作者：姚崇舜
出版社：人民卫生出版社
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莪术油及其制剂的现代研究与应用试读：
前言
莪术油为姜科植物蓬莪术（Curcuma phaeocaulis Val．）、广西莪术（Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang）或温郁金（Curcuma wengyujin Y．H．Chen et C．Ling）的干燥根茎经水蒸气蒸馏或超临界萃取得到的挥发油，呈浅棕色或深棕色，具有很强的挥发性。莪术油主要成分为倍半萜类，包括莪术醇、莪术二酮、吉马酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯等。近年来莪术油的药理试验和临床应用结果表明，莪术油具有抗菌、消炎、抗肿瘤、增强免疫功能及抑制血栓形成的作用，具有很好的应用前景。
我国药代动力学创始人、沈阳药科大学药剂教研室主任陈济民教授及本人经过多年的研究，基于莪术油良好的抗肿瘤活性，成功地研制出“莪术油注射液”，用于治疗宫颈癌等癌症；在长期临床使用过程中取得良好的疗效，得到广大医生和患者的肯定。
此后，以莪术油为主要成分，陈济民教授及本人又研制出“保妇康栓”，并于1972年用于临床，取得较好的疗效。“保妇康栓”现已收载于1995—2010年四版《中华人民共和国药典》，是2012年国家基本药物。
20世纪90年代，鉴于肝动脉栓塞治疗肝癌已成为不能手术的肝癌患者的首选疗法，陈济民教授进一步开发出莪术油明胶微球，采用微球作为栓塞载体和莪术油的传递载体，在动物原位肝肿瘤模型上取得了较好的治疗效果。
本书收集了莪术种植、采收、生药学特征；莪术油提取，化学成分，质量标准，传统制剂及新剂型的药剂学研究、药代动力学研究、药理毒理研究；莪术油制剂的临床应用等最新研究成果和进展。本书是编者们多年积累的理论知识和实践经验的阶段性总结，并参考大量相关文献精心编撰而成，内容全面、系统、详尽，可作为莪术油及制剂的科研人员、生产经营单位、临床医生、医药院校师生的辅助教材，对培养硕士生也具有切实的参考价值。
最后，衷心感谢曾参与莪术油研究的姚新生院士的指导与支持。感谢参加本书编写的各位同仁，正是由于他们的科学严谨的工作态度才使得本书顺利问世。由于编者水平所限，经验不足，难免有不妥和错误之处，恳请读者给予批评指正。姚崇舜2014年6月第一篇 莪术油的研究概述第一章 中药莪术概述一、中药莪术的传统应用
中药莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎，其中温郁金的根茎俗称“温莪术”。莪术作为常用中药，其药用研究历时悠久，《本草经疏》、《开宝本草》等古籍中均有记载，可行气破血，消积止痛。
莪术的功效在历代本草中的记载如下所述：
1.宋·苏颂《本草图经》：“蓬莪荗，古方不见用者，今医家治积聚诸气，为最要之药。与荆三棱同用之良，妇人药中亦多使。”
2.元·王好古《汤液本草》：“蓬莪荗色黑，破气中之血，入气药发诸香。虽为泄剂，亦能益气，故孙用和治气短不能接续。所以大小七香丸、集香丸散及汤内多用此也。”
3.明·李时珍《本草纲目》：“蓬莪荗入肝，治气中之血，稍为不同。按王执中《资生经》云，执中久患心脾痛，服醒脾药反胀，用蓬莪荗面裹炮熟研末，以水与酒醋煎立愈，盖此药能破气中之血也。”
4.明·缪希雍《本草经疏》：“心腹痛者，非血气不得调和，即是邪客中焦所致，中恶疰忤，皆由气不得调和，脏腑壅滞，阴阳乖隔，则疫疠疰忤得以凭之。荗气香烈，能调气通窍，窍利则邪无所容而散矣。又疗妇人血气结积，丈夫奔豚，入肝破血行气故也。”故蓬莪荗行气破血散结皆可用之。二、中药莪术的基原及分布
莪术主要分布在热带亚热带的混交落叶林和常绿阔叶林中，地理分布上处于从印度到泰国、中国、马来西亚、印度尼西亚和澳大利亚北部的地域。日本、韩国等也有部分种类分布。关于我国的种源，三十年来，植物学者们做了大量的工作，已从1981年吴德邻先生编著的《中国植物志》记载的3种1变种到现在的十几种之多，这里面也存在许多混乱之处。拉丁学名有20个种名和2个变种名，中文名有18个之多。中国科学院华南植物园的刘念等学者对此修订为12个种和1种存疑，它们名称分别是细莪术（C．cxigua，四川）、顶花莪术（C．yun-anensis，云南）、川郁金（C．sichuanensis，四川、云南，其中白顶姜黄C．albicoma归此）、姜黄（C．longa，陕西、长江流域及以南）、广西莪术（C．kuangsiensis，广西；川郁金C．chuanyujin归此。两变种紫脉莪术C．kuangsiensisvar．affinis和毛莪术C．kuangsiensisvar．puberula不能成立）、印尼莪术（黄红姜黄，C．xan-thorrhiza，云南）、极苦姜黄（C．amarissima，云南）、狭叶莪术（C．angustifolia，广西）、温郁金（C．wenyujin，长江以南各省区；C．elata归此）、莪术（黑褐姜黄，C．phaeocaulis，长江以南各省区，C．zedoaria、C．caes-la、C．aeruginosa均归此）、黄花姜黄（C．flaviflora，云南）、郁金（C．aromatica，长江以南）、二黄莪术（C．viridiflora，我国台湾省，存疑）。
Apavatjrut P等以初花为材料，通过对7种莪术属植物21种同工酶分析，发现其中磷酸葡萄糖变构酶（PGM）、丙氨酸氨基转移酶（AST）、淀粉酶（DIA）、乌头酶（ACO）、酯酶（EST）、亮氨酸氨肽酶（LAP）和异柠檬酸脱氢酶（IDH）显示出多态性，尤其是EST同工酶具有19条带，AST 5条，DIA 5条，LAP、莽草酸脱氢酶（SKD）、PGM各4条，ACO 3条、IDH 2条。其他如过氧化物酶（POX）、超氧化物歧化酶（SOD）因不稳定，过氧化氢酶（CAT）、乙醇脱氢酶（ADH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和葡糖磷酸异构酶（PGI）分辨率低等原因未显现理想谱带。P Paisooksanti-vatana等对来自泰国和日本不同海拔高度的野生和栽培种C．alismatifolia的幼叶进行7种同工酶分析发现GPI-2有6条带和10种不同谱图，GDH-1各5条，ADH分别为3条和5种，PGM分别为4，LAP-1分别为3条和4种。Chandra R等以C．longar的10个特征计量分析将其归类为25种基因型。三、中药莪术的植物形态1.蓬莪术
多年生草本，株高约1m；根茎圆柱形，肉质，具樟脑般香味，淡黄色或白色；根细长或末端膨大成块根。叶直立，椭圆状长圆形至长圆状披针形，长25～35（60）cm，宽10～15cm，中部常有紫斑，无毛；叶柄较叶片为长。花葶由根茎单独发出，常先叶而生，长10～20cm，被疏松、细长的鳞片状鞘数枚；穗状花序阔椭圆形，长10～18cm，宽5～8cm；苞片卵形至倒卵形，稍开展，顶端钝，下部的绿色，顶端红色，上部的较长而紫色；花萼长1～1.2cm，白色，顶端3裂；花冠管长2～2.5cm，裂片长圆形，黄色，不相等，后方的1片较大，长1.5～2cm，顶端具小尖头；侧生退化雄蕊比唇瓣小；唇瓣黄色，近倒卵形，长约2cm，宽1.2～1.5cm，顶端微缺；花药长约4mm，药隔基部具叉开的距；子房无毛。花期：4～6月（如图1-1-1）。2.广西莪术
多年生草本，根茎卵球形，长4～5cm，直径约2.5～3.5cm，有或多或少呈横纹状的节，节上有残存的褐色、膜质叶鞘，鲜时内部白色或微带淡奶黄色。须根细长，生根茎周围，末端常膨大成近纺锤形块根；块根直径1.4～1.8cm，内部乳白色。春季抽叶，叶基生，2～5片，直立；叶片椭圆状披针形，长14～39cm，宽4.5～7（9.5）cm，先端短渐尖至渐尖，尖头边缘向腹面微卷，基部渐狭，下延，两面被柔毛；叶舌高约1.5mm，边缘有长柔毛；叶柄长2～11cm，被短柔毛；叶鞘长约11～33cm，被短柔毛。穗状花序从根茎抽出，和具叶的营养茎分开；总花梗长7～14cm，花序长约15cm，直径约7mm；花序下部的苞片阔卵形，长约4cm，先端平展，淡绿色，上部的苞片长圆形，斜举，淡红色；花生于下部和中部的苞片腋内；花萼白色，长约1cm，一侧裂至中部，先端有3钝齿；花冠管长2cm，喇叭状，喉部密生柔毛，花冠裂片3片，卵形，长约1cm，后方的1枚较宽，宽约9mm，先端尖，略成兜状，两侧的稍狭；侧生退化雄蕊长圆形，与花冠裂片近等长；唇瓣近圆形，淡黄色，先端3浅圆裂，中部裂片稍长，先端2浅裂；花丝扁阔，花药狭长圆形，长约4mm，药室紧贴，基部有距；花柱丝状，无毛，柱头头状，具缘毛；子房被长柔毛。花期：5～7月（如图1-1-2）。3.温郁金
株高约1m；根茎肉质，肥大，椭圆形或长椭圆形，黄色，芳香；根端膨大呈纺锤状。叶基生，叶片长圆形，长30～60cm，宽10～20cm，顶端具细尾尖，基部渐狭，叶面无毛，叶背被短柔毛；叶柄约与叶片等长。花葶单独由根茎抽出，与叶同时发出或先叶而出，穗状花序圆柱形，长约15cm，直径约8cm，有花的苞片淡绿色，卵形，长4～5cm，上部无花的苞片较狭，长圆形，白色而染淡红，顶端常具小尖头，被毛；花葶被疏柔毛，长0.8～1.5cm，顶端3裂；花冠管漏斗形，长2.3～2.5cm，喉部被毛，裂片长圆形，长1.5cm，白色而带粉红，后方的一片较大，顶端具小尖头，被毛；侧生退化雄蕊淡黄色，倒卵状长圆形，长约1.5cm；唇瓣黄色，倒卵形，长2.5cm，顶微2裂；子房被长柔毛。花期：4～6月（如图1-1-3）。图1-1-1 蓬莪术图1-1-2 广西莪术图1-1-3 温郁金花、根茎（即温莪术）及块根参考文献
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莪术油为莪术中提取的挥发油，研究表明莪术油在抗肿瘤、抗血栓方面成效显著，并具有抗菌、保肝、抗银屑病等作用，其抗病毒活性目前已成为新的研究热点。目前已开发出的莪术油制剂包括莪术油注射液、莪术油栓剂、莪术油滴眼液、莪术油软膏、莪术油霜剂、莪术油乳剂、莪术油微球。
如何提高莪术油提取效率一直是中药研究人员面对的问题。因为莪术油是多种成分的混合物，不同植物、不同条件、不同地区所得到的莪术油有很大的区别，周欣等在市售的莪术油、温莪术油、蓬莪术油、浙江永嘉莪术油及瑞安陶川莪术油中分别分离提取并鉴定出29～42个化合物。目前的研究认为，莪术油的成分多为倍半萜类，而抗菌、抗病毒的主要成分也是倍半萜类的莪术醇、莪术酮等。黄可新等通过溶剂萃取、树脂吸附、胶柱及薄层色谱等一系列方法进行分离纯化，通过物理、化学和波谱学来鉴定化合物的结构，首次发现新莪二酮和（R）-（＋）-1，2-十六烷二醇。夏文娟等用比色法、薄层层析-比色法及水蒸气蒸馏法，分别测定姜黄属不同种类、不同产地、不同部位、不同时期的总姜黄素、姜黄素和挥发油，发现不同种类植物总姜黄素和姜黄素含量差异悬殊，而不同产地之间差异较小，而且不同种类的姜黄素含量与挥发油含量存在较明显的相关性。一、水蒸气蒸馏法
莪术中一般含有两大类成分，即挥发油和姜黄素。莪术油中含倍半萜烯类物质，易溶于有机溶剂，难溶于水，传统提取方法为水蒸气蒸馏法（SD）。
莪术原药材经适当粉碎，称取一定质量的药粉，与适当倍量的水置于烧瓶中，加入玻璃珠数粒，振摇混匀，浸泡过夜，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水至充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸腾，并保持微沸规定时间；停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出。接收挥发油于梨形分液漏斗中，用少许乙醚萃取数次，低温挥尽乙醚，挥发油用减重法称重。
水蒸气蒸馏中，影响较大的因素有加水量、蒸馏时间和粉碎粒度等几个因素。有学者根据正交试验结果，确定提取莪术油的最佳工艺条件，即药材粉碎成粗粉（过30目筛），加质量分数8倍水，蒸馏提取8小时。药材平均出油率为2.51%。
水蒸气蒸馏法沿用已久，但用于莪术挥发油提取时尚有缺点。如药材需要前处理，蒸馏时间较长，温度较高，长时间加热可能使其有效成分（如倍半萜类衍生物）发生分解和转化，影响其功效；莪术中含有较多的淀粉粒与挥发油一起被蒸馏出，造成提取的莪术挥发油中含有大量的泡沫，难以分层。因此，必须使用有机溶剂等进行分离。
关怀等拟用正交试验设计对水蒸汽蒸馏法提取工艺条件进行安全优选，发现粉碎度和蒸馏时间是影响挥发油提取效率的主要因素，而浸泡时间是非主要因素，由试验结果得出最佳因素组合为粉碎度10～20目，蒸馏时间6小时。但水蒸气蒸馏可使莪术二酮转变为莪术内酯，降低部分药效，黄可新等通过多种提取分离的试验方法比较，发现用甲醇提取温莪术干粉，通过减压蒸馏除去甲醇，加入适量水稀释并用石油醚提取，蒸馏除去溶剂即得挥发油，这一方法效果较优。二、超临界CO萃取法2
近年，超临界流体萃取法（SFE）广泛用于药物有效成分的提取分离。超临界流体萃取是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行萃取和分离的新型技术，其原理是利用流体（溶剂）在临界点附近某区域（超临界区）内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种超临界流体作为溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。
常用的超临界流体为CO，因为CO无毒，不易燃不易爆，价格22低廉，有较低的临界压力和温度，易于安全地从混合物分离出来。超临界CO萃取法与传统提取方法相比，最大的优点是可以在近常温的2条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能。
在超临界CO萃取莪术挥发油中，有许多因素会影响挥发油的提2取率，重要的如时间、温度和压力等。通常，时间是试验中最为显著的影响因素，在一定范围内，随着萃取时间的延长，挥发油产率也增大；而温度、压力和CO流速等影响比较复杂。温度对萃取率的影响，2一方面，温度升高，CO流体密度下降，导致流体溶解能力下降；另2一方面，温度升高，溶质蒸气压增大，CO流体黏度减小，利于萃取。2在具体提取过程中，这几个因素都有一个最佳值，需要通过试验去摸索。有学者研究认为，时间90分钟，CO动态流量4kg/h，压力220MPa，温度55℃为超临界流体萃取温莪术挥发油的最佳条件。
与传统的水蒸气蒸馏法相比，超临界CO萃取中药挥发油有以下2优势：萃取速度快，可缩短生产周期，没有残留的有机溶剂，同时可以节省大量的有机溶剂，特别适合于那些对热不稳定的物质的萃取；其流程简单，操作方便，可避免传统溶剂法提取时易燃易爆的危险，减少环境污染。
在物质临界点附近，温度和压力的微细变化往往会导致溶质的溶解度发生数量级改变，并非温度和压力越高越好，而是有一个最佳值，因此需要对温度和压力进行优化。超临界CO是非极性物质，对低极2性的亲脂性化合物表现出极好的溶解性能，但对极性物质进行萃取时，需要加入极性改性剂。陈淑莲等用超临界萃取分析蓬莪术的挥发性成分，结果发现最优化的萃取条件为20.0MPa，55℃，0.5ml乙醇作改良剂，CO12ml，动态萃取40分钟，与传统的索氏提取、水蒸气2蒸馏法相比，萃取能力更强，效率更高，可提高产品收率和资源利用率，缩短提取时间，能耗低，可避免大量使用溶剂，减少污染。聂小华等分别用超临界CO萃取法（SFE-CO）和水蒸气蒸馏法（SD）22两种不同方法提取温莪术挥发油，通过气相色谱质谱仪（GC-MC）分析比较了提取物的化学成分及相对含量，发现SFE法提取的挥发油的提取率是SD法的2倍，而且SFE法相对SD法来说，工艺更为简单，萃取时间也缩短，不存在有机溶剂残留的问题，是未来产业化发展极为有用的技术。
超临界流体萃取技术的局限性是其较适合于那些亲脂性、相对分子量小的物质的萃取，对于极性大、相对分子量太大物质的萃取，要加夹带剂或在很高的压力下进行，这就给工业化带来了一定的难度。另外，设备一次性投资大，给其普及带来了一定的限制。三、莪术油两种提取方法的比较
聂小华等比较了超临界CO萃取法和水蒸气蒸馏法提取温莪术挥2发油，通过GC-MS分析比较了提取物的化学成分及其相对含量，并研究了其对肺腺癌细胞SPC-A-1的体外抗肿瘤活性。结果如下所述：
1.抗肿瘤活性物质超临界CO萃取法所提取的温莪术挥发油中主2要抗肿瘤活性物质莪术二酮、异莪术醇明显高于水蒸气蒸馏法；超临界CO萃取法提取的温莪术挥发油具有显著的抗肿瘤活性，在浓度为262.5μg/ml时，抑制率可达62.57%，而水蒸气蒸馏法提取的温莪术挥发油在高浓度下才表现出较弱的抗肿瘤活性，当浓度为500μg/ml时，其抑制率仅为25.79%。
2.挥发油提取率超临界CO萃取法提取温莪术挥发油的提取率可2达4.0%～5.0%，明显高于水蒸气蒸馏法的2.5%。
3.化学成分经GC-MS分析，通过比较发现，超临界CO萃取法中2莪术二酮和异莪术醇的含量分别为22.30%和6.19%，明显高于水蒸气蒸馏法；而榄香烯、吉马酮、表莪术酮和莪术醇含量相应低于水蒸气蒸馏法。
4.挥发油的外观与香气从挥发油的外观及香气来看，超临界CO2萃取法所得挥发油较水蒸气蒸馏法所得挥发油有较好的色泽，颜色均一，香气纯正、自然。这主要是由于其操作温度低，可大量保存热敏性及易氧化成分，保存了有效成分的天然品质。
以上结果说明，在温莪术挥发油的提取技术中，超临界CO萃取2法确实在多方面均优于传统的水蒸气蒸馏法。四、榄香烯的提取
2003年，癌症药物研究专家、美国中药研究中心徐任生教授在广西南宁举行的国际药物化学、新药开发学术研讨会上说：“近年来抗癌药物的筛选技术有了很大的改进，促进了植物来源抗癌新药的研究，而中国丰富的药用植物正为开发抗癌新药提供了独特的来源。从植物中探索抗癌新药已是科学家们热衷的研究方向。因为，迄今为止，也只有从天然产物中才能找到如此结构新颖和作用独特的化合物。”所以说，从温莪术中提取分离提纯榄香烯抗肿瘤活性成分，并研发植物抗肿瘤新制剂具有十分重要的意义。
榄香烯是近年来备受关注的抗癌新药，它可从多种植物中提取分离而得到。目前，研究最多的就是从温莪术的挥发油中提取分离，从温莪术中提取得到的产物以β-榄香烯为主要成分，同时含有α-榄香烯和γ-榄香烯。据《浙南本草新编》记载，20世纪70年代浙南地区的赤脚医生就发现应用莪术油蘸药棉外塞阴道治疗宫颈癌和子宫糜烂疗效显著。后由大连医药科学研究所和上海市肿瘤防治办公室等单位联合研究发现莪术油中抗肿瘤的主要成分是榄香烯。1993年12月，大连华立金港药业有限公司开发的榄香烯乳注射液获得国家二类新药批文，开始应用于临床。
经研究表明榄香烯对多种肿瘤细胞作用明显，能提高淋巴因子IL-2的水平，而IL-2又有诱导原始NK细胞的增强分化和使前体NK细胞分化成熟表现活性。因此，榄香烯除直接杀伤肿瘤细胞外，还可以通过激活机体免疫系统，使宿主特异性免疫功能增强而获得明显的免疫保护效应。榄香烯与所有化学抗癌药相比其最大的特点是具有靶向性，副作用少，不仅不会杀伤正常细胞，相反还能提高免疫力。目前临床上已应用的榄香烯乳注射液，具有很强的杀灭肿瘤细胞和抑制肿瘤生长作用。近年榄香烯的抗癌作用已引起国内外学者的高度重视，并试图在榄香烯乳注射液之后，研发出作用更强大、副作用更小、应用范围更广的新剂型。
如果以从莪术油中提取榄香烯为目标，则需对莪术油的两种提取方法（即水蒸气蒸馏法和超临界CO萃取法）作出重新评价。此时，2传统的水蒸气蒸馏法被认为比超临界流体萃取法更有优势。虽然前者的提取率比超临界CO萃取法要低，但所提取的莪术油澄明度好，成2分稳定，有利于下一步榄香烯的提取。而超临界CO萃取法提取的莪2术油虽然提取率高，但同时将大量杂质成分带出，在精密分馏过程中，由于杂质多，所析出的结晶也明显增多，无法从分馏头中排出，达不到分离纯化榄香烯的目的。有人认为，超临界CO萃取技术适于在温2郁金中提取一般极性的挥发性精油等成分，而不能用于提纯精制精油中分子量较大的极性成分，更无法有效地将与榄香烯沸点、分子量都极其近似的化合物分离出来。而如果应用超临界多元流体分步选择性提取工艺，则需经过萃取精馏→萃取结晶分离→离子膜分离→流体色谱重组等繁杂的工艺步骤，且要添加第二、第三溶剂方能实现，这导致投资巨大、工程复杂，又不利于天然成分的纯化。
目前，在以温莪术为起始原料的分离工艺中，都存在着工艺复杂、需要加入溶剂、提取量少、无法满足工业化生产要求等缺陷，这导致榄香烯生产受限，产品供不应求，价格昂贵，较大程度地阻碍了榄香烯抗肿瘤制剂的推广应用：β-榄香烯的含量过低，其他杂质过多；其制剂在使用时仍存有不少缺陷，如注射时有剧烈疼痛感，静脉给药时易患脉管炎等。为了解决从温莪术中提取高纯度榄香烯的难题，国内外很多研究机构都作出了自己的努力。可喜的是，在温莪术的道地产区温州，有一家研究机构摸索出了一种较好的办法。温州乐清市温特莪术油研究所采用水蒸气蒸馏法提出莪术油，并反复试验，对精密分馏柱的大小，填充的材料，加热器的类型、温度、真空度，接收馏分的最佳程度以及操作程序、分析仪的选择和方法等进行了深入研究，最终，确定了一条提取、分离和提纯得到纯度达85%以上榄香烯活性成分的技术路线：
第一步，提取：取温郁金根茎→粉碎→水蒸气法蒸馏→油水分离→莪术挥发油；
第二步，G-排式同步精密分馏：取莪术油→高真空加热→精密分馏→接收分馏组分→得到平均纯度在55%以上的榄香烯；
第三步，精密提纯：取55%以上的榄香烯→高真空加热→精密分馏→接收分馏组分→得到纯度在85%以上的榄香烯。
技术路线第二步方法中的G-排式同步精馏装置，由多条玻璃柱组成，柱内填充金属环（理论塔板数未计）。
此路线的关键技术是将多条玻璃柱串联，将分离系统、加热系统、真空系统、冷却水系统集为一体，构成成套的精密分馏系统装置，能有效地分离提纯榄香烯，使榄香烯在莪术油中的含量从5%～6%，分离提纯到85%～93%，且一次性投料5000ml，可得到合格榄香烯原料药200～250ml，一次性反应时间在8～10小时，提取率达到75%～90%。该装置的特点是一次性投料多，提取量大，达到工业化生产程度；设备简单，成本低，操作方便，不添加任何溶剂，在高真空状态下分离，环保，无污染。
该制备工艺还可在轻馏分的蒸馏液中和重质逆向回流液中精制提取植物天然香精、牻牛儿酮及莪术醇等。采用此法整套生产线可年产榄香烯180kg，莪术油30 000kg，莪术醇300kg，提取的产物中β-榄香烯、α-榄香烯、γ-榄香烯总和高于85%，β-榄香烯高于75%。通过该技术的实施，可综合利用莪术油中的多种植物活性成分，更大程度地提高温莪术的附加值。参考文献
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莪术根状茎中含挥发油约1%～2.5%，目前从不同品种、不同产地的莪术油中分离鉴定出29～42种化合物，这些成分多为萜类及倍半萜衍生物。萜类化合物是存在于植物界的一大类化合物，具有多种生物活性，并且是某些中药的主要有效成分。当前，药学工作者对莪术醇、榄香烯的研究较多，其抗肿瘤、抗病毒的疗效已得到肯定。莪术挥发油中的莪术二酮，临床应用表明对宫颈癌有较好的疗效；同时莪术挥发油中的姜黄醇、1，8-桉叶素、吉马酮、姜黄酮、芳姜黄酮和樟脑等成分具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、平喘、镇痛和利胆等作用。随着分析方法的不断发展，对莪术油中的成分进行了深入研究，发现其中尚含有表莪术酮、莪术烯、焦莪术酮、异莪术醇、去氧莪术酮、呋喃二烯酮、去氢莪术二酮、α-蒎烯、β-蒎烯、樟烯、异龙脑、龙脑、桉油精、异呋吉马酮、川芎嗪、莪术烯酮、异莪术烯醇等。
将温莪术饮片经水蒸气蒸馏，得到棕褐色挥发油。滤取析出结晶，以石油醚（沸程30～60℃）充分洗涤后，用无水乙醇重结晶，得到无色针状结晶即莪术醇针状结晶。薄层层析鉴定为单一斑点。熔点：143.5～144℃，易溶于乙醚、三氯甲烷，溶于乙醇，微溶于石油醚，几乎不溶于水。用质谱测得莪术醇的分子量为236，元素分析计算（试验值：C：76.04%；H：10.32%；理论值：C：76.22%，H：-110.24%）得出分子式：CHO。红外光谱测定3420cm（羟15242-1-1-1基），3096cm，1645cm，882cm（亚乙烯基）［理论值：-1-1-1-13420cm（羟基），3096cm，1645cm，882cm（亚乙烯基）］。将莪术醇用醋酐吡啶进行酰化，得无色油状物；折光率为-1为1.484；元素分析C：73.71%，H：9.30%；红外光谱测定1757cm，-1-1-1-11212cm（乙酰基），3096cm，1647cm，886cm（亚乙烯基）-1-1-1-1［理论值：1757cm，1214cm（羟基），3096cm， 1647cm，-1882cm（亚乙烯基）］。
莪术油中主要成分莪术醇、莪术二酮、吉马酮、β-榄香烯结构式见图1-3-1、1-3-2、1-3-3、1-3-4。图1-3-1 莪术醇的结构式图1-3-2 莪术二酮的结构式图1-3-3 吉马酮的结构式图1-3-4 β-榄香烯的结构式
周欣等利用气相色谱-质谱联用仪对不同品种、不同产地的莪术挥发油［市售莪术油、温莪术油、蓬莪术油、浙江永嘉莪术油（A样）、浙江永嘉莪术油（B样）、瑞安陶川莪术油］中的化学成分进行分析鉴定。取莪术挥发油1μl（乙醚溶液），用气相色谱-质谱联用仪分析鉴定，选用HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane（30m× 0.25mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱为色谱柱，气相色谱条件：柱温60℃，以10℃/min升温至100℃，再以4℃/min升温至200℃后，以20℃/min升温至300℃，保持2分钟；汽化室温度250℃；载气为高纯氦气；柱前压52.5kPa，载气流量1.0ml/min；进样量1μl（用乙醚作稀释液）；分流比40∶1。质谱条件：离子源为EI源；离子源温度30℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1388V；接口温度280℃；溶剂延迟3分钟；质量范围10～550。分别检出88～106个峰及对应的质谱峰，通过HP MSD化学工作站检索Nist98标准质谱图库和WILEY质谱图库，并结合有关文献谱图解析，分别鉴定出29～42个化合物。通过HP MSD化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行计算求得各化学成分在挥发油中的相对含量。研究发现，不同品种、不同产地的莪术，其挥发油中化学成分有较大差别，所得的各化学成分在挥发油中的相对峰面积百分含量见表1-3-1。从表中可知，不同品种、不同产地的莪术挥发油中的化学成分及其相对峰面积的百分含量有较大差别，有些品种或产地的莪术挥发油中不含莪术二酮、莪术酮、莪术醇、姜黄醇等具抗癌活性的成分。这一研究为控制莪术挥发油的质量提供理论依据，提示在中成药产品质量控制中，应确定药材的品种、产地等影响因素。表1-3-1 莪术挥发油的化学成分续表续表续表注：相对含量项下：1：市售莪术油；2：温莪术油；3：蓬莪术油；4：浙江永嘉莪术油（A样）；5：浙江永嘉莪术油（B样）；6：瑞安陶川莪术油
李爱群用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析了浙江、四川和福建所产莪术挥发油的成分。分别将浙江、四川、福建产的莪术粉碎，经水蒸气蒸馏，蒸馏液用乙醚萃取，无水硫酸钠干燥后浓缩得到的淡黄色挥发油——莪术油。分别用乙腈稀释后进样，色谱条件：进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，电离电压为70V，载气为氦气，流速为1ml/min；采用程序升温，起始温度70℃，升温速率3℃/min，升至145℃，维持10分钟，再以3℃/min升至210℃。不同产地莪术挥发油的总离子流（TIC）图分别见图1-3-5、1-3-6、1-3-7。从总离子流图中可见，不同产地的莪术所提取的挥发油成分相差较大，福建产莪术的挥发油成分明显比浙江和四川的多。本试验结果表明，不同产地莪术的挥发油的成分差异较大，其中3种抗癌活性成分β-榄香烯、莪术醇、莪术酮存在明显差异，其中四川产莪术挥发油中没有检测到莪术醇和莪术酮。该研究提示在使用莪术作为原料制备制剂时，应规定莪术的产地。图1-3-5 浙江产莪术挥发油总离子流图图1-3-6 四川产莪术挥发油总离子流图图1-3-7 福建产莪术挥发油总离子流图
孙秀燕对四川、广西、浙江这三个产地的莪术油化学组成进行考察，所采用的气相色谱条件：色谱柱为DB-5（30m×0.25mm，0.25μm），柱温70℃，以10℃/min的速率升温至250℃，然后保持20分钟；汽化室温度250℃，载气为氦气，流量0.9ml/min；质谱条件：离子源为EI源，温度200℃，70eV，进样量1μl。将这三种不同产地的莪术油按上述GC-MS条件检测，对得到的总离子流各主要色谱峰的质谱图进行比较（图1-3-8），如果以保留时间15分钟为界，将总离子流图分为A区和B区，发现15分钟之前的A区色谱峰是不同产地莪术油的共有峰，它们之间仅存在相对量的差别；而不同产地莪术的特有峰主要出现在15分钟之后的B区，B区可显示莪术油的特征峰；蓬莪术含量最大的组分为莪术酮（22.44%）；在广西莪术（5.52%）和温莪术（3.27%）中则含量很少；温莪术中主要成分之一莪术二酮（15.99%）比广莪术（2.18%）和蓬莪术（1.44%）高出7～14倍，提示考虑以莪术酮和莪术二酮的含量来区别蓬莪术和温莪术。在保留时间在20～21分钟的色谱图中，仅显示出广西莪术的一组特征峰，而其他品种未见出峰，提示可将此时间段作为广西莪术区别于其他品种的特征区。经GC分析，3个品种莪术油中共有的14个特征成分相对含量在80%以上，基本能代表和反映出这三个不同产地莪术品种的莪术油的主要组分，因此可作为莪术油的指纹峰。图1-3-8 三个产地莪术挥发油总离子流色谱图图中a：温莪术（水蒸气蒸馏法提取）；b：广西莪术（水蒸气蒸馏法提取）；c：蓬莪术（水蒸气蒸馏法提取）；d：温莪术（超临界CO萃取法）；e：广西莪术（超临界CO萃22取法）；f：蓬莪术（超临界CO萃取法）2参考文献
［1］王琰，王慕邹．姜黄属常用中药的研究进展．中国药学杂志，2001，36（2）：80-82.
［2］周欣，梁光义，沈万雁，等．不同产地莪术挥发油的研究．华西药学杂志，2002，17（3）：201-203.
［3］李爱群，姚崇舜，胡学军，等．不同产地莪术挥发油的有效成分．分析测试学报，2002，21（6）：67-69.
［4］孙秀燕，李勇，林东海，等．三个品种莪术挥发油的化学成分研究．分析测试学报，2005，24：133-135.第四章 莪术油有效成分的鉴别及质量标准的建立一、莪术油有效成分的鉴别、含量测定及质量标准的研究
莪术油的活性成分为倍半萜烯类等物质，如莪术酮、莪术醇、榄香烯等。王琰等用硅胶柱层析的方法从温莪术中分离提取得到7种单体化合物，经熔点、紫外、红外、质谱、磁共振等方法测定，分别确证为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、莪术醇、莪术二酮、异莪术烯醇和吉马酮。通过X单晶衍射测定出姜黄素、莪术醇、异莪术烯醇和吉马酮的化学结构式，且通过TLC、HPLC方法检查到纯度均在98%以上。通过药效学试验及对三种不同品种及产地的莪术中的这七种成分含量比较，提示可将挥发油作为有效部位，姜黄素作为莪术的有效成分，吉马酮作为指标性成分，一并控制莪术质量。
目前，国内外还认为建立在中药成分系统研究基础上的指纹图谱对于中药内在质量评价和控制可以保障中药质量的测控，全面反映所含特征成分的指纹标准的建立，将更有效地进行中药的质量评价和控制。谢莹等用毛细管气相色谱法对莪术油的气相色谱指纹的标准化和数字化进行研究，考察利用系列正构烷烃为参比，在不同色谱条件下进行气相指纹谱的测定，结果表明，用多参比指标建立的指纹图谱数字化标准对中药质量控制更科学有效。
国内文献报道，主要以莪术油中的莪术醇和榄香烯的含量为依据，制定质量标准。（一）莪术醇
莪术醇是莪术油中的有效成分之一，可作为莪术油真伪鉴别的依据。莪术醇为倍半萜类化合物，具有半缩酮结构，其熔点为147～25142℃，比旋度［α］为40.8°，折光率n为1.482。《中国药典》1995年版采用薄层层析鉴定莪术醇，即在硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（90∶10）倾斜上行展开，用1%香草醛硫酸溶液喷雾显色。有文献报道在硅胶G薄层板上以石油醚-乙酸乙酯（85∶15）展开，香草醛硫酸溶液喷雾显色。此外，亦有文献报道在硅胶G薄层板上以己烷和乙烷-乙酸乙酯（85∶15）为展开剂，用10%磷钼酸显色。《中国药典》2010年版一部采用薄层色谱法，以硅胶G板为色谱板，石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（60∶5∶0.5）为展开剂，用莪术醇、牻牛儿酮和莪术二酮为对照品进行鉴别，以5%香草醛硫酸溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，结果发现斑点分离较好，斑点清晰可见。
我国现有的莪术醇定量测定方法有以下几种：
1.分光光度法该法为《中国药典》1995年版推荐方法，为莪术醇与香草醛硫酸溶液反应，在20～25℃放置1小时，在520nm波长处用分光光度法测定吸收度，并以聚山梨酯乙醇溶液作空白对照得到测定值。但这种方法特异性不强，易受多种因素影响如水分等，同时，莪术醇与挥发油中其他成分没有分离，难免对测量值产生干扰，使结果不太稳定。
2.红外分光光度法在硅胶G板上，以石油醚-丙酮（96∶4）为展开剂，将挥发油中极性较小的干扰组分层析至高R值区，而将莪术醇f留在原点附近，然后无须显色标记出其斑点位置，而根据试验中求出R值，直接将薄层上莪术醇部分刮下洗脱，再以其红外光谱中亚乙基f吸收峰为定量谱带，CCl为溶剂，基线法测定吸光度，结合标准曲线4定量。此法中亚乙基的谱带专属性强，除干扰组分外，其他组分与莪术醇无须进行分离。
3.薄层扫描法李静坤在硅胶G-CMC上，石油醚-乙酸乙酯（95∶5）倾斜上行展开，使莪术醇与其他成分分离，立即挥散溶剂后，用香草醛冰草酸醋酸显色，100℃下干燥，莪术醇为紫红色斑点，显色后1小时用λ＝575nm，λ＝730nm双波长薄层扫描仪测定吸收度积SR分值。由于莪术醇在酸中性质稳定，应在显色后2小时内进行扫描。以硅胶G薄层板为固定相，石油乙醚（30～60℃）-丙酮-乙酸乙酯（94∶5∶1）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，60℃显色4分钟，以反射式锯齿扫描测得温莪术油中莪术醇的平均含量为7.45%。
4.气相色谱法鉴于挥发油组分复杂，内标物选择困难，顾民心采用外标法测定莪术醇含量。选用的色谱条件为：固定相2%OV-17，柱长2m，柱温156℃，汽化室温度200℃，氢火焰离子检测，载气流量（ml/min）：氮35，氢54，空气400。郑少珠以联苯和氧杂葱为内标物，采用色谱条件为3.2mm×2m玻璃填充柱，柱温155℃，汽化室及检测器温度220℃，载气流量（ml/min）：氮气50，氢气50，空气500，测定莪术油原料药莪术醇的含量。
Zhu等利用气相色谱法来测定莪术中莪术醇的含量。用高效毛细管气相色谱法定量测定姜黄属的4种中药材温郁金、姜黄、蓬莪术、广西莪术中莪术醇含量，结果表明用高效毛细管气相色谱程序升温法分离姜黄属植物根茎挥发油结果较为理想。
5.液相色谱法游剑等在莪术油微球的含量测定中，利用香草醛浓硫酸溶液显色，以莪术醇为对照，通过醇油系数κ从而计算出微球中总油的含量。运用二极管阵列检测器同时分析制剂中莪术油3种指标性成分含量：莪术醇、莪术二酮、吉马酮，从UV扫描结果分析及排除测定溶剂的干扰，最终选定莪术醇、吉马酮、莪术二醇测定波长分别为204nm、245nm、227nm。
王婷等报道紫外-可见分光光度法是根据莪术醇与香草醛浓硫酸反应后的物质来测量，显色反应的温度和时间难以控制，且香草醛浓硫酸试剂本身不稳定，需临时配制，准确度和精密度都难以保证。其采用高效液相色谱法测定莪术醇的含量，色谱柱为C18液相色谱柱（ODS柱），以乙腈-水（15∶85，V∶V）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为210nm，柱温为25℃；以外标两点法计算含量。该法简便、准确、快速，可用于莪术醇及其制剂的质量控制。（二）榄香烯
魏福祥等以SE-30毛细管色谱柱为分析柱，正十六烷为内标物质，采用程序升温气相色谱法，起始温度160℃，保持7分钟，然后以20℃/min速率升温至240℃，保持15分钟，氮气流量1.9ml/min，分流体积比为1∶30，汽化室及检测室温度240℃，测定莪术挥发油中榄香烯的含量，该方法简便、快速，测定结果准确、可靠。
杨威采用内标法，以水杨酸甲酯作为内标物，通过毛细管气相色谱法测定莪术油中β-榄香烯含量。采用OV 1701为固定相、柱长25m、内径0.2mm、液膜厚度0.25μm的毛细管色谱柱；程序升温：起始温度100℃，5℃/min，结束温度200℃，载气为氮气，流速1.5ml/min。氢火焰离子化检测器。结果β-榄香烯进样量在0.715～14.300ng内与峰面积比值（β-榄香烯/水杨酸甲酯）呈良好的线性关系，r＝0.9999，平均回收率100.4%（RSD＝0.58%）。提示毛细管气相色谱法可作为莪术油中β-榄香烯的含量测定方法。
杜霞采用HP-5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm），初始温度100℃，然后以10℃/min升温至220℃，汽化室温度250℃，载气氮气流量1ml/min，进样量1μl，不分流进样。用GC-MS对温莪术和广西莪术莪术油中β-榄香烯的含量进行比较，结果表明温莪术的莪术油中β-榄香烯的含量明显高于广西莪术。（三）莪术二酮和牻牛儿酮（吉马酮）
在薄层色谱法中选择莪术油中量较高的倍半烯萜类成分呋喃二烯、牻牛儿酮和莪术二酮作为莪术油的指标成分，更能体现莪术油的质量。从莪术油组成成分性质差异大的角度考虑，由于莪术二酮的极性较大，呋喃二烯极性较小，牻牛儿酮的极性居中，选用呋喃二烯、牻牛儿酮和莪术二酮作为薄层鉴别法的指标成分，可根据3个不同性质的化学指标展示莪术油薄层色谱图的特征并标示主要成分的位置，综合评价莪术油整体的稳定性情况，使鉴定的可靠性更有保证，使评价结果更客观真实。《中国药典》2005年版一部规定莪术油的含量测定方法为高效液相色谱法，以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（35∶65）为流动相进行洗脱，以牻牛儿酮为对照品，检测波长为210nm进行含量测定。刘慧俊以莪术油有效成分蓬莪术环二烯、牻牛儿酮和莪术二酮同时作为指标成分，采用Kromasil KRIOO-5C18色谱柱，柱温为25℃，流动相为甲醇-水（90∶10），测波长为215nm。结果蓬莪术环二烯、牻牛儿酮和莪术二酮分别在24.12～120.60μg/ml、8.30～41.52μg/ml和24.62～123.12μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率分别为97.45%、99.26%和96.71%，RSD分别为2.43%、2.71%和1.88%，即加样回收率良好。莪术油的抗癌、抗病毒物质基础是倍半萜类成分，主要包括蓬莪术环二烯、牻牛儿酮和莪术二酮，三者含量约占莪术油的42%～50%。试验表明采用蓬莪术环二烯、牻牛儿酮和莪术二酮同时作为指标成分，代替原来的单一指标成分，能更好地控制莪术油的内在质量，确保其临床疗效，减少副作用。《中国药典》2010年版一部规定莪术油的含量测定方法为高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，以牻牛儿酮和呋喃二烯为对照品，检测波长为216nm进行含量测定。
莪术二酮的含量测定：李成网等用高效液相色谱法测定莪术油中莪术二酮的含量。采用K romasil CN柱（150mm× 416mm），乙腈-水（32∶68）为流动相，检测波长为220nm。该法简便、快速、重复性好，可作为莪术油及其制剂的定量分析方法。
贾东明等用反相-高效液相色谱法（RP-HPLC）测定莪术油凝胶剂中吉马酮的含量，方法是在ODS-C18色谱柱上采用流动相乙睛-0.025mol/L磷酸（45∶55）（三乙胺调节pH至4.5）溶液进行梯度洗脱，乙腈（70%）：0～5分钟；乙腈（70%→90%）：5～30分钟；乙腈（90%）：30～50分钟。检测波长213nm，流速为1.0ml/min。本法专属性高，可同时测定凝胶剂样品中莪术醇和吉马酮的含量，可用于对莪术油凝胶剂的质量控制。杨威等以毛细管气相色谱法测定莪术油中吉玛酮和β-榄香烯含量。以水杨酸甲酯为内标物，采用OV-1701为固定液，柱长25m、内径0.2mm、液膜厚度0.25μm的毛细管色谱柱；程序升温：起始温度100℃，5℃/min，结束温度200℃；载气为氮气；流速115ml/min；氢火焰离子化检测器。（四）莪术油指纹图谱在莪术油化学成分鉴定及含量测定中的应用
指纹图谱一般是指某些中药材或中药制剂经过适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识其化学特征的色谱图或光谱图。指纹图谱主要是通过现代的分析检测手段对复杂物质体系特征的一种阐释。近十几年来，世界主要的中药、天然药物强国或组织均采用指纹图谱的方法来检测中药或天然药物的整体化合物特征，包括日本、法国、德国、中国、英国、印度、世界卫生组织（WHO）等。近十年来，莪术油的指纹图谱研究也取得了长足的进步，不仅包括GC指纹图谱、GC-MS指纹图谱、HPLC指纹图谱，而且GC-QTOF-MS指纹图谱的研究也取得了较大的进展。
彭缨采用高效液相色谱/电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法测定莪术油化学成分。液相色谱-质谱联用仪为Agilent 1100系列液相色谱系统和布鲁克microTOFQ质谱检测器。液相色谱和质谱条件如下：TM
液相条件：色谱柱：GRACE AlltimaC18（250mm×4.6mm，5μm）；
流动相：乙腈-0.1%甲酸水；检测波长：214nm；
进样量：5μl；流速：0.9ml/min；柱温：25℃；
梯度洗脱程序：
质谱条件：ESI源：正离子检测模式；End Plate offset：-500V；
毛细管电压：-4500V；雾化气压力：120kPa；干燥气：N；2
干燥气流速：8.0L/min；干燥气温度：180℃；
精密称取莪术油适量，甲醇溶解并配制成相当于莪术油浓度为10μg/ml的溶液，按液相色谱与质谱条件下所得的莪术油总离子流色谱图（图1-4-1）进行分析。
通过保留时间结合文献并比对所建数据库，对莪术油和莪术水煎液中的色谱峰进行鉴别。以莪术油中bisacurone epoxide的鉴别为例说明莪术中色谱峰的鉴别过程。利用布鲁克“Bruker Daltonics Data Analysis”软件，对数据库中所有化学成分进行萃取，若能得到萃取离子流色谱图，则可能包含此种化学成分。bisacurone epoxide的准分子离子峰M＋H峰和M＋Na峰的精确相对分子量分别269.1747和291.1567，M＋Na峰的萃取离子流图如图1-4-2。在“Generate Molecular Formula”软件中输入bisacurone epoxide的分子式CHONa，计算精确分子质量和真实放射性核素分布并与实际情15244况进行比对，计算得到质量测量误差为-0.5ppm，sigma值为0.0969，确定此峰为bisacurone epoxide。同理可得莪术油中bisacurone epoxide、4-methoxy-5-hydroxy-bisabola-2，10-diene-9-one、acetoxyneocurdione、zedoarolide A、trans，trans-1，7-diphenyl-l，3-heptadien-5-zedoalactone A、ar-turmerone、curcumenol、zedoalactone B、crucumalactone的解析过程。试验中采用莪术二酮、呋喃二烯、莪术醇为对照品，准确鉴定出莪术油中的莪术二酮和莪术醇，混合对照品的总离子流图如图1-4-3，峰1为莪术二酮，峰2为莪术醇。通过以上数据处理过程共鉴定出莪术油中的15种化学成分，鉴定结果列于表1-4-1。图1-4-1 莪术油总离子流图图1-4-2 bisacurone epoxide提取离子流色谱图图1-4-3 混合对照品总离子流图表1-4-1 莪术油化学成分鉴别结果
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]