作者：胡恒宇 著
出版社：化学工业出版社
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降解石油烃产甲烷菌群筛选及应用试读：
前言
在对老油田开发过程中，提高石油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。经过开采以后，大量的残余油滞留在地下，因而如何利用残存在油藏中的石油成为一项重要课题。本书涉及的微生物降解石油烃产甲烷技术，将成为对残余石油进行利用的一条有效途径。
目前大部分的石油污染土壤生物修复的基础研究主要集中在好氧生物修复，本书针对石油污染土壤生物修复的实际情况进行了厌氧降解菌的基础探讨，为厌氧生物修复技术提供了理论基础；同时对石油污染土壤生物修复的土壤理化性质和石油烃组分的纵向分布进行了阐述，并使用纵向分布特征对厌氧生物修复技术的可行性进行了分析；系统地阐述了厌氧微生物对石油烃及石油烃模式物的降解特性，建立相关降解动力学模型，并通过多种分析手段对降解特定的石油烃化合物进行了代谢途径的推测；将传统培养分离方法和现代分子生物学方法相结合阐述了厌氧微生物的群落结构和多样性，对厌氧混合菌在不同的石油烃模式物下的微生物群落结构和多样性进行了分析。
本书阐述从油井采出液和含油污泥中筛选的降解石油烃产甲烷菌群，系统阐述温度和压力条件对产甲烷菌群的影响，运用高温模拟蒸13馏和离子色谱仪分析产甲烷菌群对石油的降解情况。通过同位素C示踪方法阐述降解石油烃产甲烷的微生物菌群，并且利用二维高效液相色谱-质谱分析菌群降解副产物。
本书共分为7章，其中第1章绪论，第2章降解石油烃产甲烷菌群的初筛，第3章高效产甲烷菌群的建立，第4章混合菌中单菌鉴定及混合菌培养条件的优化，第5章生长激活剂对菌群产甲烷的影响，第6章降解石油烃产甲烷的机理初探以及第7章的结论及展望。全书具有较强的技术性和针对性，适用于石油化工、生态环境、生物工程等领域的工程技术人员、科研人员和管理人员参考，也可供高等学校环境科学与工程、生态工程、化学化工及相关专业师生参阅。
本书主要选取多口油井采出液和油田含油污泥，分析其中的厌氧降解石油烃产甲烷菌群；其中油田采出液（YH）和含油污泥（TH）均按照厌氧条件培养。经过初筛，油田采出液中YH5菌群的甲烷产量最高。含油污泥样品中，TH2菌群的甲烷产量最高；而后将YH5和TH2两种菌群混合配比，最终得到混合后的产甲烷菌群HYH5。在相同条件的培养基中，HYH5菌群与YH5菌群、TH2菌群相比，高于YH5菌群和TH2菌群的甲烷产量。在HYH5菌群降解石油烃产甲烷前后红－1外光谱分析表明：降解后出现了3380 cm的振动峰，表明有羟基类化合物产生。并且通过气相色谱-质谱和高温模拟蒸馏仪分析降解后的石油样品表明：石油中的部分饱和烃被微生物降解，而通过离子色谱仪分析HYH5菌群的降解产物，发现有长链酸存在，如十六酸、十八酸、二十酸、二十二酸。而在考虑温度和压力对HYH5菌群产甲烷的影响，在其他培养条件都相同的情况下，低温30℃时，其甲烷产量最高，高温60℃时，其甲烷产量较低。而压力对HYH5菌群降解石油烃产甲烷也有显著影响，在常压下，HYH5的甲烷产量较高，
在高压15MPa下较低。本书对厌氧混合菌群HYH5中的单菌多次分离、纯化，共获得三株降解石油烃的单菌，分别命名为 HYH5-1、HYH5-2和HYH5-3。通过提取菌株 HYH5-1、 HYH5-2和HYH5-3的DNA，对其16S rDNA V3区进行扩增，比对得到16S rRNA的部分序列，鉴定出HYH5菌群中的单菌HYH5-1与Thermodesulfobiaceae bacterium enrichment culture clone 相似性最高，而HYH5-2与另一株厌氧降解石油烃产甲烷菌相似，相似度达到97%，对HYH5-3的序列进行比对，表明其与Uncultured Methanomethylovorans sp.clone最相似，为高温油藏中的产甲烷古菌，八叠球菌属。本书研究还表明：相对于其他表面活性剂，生物表面活性剂明显提高HYH5菌群降解石油烃产甲烷的效果；同时碳酸氢盐也可以促进HYH5菌群产甲烷。钼离子和锌离子的共同作用也可以提高其甲烷产量，但是相对于锌离子，钼离子的促进作用更明显。并且硝酸盐和硫酸盐的共同作用，也提高了HYH5菌群的甲烷产量。利用高效液相色谱-质谱鉴定出一种脂肽类物质，这种物质也可以促进HYH5菌群更高效地产甲烷。本书利用13C标记甲苯的方法来研究HYH5菌群中降解甲苯的菌群，得知：甲苯降解后的主要产物为苯甲酸、延胡索酸、苯甲酰琥珀酸等，其降解甲苯是延胡索酸加成反应。而且其降解正十六烷的产物主要是十烷二羧酸、十四烷二羧酸、十五烷酸、十六烷酸，其降解十六烷主要进行了羧基化反应。
本书编写过程中参考了国内外学者的最新研究成果，在每章后虽尽力对引用参考文献给以标注，但恐有遗留，在此深表感谢和歉意。感谢临沂大学的大力支持；同时在写作过程中也得到了卢金荣、申洪源、梁仁君、王梁、赵敏、李宝等老师的大力支持，以及韦安培、傅敏、丁文超、房媛等同志的大力协助，在此一并表示感谢！
限于著者水平和编写时间，书中难免有不足和疏漏之处，敬请读者批评指正。著者于山东省水土保持与环境保育重点实验室2018年8月15日第1章 绪 论1.1 降解石油烃产甲烷的研究背景
对老油田进行深度开发，提高石油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。现有的提高石油采收率的技术存在的主要问题是提高幅度有限，大量的残余石油滞留地下，因此如何利用大量残存在油藏中的石油成为了一项重要课题。通过微生物降解石油烃产甲烷，从而对残余石油进行利用是一条有效途径。最近，美国俄克拉荷马大学Suflita教授通过微生物的作用，将油藏中残余油转化为甲烷，可使老[1]油田重获生机。而此微生物厌氧降解石油烃产甲烷过程是多种菌群[2参与的多步骤反应，在整个降解过程中影响反应速率的因素非常多～6]。有学者研究认为：影响微生物厌氧降解石油的主要因素之一就[7]是烃的化学性质，特别是溶解性。而且加快厌氧降解石油速度的可[8，9]行方法之一就是增加微生物对石油烃的摄取能力，这就需要对石油烃和微生物菌群进行细致的研究。进一步研究表明：微生物还可以在油藏中代谢产生气体、生物表面活性物质、有机酸等，而这也是[10～12]微生物强化石油开采技术的原理。所以需要对微生物产生的副产物进行细致研究。
油藏中的实验也证实了在有机质（特别是残余石油）降解过程中，公认的降解终端产物是甲烷，而电子受体耗尽是甲烷产生的基础，具体来说产甲烷古菌和其他功能菌群协同作用，最终使残余石油得到[13]降解并产生甲烷。而在如何促进这一过程方面，有学者做了关于[14～16]天然气成因的研究工作并推测：影响厌氧降解含碳有机质产甲[17]烷的另一主要因素为可以供微生物利用的营养物质。进一步研究表明：微生物可以利用一些廉价的资源充当激活物产生可被利用的次[10]级产物。这些次级产物可以增加微生物对石油的利用率。还有学者研究表明：多种营养物质和功能性外源微生物的注入可以提高降解[10][18]石油烃产甲烷的效率，达到很好的预期效果。尤其在Muller 和[19]Jack等的研究报告中，首先研究并证实了注入外源添加物质的情况下，石油烃被降解产甲烷；最近有很多学者也证实了这一过程，他们通过加入更有潜力的降解石油烃产甲烷的微生物来降解石油烃，取[9，20～24]得了很好的效果。而地质学的研究也表明，在数千年来油藏内部一直自发进行着微生物降解石油烃产甲烷过程，因为地球内部[23，25，26]的厌氧环境有利于这一过程的进行。并且在油藏采出液中[27～31]也发现并鉴别出了各种各样的厌氧菌群，而且通过研究它们的代谢机制也都证实了在厌氧环境中石油烃能被微生物降解产甲烷的事[32～34]实。1.2 降解石油烃产甲烷的目的和意义
研究微生物降解残余石油产甲烷时，应该研究油、气、水以及水[35～37]中的微生物菌群和代谢产物。而且有研究表明：油藏中的微生物群体是由微好氧菌群和兼性厌氧型以及严格厌氧型细菌组成的，烃[38，39]类提供了它们存活的基础条件，其可能原因是随着油藏的开采，[35，39]会大量注入水和其他物质，这改变了油藏本来的环境。尤其是国内外对石油采出液中的好氧菌群和厌氧菌群的综合研究较少，而且对石油采出液中的混合菌群所知甚少，因此在本书第2章中进行产甲烷菌群的初步筛选，以探究油藏中的各种菌群，同时对不同油井的采出液和不同区位的含油污泥进行考察，主要意义在于研究不同油井和不同区位含油污泥中的降解石油烃产气的混合菌群，而且通过富集培养分离出高效的产甲烷混合菌群。[4，33]
因为在油藏中会有很高的温度和压力，所以必须研究特定温度和压力对菌群产甲烷的影响，本书第3章将研究温度和压力对产甲烷菌群的影响，这在实际应用中也会有重要的意义。同时，在第5章中考察有哪些激活物质可以加速菌群产甲烷过程，以便提高厌氧降解石油烃产甲烷的效率，这在实际应用中具有重大的意义。在厌氧的代谢机制研究中，有学者研究表明：厌氧代谢和好氧代谢相比有很大的不同，首先，电子受体不同，厌氧多是硫酸盐、硝酸盐、铁离子、二氧化碳等；其次，反应中的中间产物和最终产物也不相同，而且参[40～45]与反应的活性酶也不一样。而在各化合物代谢反应中起决定作用的初始活化能上，厌氧降解各化合物的初始活化能也有很大差异[46～48]（图1-1），而且微生物厌氧降解石油烃产甲烷的机制研究还比较少，所以本书将在第6章对选取的长链烷烃、芳香烃进行研究，考察产甲烷过程中的反应机制，具有理论和现实意义。[46～48]图1-1 芳烃和链烃中碳氢键离解能
① 目前大部分的石油污染土壤生物修复的基础研究主要集中在好氧生物修复，本书针对石油污染土壤生物修复的实际情况进行了厌氧降解菌的基础研究，为厌氧生物修复技术提供了理论基础。
② 首次对石油污染土壤生物修复的土壤理化性质和石油烃组分的纵向分布进行了探讨，并使用纵向分布特征对厌氧生物修复技术的可行性进行了探讨。
③ 系统地研究了厌氧微生物对石油烃及石油烃模式物的降解特性，建立相关降解动力学模型，并通过多种分析手段对降解特定的石油烃化合物进行了代谢途径的推测。
④ 将传统培养分离方法和现代分子生物学方法（DNA分子鉴定和ARDRA技术）相结合研究了厌氧微生物的微生物群落结构和多样性，首次对厌氧混合菌在不同的石油烃模式物下的微生物群落结构和多样性进行了研究。
采用原位强化生物修复技术对某区块石油污染土壤进行为期16个月的生物修复，考察处置后污染土壤理化性质、微生物学特性以及石油烃组成的纵向分布特征，探讨生物修复过程中厌氧菌作用以及厌氧生物修复的必要性。在前期研究的基础上，采集石油污染样品，选择合适的电子受体进行石油烃厌氧降解菌的筛选，考察降解菌的相关生理特性，并进行分子生物学鉴定，对厌氧降解混合菌进行进化关系分析，并对最终选定的厌氧降解菌的培养条件进行优化，为后期的实验提供稳定和高活的菌源。考察不同环境因素对厌氧降解混合菌降解石油烃的影响，并通过红外、四组分分离和模拟蒸馏等手段分析厌氧降解混合菌对原油组分降解的特性。选择合适的石油烃模式物，考察厌氧降解菌对石油烃模式物的底物利用能力和范围，并对不同碳源下厌氧降解混合菌的群落结构的稳定性进行探讨，以此为基础考察厌氧降解菌对特定石油烃模式物（甲苯和萘）的降解特性并进行降解动力学的初步研究，对厌氧降解特定石油烃模式物进行代谢途径的探索，为石油污染土壤厌氧生物修复提供理论基础和技术保障。
① 对实验选用站位采出水水质分析：主要研究地层中采出水营养情况，为后续激活实验营养物质提供依据。
② 油藏地址条件分析：分析油藏中微生物的生存环境。
③ 单因素激活实验：包括碳源、氮源、磷源、微量元素（Fe、Co、Ni）的激活实验；主要考察每种因素的不同物质和不同投加量对产气的影响，找到最佳激活营养物质及最佳投加量。
④ 响应曲面优化进行多因素激活实验：根据单因素实验结果运用响应曲面法进行优化，进行多因素实验，分别进行了碳源、氮源、磷源组合和Fe、Co、Ni微量元素组合的响应曲面设计实验。
⑤ 对实验选用的采出水原液和不同条件激活后的微生物群落进行分析；分析前后微生物的群落变化情况。
分析降解前后石油的组分变化、石油降解率；通过萃取模拟蒸馏实验研究所用原油降解前后的组分变化。1.3 降解石油烃产甲烷的国内外研究进展
根据国内外最新研究结果表明，微生物厌氧降解石油烃产甲烷时会涉及5种可能的反应过程（图1-2），但是这些实验研究都集中在产[40，49]甲烷的最后几步，而在石油烃中都含有一些长链或复杂的芳香化合物，这些长链或复杂的芳香化合物是怎样被降解产生小分子含碳化合物的，这一方面在厌氧降解石油烃产甲烷的研究中还少见报道，因此本书将选取几种模式物对其进行探讨研究。图1-2 5种可能的产甲烷途径（1）生物强化处理石油污染土壤理化性质和微生物学特性的纵向分布特征
采用原位强化生物修复技术对某区块石油污染土壤进行为期16个月的生物修复，考察处置前后污染土壤理化性质（包括pH值、含水率、有机质、总氮和总磷）、微生物特性（细菌、真菌、放线菌和厌氧菌等微生物种群数量与活性）以及石油烃组成（含油率、四组分分离、正构烷烃组成）的纵向分布特征，探讨生物修复过程中厌氧菌作用以及厌氧生物修复的必要性。（2）石油烃厌氧降解菌的筛选、鉴定和最优培养条件考察
采集石油污染样品，通过测定土壤样品中电子受体的分布规律，结合相关研究成果，选择合适的电子受体进行石油烃厌氧降解菌的筛选，并对石油烃厌氧降解混合菌进行分离纯化，并进行分子生物学鉴定，对筛选得到的降解混合菌的群落结构做初步分析，并对最终选定的厌氧降解菌的培养条件进行优化，为后期的实验提供稳定和高活性的菌源。（3）环境因素对石油烃厌氧降解菌降解原油的影响及其降解特性
考察不同环境因素（pH值、接种量、培养温度、底物浓度、表面活性剂、碳源类型和电子受体）对厌氧降解混合菌降解石油烃的影响，找出影响混合菌厌氧降解原油的限制性因子；并通过红外、四组分分离和模拟蒸馏等手段，分析厌氧降解混合菌对原油组分降解的特性。（4）石油烃厌氧降解菌的底物降解范围和群落结构稳定性研究
选择合适的石油烃模式物（苯、甲苯、环已烷、蒽、萘、正已烷、环已酮和邻苯二酚），考察所筛选到的厌氧降解菌和混合菌对石油烃模式物的底物利用能力和范围。同时，通过PCR-ARDRA技术考察在不同碳源下厌氧降解混合菌的群落结构的变化。（5）石油烃厌氧降解混合菌对芳烃的降解特性及降解动力学
在前期底物降解范围实验的基础上，选择特定的石油烃化合物，考察厌氧降解菌对这些化合物的降解特性（碳源浓度的影响、电子受体的影响、甲苯和萘共存的相互影响、碳酸氢盐的影响）和降解动力学的初步研究、同时对硫酸盐还原条件下，厌氧降解混合菌的代谢途径进行了初步探索，为石油污染土壤和地下水厌氧生物修复的开发和应用提供参考。
筛选出具有高效降解石油烃厌氧降解混合菌对后续研究降解特性、降解动力学和群落结构具有举足轻重的作用。笔者在前期已经在土壤模拟修复、石油烃高效降解混合菌群的培育方面做了大量的工作，积累了丰富的实验室经验，因此高效降解石油烃厌氧菌的筛选是可以实现的。
① 高效石油烃厌氧降解混合菌的富集和筛选。
② 厌氧降解混合菌对石油烃的降解特性研究。
③ 厌氧降解石油烃模式物的相关动力学模型的选择及研究。
④ 利用PCR-ARDRA技术分析不同碳源下厌氧降解混合菌的微生物群落结构和多样性。
⑤ 厌氧代谢产物的分离和分析手段的确定。
本书总结了5种可能的产甲烷途径，如图1-2所示。
乙酸是重要的微生物厌氧降解石油烃产甲烷的中间产物，乙酸在厌氧降解石油烃产甲烷中起到的作用在国内外研究较少，本书将对其进行探讨。特别是最近有学者提出：在自然界中乙酸是甲烷的重要来[40]源，大约有60%～70%的甲烷由乙酸转化而来。另外，石油烃厌氧产甲烷过程中，一般会涉及的主要反应过程（图1-3）：a.发酵水解[40，50]过程；b.厌氧氧化过程；c.产甲烷过程。图1-3 石油烃厌氧降解的一般过程
另外，有学者研究表明：即使是稠油油藏中也会有伴生甲烷气的
[37，51]存在。因此，本书会广泛采集不同油井中的采出液，以求对各种类型的油藏都进行研究，首先采集油藏采出液样品，进行厌氧降解残余石油产甲烷菌群的筛选与研究，考察降解菌的相关生理特性，并进行分子生物学鉴定，对厌氧降解石油烃产甲烷混合菌的进化关系分析，并对最终选定的厌氧降解石油烃产甲烷菌群培养条件进行优化，为后期的实验提供稳定和高活性的菌源。下面介绍一下国内外学者在功能菌群研究方面的进展。1.3.1 降解石油烃产甲烷的功能菌群
在油藏内部已经分离得到了多种不同功能的厌氧微生物，主要包[52，53][54][55]括发酵菌、产甲烷古菌、 三价铁还原菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌。而后人的大量实验也证实了厌氧代谢的电子受体一般[56～60]包括（三价铁、锰离子、二氧化碳、硫酸盐等）。但是最初因为高温高压以及高地层水矿化度的厌氧环境使得微生物的生存环境异常苛刻，所以人们认为在这种环境中微生物很难生长，而在此期间，[61]Bastin等在油藏内部分离得到了厌氧菌群，改变了人们的想法，此后各种不同功能的厌氧微生物菌群被发现和分离，而且不同种类的电子受体也被大量发现。近年来，人们越来越认识到油藏内部的产甲烷[9]过程是多种菌群共同作用的结果，有研究表明：整个过程主要涉及的反应有4种类型，a.在各种还原菌群的共同作用下石油烃失去电子发生氧化反应；b.乙酸失去电子发生氧化反应；c.乙酸分解生成甲烷；[24]d.二氧化碳接受电子还原产生甲烷。例如，长链烷烃通过复合菌群的共同作用产生乙酸和二氧化碳以及氢气，最终在产甲烷古菌和其[3，20]他硫酸盐和硝酸盐还原菌的作用下产生甲烷和其他气体。下面我们来介绍一下石油油藏中的主要菌群。（1）发酵菌（Fermentative bacteria）
石油油藏中的烃类通过发酵菌的作用产生氢气、二氧化碳和有机[62]酸类，它们分为细菌和古菌两类。油藏的高温环境中含有耐高温的发酵菌，其中，一些发酵菌还是非常古老的菌种，发酵产物为气体[63，64]和有机酸类。另外，有学者研究证实了发酵菌主要产生乙酸、丙酸、氢气和二氧化碳。而且还有极其稀少的远古细菌会发酵有机物[65，66]产生氨基酸，这也向我们暗示其重要的地位。（2）硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria）
硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria，简称SRB）能还原多种硫酸盐类，同时以这些硫酸盐类作为电子受体，最终将这些硫酸盐类还原成硫化氢。已知硫酸盐还原菌存在于大部分的油藏中。硫酸盐还原菌是一个复杂的生理菌群，在其众多性质中最重要的是活力、最适温度、厌氧氧化能力等。该还原菌又可分为革兰氏阴性嗜温菌、革兰氏阳性芽孢菌、嗜热细菌、嗜热古细菌四大菌群，它们都以硫酸盐[67]作为电子受体进行无氧呼吸。还有学者研究革兰氏阴性嗜温菌的演化历史（图1-4），从中得出一些关于细菌演变的线索，硫酸盐还原菌的共同祖先是一些光养生物，随后在漫长的演变过程中一些菌群失[68]去了光合能力变成异氧细菌。通过研究得知：Desulfovibrionaceae 和Desulfobacteriaceae 已经出现很大分化，Desulfobacteriaceae是原始的细菌，因为它包括一个δ-Proteobacteria，[69，70]而Desulfovibrionaceae却没有这部分。图1-4 Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae菌群家族嗜温菌的系统发育[69，70]树演变分析（图中的数字代表百分数，说明亲缘关系远近，数字越大关系越近，低于50%的没有说明）
其他研究人员也发现硫酸盐还原菌可以在富含石油烃的环境中正常生长，如在烷烃、苯及苯系物的环境中，并从这些环境中分离纯化[71]了多种硫酸盐还原菌。另外有研究表明：分离自海洋沉积物的硫酸盐还原菌株Tol2可以降解甲苯，且有两种脱氢酶参与了降解反应[72]。还有学者从被石油污染的土壤中分离得到了prtol1菌株，其为1株硫酸盐还原菌，以甲苯为唯一电子供体和碳源，降解甲苯为二氧化[73]碳，降解过程中有15%的甲苯转变为非挥发代谢物。还有研究团队从烷基苯培养试验中分离得到2株培养菌oXyS1和mXyS1，以硫酸盐为电子受体，分别能降解邻二甲苯和间二甲苯，并且都有降解苯甲酸和苯甲酸甲酯的能力，而且通过16S rRNA序列分析发现：oXyS1与已知菌株Desulfobacterium cetonicum 和Desulfosarcina variabilis的相似值分别达到98.4%和98.7%，而mXyS1与Desulfococcus [74]multivorans 的相似值为86.9%。
有学者从严格厌氧降解实验中分离得到硫酸盐还原菌，其能够降解甲苯、邻二甲苯、间二甲苯，进一步研究表明：在其细胞提取液中[75，76]发现了苄基琥珀酸和甲基富马酸。另外，有团队从一个油藏中发现了1株硫酸盐还原菌能够降解甲苯，为革兰氏阴性，最宜温度34～38℃，最佳盐度为1.5%（体积比百分数），适宜pH值为7.2～7.5，[77]细胞形态呈杆状。还有学者从含十六烷的富集培养基中分离到1株厌氧菌，它能利用硫酸盐作为电子受体并将它还原为硫化氢，而且在[55]脱氢酶的作用下这株菌可以降解C～C的长链烷烃。1220
有学者则从萘存在的富含硫酸盐的海洋沉积物中富集培养硫酸盐还原菌，该菌株以萘为唯一碳源和电子供体，最终硫酸盐被还原成硫
[78]化物。另外，有学者从海洋沉积物中分离得到2株菌，是严格的以硫酸盐为电子受体的厌氧菌，对C～C有明显的降解作用，通过1220[79]16S rRNA序列分析，2株菌高度同源。还有学者从被石油污染的河口沉积物中，分离得到降解烷烃的硫酸盐还原菌，此菌株为革兰氏阴性杆菌，可以降解C～C链的正构烷烃，而且以脂肪酸、甲酸1318[80]盐为电子供体，硫酸盐、亚硫酸盐为电子受体，进一步通过气相[81]色谱-质谱检测表明：该正构烷烃代谢产生琥珀酸。而其他学者通过研究含油废水和油田生产水，从中分离得到1株新的菌株，为Desulfoglaeba alkanexedens属的新种，其能够降解C～C的烷烃，612为革兰氏阴性短杆菌，并且常成对出现，最适宜生长温度37℃，适[82]宜pH值为7.2。通常乙烷、丙烷和丁烷等短链烃类化合物是天然气的成分，有学者从海洋天然气渗漏区提取物中富集到能够降解短链烃[83]的硫酸盐还原细菌。近年来，有学者通过PCR-DGGE分析技术确定了高效烷烃降解菌，它同样是以硫酸盐为电子受体，实验中其能对[84]C与C的烷烃进行降解。另外，本书中详细列出了各研究报告中610的硫酸盐还原菌及其可利用的底物（表1-1），而且也列出了几种有代表性的硫酸盐还原菌的重要性质（表1-2）。[85，86]表1-1 厌氧降解烃的硫酸盐还原菌注：数字表示碳的数量。[67]表1-2 典型硫酸盐还原菌的重要性质（3）硝酸盐还原菌（Nitrate-reducing bacteria，简称NRB）
硝酸盐还原菌可以还原硝酸盐为氨，有学者从废水中提取一株细菌，初步鉴定为假单胞菌属，其经过纯化培养后能够降解甲苯，并且以硝酸盐作为降解的电子受体。此外，该菌株也能够降解间二甲苯、[92]苯甲酸、苯甲醛。在厌氧条件下，有学者用甲苯作为唯一碳源，分离出能够降解甲苯的菌株，其中大于50%的甲苯碳被降解为二氧化碳，29%的碳被吸收，甲苯的降解速率为1.8mmol/（min·L），而且它[93]有不同于其他细菌降解甲苯的途径。
另外，也有学者从含有各种芳香族化合物的培养基中分离出几种假单胞菌属，以硝酸盐为电子受体，其中有7株是能够降解甲苯的菌株，而且研究表明：超过50%的甲苯变为二氧化碳，而且厌氧降解甲苯是通过甲基侧链羧化为苯甲酸实现的，而且高达37%的碳被吸收进微生物细胞质。但是其对甲酚、羟基苯甲醇、苯甲醛或对羟基苯甲酸[94]的降解缓慢或有不同的滞后时间。
一般反硝化也称脱氮作用，反硝化细菌在缺氧条件下还原硝酸盐，释放出分子态氮（N）或一氧化二氮（NO）。能进行反硝化作22用的只有少数细菌，这个生理菌群称为反硝化细菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源进行无氧呼吸。有学者通过16S rRNA序列分析，共分离得到8种降解甲苯的反硝化菌株，然后构建系统进化树，利用距离矩阵、最大简约法和最大似然方法确定各个菌种的种属关系，表明这8[95]种反硝化菌株形成一个密切相关的集群。而其他学者也在研究世界不同地区的污染土壤和农业土壤，并且从中富集了能够降解甲苯的菌群，在相对较低的甲苯浓度下（通常为5mg/L）分离得到了10株细菌，通过PCR指纹分析表明：有多个不同种属的菌株，并且其对芳香族化合物都有较强的降解能力，所有菌株都是革兰氏阴性杆菌，其中4株有固氮酶结构基因，所有菌株都有血红素亚硝酸盐还原酶。进一步通过16S rRNA分析表明：这些菌株是彼此密切相关的，它们属于[96]Azoarcus属。
有学者对淡水泥浆样品进行了厌氧降解，从中提取出2个新的反硝化菌株EbN1和pbn1，在硝酸盐存在下，该菌株可以降解烷基苯和侧链长于甲苯的芳烃类，能降解乙苯和丙苯；同时在含有甲苯和间二甲苯的泥浆中分离到两个反硝化菌ton1和mxyn1，16S rRNA序列分析[97，98]揭示该菌株与Thauera selenatis有密切的关系。 而其他学者通过反硝化细菌对乙苯的厌氧降解反应，提取到了EB1，在反硝化条件下EB1降解乙苯，而且有学者发现菌株EB1细胞代谢乙苯后，形成1-苯基乙醇、苯乙酮和一个未知的化合物，同时在光谱数据分析的基础18上确定了未知的化合物是苯甲酰乙酸乙酯，并且实验使用HO标记2表明：其厌氧降解乙苯的第一个产物为羟基1-苯基乙醇，其羟基来源
[99]于水。另有学者在生物治理柴油污染的含水层时，通过原位NO的注入和营养物的添加，以刺激微生物活性，经过3.5年的整治，从含水层样品中分离得到的细菌菌株能够对特定的烃类化合物进行厌氧反硝化降解，与此同时为了更好地模拟反硝化的修复过程，在实验室[100]中构建了一个模拟含水层，也取得了成功。另外，有学者用三氯乙烯（TCE）驯化分离得到的菌株，发现其能够以共代谢的方式降解苯酚或甲苯，对这些降解菌进行测量表明：该菌株对这些基质相当敏感，而对它们的基因序列鉴定，发现其中60%为苯酚和甲苯降解菌株，并且在实验中应用了甲苯邻单加氧酶探针进行杂交分析，以探讨可能[101]的降解途径。
在厌氧条件下，有研究者也分离得到了一株硝酸盐还原菌，其能够降解烷基苯和二甲苯的三种异构体，对异丙基甲苯降解的速度最快（4周内），对天然芳香烃降解时间为6周，而对其他烷基苯的降解效果不明显，而实验还表明其厌氧降解烷基苯至少有两个酶系统，一个[102]代谢芳香族和乙基甲苯，其他代谢甲苯。而苯污染也是一个严重的问题，尤其是在地下水和地表水中，同时它也是难生物降解的有机物，但是有研究表明：在厌氧降解苯的实验中，硝酸盐和三价铁、硫酸根、二氧化碳可以用作电子受体，而且有学者富集了Dechloromonas菌株，可以完全代谢各种单芳香族化合物包括苯，并且用CO可以作为替代硝酸盐的电子受体，说明这些微生物可适用于2[103]环境污染的防治。另外，本书也比较详细地列出了各研究报道中的硝酸盐还原菌及其可利用的底物（表1-3）。表1-3 厌氧降解烃的硝酸盐还原菌（4）铁还原菌（Iron- reducing bacteria）
有学者分离到可以降解甲苯和苯酚的厌氧细菌，它们都是以三价[54]铁作为电子受体，最后生成二价铁和二氧化碳。又有学者从受石油污染的水层中也分离得到了类似的严格厌氧菌株，为革兰氏阴性[104，105]菌，分别属于3个种属，并且都能够降解芳香族化合物。综合国内外多位学者的研究情况，铁还原菌降解烷烃的种类不一样，分离的方法也多种多样，而且铁化合物广泛存在于油藏里，主要有两种价态，分别是三价铁和二价铁，在烷烃降解反应时其可以作为电子受体，而且铁还原菌也是多种多样的，有嗜温和啫热厌氧菌，并且铁还原菌也可以以硝酸根、锰离子作为电子受体，也有以氢气作为电子供[106～109]体，乙酸为碳源。（5）产甲烷古菌（Methanogenic archaea）
产甲烷古菌广泛存在于土壤、底泥、地热环境、油井、海底沉积
[118]物中，同时厌氧产甲烷古菌处在有机物降解产甲烷的最后环节，[119，120]通过利用小分子物质产甲烷，而甲烷气体有着广泛的应用。产甲烷古菌有3种营养类型，分别是氢营养型、甲基营养型、乙酸营养型，在产甲烷途径中，通过与其他菌群的协同作用将长链有机物降[121，解成短链的无机物或有机物，然后通过产甲烷古菌降解产生甲烷122]。
产甲烷古菌的主要类型如下。[123][124]
① 氢营养型主要有伊万诺夫甲烷杆菌、热自养甲烷杆菌、[125][126]布氏甲烷杆菌和嗜热嗜碱甲烷杆菌、热自养甲烷球菌、石油[127][128]甲烷盘菌属、耐盐甲烷卵圆形菌。[129，130]
② 甲基营养型有盐水甲烷嗜盐菌、斯氏甲烷八叠球菌[131，132]。[133]
③ 乙酸营养型有马氏八叠球菌。
本书进一步总结了产甲烷古菌的分类情况，表1-4可以看出甲烷菌的细致分类情况。还有学者认为当硫酸盐和硝酸盐这些电子受体缺乏时，烷烃仍然可以被富集培养的菌群降解，生成二氧化碳和甲烷，另外Julia Foght认为厌氧降解芳烃可以通过氯酸盐、高氯酸盐或锰离子作为电子受体。[41]表1-4 产甲烷古菌系统分类及其代谢底物1.3.2 影响微生物厌氧降解产甲烷的条件（1）激活剂对降解石油烃产甲烷的影响
微生物利用石油烃是通过与石油烃接触，因此增大微生物与石油烃的接触面积可以有效地提高微生物利用石油的效率。有学者研究表明：低浓度的表面活性剂可以提高微生物对石油烃的利用率，其可以降低石油烃与水相间的界面张力，但是有毒害作用，而生物表面活性[134，135]剂毒害作用小，因此生物表面活性剂更有应用前景。另外，微生物利用石油烃需要氮源和磷源等的投入，有研究表明：在氮源和[136，137]磷源充足的条件下微生物可以高效利用石油烃。但是外源营[138～140]养物的添加并不是越多越好，而是需要一定的比例。在众多2－激活剂中，人们对于乙酸和 SO的研究逐渐成为近些年的研究热4[141～143]点。硫酸盐是厌氧烃降解过程中的重要电子受体，对厌氧烃[144]降解有很重要的影响。而乙酸作为石油烃产气中的一个重要中间[145]产物，也起着重要的作用。（2）温度和压力对产气的影响
厌氧降解烃的微生物对温度比较敏感，不同的温度条件下，厌氧[146～148]降解烃的关键微生物类群是不一样的。同时，油藏中是高压环境，因此必须分析压力对产气的影响。1.3.3 石油降解的副产物[9，24]
厌氧降解石油烃会产生多种气体，如CH、H、CO等。422[149～151]这些气体可通过色谱的方法进行测量，如常用的峰面积法。[150～153]在加入电子受体的情况下会有一些无机离子产生，例如NO2－＋、NH等。测量这些离子多采用离子色谱。而且在厌氧降解的时4候会产生一些有机酸，主要是挥发性有机酸和非挥发性有机酸，测量[154～157]这些有机酸多采用气相色谱或高效液相色谱。1.3.4 石油烃厌氧代谢机理
图1-5说明的是芳香烃和脂肪烃的厌氧化学反应过程，并且具体的石油烃厌氧代谢机理大致可分为如下几项。（1）延胡索酸加成反应
Kniemeyer等提出了烃降解的一个主要途径，就是生成芳香基或烷基琥珀酸盐，这一步骤的达到是通过延胡索酸盐上的双键碳被烃上的碳原子加成。例如，在分析己烷的降解时，生成了（1-甲基戊基）琥珀酸盐，原因是延胡索酸盐双键碳原子被己烷的第二个碳原子结合。而且通过氢同位素标记方法证实了延胡索酸加成反应，检测到了琥珀酸盐的生成。而在间二甲苯降解的途径中，延胡索酸和苯环上的甲基发生加成反应，生成苯甲基琥珀酸这一短暂性的中间产物，然后脱氢产生中间代谢产物苯甲酰辅酶A。而2-甲基萘的甲基加到延胡索酸的双键碳上产生琥珀酸，经过β氧化产生中间代谢产物2-萘酸，再[38，85，158]经过一系列苯环还原反应，最终产生二氧化碳。[38，63]图1-5 烃类化合物厌氧降解化学反应过程（2）羟基化反应
芳香烃的另一种主要代谢方式为羟基化反应。例如，有学者在研究乙苯降解时提出，羟基化反应发生在乙苯的亚甲基上，生成1-苯基乙醇，是由于羟基结合于芳香烃的烷基链或苯环上。还有其他学者认为苯氧化为苯酚就是在脱氢酶的作用下，由羟基进攻苯环，羟基化的
[159～161]过程。（3）甲基化反应和羧化反应
在研究萘的代谢反应时，有学者提出了甲基化的反应，在添加碳酸氢盐激活剂的情况下，实现了萘的甲基化作用生成2-甲基萘，而这一作用途径与一氧化碳脱氢酶催化的反应途径不同，从而加快了萘的
[162][163]代谢。也有学者提出了可能的羧化代谢途径（图1-5）。1.3.5 降解石油烃产甲烷的微生物分析方法[30～32]
近年来，人们越来越认识到油藏内部含有多种菌群，它们分属于不同的菌属，而且在自然状态下就可以降解和利用石油烃，但是单纯利用内源微生物，在自然状态下进行的石油烃降解效率低[24]。因此，需要从被微生物菌群高度降解的石油培养液中分离能够高效降解石油烃的菌群，然而首先要分析和鉴定这些菌群，尤其是一些难分离培养的菌群。而现有的细菌群落分析技术，如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增技术，虽然可以很好地分析微生物的群落结构，但是不能准确地分析哪些菌降解了芳烃，因芳烃是难降解的有机污染[164]13物。用稳定性同位素探针（SIP）如C标记的石油烃和DGGE技[165，166]术结合就可以准确地分析和鉴定石油烃降解菌群的结构。13
利用C标记的和没标记的芳烃分别作为碳源，菌群利用这种碳13源合成自身的核酸（DNA），带有C的DNA片段会在氯化铯（CsCl）密度梯度里和其他DNA片段分离，从而鉴别分离出高效芳烃类降解菌。而PCR-DGGE技术也被用于各种微生物群落结构的研究中，如[167～174]在海洋环境中、土壤环境中、动物肠道中、油藏环境中等，而在油藏中也可以通过研究16S rDNA序列，分析油藏中的菌群结构[169～176]。除此之外，还有一些新技术也应用在降解石油烃产气研究[177～190 ]中，例如qPCR技术、454高通量测序技术、FISH技术等，通过这些技术可以更好地研究厌氧降解石油烃产气。1.4 主要研究内容及技术路线1.4.1 主要研究内容
综上所述，众多学者都对厌氧降解石油烃产甲烷做了研究，但是现在的关注点是能否筛选出一些产甲烷优势菌群，而且根据各个油井的具体条件，能否筛选出内源的功能菌群，这方面需要做大量的工作，尤其是在国内还有很多老油井等待研究。并且要运用比较新的方法对其进行研究，将有助于筛选出产甲烷多的功能菌群。因此，本书的主要研究内容包括以下几个方面。
① 通过油藏采出液分析，探讨环境条件如温度、压力、pH值和盐度等对微生物降解石油烃产甲烷的重要影响。
② 进行厌氧降解石油烃产甲烷混合菌的筛选，同时建立模拟温度和压力的反应器，研究温度和压力对厌氧产甲烷菌群的影响，通过富集培养降解石油微生物，采用PCR-DGGE方法确定微生物混合菌的组成及特征。
③ 通过营养激活剂的配比，提高厌氧降解石油烃产甲烷的效率，特别是一些无机盐类、生物表面活性剂等激活剂。其中考察电子受体对微生物的作用，从而有助于提高微生物降解石油烃产甲烷的效率。
④ 利用气相色谱、液相色谱、红外光谱、质谱等分析微生物降解石油烃产甲烷的产物变化情况，利用GC-MS分析微生物降解石油13烃产甲烷过程中的代谢中间产物的变化，同时用C同位素示踪方法确定降解石油烃的微生物菌群。1.4.2 主要技术路线
技术路线见图1-6。图1-6 技术路线参考文献[1] Suflita J M，Davidova I A，Gieg L M，et al. Anaerobic hydrocarbon biodegradation and the prospects for microbial enhanced energy production[M].Amsterdam: Elsevier Science，2004：283-305.[2] Rowe D，Muehlenbachs A. Low-temperature thermal generation of hydrocarbon gases in shallow shales[J]. Nature，1999，398（6722）: 61-63.[3] Parkes J. Cracking anaerobic bacteria[J]. Nature，1999，401（6750）: 217-218.[4] Hallmann C，Schwark L，Grice K. Community dynamics of anaerobic bacteria in deep petroleum reservoirs[J]. Nature Geoscience，2008，1（9）: 588-591.[5] Head I M，Jones D M，Larter S R.Biological activity in the deep subsurface and the origin of heavy oil[J]. Nature，2003，426（6964）: 344-352.[6] Jackson B E，McInerney M J. Anaerobic microbial metabolism can proceed close to thermodynamic limits[J]. Nature，2002，415（6870）: 454-456.[7] Larter S R，Wilhelms A，Head I M，et al. The controls on the composition of biodegraded oils in the deep subsurface. 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