谢美国国立卫生研究院（NIH）、美国国立老化研究院（NIA）蔡怀彬高级研究员及其所在实验室成员在我在NIH学习期间对我实验技术的悉心传授，以及感谢他们在编写本书过程中提供的宝贵意见。
本书由国家自然科学基金（项目号：81200991及81571257）、福建省高校新世纪优秀人才支持计划（项目号：JA13131）、福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目资助计划重点项目(项目号：2014-ZQN-ZD-11)、福建省自然科学基金（面上联合）（项目号：2015J01398）以及国家临床重点专科老年病科建设项目、福建省临床重点专科老年医学科建设项目联合资助出版。潘晓东福建医科大学附属协和医院神经内科福建省老年医学研究所福建省分子神经病学重点实验室2016年6月22日 于福州第一章 原代神经细胞培养和细胞功能测定第一节 原代皮质和海马神经元培养
皮质和海马神经元是最常用于神经功能检测的神经细胞类型。分离后的神经元可以用于细胞毒性试验、观察细胞存活、突触形态学、细胞转染等离体实验，也适用于神经电生理、药理学的研究。海马因受解剖结构的影响，取材小、因此获得率较低。通常情况下皮质和海马的原代神经元在形态学上不会有太明显的区别。本节介绍应用新生（24h以内）或孕17～19天的胎鼠，采用急性分离、木瓜蛋白酶消化的方法培养皮质和海马神经元，并结合免疫细胞化学或免疫荧光的方法鉴定所培养的神经元的纯度。
1.实验对象
胎鼠［孕（18±1）天］、新生鼠（出生24h内）。
2.实验材料（1）器械：无菌培养瓶、培养皿、离心管、吸头（tip）、手术器械一套（眼科剪、眼科镊、显微镊等）。（2）试剂：Neurobasal-A 培养基（购自Gibco，货号10888-022）、L-谷氨酰胺（L-Glutamine，购自Gibco，货号25030）、B27无血清添加剂（B27 serum-free supplements，购自Gibco，货号17504-1044）、多聚赖氨酸（Poly-D-lysine，购自SIGMA，货号P-1274）、青霉素/链霉素溶液100×（Penicillin/Streptomycin Solution，购自Hyclone，货号SU30010）、木瓜蛋白酶（Papain，购自Worthington），乙二胺四乙酸（EDTA，100mmol/L，pH 7.2）、溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液（溶木盐，pH 7.2）［137mmol/L氯化钠+5.3mmol/L氯化钾+1mmol/L氯化镁+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液+3mmol/L氯化钙］。（3）试剂配剂
① 培养基（50ml）：Neurobasal-A培养基（49ml）加入B27无血清添加剂（1ml）、青霉素/链霉素溶液（100×，0.25ml）、L-谷氨酰胺（0.5ml）。
② 木瓜蛋白酶溶液：以一只小鼠为例，配制1.5ml溶木盐+25ml 木瓜蛋白酶+30ml 乙二胺四乙酸（EDTA）+少量的DNAase和左旋半胱氨酸，无菌过滤后，于4℃冰箱中备用。
3.操作步骤（1）包被：培养前晚上用多聚赖氨酸（25μg/ml）铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱至少1h或过夜，用超纯水清洗培养瓶或培养板3遍，置培养箱中待其干燥。（2）取脑：75%乙醇（酒精）全身消毒胎鼠或新生鼠，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用眼科镊拉开，小心取出全脑，放于盛有冰冷溶木盐的平皿中。（3）分离海马、皮质：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮质，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，分离皮质，显微镜下用眼科剪、显微镊分离脑膜、血管膜。（4）消化和分散：将皮质或海马组织置于装有木瓜蛋白酶溶液的离心管中，37℃培养箱消化20min，每10min晃动1次。吸弃消化液，用完全培养基洗3遍，再加入3～4ml 完全培养基吹打10～15次，静置1min后，用吸头吸取上清液至另一干净的离心管中，再加3～4ml完全培养基吹打、沉淀10～15次，依次吹打，直至沉淀完全分散成单细胞悬液。（5）计数和接种：混匀所有吹打后的上清液，取少量细胞悬液52以台酚蓝染液观察存活率并计数。按1×10/cm的密度将细胞种入预先包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中，置培养箱培养（37℃，5%二氧化碳，饱和湿度）。24h以后换液，之后每3～4天换液一次。（6）神经元的形态学观察：分散培养的神经元，在接种1h后即可贴壁，细胞呈单个圆形或椭圆形。2～3天后细胞明显增大，突起长出并延伸。6～7天时神经元在相差显微镜下可见具有明显的光晕。此时神经元呈三角形或多边形，边界清晰，胞体明亮，胞核和核仁清晰可见。在培养过程中神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。随着培养时间的延长，神经元逐渐退化变性，表现为神经元胞体光晕消失，胞体皱缩，突起萎缩，有的出现空泡，直至脱落，造成神经元的数量逐渐减少。（7）神经元的鉴定：细胞经4%多聚甲醛固定后，β-微管蛋白3（β-Ⅲ-tublin）免疫细胞化学染色，胞浆和轴突着色，4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染核可以鉴定。图1-1为典型的神经元染色。图1-1 免疫细胞化学染色鉴定原代培养神经元的形态和纯度为C57BL/6小鼠海马来源的原代神经元（DIV10），β-Ⅲ-tublin阳性（绿色）为典型的神经元染色（张 静）
第二节 新生小鼠中脑多巴胺能神经元培养
中脑或腹侧被盖区多巴胺能神经元的培养用于研究多巴胺能神经元的发育和功能，也用于研究不同的多巴胺能的调节机制。本节主要介绍在单层星形胶质细胞表面培养新生鼠多巴胺能神经元的方法。星形胶质细胞的存在能够为多巴胺能神经元的生长提供与在体类似的环境，对于多巴胺能神经元各种特性的产生很关键。本节介绍两种新生鼠中脑多巴胺能神经元的培养方法。一种是基本方法，包括三个关键步骤：①包被玻片；②原代单层星形胶质细胞的培养；③原代中脑多巴胺能神经元的培养。这种方法建立起多巴胺能神经元与中脑内的其他类型神经元相互联系的神经元网络。该方法适用于多巴胺能神经元功能与机制的生理、药理、生化和分子等层面的研究。另外一种方法是准备一个微细胞培养环境，这种方法适用于研究单个或几个多巴胺能神经元，它们之间形成突触联系，研究人员可以分析各种突触结构与物质运输机制。一、单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元
选取出生后0～3天的小鼠进行星形胶质细胞的培养，将小鼠麻醉后剥离头皮和背侧颅骨，获得脑组织，分离获得前脑。酶消化、机械分离组织、悬浮细胞，涂片之后在培养皿中孵育24h。然后用预冷的液体振摇，去除其余类型的神经元和小胶质细胞。细胞之间一旦接触生长，则收集星形胶质细胞，接种在事先用胶原-多聚赖氨酸包被的玻片上，并等待星形胶质细胞在玻片上聚集接触。第二步是培养多巴胺能神经元，选取出生后0～2天的小鼠，按照如上星形胶质细胞的方法获得小鼠脑，切取部分中脑和黑质与腹侧被盖区脑组织。酶消化之后、机械分离组织、收集细胞，重悬，以合适的浓度种植。
第二天，向培养基中加入有丝分裂抑制剂阿糖胞苷（Ara-C），抑制星形胶质细胞和小胶质细胞增殖。
整个过程在培养箱（37℃，5%CO）中进行。具体操作见图1-2。2图1-2 单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元流程（一）材料准备（1）试剂：12mol/L的浓盐酸；无菌过滤水；95%和70%的乙醇；A胶原溶液1；多聚赖氨酸溶液；MEM培养基（Invitrogen）；分离溶液；木瓜蛋白酶；有丝分裂抑制剂阿糖胞苷；EDTA（Invitrogen）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）；0.5%胰蛋白酶；0.4%台酚蓝；条件培养基；氟尿苷；犬尿喹啉酸；75%酒精。（2）器材：直径1.5cm的玻片；分离器械（Fine Science Tools）：眼科剪（2把）、眼科镊（2把）、7号弯镊1对、7号和5号弯钳、刀片、酒精灯；90mm孔径的滤纸（紫外灯消毒）；0.2μm孔径的注射器过滤器；紫外线灯；100mm×15mm和35mm×10mm培养皿；10ml注射器；高压灭菌锅；5ml和10ml移液管；铝箔纸；倒置显微镜；3个2225cm的培养瓶；175cm培养瓶；可放入15ml离心管的离心机；血细胞计数器，电烙铁。（二）操作步骤
1.包被玻片（1）将玻片放入12mol/L浓盐酸浸泡24h。（2）用无菌过滤水冲洗3遍，之后在无菌水中浸泡1h。（3）95%乙醇洗3遍，最后浸泡到乙醇中至使用前取出（玻片置于盛有95%乙醇的密闭容器中可放置几周，如果发现液体变黄，则要将玻片丢弃）。（4）用7号弯钳将玻片逐一从95%乙醇中取出，放到新鲜的95%乙醇中浸泡后用酒精灯烤干。（5）小心地将玻片放到100mm×15mm无菌培养皿中用紫外灯消毒过的无菌滤纸上（注意观察玻片是否透明，如果不透明则丢弃，否则细胞不易爬片）。（6）用10ml注射器吸一滴新鲜的胶原溶液1，通过0.2μm孔径的过滤器滴到每一个玻片上，用7号弯钳夹住吸头将其铺匀，直至晾干。（7）按照滴加胶原溶液1的方法将65ml多聚赖氨酸溶液滴加到玻片上，放入密闭的玻璃皿中1h（注意此过程中多聚赖氨酸不能晾干）。（8）将玻片依次放入3个盛有无菌细胞培养水的烧杯中，然后将它们分别放到用紫外灯消毒过的无菌滤纸上，向每张玻片上滴加65ml无菌水，盖好培养皿，静置1h，同样方法重复一次，吸干玻片上多余的无菌过滤水至玻片完全晾干。（9）每个35mm×10mm的培养皿中放入两个玻片并用电烙铁在培养皿上画一条中线以免两张玻片重叠（图1-3）。图1-3 培养皿中间画一条线分隔两个玻片
注意：（7）～（9）要在一天内完成，包被的玻片要在一周内使用完。（10）在接种星形胶质细胞之前，提前至少3h在玻片上滴加100ml MEM培养基。
2.培养单层星形胶质细胞（1）器械和操作台的准备
① 用高压灭菌锅灭菌器械或用70%乙醇浸泡之后烘干备用。
② 向35mm×10mm的培养皿中加入2ml分离溶液，并置于冰上备用。
③ 准备抑制剂和5ml木瓜蛋白酶。
④ 将2根5ml的玻璃吸管放到酒精灯上烧至其口径分别变小为1.5mm和0.5mm。（2）分离组织
① 将新生鼠放到碎冰上的铝箔纸上麻醉，一旦小鼠停止活动，用70%乙醇消毒其头颅，然后用吸水纸吸干；如图1-4所示，用眼科剪从颈部开始，以圆形走形剪开头皮和背侧颅骨；用7号弯镊去除皮肤和颅骨，暴露脑，用2ml分离溶液冲洗脑组织，用烧至弯曲的玻璃吸管将脑组织轻轻拉出，放入盛有预冷的分离溶液的培养皿中。图1-4 暴露脑方法
② 将脑组织放到倒置显微镜下，背侧向上，用5号弯钳夹住脑，用刀片切下前脑。
③ 小心分离出中脑，将脑膜连同所有血管剥下。
④ 将前脑切成许多组织块，以便均匀消化。用10ml的无菌玻璃吸管将组织块转移到盛有事先激活的木瓜蛋白酶的15ml离心管中，将其放到可以入水的磁力搅拌器上于37℃温水中水浴50min（搅拌过程可以借助向烧杯中加入几个磁力转子来加大搅拌力量）。注意在转移组织块时尽量少的吸取分离溶液，以免其将木瓜蛋白酶稀释。（3）分离星形胶质细胞
① 使组织块自然下沉，将木瓜蛋白酶小心吸出，用2.5ml的抑制剂冲洗组织块2次。
② 用2ml的MEM培养基冲洗组织块2次，之后向离心管中加入1ml MEM培养基，用1.5mm口径的5ml玻璃移液管反复吹打组织块20次，之后换用0.5mm口径的5ml玻璃移液管吹打40次，若发现仍有组织块未完全消化，则分离细胞悬液和沉淀，将悬液吸取到另一个15ml的离心管放到培养箱保存，向剩余沉淀中加入1ml MEM培养基再次像之前一样吹打，至均匀将其与细胞悬浮液混匀。
③ 向上述的细胞悬浮液中加入MEM培养基至体积为25ml，吸取2215ml平均分到3个25cm的培养瓶中，剩余10ml加入到175cm的培养瓶中过夜。前三者用于提供中脑多巴胺能神经元生长所需的星形胶质细胞单层，后者用于形成MEM条件培养基。（4）预冷2
① 细胞分离后的第二天，将培养瓶中的培养基吸出，25cm和2175cm的培养瓶分别加入2ml和10ml１×MEM培养基洗2次，左后分别加入5ml和100ml MEM培养基即可。
② 之后将培养瓶放入细胞培养箱中至细胞接触生长，这个过程一般需要7天，然后将星形胶质细胞转移到玻片上。2
③ 准备胰蛋白酶：向25cm的培养瓶中加入7ml预热的EDTA溶液和2ml磷酸盐缓冲液。
④ 酒精灯上烧5ml的玻璃吸管至其口径减少至0.5mm。
⑤ 准备0.5%的胰蛋白酶。
⑥ 吸出每个培养瓶中的培养基弃去，分别加入2ml EDTA溶液，轻轻吹打十余次。然后弃去EDTA，再分别加入2ml的EDTA。此步是为了去除血清蛋白，以免其干扰胰蛋白酶对星形胶质细胞的分离，根据经验，在用胰蛋白酶消化之前，用EDTA处理比用磷酸盐缓冲液处理更能增加其消化效果。2
⑦ 弃去EDTA溶液，向每个25cm的培养瓶中加入2ml提前激活的0.5%的胰蛋白酶，孵育5min后观察细胞是否分离；若没有分离则继续孵育至分离。
⑧ 向每个培养瓶中加入2ml的EDTA溶液将胰蛋白酶稀释，然后用0.5mm口径的10ml玻璃管轻轻吹打十余次。
⑨ 将细胞悬液转移到15ml的离心管中，向培养瓶中加入1ml EDTA覆盖剩余的细胞，然后将其转移到15ml的离心管中。
⑩ 三步离心法：室温下以200g离心2min，300g离心2.5min，900g离心30s。此三步的目的是将离心时间和机械损伤降到最小，同时有效分离出上清液以及细胞碎片。因此，前两步离心是将细胞碎片分离出，最后一步是将其沉淀，分离出上清液。
⑪ 弃去上清液，向每个离心管中加入1ml MEM培养基，用0.5mm口径的5ml玻璃移液管轻轻吹打二十余次。
⑫ 用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。5
⑬ 将细胞悬液稀释到需要的浓度：1×10cells/ml。
⑭ 向每个事先包被过的玻片上涂布130ml的细胞悬液，孵育3h；这3h的孵育是为保证在将玻片转移到含有2.5 ml培养基的培养皿之前，使细胞附着玻片的同时还防止其干燥。
⑮ 向培养皿中加入含MEM培养基和MEM条件培养基各一半的溶液共2.5ml，继续孵育，注意此步要小心操作，以防止贴壁的细胞分离。
⑯ 细胞成功贴壁并且接触生长之后，向培养皿中加入12.5ml的氟尿苷。氟尿苷是一种抗肿瘤药，它的作用是延缓胶质细胞增殖，以便其形成单层，使神经元细胞附着。此步骤是否需要进行取决于新生小鼠的出生日期，氟尿苷加入之后可以使胶质细胞在几天内保持单层，如果神经元细胞恰好也培养好，则不需要此步便可直接涂片在星形胶质细胞单层上。
3.在星形胶质细胞单层培养中脑多巴胺能神经元（1）器械与超净台准备
① 分离器械在高压灭菌锅灭菌或用70%的乙醇浸泡后烘干。
② 酒精灯上将2根5ml的玻璃吸管烧至口径分别为2mm和0.5mm。
③ 向35mm×10mm培养皿中分别加入2ml分离溶液，每个培养皿中加入两个脑组织，并置于冰上操作。
④ 用10ml注射器吸满分离溶液备用，每个脑组织5ml。
⑤ 准备离心用溶液（5ml/5个脑组织），研磨液（10ml/5个脑组织）和MEM培养基（2.5ml/2个玻片）。
⑥ 每5个脑组织准备5ml激活的木瓜蛋白酶溶液。（2）解剖分离
① 取出生后0～2天的新生鼠按照培养单层星形胶质细胞的分离组织的方法①分离脑组织。
② 将脑组织腹侧面向上置于倒置显微镜下（图1-5），头端以中脑皱褶为参照，尾端以Willis环为参照，在冠状面切下大约1mm厚的薄片（图1-6），大体位置如图1-7所示。
③ 用刀片切下腹侧被盖区和黑质部分。
④ 将脑组织块收集到预冷的分离溶液中，按此操作准备5个脑组织。
⑤ 用10ml的玻璃吸管将脑组织块转移到盛有提前激活的木瓜蛋白酶的15ml离心管中，将离心管放到37℃水浴锅中搅拌水浴。确保在转移组织块的过程中，尽量少的吸取分离溶液，以免将木瓜蛋白酶稀释。
注意：细胞的存活率与操作速度是相关的，建议两个人一起操作，一人负责取脑组织，另一个负责分离中脑。图1-5 倒置显微镜下脑组织图1-6 冠状面的薄片图1-7 薄片的大体位置图示（3）分离细胞
① 使组织块自然下沉，小心吸出木瓜蛋白酶，用室温下的分离溶液冲洗组织块两次。
② 再用2ml的研磨溶液冲洗组织块2次，之后向离心管中加入1ml研磨溶液，用1.5mm口径的5ml玻璃吸管研磨组织块20次之后换用0.5mm口径的5ml玻璃吸管研磨40次。若发现仍有组织块未完全消化，则参照培养单层星形胶质细胞的分离组织的方法②，只是将MEM培养基换成研磨溶液。
③ 将含有5个经酶消化过的脑组织的细胞悬液小心地滴加到5ml的离心溶液中，确保每根管的体积相同。然后以下面转速离心：室温下200g，离心2min，300g，离心3min。本操作的目的同前。
④ 弃去上清液，每根管加入500ml研磨溶液，重悬细胞。
⑤ 用血细胞计数器和台酚蓝计数细胞。5
⑥ 稀释细胞悬液到所需要的浓度：一般是（1～3）×10cells/ml。
⑦ 用7号弯钳将培养有单层星形胶质细胞的玻片从培养皿中夹出，放在用紫外灯消毒过的滤纸上将底面液体吸干，然后将其放到紫外灯消毒过的新的10mm×35mm的培养皿中，用如前所述的方法在培养皿中央用电烙铁画一条线，将两个玻片分隔开，最后向每个玻片上滴加65ml的中脑多巴胺能神经元细胞悬液，培养箱中孵育3h。为防止已经贴壁的单层星形胶质细胞干燥，此步要两个人来完成，一次性摆好5个培养皿，不时地用移液管吹打剩余的细胞悬液而防止其形成沉淀。
⑧ 孵育完成之后，向每个培养皿中加入2.5ml的Neurobasal-A+/MEM+培养基过夜，注意此步小心操作，以免将细胞分离。
⑨ 之后向每个培养皿中加入12.5ml氟尿苷，以减慢胶质细胞进一步增殖，由于此时的细胞悬液中包括胶质细胞和神经元两种，所以加入氟尿苷防止其增殖是很有必要的。
⑩ 接种上神经元后的第7天，向培养皿中加入10ml犬尿喹啉酸，防止其与谷氨酸受体结合以及兴奋性谷氨酸中毒，然后加入500ml Neurobasal-A+/MEM+培养基，防止蒸发，继续孵育。
⑪ 之后每周都要向培养皿中加入500ml Neurobasal-A+/MEM+，以防止液体蒸发。此培养持续60天，细胞贴壁期间都可以通过免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶的浓度以测定多巴胺能神经元的比例（图1-8）。正常情况下，应该保持在20%～25%。图1-8 多巴胺能神经元的比例免疫细胞化学法二、单层星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元及形成神经突触
该方法是在小部分星形胶质细胞表面培养多巴胺神经元。总体方法是在玻片上喷洒胶原基质，形成星形胶质细胞可以附着的微滴。这样多巴胺能神经元就可以附着在星形胶质细胞上生长。在这种模型中，孤立的神经元可以与其细胞体和树突形成突触联系，称为“自身突触”。这种模型可以用来进行突触结构与功能的定量研究。（一）补充材料（与单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元相比需要的材料）
多聚鸟氨酸溶液，0.15%琼脂糖溶液，胶原溶液2，薄层色谱试剂喷雾器（Kimble/Kontes）。（二）操作步骤
⒈包被玻片（1）同单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元包被玻片的（1）～（5）。（2）把100ml新鲜配制的多聚鸟氨酸溶液滴加在每个玻片上，用7号弯钳夹住移液管，利用其末端将溶液展开使其覆盖在玻片的整个表面。在37℃下培养24h。（3）吸出多聚鸟氨酸溶液，代之为100ml水，室温下放置5min。重复清洗，在开始下一步之前，将其放到用紫外灯消毒过的滤纸上静置24h。（4）用巴斯德移液管把加热过的0.15%琼脂糖溶液滴加到玻片上，一次5张玻片。吸出多余的0.15%琼脂糖溶液，仅仅只留下薄薄的一层。在开始下一步之前晾干24h。
注意：0.15%琼脂糖溶液在使用之前，为了减少它的黏度必须加热，这样才能更容易地铺成薄薄的一层。当0.15%琼脂糖溶液开始变得越来越黏稠的时候，有必要对其进行重复加热。（5）在接种星形胶质细胞的前一天，要用胶原溶液2处理玻片；将薄层色谱试剂喷雾器的气压设置为45psi。盛有玻片的培养皿放在喷雾器的50cm以外、比它低20cm以下的位置。最后，胶原溶液2垂直地落在玻片上形成小圆点。见图1-9。图1-9 胶原溶液2的位置（6）紫外灯照射玻片消毒30min并干燥。每一个紫外灯消毒过的35mm×10mm的培养皿中放置两个玻片，然后将100ml MEM培养基滴加在玻片上。
2.玻片上培养少量星形胶质细胞（1）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的培养单层星形胶质细胞（1）的①至（4）的⑫。4（2）稀释细胞悬液到需要的浓度（6×10cells/ml）。
星形胶质细胞的量至关重要，但无需过多，形成平滑稀薄的一层即可，这对细胞成像等技术很重要。（3）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的培养单层星形胶质细胞（4）的⑭和⑮。（4）一旦神经胶质细胞延伸覆盖在整个玻片表面后，一般是在涂片后一天，立即添加12.5ml氟尿苷溶液。
3.星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺神经元（1）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的在星形胶质细胞单层中培养脑多巴胺能神经元（1）的①至（3）的⑤。（2）稀释细胞悬液到所需的浓度（80000cells/ml）。（3）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的在星形胶质细胞单层中培养脑多巴胺能神经元（3）的⑦至（3）的⑪。
这种培养可以保持15天以上。三、本节实验中使用到的试剂和溶液（1）0.15%琼脂糖溶液［20ml水、30mg琼脂糖（购自Sigma）］：在微波炉上加热至出现沸腾的气泡，然后搅拌至琼脂糖粉溶解。（2）多聚-L-赖氨酸硼酸盐溶液［50ml水、155mg硼酸（购自Sigma）、238mg硼砂（四硼酸钠+水合物）（购自Sigma）］：用1mol/L的盐酸调整pH值为8.5，使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存3周。（3）多聚-L-鸟氨酸硼酸盐溶液［50ml水、2.38g硼酸（购自Sigma）、1.27g四硼酸钠水合物（购自Sigma）］：使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存3周。（4）离心分离溶液［5ml Neurobasal-A+、50mg胰蛋白酶抑制剂、50mg 98%的牛血清白蛋白、11.9mg羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液，最低浓度99.5%］：用1mol/L的氢氧化钠调整pH为7.4，使用0.2μm 过滤器过滤，置于二氧化碳保温箱加热到37℃，现用现配。（5）胶原溶液1［7.25ml水、250ml PureCol（3.0mg/ml；购自Inamed Biomaterials）］：现用现配，可用于包被方法1中的至少100张玻片。（6）胶原蛋白溶液2［3ml 125mmol/L醋酸、1ml PureCol（3.0mg/ml；购自Inamed Biomaterials）］ ：现用现配，可用于包被方法2中的至少100张玻片。（7）MEM+条件培养基（MEM条件培养基和10% 胎牛血清培养2基）：按照方法2中的步骤在175cm的烧瓶中接种星形胶质细胞。则条件培养基在合适的条件下经14天将逐渐形成。（8）D-葡萄糖MEM培养基［50ml最基本的培养基、18.02g D-葡萄糖（购自Sigma）］：使用0.2μm过滤器过滤，37℃下保存3个月。（9）分离介质（6.39g硫酸钠、2.62g硫酸钾、590mg氯化镁六水合物、18.4mg氯化钙二水合物、1.19g羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、1.80g D-葡萄糖）：
① 加水至总体积为500ml，在磷酸盐缓冲液中加入0.5%的酚红溶液。
② 用1mol/L 氢氧化钠调整pH为7.4，使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存1个月。
硫酸钠、硫酸钾、氯化镁、氯化钙、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、D-葡萄糖、酚红均购自Sigma公司。（10）氟尿苷溶液（203ml基本培养基、100mg 5-氟-2脱氧尿苷、198mg尿苷）：使用0.2μm过滤器过滤。分装成每管1ml可在-20℃下储存一年。（11）抑制剂（5ml MEM+培养基、12.5mg胰蛋白酶抑制剂、12.5mg 98%的牛血清白蛋白、23.8mg 最低浓度99.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液）：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4，用0.2μm过滤器过滤，把溶液放置在二氧化碳保温箱中加热到37℃，现用现配。（12）125mmol/L犬尿喹啉酸（10ml水、236.5mg犬尿喹啉酸）：加入5mol/L氢氧化钠直到粉末溶解。使用0.2μm过滤器过滤。分装成200ml 每管-20℃储存一年。（13）MEM+培养基（MEM/10% 胎牛血清介质）［85.7ml基本培养基、1ml D-葡萄糖MEM、1ml青霉素/链霉素（购自Invitrogen）、1ml GlutaMAX（购自Invitrogen）、1ml 100mmol/L的丙酮酸钠、100ml MITO+］：在 DPBS中加入200ml 0.5%的酚红溶液。使用0.2μm过滤器过滤。10ml胎牛血清。37℃下保存一周。（14）MITO+［5ml水、1瓶MITO+血清添加物配成5L的培养基（购自BD Biosciences）］：分装成100ml每管，-20℃下储存一年。（15）Neurobasal-A+培养基（Neurobasal-A和10% 胎牛血清）［86ml Neurobasal-A培养基 1×（无L-谷氨酰胺）、1ml青霉素-链霉素、1ml GlutaMAX、2ml B27补充物、10ml胎牛血清］：使用0.2μm过滤器过滤，37℃下保存一周。（16）Neurobasal-A+/MEM+培养基（66ml Neurobasal-A+、33ml MEM+条件培养基）：37℃下保存一周。（17）木瓜蛋白酶溶液［5ml分离溶液、2.25mg L-半胱氨酸盐酸盐化合物（购自Sigma）］：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4。100U木瓜蛋白酶（购自Worthington）。不晃动使其在37℃下活化15min，然后连接到直径26mm注射器上的0.2μm SFC过滤器过滤并在37℃下最多储存30min，现用现配。（18）多聚-L-赖氨酸（5ml硼酸缓冲聚-L-赖氨酸、5mg多聚左旋赖氨酸）：分装成每管200ml。在-20℃下储存两年。（19）多聚赖氨酸溶液（1.8ml硼酸缓冲聚-L-赖氨酸、200ml L-半胱氨酸盐酸盐等分）：现用现配。（20）多聚-L-鸟氨酸（2.5ml水、25mg多聚-L-鸟氨酸）：分成每管30ml。在-20℃下储存两年。（21）多聚-L-鸟氨酸溶液（用75盖玻片）（6.72ml水、750ml多聚-L-鸟氨酸硼酸盐溶液、30ml多聚-L-鸟氨酸）：现用现配。（22）研磨溶液（20ml Neurobasal-A+、20mg胰蛋白酶抑制剂、20mg 98%的牛血清白蛋白、47.6mg最低浓度99.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液）：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4，使用0.2μm 过滤器过滤。把溶液放置在二氧化碳保温箱中加热到37℃，现用现配。（23）0.5%胰蛋白酶溶液［10ml 37℃的磷酸盐缓冲溶液、5mg胰蛋白酶（1∶250，购自Invitrogen）］：使用0.2μm 过滤器过滤并在37℃下放置5min，现用现配。四、注意事项（1）尽快地进行解剖和活体组织的分离。快速解剖和处理组织将确保游离神经元的高存活率，并产生高比例的存活多巴胺神经元。因此，以两人为一组的形式有利于执行所有关键步骤。（2）动物的年龄。虽然出生后0～3天的小鼠均可使用，但是为了获得更高比例的多巴胺能神经元和一个更长的生存期，使用出生后0～1天的更优。另外，为获得高比例的多巴胺能神经元（50%以上），准备一个稍微更薄和最佳区域的中脑切片。（3）培养基中所用的血清。大量的劣质血清可降低出生后小鼠多巴胺神经元的存活率。当预备进行出生后小鼠的多巴胺神经元的培养时，有一个好办法是先测试多个血清，并选择其能达到多巴胺能神经元最长存活期的血清。五、常见问题及解决方案
最常见的问题是多巴胺能神经元的存活率低。使用本节中描述的基本数据，一般可获得25%～ 30%的多巴胺神经元。如果所得比例远远低于此值，则操作过程值得探究。
这通常有以下四个可能的原因：（1）解剖分离时间过长。
解决方法：两人一起操作共同获得部分脑组织。（2）转移神经元悬浮液到星形胶质细胞玻片上的使用过长时间。
解决办法：如上所述，团队合作。此外，每次准备少量的载玻片。（3）过高或低的细胞密度。平铺星形胶质细胞时密度过高或过低都会导致神经元的生存率无法达到理想结果。
解决办法：严格遵守本报告中的建议。（4）实验动物月龄过大。使用月龄过大的动物进行实验时，尽管可以优化酶消化法和机械分离法的条件，但目前的实验表明，出生0～2天的大鼠或小鼠幼崽是最为适合使用的动物年龄。使用月龄较大幼崽将会导致多巴胺神经元的生存率降低。
除此之外，多巴胺能神经元的比例过低也可能因为解剖分离脑组织时并没有正确分离出中脑。六、预期结果
通过方法1每个玻片有200～500个多巴胺神经元。其中较成熟的神经元之间能够形成一个复杂的轴突和树突网络。方法2会产生单个多巴胺神经元或一小部分神经元。每个玻片上有10～20个多巴胺神经元。七、时间因素
经过24h的浓盐酸浸泡，酒精灯烘烤和包被后，玻片可以使用 6～10h，具体取决于准备了多少。对于微量细胞培养的玻片，需要额外的48h来进行孵育和干燥。然后，麻醉动物、分离皮质、分离细胞、将星形胶质细胞接种至烧瓶中需要2h。星形胶质细胞经过 1 周孵育后，需要4～6h准备玻片和接种星形胶质细胞，加入培养基需要额外的3h的孵育时间。星形胶质细胞在标准玻片（3～5天）或微量细胞培养玻片（24h）还需要一定的时间。最后，培养多巴胺能神经元，用3h分离5～10只动物脑组织，包括麻醉、分离组织、分离细胞、接种，在加入培养基之前再孵育另外3h。每只动物分离脑组织和中脑的最佳时间不应超过1.5min，以减少多巴胺能神经元的死亡。参考文献
Fasano C, Thibault D, Trudeau LE. Culture of postnatal mesencephalic dopamine neurons on an astrocyte monolayer. Curr Protoc Neurosci. 2008, Chapter 3: Unit 3.21.（宋 悦 潘晓东）第三节 小鼠神经干细胞培养一、成年鼠神经干细胞培养
神经干细胞具有自我更新和分化成中枢神经系统不同类型细胞的能力。体外分离培养和分析神经干细胞是揭秘神经发生的细胞和分子机制的重要方法，也有助于神经系统疾病和神经损伤干细胞治疗的条件优化。成年哺乳动物脑内神经发生主要集中在两个区域：侧脑室室下区（subventricular zone of the lateral ventricle，SVZ）和海马齿状回的颗粒下层（subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus，SGZ）。SGZ区的神经干细胞主要产生海马齿状回兴奋性谷氨酸能神经元。SVZ区的神经干细胞产生抑制性的γ-氨基丁酸能神经元和嗅球的多巴胺能中间神经元。除了分化为不同的神经元外，这两个区域的神经干细胞对神经营养因子、神经生理和病理刺激的反应性也不同，然而，这两个区域神经干细胞具有不同特性的分子机制并不十分清楚。因此，比较同一个脑组织中，这两个神经发生区域神经干细胞的特征显得尤为重要。
近些年来，国际上相关领域的专家一直都在优化成年鼠神经干细胞的分离培养条件，但仍然存在很多的不足之处，如贴壁单层生长的细胞容易分化、所需的鼠脑数量较多等。本文将介绍一种从一只鼠脑中同时分离培养DG区和SVZ区神经干细胞的方法。
1.材料
8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠、Hank′s平衡盐溶液（HBSS，购自Invitrogen，货号14025-126）、Neurobasal 培养基（购自Invitrogen，货号21103-049）、DMEM/F12培养基（购自Invitrogen，货号11330-032）、B27添加物（购自Invitrogen，货号17504-044），N2 添加物（购自Invitrogen，货号17502-408，无菌分装）、GlutaMAX（购自Invitrogen，货号35050-038，无菌分装）、L-谷氨酰胺（购自Invitrogen，货号2503-081，无菌分装）、青霉素/链霉素溶液（Antibiotic-Antimycotic，购自Invitrogen，货号15240-062，无菌分装）、碱性纤维生长因子（bFGF-2，购自PeproTech，货号100-18B-B）、表皮生长因子（EGF，购自PeproTech，货号100-15）、MACS神经组织分离试剂盒（购自Miltenyi Biotec，货号130-092-628）、β-巯基乙醇（购自EM Sciences，货号MX031OMB-1，属剧毒品，在通风橱中打开）、Percoll分层液（购自Amersham Biosciences，货号17-0891-01）、10×DPBS（购自Invitrogen，货号14200-059）、1× DPBS（购自Invitrogen，货号14190-136）、多聚鸟氨酸（Poly-L-ornithine，购自Sigma-Aldrich，货号P-3655）、层粘连蛋白（Laminin，购自BD Biosciences，货号354232）、维甲酸（Retinoic acid，RA，购自Sigma-Aldrich，货号R2625）、毛喉素（Forskolin，FSK，购自Sigma-Aldrich，货号F6886）、二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO，购自Sigma-Aldrich，货号D2650），超纯水（Mini Q）、75%酒精、4%多聚甲醛、细胞消化液（购自Accutase）、磷酸盐缓冲液（PBS）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxy Uridine，Brdu）。
2.仪器
6cm和10cm直径的细胞培养皿，离心管，1ml带滤芯的吸头，超低黏附6孔和24孔细胞培养板；解剖工具［眼科剪（购自Roboz，货号RS-5840、RS-6942），眼科镊（购自Roboz，货号RS-5237、RS-5095）］；解剖显微镜；McⅡwain 组织切片机（购自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD，货号10180）及刀片；MACSmix 离心管混匀器（购自Miltenyi Biotec，货号130-090-753）；无菌试纸（购自Fisher Scientific，货号14-959-92B）；低速离心机（购自Eppendorf，型号5702，货号022626001）；数字相差倒置显微镜（购自Olympus，CK41）。
3.试剂准备（1）碱性纤维生长因子和表皮生长因子：按照说明书将母液配制成0.1mg/ml浓度，50ml分装后-80℃保存，使用前用Neurobasal培养基稀释成终浓度10μg/ml，4℃保存不超过2周。（2）溶液A：1× Hank′s平衡盐溶液中含有30mmol/L的葡萄糖，2mmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，26mmol/L的碳酸氢钠，无菌过滤后4℃保存不超过4周。（3）起始增殖培养基（initial proliferation medium，IPM）：48ml Neurobasal培养基+1ml B27添加物+0.5ml GlutaMAX+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）+20ng/ml碱性纤维生长因子+20ng/ml表皮生长因子，4℃保存不超过2周。（4）N2培养基：500ml DMEM/F12培养基+5ml N2添加物+5ml L-谷氨酰胺+5ml青霉素/链霉素溶液（100×）。使用N2培养基传代神经干细胞以前，添加终浓度为20ng/ml碱性纤维生长因子和20ng/ml表皮生长因子，4℃保存不超过4周。（5）β-巯基乙醇的稀释：34.7ml β-巯基乙醇+10ml无菌双蒸水，每次新鲜配制。（6）消化酶混合物1：将MACS神经组织分离试剂盒中的2ml溶液2+50ml溶液1+2.5ml稀释后的β-巯基乙醇混匀。若用两只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，则溶液的量相应增加。（7）消化酶混合物2：将MACS神经组织分离试剂盒中的溶液3+10ml 溶液4混匀。若为两只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，则溶液的量相应增加。（8）Percoll分层液：倘若分离两只或两只以上的8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，才需要使用Percoll分层液，22.5ml Percoll分层液+2.5ml 10×DPBS，4℃保存不超过4周。（9）维甲酸的配制：使用二甲亚砜（DMSO）将维甲酸配制成10mmol/L的母液浓度，-20℃分装，使用前1∶10000稀释。（10）毛喉素的配制：使用二甲亚砜（DMSO）将毛喉素配制成10mmol/L的母液浓度，-20℃分装，使用前1∶10000稀释。（11）分化培养基：向不含生长因子的N2培养基中加入终浓度为1μmol/L维甲酸和1μmol/L毛喉素，新鲜配制；或向不含生长因子的N2培养基中加入0.5%～1.0%的胎牛血清。（12）防冻液：含有10%二甲亚砜的N2培养基，新鲜配制。（13）多聚鸟氨酸溶液：用无菌的MiniQ水配制成10mg/ml的母液，-20℃分装保存，使用前用无菌的Mini Q水稀释成10μg/ml的工作浓度，新鲜配制。（14）层粘连蛋白溶液：用无菌的磷酸盐缓冲溶液将其稀释成5μg/ml的终浓度，新鲜配制。
4.操作步骤（1）小鼠脑DG和SVZ区的显微解剖（时间：30min）
① 用230mg/kg戊巴比妥钠麻醉成年小鼠，深度麻醉后断头取脑。
② 用无菌的眼科剪和眼科镊，依次剪开头皮，去除头颅骨，分离出完整的全脑，迅速将全脑移入50ml装有20ml预冷的Hank′s平衡盐溶液中，并置于冰上。切片前将脑移入装有预冷20ml溶液A的10cm的培养皿中。
③ 取鼠脑以前，用75%乙醇浸泡或擦拭消毒McⅡwain组织切片机中与组织接触的地方，并晾干。将灭菌的滤纸放在切片平台上，将鼠脑移入滤纸上，用McⅡwain组织切片机切脑片为400μm的厚度，用无菌试纸收集含有SVZ（约6片）和海马的脑片（约5片），移入含有5ml溶液A的6cm的培养皿中。
④ 如图1-10所示，在解剖显微镜下分离SVZ区［图1-10（a）～图1-10（c）］和海马的DG区［图1-10（d）～图1-10（f）］，将分离的区域分别移入装有10ml溶液A的15ml的离心管中。
注意：取出鼠脑以后的过程中，尽量全程使用冰浴，以提高细胞存活率。图1-10 解剖显微镜下的SVZ区和海马的DG区（2）神经干细胞的分离（时间：1～2h，室温：20～25℃）
① 用低速离心机以200g，离心1min，第（4）步取得的脑组织。
② 在超净工作台内，去除上清液，每管中加入2ml的消化酶混合物1，用MACSmix离心管混匀器在室温下旋转20min。注意不能超过30min。
③ 每管中加30ml的消化酶混合物2，再旋转20min。注意不能超过30min。
④ 用1ml的吸头上下吹打10～20次，直至没有组织团块，加8ml N2培养基稀释消化酶混合物，200g，离心5min，以沉淀细胞。吹打时尽量减少气泡生成，尽量将组织块消化成单细胞悬液，消化的时间可适当的调整。
⑤ 用10ml的N2培养基，200g，离心5min，洗涤细胞2次。
⑥ 用8ml的起始增殖培养基洗涤细胞1次。
⑦ 用1ml的起始增殖培养基重悬DG区沉淀，接种于24孔细胞培养板的1个孔中，用2ml的起始增殖培养基重悬SVZ区沉淀，接种于24孔细胞培养板的2个孔中，CO培养箱中培养48h。2
⑧ 隔天半量更换起始增殖培养基，持续培养7～14天，检测神经球的形成情况。正常情况下1～2周形成神经球。（3）神经干细胞的传代
① 培养7～14天后，收集原代培养的神经球，200g，离心5min。
② 小心去除上清液，用1ml的细胞消化液重悬神经球，37℃消化10min，用1ml吸头吹打神经球10～15次后，加8ml起始增殖培养基混匀，200g，离心5min。
③ 小心去除上清液，用1ml起始增殖培养基重悬DG区细胞，继续接种于24孔细胞培养板的1个孔中；用2ml起始增殖培养基重悬SVZ区细胞，接种于6孔细胞培养板的1个孔中。
④ 用新鲜的起始增殖培养基隔天半量换液DG区细胞，用N2培养基隔天半量换液SVZ区细胞。第二次传代后DG区细胞也可以使用N2培养基维持培养。第二次传代后，细胞接种密度介于（3×10～1×410）个/ml，每2～3天传代一次。干细胞可以在体外传20代以上，但5推荐使用2～10代的干细胞进行后续的实验研究。（4）神经干细胞的鉴定及增殖分析
① 神经干细胞表达Nestin蛋白，可将神经球接种于多聚赖氨酸包被的载玻片上，4%多聚甲醛固定20min、磷酸盐缓冲溶液漂洗3次后，用免疫细胞化学的方法检测Nestin蛋白的表达情况，代表性的结果见图1-11。图1-11 Nestin、BrdU和β-Ⅲ-tublin/GFAP4
② 将单细胞悬液以2.5×10个/ml密度接种于超低黏附的细胞培养板中，完全培养基中加入2μmol/L BrdU，37℃培养24h后，免疫细胞化学方法检测BrdU掺入阳性率，代表性的结果见图1-11。
③ 神经干细胞的增殖分析也可直接在光镜下拍照后，测量神经球的数量和直径大小，代表性的结果见图1-12。图1-12 光镜下的神经球数量和直径大小（5）神经干细胞的分化
① 诱导分化前两天，用工作浓度的多聚鸟氨酸包被培养板和盖玻片，室温孵育过夜。注意板不能风干。
② 去除鸟氨酸，用无菌MiniQ水漂洗板3次。
③ 加工作浓度的层粘连蛋白溶液，37℃孵育过夜，接种前去除多余的层粘连蛋白溶液。5
④ 将消化好的神经干细胞以1×10个/ml密度接种，37℃培养过夜。
⑤ 用分化培养基半量换液细胞，每天半量更换培养基，连续4～7天。分化好的细胞可以直接裂解用于生化分析，也可用4%多聚甲醛固定后用于组化分析。神经干细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞，通过免疫荧光检测神经元标志物β-Ⅲ-tublin和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达情况。代表性的结果见图1-11。（6）神经干细胞的冻存
① 收集神经干细胞球，200g，离心5min。
② 小心去除上清液，用1～2ml的防冻液重悬沉淀细胞，并移入2ml的冻存管中。
③ 将冻存管放置于冻存盒并移入-80℃冰箱中，1～2天后，将细胞移入液氮（-180℃）中长期保持。（7）冻存神经干细胞的复苏
① 从液氮罐中小心取出冻存管，37℃水浴中轻轻摇动，直到防冻液完全融化。
② 将融化的细胞移入预温的N2培养基中，200g，离心5min。
③ 小心去除上清液，用预温的含有生长因子的N2培养基重悬细胞并接种培养。干细胞的冻存和复苏遵循“慢冻快融”的原则。二、新生鼠海马神经干细胞的培养
成年鼠神经干细胞的增殖和分化能力明显低于新生鼠，在某些实验中需要培养海马区的神经干细胞，因此本文也解释新生鼠海马神经干细胞的培养要点，新生鼠海马神经干细胞的培养所需要的主要试剂和仪器与成年鼠神经干细胞的培养基本相同。
1.特殊试剂
木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）（终浓度20U/ml，购自Invitrogen）、溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液（简称“溶木盐”，pH 7.2）（137mmol/L 氯化钠+5.3mmol/L氯化钾+1mmol/L氯化镁+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液+3mmol/L 氯化钙）。
2.操作步骤（1）消化液的配制：木瓜蛋白酶+脱氧核糖核酸酶Ⅰ+少许半胱氨酸+溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液，混匀后37℃，使其变澄清，使用前无菌过滤。（2）出生当天的小鼠，用75%酒精喷试后直接断头取脑，将全脑移入冰冷的A溶液中，在解剖显微镜下分离海马，去除脑膜。（3）将海马移入消化液中，37℃消化20min，每5min晃动1次。（4）静置沉淀后，小心弃除消化液，用10ml的N2培养基漂洗残留的消化液2次。（5）加入2ml的N2培养基，使用1ml带滤芯的吸头反复的吹打、沉淀15～20次。（6）静置沉淀后，小心将上清液移入另一无菌的离心管中；再次向沉淀中加入2ml的N2培养基，1ml带滤芯的吸头反复吹打、沉淀15～20次。重复该步骤，直至组织团块完全消失。（7）收集所有的上清液，200g，离心5min，弃上清液。（8）用10ml的N2培养基漂洗细胞两次，再用10ml的起始增殖培养基漂洗细胞1次。（9）使用起始增殖培养基重悬神经干细胞，以每个海马种1个6孔细胞培养板的密度接种细胞，37℃二氧化碳培养箱中培养，2～3天后第一代的神经球形成。
新生鼠海马神经干细胞球前两代使用起始增殖培养基培养，第三代以后可以使用N2培养基培养。
新生鼠海马神经干细胞的传代、分化、冻存及复苏均与成年鼠神经干细胞相同。三、胎鼠神经干细胞的培养
胎鼠来源的神经干细胞较新生鼠和成年鼠具有更高的增殖和分化潜能，因此很多实验中需要培养胎鼠神经干细胞。
胎鼠神经干细胞的培养所需的试剂和步骤与新生鼠海马神经干细胞的培养大致相同，只是取材的时间和部位不同，本文采用的是小鼠胚胎14天脑神经节的隆起处（ganglionic eminence，GE）培养胎鼠神经干细胞。GE区域的取材见图1-13所示。图1-13 GE区域的取材引自：Andrew, Chojnacki, Samuel. et al. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature Protocols, 2008, 3(6): 935-940.参考文献
［1］Guo W, Patzlaff NE, Jobe EM, et al. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 2012, 7(11): 2005-2012.
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