作者：刘用成
出版社：中国轻工业出版社
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高等职业教育“十二五”规划教材·食品微生物检验技术试读：
前言
近十年来，我国食品工业取得了举世瞩目的成绩，已成为国民经济中增长最快、最具活力和发展潜力的经济增长点。从1997年至今，中国食品行业的产值在制造类GDP总量中始终占第一位，近几年来一直以超过20%的速度发展。食品工业在满足人们对食品消费的同时，也引起了人们对食品安全的高度关注。我国政府历来重视食品安全，制定了各种与食品安全有关的法律、法规。2005年至今，国务院、卫生部、国家工商行政管理总局、国家食品药品监督管理局等部门先后发布了关于食品安全监管和食品安全专项整治的通知等，同时把食品安全列入《国家中长期科技发展规划》公共安全重点领域的优先课题。最近几年，卫生部还先后修订和制定了许多食品卫生微生物学检验、理化检验等国家标准，为食品安全构筑起了一道道坚固的堤防。作为食品微生物学检验工作者，更有责任和义务担当起食品安全的重任。
本书原名《食品检验技术（微生物部分）》，自2006年出版以来，颇受广大读者的欢迎。上一版出版至今已有六七年时间了，其中很多内容已不适应国家和人们对食品安全的要求。为了不辜负广大读者对本书的厚爱，编者对原书进行了较大幅度的修订，并更名为《食品微生物检验技术》。
本次修订总的指导思想是体现食品卫生微生物学检验新的国家标准，体现食品高级检验工所必需的微生物学基础理论知识和操作技能要求，所以修订的重点是原书的第五、六、八章。由于国家新发布的有些微生物学检验标准中，修改了培养基和试剂，所以第三章所列的一些试剂和培养基也作了较大幅度的增删和修改。本书还增加了附录二和附录三，这不论对于使用本书的师生，还是将来从事本专业工作的学生，都不无裨益，尤其对非在职学习而希望报考高级食品检验工的读者，帮助也许更甚。修订后的本书仍保持了原来架构和体例，这将方便曾使用过该书的相关老师的教学。
修订后的本书，更适用于食品生产、食品销售、食品商检、卫生防疫的微生物学检验人员及相关人员的学习和参考。
此次修订，郝涤非教授付出了较多的艰辛和努力，新增和改写了部分章节。在修编的过程中得到了教育部高等学校高职高专食品类专业教学指导委员会主任贡汉坤教授的支持，编者在此一并致以衷心的感谢。
由于时间仓促，编者水平有限，资料的搜集也不够全面，错误和疏漏在所难免，恳请读者批评指正。刘用成2012年初夏于长沙
第一版 前言
近年，我国高等职业教育蓬勃发展，为我国社会劳动力就业、加强职业技能培训和产业结构优化升级，作出了积极贡献；对于把巨大的人口压力转化为人力资源优势，使我国的经济发展切实地转到依靠科技进步和提高劳动者素质的轨道上来产生了深远的意义。为适应高职教育快速发展的大好形势，中国轻工业出版社多次召集高职院校食品类专业骨干教师的教学改革和教材建设研讨会。2005年3月在深圳召开的全国食品系列教材建设研讨会上，决定组织编写适应新形势下的全国食品系列高职教材。本人很荣幸地应邀担任《食品检验技术（微生物部分）》的主编。
民以食为天，食品与人民群众的生活息息相关。在我国人民群众生活水平极大提高的今天，人们对食品已经不再仅仅是满足于果腹，而是要吃好，吃得营养和健康，吃出令人陶醉的饮食文化。为了保障人民群众对食品的高水准要求，首先应该保证食品的安全卫生。作为食品从业人员和食品卫生监督工作者，掌握食品微生物学检验技术是神圣的职责，也是不可或缺的技能。
食品工业在我国的国民经济中占有很大比重。据不完全统计，它在我国国民经济中所占GDP的比重达10%左右，个别省份达到了30%。食品工业为我国的出口创汇也作出了重大贡献。保证食品的安全卫生，是食品工业良性发展和积极出口创汇的重要前提。掌握食品微生物检验技术，是保证食品安全卫生的重要手段，是为食品工业健康发展保驾护航。
本书是编者在多年的教学实践和社会调查的基础上进行组织和编写的。其宗旨是着力培养适应食品工业发展和超市、农贸市场（国家要求今后的大型超市和农贸市场应配有食品检验人员）、食品卫生监督等部门需要的高素质食品检验技能人才，为满足本专业高职学生就业打实基础，创造条件。所以本书在编写中，时刻牢记温家宝总理在全国职业教育工作会议上关于“深化教学改革，注重学以致用”的指示。全书以作为食品微生物检验人员必须掌握的一些应知应会的基本常识和技能技术为主，淡化相关的理论知识。通过本书的学习，学生能够全面系统地掌握检验技术，既掌握食品卫生学方面关于细菌总数、大肠菌群数的检验技术，又掌握由食品传染给人的病原微生物的检验技术。食品微生物的检验随着科学技术的进步，正由传统的检验方式朝着快速检验的方向发展，因此我们也介绍了食品微生物的快速检验方法。国家规定，食品检验人员应持证上岗，为了读者实训和考证的需要，书末还编录了两套“高级食品检验工技能操作考试模拟试卷”。总之，希望读者能通过本书的学习，为就业创造条件，为食品工业的发展、为人民群众的身体健康发挥作用。本书还可供食品生产、食品商检、卫生防疫的微生物学检验人员及相关人员学习和参考。
参加本书编写的有湖南科技职业学院刘用成教授、江苏食品职业技术学院郝涤非副教授（第二章）、河南信阳农业高等专科学校刘开华（第三章）、新疆轻工职业技术学院李芳（第四章）、江苏经贸职业技术学院郑萍（第五章）、北京电子科技职业技术学院刘玮（第六章）、广东轻工职业技术学院刘晓蓉（第七章、第八章）。刘用成教授任主编兼统稿，郝涤非副教授、刘晓蓉老师任副主编。
微生物学家、湖南师范大学博士生导师邓乐教授、湖南科技职业学院院长、博士生导师杨栋梁教授在百忙中主持审阅了本书全稿。本书的编写还得到了江苏食品职业技术学院食品系主任翟玮玮副教授、中国轻工业出版社白洁编辑的大力支持，编者在此一并致以诚挚的谢意。
由于水平有限、时间仓促，书中不妥和失误之处诚望读者批评指正。刘用成
第一章 食品中的微生物及其检验
第一节 食品中的微生物
学习目标
1.了解食品中的微生物主要来源于土壤、空气和水，因此应注意食品从原料到加工、储运、销售等各个环节的卫生。
2.了解不同微生物对营养的要求有所不同，因此，不同食品的变质，引起其变质的微生物类群也会不同。
3.了解评价食品质量的主要标准。
4.了解食品检验中细菌总数、大肠菌群数的定义及其检验意义。
自然界中广泛地存在着各种微生物，无论是高山、陆地、江河、湖泊、海洋还是空气中。在植物和动物的体表、体内也存在多种微生物。因此，动物性食物、植物性食物或由它们加工成的各种食品，就不可避免地存在着微生物。
自然界中存在的微生物，有些可以用来制造食品或制药、制酶等，为人类所利用；有些能使食品腐败变质，以致这些食品人们不能食用，造成浪费；还有的微生物能引起人体疾病，导致人们健康受损，甚至危及人的性命。因此，我们在搞清微生物特性的基础上，了解食品中微生物的来源，对于保障食品卫生和进行食品微生物的检验都具有重要意义。食品中微生物的来源主要有以下几个方面。
一、来自土壤中的微生物
土壤是微生物的“天然培养基”，在这里有供微生物生长繁殖的大量有机物和无机盐，还有供它们生活的空气、水分，土壤也具有一定的酸碱度和较恒定的温度，这为微生物的生存提供了充足的条件。虽然不同土壤，微生物的种群和数量可能不同，但总的来说，土壤中存在有自然界中绝大部分的微生物，它也是食品中微生物存在的主要源头。
根据不同土壤的分析统计，每克肥沃土壤中，通常含有几亿到几十亿个微生物，贫瘠土壤也含有几百万到几千万个微生物。在这些微生物中，以细菌最多，占土壤中微生物总数的70%～80%，其次是放线菌、霉菌及酵母菌等。按其营养类型来分，主要是异养菌，但自养型的细菌也普遍存在。
不同土壤中，微生物种类的分布不同。在酸性土壤中，霉菌较多；碱性土壤和含有机质较多的土壤，细菌、放线菌较多；在森林土壤中，分解纤维素的微生物较多；在油田地区的土壤中，分解碳氢化合物的微生物较多；在盐碱地中，可分离出嗜盐微生物。
土壤也是某些病原微生物存在的温床，如炭疽芽孢菌、肉毒梭状芽孢菌、破伤风菌等，特别是它们的芽孢体，可以在土壤中几十年不死。这些病原体一旦散布出去感染人畜，污染食品，就有可能在人畜体内大量繁殖，危害人畜健康。还有些肠道致病菌，随人畜的排泄物也很容易污染土壤。
二、来自水中的微生物
江河、湖泊、海洋、池塘、水井或下水道中，都存在着大量的微生物。甚至在摄氏几十度的温泉中，也存在微生物。可以说，在自然界中，只要有水的存在，就有微生物存在。一般来说，越不清洁的水体，微生物的数量和种群越多。
水体中的微生物主要来自土壤、空气、动物的排泄物、动植物尸体、工厂废水和生活污水等。
不同的水体微生物种群和数量不同。井水、泉水，因为经过很厚土层的过滤，含有机营养物很少，微生物的种类和数量较少；溪流中，由于营养物缺乏，微生物也不太多，常见的主要是一些革兰氏阴性无芽孢菌；江河、湖泊、池塘中的微生物主要来自土壤和生活污水。这些水中的微生物与其周围陆地的情况有关。海洋和咸水湖中的微生物主要是一些嗜盐类细菌。
江河、湖泊、池塘、溪流的水体中，微生物的种群和数量随季节和气候条件的不同有显著的变化。河水泛滥和多雨季节，陆地上的污物被冲洗到水流中，因而细菌数目会显著增加。
水也是传染病的媒介。水中最常见的病原微生物，主要是一些肠道致病菌，如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等，牛瘟病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒等也可能污染到水中。食品的洗涤、加工等都需要大量的水，而水的洁净与否，关系到食品的质量、保藏和安全卫生等。
三、来自空气中的微生物
空气虽不是微生物生长繁殖的场所，但空气中也存在大量微生物，并且越是人群和动物活动多的场所，空气中的微生物就越多。这是因为空气中的微生物主要是附着在空气中的尘埃颗粒上或短暂悬浮于空气中的微小液滴内，它们随空气的流动而传播。人群越密集的地方，由于人们的活动使空气振动和流动，产生的尘埃越多，微生物也越多。空气湿度大或大雾弥漫的空气中，微生物也较多。
存在于空气中的微生物，主要是一些霉菌孢子及某些细菌的芽孢，微生物的营养细胞是很难生活在空气中的，这是因为空气中营养物质缺乏、环境干燥、有紫外线的照射等，都不适宜微生物长期生活。但芽孢和孢子具有一定的抵抗不良环境的能力，它们可以随空气的流动而四处传播。
因为空气中的微生物最多的是霉菌孢子，当食品暴露在空气中，首先侵入的是霉菌，当环境湿度较大时，也可能受到一些细菌和可能存在的病原菌的污染。
病原微生物在空气中一般很容易死亡，但结核杆菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、脑炎双球菌、炭疽杆菌、流行性感冒病毒、脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。
食品在加工、储运、销售等过程中，均不可避免地与空气直接接触，都有被各种微生物污染的可能。
第二节 微生物引起食品腐败变质
从广义的角度来说，凡引起食品理化性质发生改变的现象，都称为食品变质。导致食品变质的因素有物理的、化学的，也有生物的。比如油脂的氧化酸败，主要是理化因素引起的；有时发现米、面放久了生了小虫，使之陈变不可食用，这是生物因素——昆虫为之。在大多数情况下，引起食品变质的主要是生物因素——微生物。
食品的原料主要是动物性和植物性原料，以及加工时不可缺少的水，它们总是被微生物污染。食品在加工、储运过程中，也经常被微生物污染。这些微生物在一定条件下，可以在食品中大量生长繁殖，使食品失去原有的色、香、味，转变为不符合食品卫生要求的变质食品，再不能供人们食用。在这里有两点需要指出：第一，许多发酵食品，比如酸乳，就是通过乳酸细菌这类微生物发酵而制取的，从现象上看，也是一种食品的变质过程，但从变质的性质上看，没有产生有害物质，只是由一种食品变成了另一种食品。所以，这与我们一般意义上的食品变质应区别开来。第二，由于机械作用，使食品的形状发生了改变，它也不属传统意义上的食品变质范畴，比如，有的食品由于受到挤压、碰撞等变形了，压碎了。我们所说的食品变质一般是指食品在加工、储藏或运输等过程中产生了有害人们身体健康的因素。
食品是否变质，要有内因和外因的共同作用。大多数食品是动植物组织及其制品，含有有机物（如糖类、蛋白质等）、水分、无机盐，活体的动植物组织还含有生物酶。多数食品是胶体，其结构易破坏和变化。有些食品中含有不饱和脂肪酸、色素、芳香物质等，其结构很容易被氧化，这些因素都是使食品变质的内因。光、电、环境中的微生物，是食品发生变质的外因。在一般情况下，内因很容易与外因产生作用，尤其是微生物，在自然界分布极其广泛，在食品加工、储藏、运输、销售等环节中，通过水、空气、土壤、用具、器皿、动物和人而污染食品。
微生物能引起食品变质，但不是每种微生物对所有食品的变质作用都一样。也就是说不同性质的食品变质，可能是由不同种类的微生物引起的。这是因为不同微生物对营养物质的需要是有选择性的，我们了解这一点，对食品微生物的分析与检验具有重要作用。
一、分解蛋白质的微生物
含蛋白质的食品一旦被微生物分解造成败坏变质，会产生难闻的气味，这种变质，在食品生化上一般把它称作腐败。难闻气味的产生，主要是微生物分解蛋白质中的赖氨酸等产生的，微生物分解蛋白质中的某些氨基酸，能生成有毒性的胺类。例如：
还有色氨酸脱羧产生的色胺，含硫氨基酸脱羧产生的硫醇类物质等，均对人体产生毒性。在高等动物和人体内还有一种鸟氨酸，存在的数量也不是很微少，虽然不是构成蛋白质的氨基酸，但参与体内尿素循环，当尸体腐败，这种氨基酸会分解脱羧产生气味十分难闻的腐胺，也有毒性。
分解蛋白质的微生物，主要是细菌，其次是霉菌和酵母菌。不能产生胞外酶的细菌，分解蛋白质的能力极弱。使食品中蛋白质分解变质主要是产生胞外酶的细菌。它们主要有：芽孢菌属、单胞菌属、变形杆菌属、梭状芽孢杆菌属等。这些属中的蛋白质分解菌，在以蛋白质为主体的食品上能良好生长，即使在无糖分存在的情况下，也能较好生长。还有一些细菌，对蛋白质的分解能力虽然没有上述细菌强，但也有一定的分解能力。它们主要是葡萄球菌属、八叠球菌属、小球菌属、产碱杆菌属、肠细菌属、埃希氏杆菌属等。
按食品种类来区分，引起鱼贝类食品变质的细菌，主要是球菌、假单胞菌属、黄色杆菌属、无色杆菌属、赛氏杆菌属等；引起禽畜肉食品变质的主要是一些好氧性细菌，如兼氧性芽孢杆菌、变形杆菌等。
使蛋白质食品变质的霉菌，主要有青霉属、曲霉属、根霉属、毛霉属、木霉属和复端孢霉属中的多种霉菌。尤其是沙门柏干酪青霉、洋葱曲霉，分解蛋白质能力特别强，当环境中存在较多糖类时，更能促进蛋白酶的形成，分解蛋白质能力更强。
一般来说，酵母菌分解蛋白质的能力比较弱，就目前的研究结果来看，红棕色舒逊氏酵母、越南酵母、巴氏酵母、啤酒酵母等，能使凝固的蛋白质缓慢分解。红酵母属中有的酵母能分解酪蛋白，促使乳制品凝固。
二、分解糖类的微生物
含糖类和脂肪多的食品被微生物分解产酸而变质败坏，这种变质，一般称酸败。其本质是糖类在微生物糖酶（脂肪在脂酶）的作用下，生成了多种有机酸。
微生物分解糖类的简单过程一般如下：
多糖→双糖→单糖→丙酮酸→有机酸、醇、醛等→二氧化碳和水
例如酒精酵母，在缺氧条件下，分解葡萄糖产生二氧化碳和酒精：
醋酸菌可将醇氧化成醋酸：
乳酸菌可将糖发酵产生乳酸：
丁酸细菌可将糖发酵产生丁酸等：
分解糖类的微生物主要是酵母菌，其次是霉菌和细菌。
绝大多数酵母菌不能直接分解淀粉、纤维素之类大分子糖类，然而多数能利用有机酸、二糖、单糖等。比如蔗糖含量高的食品，细菌生长受抑，但酵母菌能生长繁殖。果汁、果酱、蜂蜜、果胶、酱油等易被酵母菌污染而引起变质。
大多数霉菌能分解含简单糖类多的食品。几乎所有霉菌都有分解淀粉的能力。能分解大分子纤维素、果胶的霉菌很少。能分解果胶质的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、灰绿曲霉、毛霉等。分解纤维素的霉菌有毛壳霉、灰色土霉、绿色木霉、黑曲霉、土曲霉、烟曲霉、黄青霉、淡黄霉等，其中绿色木霉分解纤维素能力特别强。霉菌还有利用某些简单有机酸或醇的能力。
分解糖类的细菌只有少数。分解淀粉能力较强的细菌有芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌属（如淀粉酸状芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌等）。分解纤维素和半纤维素的细菌仅芽孢杆菌属和八叠球菌属的少数种。能分解果胶质的细菌有欧氏杆菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属中的一些种。它们能分泌果胶酶，软化果蔬组织。绝大多数细菌能直接利用单糖、双糖，有少数细菌还能直接利用有机酸和醇类。
三、分解脂肪的微生物
脂肪是加工某些食品的主要原料，也是某些食品的重要成分。脂肪被微生物分解变质主要产生酸败气味。其本质是脂肪在微生物酶作用下分解生成有机酸等。
分解脂肪的微生物主要是霉菌，其次是细菌和酵母菌。
能分解脂肪的霉菌的种类较多，最常见能分解脂肪的细菌有黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉、娄地曲霉、代氏曲霉、无根根霉、脂解毛霉、爪哇毛霉、白地霉和芽枝霉等。
分解脂肪能力强的细菌并不多。常见的有假单胞菌属、黄杆菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、赛氏杆菌属、小球菌属、葡萄球菌属和芽孢杆菌属中的一些种。
能分解脂肪的酵母菌也不多。常见的有解脂假丝酵母，这种酵母不发酵糖类，但分解脂肪和蛋白质的能力很强。因此，肉类食品和乳制品败坏时，也应考虑酵母菌引起变质的可能性。
在自然界中，没有一种微生物能在各种不同组分组成的食品上都能生长，同时，也没有一种食品能适合所有微生物生长，细菌、酵母菌、霉菌这三大类微生物对不同营养物质的分解能力均显示了一定的选择性。因此，根据食品组成成分的特点，能推测引起食品变质败坏的主要微生物的可能类群。我们在进行食品微生物检测时，则可根据食品成分的组成特点，有针对性地进行。
第三节 食品微生物检验的意义
俗语说“民以食为天”。人们的生存，每天都离不开食品。而卫生的食品含有人体所需的营养素，提供了生命活动的能量和满足了人体生长发育需要。如果食品不卫生，不但降低了营养价值，而且容易引起疾病，损害健康，甚至危及生命。
不卫生的食品，有这样几个方面的因素：第一，食物中存在天然毒素，如河豚的卵巢、肝脏等内脏、皮肤、血液等处就存在剧毒的河豚毒素，新鲜的黄花菜中的秋水仙碱，发芽马铃薯中的茄苷，有毒蘑菇中的一些毒肽、毒碱等；第二，环境污染，各种重金属、农药等进入食物被蓄积；第三，食品加工过程中，不合理的加工工艺使食品产生了有毒物质及不合理地使用各种化学添加剂；第四，食物被微生物污染，使之含有病原微生物或者由腐败微生物生长繁殖造成食品腐败变质，营养下降，有毒物质产生。在一般情况下，由微生物污染所引起的食品不卫生状况最容易发生和最为常见。
不符合卫生要求的食品若被人们食用，常常会出现食物中毒。为了保障食品安全和对人民群众身体健康负责，我国不但有食品卫生的立法，而且订立了各种严格的食品卫生标准，不符合食品卫生标准的食品不准销售和食用。国家食品卫生标准一般包括三个方面的内容：感官指标、理化指标和微生物指标。感官指标主要是通过眼看、鼻闻、手摸、口尝来检查食品外观的指标，它包括食品的色、香、味和组织状态等项内容。感官指标就是通过感觉器官来鉴定某种食品的色泽、香气、味道是否正常，有无霉变或其他异物污染，组织形状是否符合要求，或有否沉淀、混浊等现象。根据这些感官现象，可以初步判断食品的卫生状况或初步了解该食品是否发生腐败变质或变质程度。理化指标是指食品原料、生产、加工过程中带入的有毒有害物质，或由于腐败变质而产生的有毒有害物质。如食品中残留的农药、砷、汞等重金属，如酒中的甲醇含量等。微生物指标一般分为细菌总数、大肠菌群数和致病菌三项。各种食品是否符合国家卫生标准，只有通过科学的严谨的检验手段才能判断。本书主要对微生物指标进行介绍。
一、食品中细菌总数检验的意义
2食品中细菌总数通常指1g或1mL或1cm表面积食品检样，经过技术处理，在一定条件下做细菌培养后，所得细菌菌落总数。再换算2成1g或1mL或1cm表面积食品中含有的细菌总数。这种方法所得的结果是该食品每个单位中存在的活菌数。另一种方法是将检样经过适当处理（溶解或稀释），在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样的结果，既包括活菌数也包括死菌数，因此称细菌总数。但目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数，实际上是指菌落总数，也就是前一种方法所得之结果，它比较客观地反映了食品中污染了的存活的细菌总数。
鲜活的食品原料，一般来说其内部组织是没有细菌的，但若原料不新鲜，加工、储藏、运输、销售各个环节都可能被细菌污染，尤其是不注意各个环节的清洁卫生，被细菌污染的机会将更加大幅度地增多。只有注意各个环节的清洁卫生，食品被细菌污染的机会才会减少。
食品中污染细菌数量的多少，对食品卫生质量的影响是比较大22的。据有关报道，细菌总数为1×10个/cm的牛肉，在0℃下能保存5218天，而细菌总数为1×10个/cm时，在同样温度下，只能保存732天；鲜鱼表面细菌数为10个/cm时，在0℃下能保存12天，当细菌数52为1×10个/cm时，在同样条件下只能保存6天。还有人认为，当食67品中细菌数量达到1×10～1×10个/g时，可引起食物中毒。
食品中污染细菌数量的多少，与致病菌被污染的可能性也有一定的关系。一般来说，食品被污染细菌的数量越多，污染致病微生物的可能性也越大。据资料介绍，有科技工作者用猪肉做过这样的试验：34当猪肉平均每克污染细菌数为5×（10～10）个时，沙门氏菌的污44染率为11.7%，当细菌数为1×10～2×10个时，沙门氏菌的污染率为4419.14%，在2×10～5×10个时，沙门氏菌的污染率为25%，在5×46（10～10）个时，沙门氏菌的污染率高达57.4%以上。这充分说明，凡是细菌数含量高的猪肉食品，污染沙门氏菌的几率也相应增加。用蛋制品做试验，也有类似的规律性。
实践证明，了解食品中污染细菌数量的多少，有以下几方面的卫生意义：第一，可以作为食品被污染程度的标志，能够说明食品在加工、储运、销售等各个环节的清洁卫生、消毒情况，也能在一定程度上反映出食品的新鲜程度，是否变质；第二，可以用来预测耐存放的程度和期限；第三，食品中污染细菌的数量，可以与污染某些致病微生物联系起来，如蛋制品中细菌数过多，应考虑沙门氏菌污染的可能性比较大。因此，检验食品中的细菌数，可帮助我们注意食品加工、储运、销售等各个环节的清洁卫生，促进产品质量的提高，尽量降低细菌数量，特别是不使致病微生物污染食品有机可乘。
二、食品中大肠菌群检验的意义
大肠菌群是指一群好氧与兼性厌氧，能分解乳糖产酸的革兰氏阴性无芽孢杆菌。它包括大肠埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属等属细菌，其中以埃希氏菌属细菌为主。
一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人和温血动物的粪便。曾有人做过这样的试验，对6677份检出有大肠菌群的食品样品进行研究，发现几乎无一例不是来自粪便。也有人研究了人和禽畜的104份粪便，其结果是大肠菌群检出率几近100%。由此可说明，食品中检验出大肠群菌，表明食品曾受到人和温血动物粪便的污染。因此，大肠菌群的食品卫生意义，首选是它可以作为粪便污染食品的指示菌。如果有典型的大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便的短期污染，因为典型的大肠杆菌常存在于排出不久的新鲜粪便中，若是非典型大肠杆菌占优势，则说明食品受到陈旧粪便的污染，因为非典型大肠杆菌常存在于陈旧粪便中。
大肠菌群之所以能作为食品被粪便污染的指示菌，因为它们还具有这样一些特点：①在人和温血动物的大肠道中存在的数量很多，如果在食品中粪便含量只要污染有0.001mg/kg就能检出；②有来源特异性，仅来自人和温血动物肠道；③在外界环境中有较强的抵抗力而能存活一定时间；④检验方法相对简易。不过，我们也要了解的是，大肠菌群是嗜中温微生物，5℃以下就不能生长繁殖。所以对低温菌占优势的水产品及其他冷血动物为原料的食品，就不一定适应。有人研究提出，此类食品以肠球菌作指示菌更好。
沙门氏菌、志贺氏菌等是较常见的肠道致病菌，与大肠菌群来源相同，而且在一般条件下，它们在外界环境中生存时间也与大肠菌群相仿。可以说，有大肠菌群的存在，也可能同时有肠道致病菌的存在。因此，大肠菌群的另一个卫生意义是可以作为肠道致病菌污染食品的指示菌。实践证明，带沙门氏菌的鸡、鸭、猪、牛等禽畜，其肉制品中大肠菌群的检出率与沙门氏菌检出率往往正相关。当然，食品中检验出沙门氏菌，只能说明肠道致病菌也有污染的可能性，两者并非一定平行存在。例如家兔，患沙门氏菌病较少，带沙门氏菌亦少，其加工出来的兔肉，大肠菌群检出率即便很高，但沙门氏菌检出率并不很高，有时甚至完全检不出沙门氏菌。由此可知，食品中污染的粪便，虽然大肠菌群检出率是一致的，但不同的食品与不同的条件，肠道致病菌的检出差别是存在的。
要求食品中完全不存在大肠菌群，几乎是不可能的。重要的是食品中大肠菌群污染的程度，也就是说污染大肠菌群的多少。食品污染大肠菌群的数目，我国和其他一些国家都采用相当于100 g或100mL食品中的近似值来表示。一般称作大肠菌群近似值MPN（maimnm probable number）。不同的食品，国家食品卫生标准中规定有不同的MPN值。
三、食品中病原微生物检验的意义
从食品卫生的角度讲，食品中是不允许有病原微生物存在的。若食品中污染有病原微生物，人们食用后，就会发生食物中毒，危害身体健康，甚至可以致人非命。2005年6月，四川资阳、内江等地区有人食用了污染猪链球菌的猪肉，造成200多人中毒，38人死亡。所幸发现及时，政府有关部门采取严格的防疫措施和对患者进行积极治疗，才未造成更严重的后果。因金黄色葡萄球菌和肉毒梭状芽孢杆菌造成的食物中毒，几乎年年都有报道。所以食品卫生标准中规定，任何食品均不得检出致病菌。为了保障人民群众身体健康，我国政府对食品病原微生物的检验和研究都是十分重视的，制定有严格的食品卫生法规，严格控制病原微生物的扩散和传播。
由于病原微生物的种类很多，一般情况下，污染食品的致病菌的数量又不会很多，因而在实际中是无法对所有病原微生物进行逐一检验的。加之目前对某些病原微生物检测手段也还有一定的局限性以及检验方法本身允许的误差，因此，每一种食品中是否存在有病原微生物，对此难以做出准确的判断。所以，在目前的实际检验中，一般是根据不同食品的特点，选定较有代表性的致病菌作检测的重点，并以此来判断食品中是否存在致病性微生物。如蛋粉规定沙门氏菌，酸奶规定肠道致病菌和致病性球菌作为致病菌检测的代表。总之，加强对食品中病原微生物的监控和检测，防止食品病原微生物的传播而引起的人畜传染病的流行，将病原微生物扑灭在食品加工前和加工过程中，这样，人们的健康才能得到保障。同时，防止病原微生物通过食品途径传染给家禽家畜，对发展畜牧业，促进国民经济的发展，提高广大人民群众生活水平和生活质量，也会起到更有利的作用。
对病原微生物的检验，严格地说，还应该包括某些致病性病毒的检验，如1989年，上海30多万人患流行性甲型肝炎，就是吃了污染有甲肝病毒的毛蚶而引起的。近年发生的禽流感病毒在全世界也造成很大恐慌。但这些病毒的检验和确定往往更复杂，一般在专门机构进行。
综上所述，加强对食品微生物指标的检验，是保证食品卫生质量，保障人民群众身体健康的一项十分重要的有意义的工作。当然，如果把食品中细菌总数、大肠菌群数、致病菌的结果等以及其他有关指标（如理化指标）一起进行综合分析，一定会对食品的卫生质量得出更为科学和准确的结论。
四、食品微生物检验技术的发展
食品微生物检验包括定量和定性两方面。定量指食品中微生物的数量测定；定性则是根据食品中微生物表现出的各种性状特征，对微生物的种类进行鉴别。传统的食品微生物检验以分离纯化培养为基础，在细胞水平上，从形态特征、生化反应、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等诸方面鉴别微生物；现代的食品微生物检验融合了微生物学、生理学、生物化学、免疫学、分子生物学等学科的最新理论和先进技术，把对食品中微生物的鉴别深入到了遗传学特性的测定、细胞组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的领域，使食品微生物检验技术向快速、灵敏、特异的方向发展。
免疫荧光显微技术从20世纪60年代开始应用于食品微生物检验，1976年美国分析化学家协会（AOAC）正式将沙门氏菌属荧光抗体检出方法列入食品细菌学分析手册试行。我国从20世纪70年代初开始这方面的研究，至70年代末，从沙门氏菌属荧光抗体的制备到检验操作程序，建立了一套适合我国国情的技术，并开始从实验室研究向应用过渡。目前已成功应用免疫荧光显微技术从食品中快速检出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等，取得了显著的社会经济效益。
核酸探针技术又名基因探针技术或核酸分子杂交技术，是在20世纪70年代基因工程学基础上发展起来的一项新技术，该技术广泛地应用于基因工程及医学、兽医学的实验室诊断和进出口动植物及其-9-12产品检验方面。基因探针具有敏感性高（可检出1×10～1×10g的核酸）和特异性强等优点，已成功地将核酸探针技术用于沙门氏菌、弯杆菌、轮状病毒、狂犬病毒等多种病原体的检验上。核酸探针技术已被应用于检验食品中一些常见的病原菌，如产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起人和动物腹泻的主要病原菌之一，在常规食品的大肠杆菌检验时，产耐热肠毒素（ST）的大肠杆菌常用乳鼠试验来鉴定，操作复杂、耗时多，不适于进行大样本的检验，并且所用增菌方法还常导致质粒相关毒力的丧失。核酸探针技术特异、敏感而又没有放射性，且因不需要进行复杂的增菌和获得纯培养而节省了时间，减少了由质粒决定的毒力丧失的机会，从而提高了检验的准确性。另外在沙门氏菌的检验中，核酸探针技术也被广泛使用。
PCR技术是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛地应用于生物学科的众多领域，在食品致病性微生物的检验方面也具有很大的应用潜力。PCR技术有快速、特异、敏感等特点。如对食品中单核细胞增生李氏杆菌的检验，过去一直缺乏简单快速的分离鉴定技术，克隆培养的标准方法往往需要3～4周才能出结果；免疫学技术（如ELISA等）检验时也存在着特异性、敏感性差等问题。采用PCR技术对食品中李氏杆菌的溶血O-基因进行扩增，可在12h内完成整个检验过程，且样品中只需要含有5～50个细菌即可被检出。又如PCR技术能快速地检出肉食品中的沙门氏菌，检测的敏感性和特异性均为100%，保证了检验的准确性。尽管PCR技术还存在着一定的不足（是一种极灵敏的反应，不能有极少量的污染等），但随着该技术的进一步普及、发展和完善，必将会在食品微生物检验中得到更多的应用。
思考题
1.有哪些因素能引起食品变质？其中能引起食品腐败变质的主要因素是什么？
2.食品中的微生物主要来自哪些方面？
3.食品质量的评价指标有哪些？并具体解释之。
4.检验食品中的细菌总数具有什么重要意义？
5.检验食品中的大肠菌群数具有什么重要意义？
第二章 食品微生物检验的基本条件与设备
学习目标
1.了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微生物检验室。
2.认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。
3.认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。
第一节 微生物检验室
微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。
一、微生物检验室的基本条件
微生物检验室应具备保证显微镜、微生物分离培养及其基本化学实验顺利进行的基本条件。具体应有以下要求。（1）光线明亮，且避免阳光直射室内。（2）洁净无菌，地面及四壁平滑，便于清洁和消毒。（3）配有纱窗，可防蚊蝇、小虫的袭扰。（4）配有空调设备及防风、防尘设备，保证温度适宜，空气清新。（5）应有安全、适宜的电源和安全、充足的水源。（6）具备整洁、稳固、适用的实验台，台面以耐酸碱、防腐蚀的黑胶板为宜。（7）应设有相应的橱柜，用于显微镜及常用工具、药品的存放。（8）检验室的工作区域应与办公室区域明显分开。（9）一般样品检验应在洁净区域（包括超净工作台或洁净实验室）进行，洁净区域应有明显的标示。（10）病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（Biosafety level 2，BSL-2）进行。
二、检验员手册
微生物检验员应时刻记住：我们的检验对象可能有病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身招致污染，而且可能造成病原微生物的传播。为了做好工作，并保证安全，应做到以下几点。（1）随身物品勿带入检验室，必需的文具、实验数据、笔记本等带入后要远离操作部位。（2）进入检验室应穿工作服，自检验室进入无菌室时要戴口罩、工作帽，换专用鞋。（3）不在检验室内接待客人，不抽烟，不饮食，不用手抚摸头部、面部。（4）样品检验前应登记生产日期、批号，详细记录样品检验序号、检验日期、检验程序和结果。（5）室内应保持整洁，样品检验完毕后及时清理桌面。凡是要丢弃的培养物应经高压灭菌后处理，污染的玻璃仪器高压灭菌后再洗刷干净。（6）接种环用前用后均需火焰灭菌，吸过菌液的吸管、沾过菌液的玻片等用后，要浸泡在盛有3%来苏水或5%石炭酸溶液的玻璃筒内。其他污染的试管、玻皿等必须盛于指定的容器内，经灭菌后再洗涤晾干。（7）如有病原微生物污染桌面或地面，要立即用3%来苏水或5%石炭酸溶液，倾覆其上，30min后才能抹去。（8）如有病原微生物污染了手，应立即将手浸泡于3%来苏水或5%石炭酸溶液中10～20min，再用肥皂及水洗涮。（9）易燃药品如酒精、二甲苯、醚、丙酮等应远离火源，妥为保存。易挥发性的药品如醚、氯仿、氨水等，应放在冰箱内保存。（10）贵重仪器，在使用前应加以检查。使用后要登记使用日期、使用人员、使用时间等。（11）工作完毕，要仔细检查烘箱、电炉是否切断电源，自来水开关是否拧紧，培养箱、电冰箱的温度是否正常，门是否关严，所用器皿、试剂是否放回原处，工作台是否用消毒液抹拭等。（12）离开检验室前一定要用肥皂把手洗净，脱去工作衣、帽、专用鞋。关闭门窗以及水、电、天然气等开关，以确保安全。（13）几种意外情况的处理
①遇火险，立即关闭电源开关、天然气（煤气、液化气）开关，如果酒精、乙醚、汽油着火，切勿用水，应以沙土灭火（实验室应备有防火沙包）。
②皮肤破伤，先除尽异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂以2%碘酒。
③灼烧伤，涂以凡士林油、5%的鞣酸或2%的苦味酸。
④化学药品腐蚀伤，若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗，再用5%碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和之；若为强碱腐蚀，用大量水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和之。若是眼部受伤，经上述步骤处理后，最后滴入橄榄油或液体石蜡1～2滴。如有污染物进入嘴内，要立即吐出，并以大量清水漱口，切勿使漱口水咽下，必要时可服用有关药物，以防发生感染。病原微生物污染工作服时，应立即脱下，并用高压蒸汽灭菌器消毒。
第二节 无菌室
一、无菌室的结构与要求
1.无菌室的结构
无菌室通常包括缓冲间和工作间两大部分。无菌室的面积和容积2不宜过大，以适宜操作为准，一般可为9～12m（应按每个操作人员2占用面积不少于3m设置）。缓冲间与工作间的比例可为1∶2，高度2.5m左右为宜。工作间内设有固定的工作台、紫外线灯、空气过滤装置及通风装置，应有空调设备、空气净化装置，以便在进行操作时切实达到无尘无菌。工作间的内门与缓冲间的门尽量迂回，避免直接相通，以减少无菌室内的空气对流，保持工作间的无菌条件。窗户应装有两层玻璃以防外界的微生物进入。
无菌室结构见图2-1。图2-1 无菌室
2.无菌室的要求（1）无菌室内墙壁应光滑，尽量避免死角，便于洗刷消毒。（2）应保持密封、防尘、清洁、干燥。操作时尽量避免走动。（3）室内设备简单，禁止放置杂物。（4）工作台、地面和墙壁应用新洁尔灭或过氧乙酸溶液擦洗消毒。（5）无菌室内应备有专用开瓶器、金属勺、镊子、剪刀、接种针、接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上烧灼灭菌。（6）杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒。开灯照射30min后方可进入室内工作。（7）无菌室内应备有盛放3%来苏水或5%石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有75%酒精棉球，用于样品表面消毒及意外污染消毒；无菌室每次使用前后，用紫外线灯照射。（8）根据无菌室的净化情况和空气中含有的杂菌种类，可采用不同的化学消毒剂。如果霉菌较多，先用5%石炭酸全面喷洒室内，再用甲醛熏蒸；如果细菌较多，可采用甲醛与乳酸交替熏蒸。一般情33况下，也可酌情间隔一定时间用2mL/m甲醛溶液或20mL/m丙二醇溶液熏蒸消毒。
二、无菌室的熏蒸消毒
无菌室的熏蒸消毒主要采取甲醛熏蒸消毒法。
1.加热熏蒸
按熏蒸空间计算量取甲醛溶液，盛在小铁筒内，用铁架支好，在酒精灯内注入适量酒精，将室内各种物品准备妥当后，点燃酒精，关闭门窗，任甲醛溶液煮沸挥发。酒精灯内酒精的量最好能在甲醛溶液蒸发完后即自行熄灭。
2.氧化熏蒸
准备一瓷碗或玻璃容器，称取高锰酸钾（甲醛用量的1/2）倒入，另外量取定量的甲醛溶液，室内准备妥当后，把甲醛溶液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾而挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛溶液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛溶液挥发为气体。熏蒸后关门密闭应保持12h以上。
甲醛溶液熏蒸对人的眼、鼻有强烈刺激，在一定时间内不能入室工作。为减轻甲醛对人的刺激作用，熏蒸后12h，再量取与甲醛溶液等量的氨水，迅速放入室内，同时敞开门窗放出剩余的有刺激性的气体。
三、无菌室无菌程度的测定
一般采用平板法测定无菌室的无菌程度。（1）将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭过菌的培养皿内，每皿约15mL培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，10min后，盖好皿盖。（2）将培养皿倒置，于37℃培养24h后，观察菌落情况，统计菌落数。（3）如果每一个培养皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应再重复以上步骤，进一步对无菌室进行灭菌。
第三节 食品微生物检验的常用仪器设备
一、显微镜
显微镜是食品微生物检验工作中常用的仪器之一，应对它十分熟悉。
根据光源不同，显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者以电子束为光源。（一）光学显微镜
光学显微镜有多种。食品微生物检验常用的显微镜有单目普通光学显微镜、双目体视普通光学显微镜、相差显微镜、紫外荧光显微镜等。
1.普通光学显微镜
普通光学显微镜简称显微镜（图2-2），它包括单目普通光学显微镜和双目体视普通光学显微镜，后者比前者多一个镜筒，可以双眼同时观察。它们的构造主要分为两部分：机械部分和光学部分。图2-2 单目显微镜的构造（1）机械部分 显微镜的机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配合和灵活调控。
镜座：镜座为显微镜的底座，用以支持整个镜体。
镜臂：镜臂连接镜座和镜筒，是支持镜筒及取放显微镜时手握的部位。
镜筒：镜筒是由金属制成的圆筒，连在镜臂的前上方，上端装目镜，下端接物镜转换器，形成目镜和物镜间的暗室。镜筒长度影响放大倍率和成像质量。显微镜的筒长一般为160mm，此数字标在镜筒的外壳上。
物镜转换器（旋转器）：物镜转换器接于镜筒的下方，可自由转动，盘上有3～4个圆孔，一般安装有低倍镜、高倍镜、油镜三种接物镜。转动转换器，当听到碰叩声时，物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通，使物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。
镜台（载物台）：镜台在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔。镜台上装有弹簧夹，用以夹持玻片标本，有的装有玻片标本推进器（推片器），更方便装片标本作左右、前后方向的移动。
调节器：调节器为装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台或镜筒作上下方向的移动。
A.粗调节器（粗螺旋）：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台（或镜筒）作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离，使物像呈现于视野中，通常先用粗调节器迅速找到物像。
B.细调节器（细螺旋）：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台或镜筒缓慢地升降，从而得到更清晰的物像。细螺旋每转一圈的移动距离大约是100μm。（2）光学部分 光学部分由目镜、物镜、聚光器、光源、反光镜、滤光片等组成，它们直接影响显微镜的性能，是显微镜的核心部分。
光源：有自然光源和人工光源（主要是电光源），较新式显微镜的光源是安装在镜座内，由一种小的强光灯泡发光，并有电流调节螺旋，可调节其光强度。有的普通光学显微镜在镜座内没有光源，但在镜座上安有反光镜。
反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。
集光器（聚光器）：位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。
A.聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。
B.光圈（虹彩光圈）：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。
目镜：装在镜筒的上端，通常备有2～3个，上面刻有5×、10×或15×等符号表示放大倍数，可根据需要选用。
物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3～4个物镜，其中最短的刻有“10×”以下符号的为低倍镜，较长的一般刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“90×”“100×”符号的为油镜。此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。
在物镜上，还有镜口率（N.A.）的标志，它反映该镜头分辨力的大小，其数值越大，表示分辨率越高。常见物镜的镜口率如表2-1所示。表2-1 不同物镜的镜口率
表2-1中的工作距离是指显微镜处于工作状态（物像调节清楚）时物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为0.17mm）上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100（倍）。
显微镜性能的好坏，不仅取决于放大倍数，还与显微镜的分辨力有关。分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，它取决于物镜的分辨率（D）。D表示物镜所能分辨出的两点间的最小距离。D值越小，显微镜的分辨能力越大。D值取决于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：D=0.5λ/N.A.N.A.=nsin（α/2）
式中n——介质折射率；
α——镜口角（标本对物镜镜口的张角）；
N.A.——镜口率（numeric aperture）。
镜口角总是要小于180°，所以sin（α/2）的最大值必然小于1。
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05～0.95；油镜头用香柏油等为介质，镜口率可接近1.5。几种介质的折射率见表2-2。表2-2 几种介质的折射率
普通光线的波长为400～700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常不会超过1000倍。我们在选择目镜时，不宜用放大倍数过大的，不然反而影响观察效果。
滤光片：用于增大标本之间的反差，多应用显微照相。
2.荧光显微镜
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射也可发荧光，荧光显微镜（图2-3）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
荧光显微镜和普通光学显微镜有以下的区别。（1）照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。（2）光源为紫外光，波长较短，分辨率高于普通显微镜。（3）有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人的眼睛。
3.暗视野显微镜
暗视野显微镜（图2-4所示为其光路原理）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。图2-3 尼康E800荧光DIC显微镜图2-4 暗视野显微镜照明方式
4.相差显微镜
相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。图2-5是相差显微镜的光路原理。
相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了（1/4）λ（波长），如果再增加或减少（1/4）λ，则光程差变为（1/2）λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的两个特殊之处。（1）环形光圈位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。（2）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟（1/4）λ。相位板分为两种：
①A+相板：将直射光推迟（1/4）λ，两组光线合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。
②B+相板：将衍射光推迟（1/4）λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），标本结构比周围介质更加变暗。
5.倒置显微镜
组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（图2-6）。用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。图2-5 相差显微镜照明原理图2-6 莱卡倒置显微镜
进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC（微分干涉差显微镜，能显示所观察标本结构的三维立体投影影像）、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便，用途更广。（二）电子显微镜
在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastruc-tures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子具有波的特性，是一种只有可见光十万分之一长度的波，如果用电子束代替普通光学显微镜的可见光，就可极大提高显微镜的放大倍数和分辨力，就能把病毒，甚至像蛋白质、核酸一类的大分子化合物的分子结构也能看清楚，电子显微镜就是这种显微镜。
电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统五部分构成。
目前使用的电子显微镜主要有三种：透视电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道电子显微镜。
1932年Ruska发明了以电子束为光源的透视电子显微镜（transmission elec-tron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压的平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关。次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
目前扫描电镜的分辨力为6～10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000×。
扫描隧道电子显微镜（scanning tunneling microscope，STM）由 Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到1nm的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV～2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。
利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
电子显微镜虽然放大倍数大，分辨率高，但不能观察活体微生物。食品微生物检验一般也不需使用。
二、培养箱
培养箱又称保温箱，是培养微生物的主要仪器，如图2-7所示。
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]