作者：邵荣光,甄永苏
出版社：人民卫生出版社
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生物药物研究与应用丛书----抗体药物研究与应用试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
抗体药物研究与应用/邵荣光，甄永苏主编.—北京：人民卫生出版社，2013（生物药物研究与应用丛书）
ISBN 978 -7 -117 -17051 -2
Ⅰ.①抗… Ⅱ.①邵…②甄… Ⅲ.①抗体-药物-研究 Ⅳ.①TQ464
中国版本图书馆CIP数据核字（2013）第089646号
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主 编：邵荣光 甄永苏出版发行：人民卫生出版社有限公司
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编者名单（以姓氏笔画为序）
于孟学（中国医学科学院北京协和医院）
马宁宁（中国医学科学院北京协和医学院细胞工程研发中心）
马胜林（杭州市第一人民医院）
王世真（中国医学科学院北京协和医院）
王军志（中国食品药品检定研究院）
王莉莎（解放军第305医院）
王维刚（ImClone Systems Incorporated，NY，USA）
左从林（北京昭衍新药研究中心）
申昆玲（首都医科大学附属北京儿童医院）
冉宇靓（中国医学科学院肿瘤研究所）
冯奉仪（中国医学科学院肿瘤医院）
冯健男（军事医学科学院基础医学研究所）
邢镨元（中国医学科学院肿瘤医院）
朱 军（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所）
乔春霞（军事医学科学院基础医学研究所）
刘 坚（北京军区总医院）
刘小云（The University of Texas Southwestern Medical Center，TX，USA）
刘卫平（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所）
刘昌孝（天津药物研究院）
刘铁刚（Tufts Medical Center，Department of Pulmonary and Critical Care，Medicine MA，USA）
李 良（中国医学科学院医药生物技术研究所）
杨治华（中国医学科学院肿瘤研究所）
吴从愿（中国医学科学院北京协和医院）
何红伟（中国医学科学院医药生物技术研究所）
沈倍奋（军事医学科学院基础医学研究所）
宋玉琴（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所）
张 萍（中国医学科学院肿瘤医院）
陈淑珍（中国医学科学院医药生物技术研究所）
邵荣光（中国医学科学院医药生物技术研究所）
苗庆芳（中国医学科学院医药生物技术研究所）
钟根深（新乡医学院）
徐兵河（中国医学科学院肿瘤医院）
高 凯（中国食品药品检定研究院）
郭亚军（第二军医大学肿瘤研究所）
郭晓芳（新乡医学院）
唐 勇（Lombardi Comprehensive Cancer Center，Georgetown University，Washington，DC，USA）
陶 磊（中国食品药品检定研究院）
寇 庚（第二军医大学肿瘤研究所）
谢正德（首都医科大学附属北京儿童医院）
谢良志（中国医学科学院北京协和医学院细胞工程研发中心）
甄永苏（中国医学科学院医药生物技术研究所）
蔡 炯（中国医学科学院北京协和医院）
蔡永明（天津药物研究院）
潘月龙（杭州市第一人民医院）
戴 垚（Department of Radiation Oncology，University of Florida，FL，USA）前 言
抗体对相应的抗原具有高度的特异性，针对特定的、与疾病发生发展相关的靶分子（抗原），可以制备特异性的抗体。抗体用于治疗各种疾病特别在治疗癌症、自身免疫疾患和病毒感染中显示巨大的潜力和应用前景。据报道，目前全球年销售额居前10位的药物中，抗体药物占6种。显然，抗体药物（antibody- based drug）已成为生物医药发展的一个重要领域。
抗体药物的研究与应用经历了漫长曲折的过程。抗体作为治疗剂的潜能，在20世纪初期即已引起医药研究者的关注。早期研究者曾报道，将癌细胞注入动物体内，取其抗血清进行治疗，但未能取得确定的疗效，甚至可能产生严重的毒副反应。在相当长时期内，抗血清一般用于中和外源性毒素如蛇毒等有效，但未能用于癌症和其他疾病的治疗。近30年来，以细胞工程和基因工程为基础的抗体工程技术的快速发展推动了抗体药物的研发和应用。主要体现在三个方面：①单克隆抗体。1975年Koehler和Milstein报道用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，具有重大意义并取得突破性进展。单克隆抗体的特异性高，性质均一。可大大降低其在体内与正常组织细胞的交叉反应，为利用抗体治疗疾病，特别是治疗癌症带来了新的希望。目前研制中或已在临床应用的抗体药物，基本上都属于单克隆性的抗体制品；所以又称单克隆抗体治疗剂。为便于区别，此前以抗原免疫动物获得抗血清而制备的抗体则称为多克隆抗体。②基因工程抗体。利用DNA重组技术可以修饰抗体或制备各种模式的新型抗体。考虑到鼠源性抗体在人体可引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，以基因工程技术改造鼠源性抗体，从而制备嵌合抗体或人源化抗体，并可进而制备全人源抗体。抗体人源化为抗体药物的临床应用奠定重要基础；而各种模式基因工程抗体的制备则可推动具有不同特点的新型抗体药物的发展。③抗体药物偶联物（antibody- drug conjugate，ADC），包括抗体及其片段与药物的化学偶联物以及基因工程融合蛋白；用放射性核素标联的抗体亦可归属此类。在肿瘤治疗方面，抗体药物偶联物的研制受到特别关注，因为它兼有抗体的特异性和“弹头”药物的效应功能；既显示靶向性又具有对肿瘤靶细胞的强烈杀伤作用。在癌症治疗中，抗体药物偶联物有可能取得更显著的疗效。
抗体药物具有多方面特点：①特异性。抗体对特定的抗原具有高度特异性，这是抗体药物突出的基本特征，是抗体药物用于靶向治疗的基础。②多样性。包括靶抗原多样性，抗体结构多样性，作用机制多样性等方面。对于抗体药物偶联物，还具有“弹头”分子多样性，可以利用各式各样的“弹头”分子制备偶联物。③可以定向制备。针对特定的靶分子，进行“量体裁衣”，定向制备抗体药物。在研制抗体药物偶联物时，还可根据需要，选择不同的“弹头”药物分子。④可以利用不同的分子（模块）进行组装。借助DNA重组技术可以将抗体片段与各种活性蛋白制备融合蛋白；也可以借助化学偶联技术将抗体片段与各种小分子“弹头”物质制成抗体药物偶联物。由于上述特点，抗体药物是研究开发新型分子靶向药物的有效途径与丰富资源。
基因组学研究的成果促进了疾病相关基因及疾病相关分子机制研究，推动了分子靶向药物的研发和应用，推动个体化治疗的发展。从基因（及其衍生物）到分子靶向药物，继而实施个体化治疗，体现转化医学的基本理念和基本模式。针对特定的、疾病相关的靶分子（通路），研制高度特异性的靶向药物，并用于个体化治疗；在此过程中，抗体药物可发挥重要的作用。同时，由于抗体药物的制备可以利用不同的分子（模块）进行组装，合成生物学的发展将进一步为抗体药物研究提供广阔的技术平台。甄永苏2013年4月Table of Contents第一篇 抗体药物基本技术 第一章 抗体药物研究概况与前沿第二章 杂交瘤与单克隆抗体第三章 基因工程抗体第四章 抗体库技术第五章 动物细胞表达抗体第六章 转基因动植物生产的抗体第七章 抗体药的大规模制备与分离纯化第八章 抗体分布检测新技术第九章 抗体药物计算机模拟设计第十章 单克隆抗体的作用机制第二篇 抗体药物应用技术 第十一章 药物抗体偶联物第十二章 放射免疫交联物第十三章 基于抗体的融合蛋白第十四章 基于抗体的免疫毒素第十五章 基于抗体与配体的药物第十六章 抗体酶及其在医学上的应用第十七章 基于抗体的基因治疗第三篇 抗体药物临床前研究 第十八章 抗体药物的新剂型第十九章 抗体药物的质量控制第二十章 抗体药物的药动学研究第二十一章 抗体药物的毒理学第四篇 抗体药物临床应用 第二十二章 利妥昔单抗的临床应用第二十三章 曲妥珠单抗的临床应用第二十四章 贝伐单抗的临床应用第二十五章 西妥昔单抗等抗EGFR 抗体药物的临床应用第二十六章 治疗免疫疾病抗体药物的临床应用第二十七章 抗病毒抗体药物的临床应用中文索引英文索引插图第一篇 抗体药物基本技术第一章 抗体药物研究概况与前沿
生物技术药物（biotechnological medicine）研究是国内外迅速发展的研究领域之一，而抗体药物（antibody pharmaceutics）研究是当[1]前生物技术药物研究中最活跃的一部分 。抗体是最常用的研究工具之一，通常用于免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附分析（ELISA）、定量免疫荧光和免疫组织化学等。抗体作为诊断剂或检测剂，是临床上重要的工具，广泛使用于检验医学（ELISA和流式细胞仪检测）及病理解剖学（免疫组化）。在病理解剖学中，免疫组化可作为疾病诊断、预后和预测的手段，免疫组织化学可以直接影响到[2]患者的临床管理设置 。例如，通过免疫组化测试雌激素受体α（ER-α）和人表皮生长因子受体2（HER2），最终决定乳腺癌患者是否接受价格昂贵的药物治疗。而抗体作为治疗剂，其发展经历了一个比较曲折的过程，有高峰也有低谷。但近十多年来取得了突破性进展，使得抗体药物研究再度成为生物技术药物领域研究的热点。
通过科学家们长期不断的努力，目前基于抗体的治疗已获得了空前的成功，在基础研究、应用潜力和经济效益方面有了长足的进展，对治疗性抗体（therapeutic antibody）冠以“魔弹”（magic bullet）[3]的概念在很大程度上已经被认同 。全球排名前五的治疗性抗体（英利西单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗和阿达木单抗）的销售额已从2004年的64亿美元上升到2006年的117亿美元，再上升到2008年的260亿美元，总销售额4年内翻了两番。最近，有30多种单克隆抗体已被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床，几千种抗体药物正在临床研究之中。抗体药物在治疗和商业上的成功主要是过去30多年来抗体工程获得了显著进展，产生了安全、特异性、高亲和性、非免疫原性的抗体。近年来，第二和第三代抗体正在发展中，主要是改善了原有抗体的特异性。第一节 治疗性抗体的发展史
抗体治疗（antibody therapy）的源头可以追溯到几千年前，早在公元前200年，抗感染性疾病的疫苗就已经在中国开始利用。然而，真正的抗体治疗大约出现在1个世纪前，医学家们首次提出了基于抗体的疾病治疗，即血清治疗（serum therapy）。他们发现用毒素（如白喉毒素或病毒等）免疫的动物血清是一种有效的治疗剂，可以用于治疗该毒素导致的人类疾病。1880年，德国医学家冯•贝林（Emil Adolf von Behring）开发了一种抗毒素制剂，它不能直接杀灭细菌，但能中和从细菌释放到人体中的毒素。1901年，von Behring教授由于发现和发展了白喉的血清治疗而获得诺贝尔医学奖。随后，来自人类或动物的含有抗体的血清被广泛用于病毒和细菌性疾病的预防和治疗。这些来源于动物的多价抗血清就是第一代抗体药物，它们虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白能引起较强的人体免疫反应，该副作用限制了这类药物的应用。
直到20世纪40年代，由于抗生素的发现和在感染性疾病治疗中的应用，血清治疗逐渐被抗生素类药物所代替，放弃了大多数细菌传染性疾病的血清治疗。然而，血清多克隆抗体开始用于一些毒素介导的传染病和动物咬伤，血清免疫球蛋白也开始用于病毒性疾病的预防与治疗。尽管血清多克隆抗体在许多临床治疗中是有效的，但存在一些相关的毒性问题，包括免疫反应，以及不确定的剂量限制等。此外，多克隆抗体中活性抗原特异性的抗体仅占总抗体的小部分（约1%），其余的抗体不但没有疗效，而且还有毒性和免疫原性。一直到20世[4]纪70年代，人们渴望的特异性抗体还是不能够被大量地生产 。
抗体（antibody）是一类用于抵抗外源性物质侵袭的蛋白质，其分子量约为15万～90万Da。抗体主要分布在机体的血清中，也分布于组织液及外分泌液中，是重要的疾病防御物质。当机体有外源性物质抗原（antigen）侵入时，机体会有许多防御措施使这些外源性物质被消除或破坏，而抗体的产生是其中的防御措施之一。抗体是指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），而每一个B细胞只能生产一种抗体。此外，这种细胞本身不再具有分裂和增殖的能力，因此当B细胞生产抗体一段时间之后就会衰老、死亡和消失。
治疗性抗体的实质性变化始于1975年，英国剑桥大学的科学家乔治斯•科勒（Georges J. F. Kohler）和赛瑟•米尔斯坦（Cesar Milstein）发表的一篇研究论文，该论文描述了能够提供大量生产预先确定的、专一性的单克隆抗体杂交瘤技术。杂交瘤细胞就像一个抗体加工厂，可以不断产生性质相同的单克隆抗体。该单克隆抗体生产技术被广泛应用于实验室、临床和工业化生产。由于发现了单克隆抗体生产技术和相关理论，1984年Kohler和Milstein获得了诺贝尔生理学和医学奖。单克隆抗体作为生物科学和医学各研究领域中强有力的工具，主要用于医学诊断和生物免疫检测等，但杂交瘤技术的主要限制是不能产生全人源单克隆抗体。
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体是第二代抗体药物。1982年，单抗首次被用于疾病的治疗，美国斯坦福医学中心Levy等制备了一个抗B细胞淋巴瘤的独特型单抗，该淋巴瘤患者经过这一单抗治疗后病情得到缓解，瘤体很快消失，显示出抗体药物的良好前景。1986年，美国FDA批准了世界上第一个治疗性单抗药物——抗CD3单抗莫罗莫那（muromonab，Orthoclone OKT3）进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应，此时抗体药物的研究和应用达到了高峰。随着使用单抗治疗的病例数的增加，鼠源性单抗用于人体的毒副作用也越来越明显，同时一些抗肿瘤单抗都没有获得显著的效果，使得人们对抗体药物的热情有所下降。到20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于脓毒症的治疗不仅没有取得预期效果，反而增加了患者的病死率，这使得单抗治疗研究和应用进入了低谷。
由于当时所采用的单抗均为鼠源性抗体，在人体内反复应用之后会引起人抗鼠抗体（human anti- mouse antibody，HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可以引起过敏反应。因此，人抗鼠的抗体反应是20世纪80年代抗体药物在临床上没有取得成功的最主要原因之一。尽管单抗的早期使用情况令人失望，但随着分子生物技术的发展，抗体工程技术的不断进步，单抗的研发有了很大的变化。一方面在给药方式上进行改良，如使用抗体片段、抗体药物偶联物、抗体同位素偶联物或局部用药等，使鼠源性抗体用量减少，也增强了疗效；另一方面发展基因工程抗体和人源抗体，以提高疗效，降低免疫原性。
20世纪90年代后期，治疗性抗体研究开始获得成功，1994年建立了产生全人源抗体的转基因小鼠，以及第一个嵌合抗体阿昔单抗（abciximab，ReoPro）批准上市。2002年第一个噬菌体展示技术产生的全人源抗体阿达木单抗（adalimumab，Humira）批准上市，近[5]十多年来取得了较快的发展 ，主要是抗体工程技术的发展为嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体提供了研发平台，这些基因工程抗体是第三代抗体药物。促成治疗性抗体药物发展的主要原因是：①鼠源性抗体人源化制备技术日趋完善，可以利用DNA重组技术进行鼠抗体人源化改造；②合成或半合成抗体库以及构建噬菌体抗体库，从中获得人源抗体；③甚至利用转基因小鼠获得人源抗体；④利用分子生物技术改良抗体性能，使之有效地到达作用靶部位，或提高抗体的亲和力，或提高抗体的效应功能。
概括治疗性抗体药物的发展史，可以简要地分为以下几个阶段（图1- 1）：①Kohler和Milstein发明单克隆抗体杂交瘤技术；②应用抗体治疗淋巴肿瘤取得成功；③第一个抗体药物莫罗莫那被美国FDA批准上市；④单抗用于肿瘤治疗效果不佳；⑤抗内毒素单抗试用于治疗败血症性休克失败；⑥嵌合抗体和人源化抗体上市；⑦抗体药物偶联物和放射性抗体上市；⑧全人源抗体药物上市。目前，已有30多个治疗性抗体药物上市。图1-1 治疗性抗体药物的发展过程第二节 治疗性抗体的研究进展
目前，临床上的治疗性抗体多为单克隆抗体（monoclonal antibody）。顾名思义，单克隆抗体是与多克隆抗体（polyclonal antibody）相对而言的。多克隆抗体的概念是外源性抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这些球蛋白就是免疫球蛋白，而这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞（单克隆细胞）接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体，该抗体能够与抗原的独特表型特异性结合。而由多种抗原决定簇刺激机体，就会产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是一些多克隆抗体。除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇也可以刺激机体，产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五种抗体类型，这些抗体是不同类型的分子，但享有共同的基本结构，决定它们独特的性质。
IgG是医学诊断和治疗中最常用的类型，它含有独特的结构和功能区。IgG是由两个相同的重链（5万～7万Da）和两个相同的轻链（2. 5万Da）组成的Y型结构分子。每一个轻链与重链结合，两个重链通过二硫键相互结合。轻链含有1个轻链可变区（variable region of light chain，VL）和1个轻链恒定区（constant region of light chain，CL），重链含有1个重链可变区（variable region of heavy chain，VH）和3个重链恒定区（constant region of heavy chain，CH）。功能上，免疫球蛋白分为2个抗原结合片段（Fab）和1个恒定区域（Fc），它们通过1个柔性铰链区域相连接。Fab的VL和VH区结合抗原，每个可变区含有3个超变序列区，它们形成一个环，主要负责抗原的识别，称为互补决定区（complementarity determining region，CDR）。剩余的可变区称作框架残基（framework residue，FR）。抗体的Fc部分介导效应功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody- dependent cell- mediated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖细胞毒作用（complement- dependent cytotoxicity，CDC）。在ADCC中，抗体与效应细胞如自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞的表面Fc受体结合，激发对靶细胞的吞噬和溶解作用。在CDC中，抗体通过激发补体系统杀伤靶细胞。
治疗性单克隆抗体的主要特点是：①来源于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上具有高度的均一性，在氨基酸序列及空间构型上也相同；②抗体识别的是抗原分子上单一抗原位点，具有高度的特异性；③产生抗体的细胞为无性细胞系，可长期传代并保存，且可持续稳定地生产同一性质的抗体。由于单抗对相应抗原具有高度的特异性以及抗体分子的均质性，有特异性识别作用靶点（如肿瘤细胞、病原微生物等）的能力，可用于疾病的诊断、预防和治疗。特别在肿瘤的治疗上，单克隆抗体药物靶向性强，对肿瘤细胞的追踪能力高，大量聚集在肿瘤细胞周围，能阻断肿瘤细胞的生长，导致肿瘤萎缩，从而达到有效的治疗目的。在过去几十年里，治疗性抗体有一个从鼠源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体到全人源抗体发展的过程。
随着生物技术的发展，已有许多不同类型的抗体药物被陆续研发出来。目前，抗体药物研究的种类繁多，主要包括：鼠源单抗、人-鼠嵌合单抗、人源化单抗、全人源单抗，鼠源性蛋白的成分从100%下降为33%乃至0%。此外，还有免疫偶联物、融合蛋白、免疫细胞[6]因子和胞内抗体等类型（表1- 1） 。近年来发展起来的人源化单抗和全人源单抗中极少包含甚至不包含鼠源成分，这种抗体不仅避免了人抗鼠抗体反应，而且特异性、亲和力不受影响，在疾病的治疗中将[7]发挥巨大作用，具有广阔的应用前景 。表1-1 各种不同类型的治疗性抗体续表一、鼠源性单克隆抗体
早期的治疗性抗体大多数是通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备的、只针对一种抗原决定簇的鼠源性单克隆抗体。杂交瘤细胞生产涉及几个步骤：①抗原（完整蛋白质或多肽）的选择；②用于免疫的动物的选择；③动物免疫接种；④活化B细胞与骨髓瘤细胞的融合；⑤杂交瘤细胞株的筛选和克隆。只有与骨髓瘤细胞株兼容的动物才可能被提供于融合使用。由于大多数杂交瘤细胞是从BALB/c小鼠产生，因此小鼠是最常见的B细胞捐献者，当B细胞与典型的BALB/c小鼠骨髓瘤细胞株融合时可以避免组织相容性问题。其基本过程为动物被注射抗原或抗原/佐剂混合物后激活B细胞，然后再从脾脏或淋巴结进行收集。活化的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，并在补充次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的细胞培养基中选择培养杂交瘤细胞，通过有限稀释技术和免疫分析对特异的杂交瘤细胞进行克隆和选择。其他小鼠单克隆抗体的生产都遵循同样的原则。
但鼠源性单克隆抗体由于人鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用小鼠抗体时会因为外源性的蛋白抗原而引起人抗鼠抗体反应，并充分激活人的效应功能，这极大地限制了单克隆抗体在疾病治疗上的应用和发展。相对而言，鼠源性单克隆抗体治疗剂一般难以获得成功。鼠源性抗体用于人体后抗体分子的半衰期较短，需重复应用，而反复大量应用后又会产生HAMA应答，导致鼠源性抗体被人体清除而药效降低。这些问题在很大程度上已经被DNA重组技术的利用所克服，以避免人体免疫反应，同时保留抗体的特异性。因此，制备人源化抗体用于疾病治疗自然成为治疗性抗体药物研究的主要发展方向。二、重组单克隆抗体图1-2 不同类型的基因工程抗体
完成抗体从鼠源性到人源化的变化经历了20～30年的时间。为克服鼠源性单克隆抗体的异源性反应，在20世纪80年代，研究者探索以基因工程方法改造鼠源性单克隆抗体（图1- 2），包括：①人-鼠嵌合抗体（human- mouse chimeric antibody），是将鼠源Ig的可变区与人源Ig的恒定区拼接而成的；②人源化抗体（humanized antibody），是将鼠源单抗可变区的互补决定区CDR置换成人Ig的CDR区，获得改形抗体（reshaped antibody），或以人抗体为参照，改造替换鼠源单克隆抗体的表面氨基酸残基，得到镶面抗体（resurfacing antibody）；③全人源抗体（fully human antibody），用噬菌体展示抗体库或转基因小鼠产生全人源抗体；④融合蛋白（fusion protein），将抗体与细胞因子（包括受体、配体和蛋白激酶等）融合。自第一个基因工程抗体人-鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现。到目前为止，美国FDA已经批准了近30个抗体治疗药物，其中绝大部分为基因工程抗体。过去10多年里，一些有效的治疗性抗体已经广泛用于临床，我们见证和享受了抗体药物的革命性成果。
人们利用DNA重组技术，根据需要对鼠源性抗体进行相应的改造，以消除抗体应用不利反应或增强生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体。与鼠源性单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①基因工程改造后的抗体鼠源性下降，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②可以根据治疗的需要，设计制备各种新型抗体；③基因工程抗体片段的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性；④小分子抗体片段容易穿透血管壁，进入病灶的核心部位；⑤抗体片段能够在原核细胞中大量表达，可以大大降低生产的成本。（一）嵌合单克隆抗体
临床治疗中使用鼠源性单抗的主要障碍之一是HAMA反应。因此，对于治疗过程较长、需反复多次给药的抗体药物，人源化是其重要的发展趋向。第一代重组单克隆抗体是嵌合抗体。1984年，第一个嵌合抗体被研发出来，以解决HAMA问题。嵌合抗体是利用重组DNA技术，将鼠源性抗体可变区与人抗体恒定区的融合，因为抗体恒定区是最强的免疫源区域。由于抗体的抗原结合位点在抗体可变区，因此人抗体恒定区取代小鼠抗体恒定区将保留抗体的抗原结合能力，并在很大程度上减弱了人抗鼠抗体的免疫反应。
人抗体恒定区的存在也使得抗体在人ADCC和CDC中作用更有效。有一些抗体药物，包括抗CD20的利妥昔单抗（rituximab，Rituxan）和抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的西妥昔单抗（cetuximab，Erbitux），就是利用这种技术开[7]发出来的 。嵌合抗体既具有鼠源性抗体的靶向结合能力，又具有人抗体的免疫系统性能。然而，嵌合抗体还有大约30%的鼠源性和70%的人蛋白序列，鼠源性部分还能够引起HAMA应答。为解决潜在的人抗嵌合抗体（human anti- chimera antibody，HACA）应答，科学家们寻求研发比嵌合抗体更好的人源化抗体。（二）人源化单克隆抗体
1986年，剑桥大学Greg Winter等研究发展了抗体人源化技术，该技术进一步应用重组DNA技术，将直接与靶抗原特异性结合的鼠源性抗体部分移植到人抗体中。最佳的人源化抗体不仅含有鼠源性抗体特异性抗原结合强度所需的最少的氨基酸数量（总量的5%～10%），[7]还具有人免疫系统的能力 。人源化抗体包括改形抗体和镶面抗体等，其特点是降低HAMA反应，在血中半衰期也相对较长。改形抗体也称CDR移植抗体（CDR grafting antibody），是将鼠单抗的CDR移植到人单抗的框架区，使人单抗获得与鼠单抗一样的抗原特异性，并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性。与嵌合抗体相比，改形抗体进一步减少了抗体中鼠源部分的比例，降低了HAMA反应。已有超过100多种鼠源性单抗通过CDR移植得到了人源化，其中超过60余种已经进行或正在进行临床试验。研究还显示，已经在全球上市的和在临床试验的人源化抗体是有效的、安全的。
抗体抗原结合的特异性主要取决于其CDR的表面构型和特性，如每个CDR构象及其氨基酸侧链的性质。因此，移植鼠源性CDR到一个人抗体的可变区，可显著降低抗体的免疫原性。然而，CDR的移植可能导致抗原结合特性不能完整保留。独特的人和小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区比较分析显示，人抗体与小鼠抗体暴露残基框架的精确模式是不同的。如果想要保留重要的抗原结合亲和力，一些来自小鼠抗体的残基框架必须在人源化抗体中保留。为了达到最佳的人抗体框架，就要从数据库中选择合适的人抗体可变区，该可变区与小鼠抗体可变区有最大的序列同源性。这种研究方法使得人源化单克隆抗体保留了原有的关联残基，该残基直接影响其抗原结合特性。该方法包括计算机模拟设计、聚合酶链反应技术以及定点突变。该过程的CDR移植已被成功地用于许多人源化的抗体，包括使用曲妥珠单抗（trastuzumab，Herceptin）和阿仑单抗（alemtuzumab，Campath）。
针对小鼠T辅助细胞表位的脱免疫技术（de- immunization technology）是另一种降低鼠源单克隆抗体免疫原性的途径。辅助性T细胞表位含有抗体的序列，它与主要组织相容性（major histocompatibility，MHC）Ⅱ类分子结合，可以被辅助性T细胞识别，启动T细胞激活和分化，从而诱导人抗鼠免疫反应。脱免疫技术程序包括确定并消除来自抗体的小鼠T辅助细胞结合表位，用计算机辅助预测序列和突变。（三）全人源抗体
尽管人源化抗体的小鼠成分含量明显减少，但人源化抗体的免疫原性并不能达到令人满意的结果，其免疫原性还不能够被忽视，有的甚至达到无法忍受的程度。因此，全人源抗体的研究自然成为当前的发展趋势，全人源抗体可以通过使用人杂交瘤细胞、转基因动物，以[8]及噬菌体抗体库等途径得以实现 。噬菌体展示（phage display）技术、转基因鼠（transgenic mouse）以及其他分子生物学技术的利用，使得全人源单克隆抗体的研究得到快速发展。
1994年，Lonberg等建立了表达人Ig的转基因小鼠，使得由动物制备全人源抗体成为可能。产生全人源抗体的转基因小鼠是基因组工程、转基因动物和杂交瘤技术的有机结合体，首先是用人Ig基因取代小鼠Ig基因，继而将含人抗体轻链和重链基因组的小鼠与SCID小鼠杂交，从中筛选出双转基因/双缺失的纯合小鼠。该转基因小鼠含有人抗体基因谱，当接受免疫抗原的注射后，受到靶抗原刺激的小鼠体内B细胞可产生免疫应答反应，分泌针对该免疫原的全人源抗体。随着人和小鼠免疫球蛋白基因的成功克隆和转基因技术的成熟，现在可以在动物中生产人免疫球蛋白。在一些小鼠品系中，他们的鼠源性免疫球蛋白基因位点已被人免疫球蛋白基因取代。这些转基因小鼠能够生产结构和功能正常的人抗体。这些抗体也可以通过使用常规的杂交瘤技术进行克隆和生产。由转基因小鼠B细胞制备的杂交瘤也能够分泌全人单克隆抗体，可以用杂交瘤技术进行克隆和生产，这为人单克隆抗体及基因工程抗体的制备开辟了一条新的途径。
噬菌体展示抗体库（phage display antibody library）是一项新的全人源抗体制备技术，由于该技术具有生产人抗体的能力，有越来越多的科学家投入这一研究，使得噬菌体展示抗体库技术得以快速发展，由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产途径。利用噬菌体抗体库来生产人抗体是一个快速增长的领域。简单地说，从不同来源的B细胞中分离得到人抗体重链和轻链信使核糖核酸（mRNA），反转录为cDNA，经过PCR扩增、克隆和在丝状噬菌体表面的表达。这些表达特异性抗体的单克隆菌株可以被抗原混合和噬菌体库的克隆筛选技术鉴别出来。人抗体mRNA的来源应根据所需抗体的目的而定，包括：已被抗原免疫或暴露到传染性病原体的个人，自身免疫疾病或癌症患者，甚至是一些非免疫器官捐献者。噬菌体展示人抗体库的特点和优势，包括：①噬菌体人抗体库可以模拟天然抗体库，不需要免疫人和动物；②抗体工程菌株比杂交瘤细胞稳定、易保存，适应于大规模工业化生产；③能够模拟抗体亲和力成熟过程，获得不同亲和力的抗体。抗肿瘤坏死因子的重组IgG阿达木单抗（adalimumab，1Campath）是第一个被FDA批准的用噬菌体展示技术制备的人单克隆抗体。
噬菌体抗体技术是生产全人源抗体的有效手段，可以产生针对几乎所有靶抗原的全人源抗体。它被用于制备能结合细胞表面受体并能够内化的抗体，这些抗体可以运载细胞毒性物质进入细胞内，达到治[9]疗效果 。噬菌体抗体库（phage antibody libraries）可直接选择肿瘤细胞株，产生能结合细胞表面受体并迅速内化的抗体。生产抗体的过程如下：①直接从噬菌体抗体库中选择内化的抗体；②用高通量流式细胞仪检测筛选结合到肿瘤细胞株的噬菌体抗体；③用免疫沉淀和质谱分析确定抗原与噬菌体抗体的结合能力；④检验和量化噬菌体抗体的内化。（四）重组抗体片段
由于完整抗体分子量较大（约15万Da），它的血管壁扩散和血流清除速度比较慢。特别是完整抗体用于肿瘤治疗时，其大分子难以穿透细胞外间隙进入肿瘤深部。采用基因工程方法可以使抗体分子小型化，小型化抗体包括：（Fab）片段、Fab片段、单链抗体（single 2chain antibody，scFv）、双链抗体（diabody）、三链抗体（triabody）、微型抗体（minibody）、轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）等。与血液恶性肿瘤相比，实体肿瘤对抗体治疗往往是不敏感的。为了改善抗体的肿瘤靶向效果，修饰的多价新型抗体已经被制备。起初，这些新型抗体模仿天然抗体的结构，多为单特异性的双价抗体。最近，通过加强肿瘤生物分布和功能性亲和能力，新型三价[10]抗体已发展为肿瘤靶向能力最大化的抗体 。近年来，由于快速重组DNA技术领域的发展，使得诊断和治疗性抗体或抗体片段的改造得[7]以实现 。
ADCC和CDC治疗性抗体需要有Fc段的存在才能发挥作用。但是Fc段的保留对于细胞因子失活、受体阻断或病毒中和是非必需的，并且可能由于Fc段的存在导致不良后果。因此，当制备细胞因子失活、受体阻断或病毒中和性抗体时，大多数抗体中的Fc段通常被去除掉。蛋白降解或重组工程技术通常被用于生产不含Fc的抗体Fab片段，以及更小分子的抗体片段。抗体结合抗原的最小功能片段是Fv片段（VH和LH），其中包括CDR和FR区。采用重组技术，VH和VL可以通过柔性肽连接形成scFv。利用微生物表达系统，scFv可以在原核生物中得到更好的表达。这些抗体片段的药动学特别是在组织穿透能力上似乎更好。
缩短单链抗体VH和LH之间的连接长度，能够增加VL和VH分子间的复合作用。进一步通过降低连接链的长度，可以产生双链抗体、三链抗体和四链抗体（tetrabody）。scFv可融合到抗体恒定区，如CH3区，制成微型抗体。通过融合两种不同scFv的双特异性抗体已经成为可能，并可能提供强大的和更特异的治疗性抗体药物。事实上，在小鼠体内，双特异性抗体（抗CD30和CD16）已被证实能显著诱导异种移植的霍奇金淋巴瘤的缩小，因为抗体能招募CD16阳性的NK细胞到CD30阳性淋巴瘤细胞上。
双特异性抗体作为癌症治疗药物使用，是在20世纪80年代中期提出的。随着基因操作、蛋白工程技术的研究发展和对正常与恶性细胞抗原及受体表达的深入了解，人们利用抗体和受体为基础的平台技术设计和生产双特异性抗体。制备双特异性抗体的一般策略是所需单抗可变区与单一双功能结构（single bispecific structure）的组合，目前该类抗体的研究已经有了显著的进展。许多不同的双特异性抗体已经被生产，包括两个完整单克隆抗体或片段的异种化学偶联、四源杂交瘤（quadroma）抗体、F（ab＇）、微型双链抗体，串联双链抗2[11]体（tandem diabody）和单链抗体 。四源杂交瘤抗体是一种单价的双特异分子，这种分子有两条不同的重链和两条不同的轻链，从而使其两条臂可以分别针对不同的抗原分子。
外源性多肽和蛋白噬菌体表面展示技术的发展是重组抗体技术在最近几年的快速发展的重要推动力。抗体噬菌体展示作为重组抗体技术的重要组成部分之一，已导致越来越多的治疗抗体得到发展。噬菌体展示技术也用于重组抗体片段的制备。抗体基因库被融合到噬菌体外壳蛋白的编码基因中，这些表达融合外壳蛋白抗体库的重组噬菌体在大肠杆菌中增殖。通过筛选（panning）过程，针对特异性靶抗原的噬菌体展示单克隆抗体片段从该库中分离出来。该基因编码从抗体库选定的所需抗体片段，包装到噬菌体颗粒内，这些与基因型和表现型相关。包括：①基于美洲骆驼重链抗体的噬菌体展示单区抗体库（phage- displayed single- domain antibody library）的构建；②抗多肽抗原库的筛选；③单区抗体（single- domain antibody，sdAb）的表[12]达、纯化和特征鉴定 。
近年来，重组抗体片段的研究也获得了显著进展，有许多抗体片段进入临床研究阶段。例如，TRU- 015是注射用抗CD20单链抗体，[13]能够介导ADCC反应，用于风湿性关节炎的治疗 。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明，风湿性关节炎患者对TRU- 015有很好的耐受性，效果与其他已批准治疗风湿性关节炎的生物药物相似。TRU- 015能否作为新的风湿性关节炎治疗药物，其有效性、安全性和优势有待进行Ⅲ期临床评价。此外，TRU- 015也可以用于B细胞瘤和自身免疫性疾病的治疗。三、免疫偶联物
为提高抗体药物特别是抗肿瘤抗体药物的功效，加强其对癌细胞的杀伤作用，人们用效应分子或“弹头”（warhead）药物通过化学方法与抗体连接，制成免疫偶联物（immunoconjugate），也称作“生物导弹”。免疫偶联物用抗体作为导向载体，用“弹头”药物杀伤肿瘤靶细胞。效应分子或“弹头”药物主要有3类，即放射性核素、毒素和药物。效应分子或“弹头”药物与抗体连接后构成放射免疫偶联物（radioimmunoconjugate）、免疫毒素（immunotoxin）和化学免疫偶联物（chemoimmunoconjugate）。目前，免疫偶联物已经取得重大进展，如抗体或片段标记毒素（利妥昔单抗/肥皂草素等）、抗体药物偶联物（吉妥单抗）和放射免疫偶联物（托西莫单抗）已经发展为效果更好的细胞毒性肿瘤治疗剂，并已广泛获得成功。
高度有效的“弹头”药物已被连接到许多能识别不同肿瘤抗原的抗体上，吉妥单抗（gemtuzumab ozogamicin，Mylotarg，一种抗体与calicheamicin偶联物）已成功上市，使得抗体药物的用量下降了10余倍。目前已经有10多种抗体药物偶联物在临床研究阶段，其中SGN- 35的Ⅰ期临床试验，探讨对于霍奇金淋巴瘤的治疗作用，Ⅱ期临床研究针对系统性间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和CD30阳性恶性血液病。已有少数放射性抗体偶联物获得FDA批准用于临床肿瘤治疗，包括替坦异贝莫单抗和托西莫单抗。放射性抗体偶联物对一些抗体耐药的肿瘤有效，目前有15种以上放射性免疫偶联物处于临[14]床研究阶段 。
抗体工程还被用于产生保留完整抗体结合活性的不同抗体片段，并在某些特异性治疗应用如放射免疫治疗中使用这些新的抗体片段[15] 。由于完整抗体大分子限制了肿瘤的渗透能力，其血清半衰期长，并不适合于放射免疫治疗或放射成像的应用，因为它会导致对健康组织的辐射和高背景。抗体片段如Fab片段，尽管它们缺乏效应功能，但其单价特性和被肾脏迅速清除的特点还是引人注意的。为了弥补这些缺陷，一些新类型工程抗体被推荐应用。单链抗体片段通过柔性链把抗体的重链和轻链可变区连接在一起，虽然小片段处在单价的形式，但还保留了完整抗体分子结合活性的能力。由于其在血清中的半衰期很短（约2小时），单链抗体片段不能用于治疗，但被广泛用作更复杂分子的连接基团。另外，双链抗体是一个中型分子（6万Da），可以作为放射免疫治疗或成像用。
除了增加分子量，这些双链抗体提供了双价效果，从而导致更高的亲和力和较高的肿瘤保留时间。因此，双链抗体提供了快速的组织渗透、高浓度的靶位保留和快速的血浆清除。由于它们是通过肾脏迅速排出的，这样就可以限制它们进入骨髓，这是放射标记性完整单克123111隆抗体最常见的剂量限制器官。标有碘（I）或铟（In）的双链抗体是具有肿瘤快速吸收和清除特点的体内成像剂。因此，微型双功能抗体放射治疗具有很大的潜力。事实上，单一剂量静脉注射钇90（Y）标记的双链抗体能抑制裸鼠HER2移植瘤在裸鼠中的生长速211率。还有报道，一次注射标有放射性核素砹（At）的抗HER2双链抗体，1年之后移植有HER2/ neu阳性肿瘤的免疫缺陷裸鼠的无瘤率达到60%之多。四、高效小型化抗体
目前上市的抗体药物价格比较昂贵，首要原因是抗体药物都为完整抗体药物，其活性需要糖基化修饰，要由哺乳动物细胞表达产生，技术含量和生产成本较高。其次是完整抗体药物在临床上的用药量较大，治疗费用随之增加。因此，人们努力寻找能够降低价格的新型抗体药物，用于肿瘤的治疗。解决手段主要有两种：①抗体药物的小型化，因为小型化抗体药物不需要糖基化修饰，可以在原核细胞中表达，操作方便，生产成本较低；②抗体药物的高效化，即抗体连接上对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的“弹头”，降低药物的用量。而联合这两种[14]手段所产生的抗体药物往往会获得更好的效果 。
为了克服抗体药物到达实体瘤数量有限的制约，需要其他手段弥补这一不足，即抗体药物的高效化，使少量抗体药物到达靶部位就能杀伤肿瘤细胞。研制高效化抗体药物需要高效“弹头”药物，常规化疗药物如多柔比星、丝裂霉素等虽然对肿瘤细胞有杀伤作用，但需用10个以上药物去连接一个抗体，以加强偶联物对肿瘤细胞的杀伤力，同时抗体特异性也受影响。因此，人们寻找一些对肿瘤细胞有极强杀伤作用的药物作为“弹头”。高效“弹头”药物主要包括：烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicin和力达霉素（lidamycin，LDM）、美登素（maytansine）衍生物、auristatin衍生物等，对肿瘤细胞的杀伤活性比常规化疗药物大约强1000倍，其免疫偶联物对裸鼠移植性肿[16]瘤均有选择性显著疗效 。临床上，免疫偶联物Mylotarg对急性复发性髓性白血病有显著疗效。
抗体药物已为大分子物质，而抗体-药物偶联物的分子量更大。庞大的偶联物分子难以通过毛细管内皮层和细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化抗体，使抗体药物较易穿透细胞外间隙到达肿瘤深部，对提高疗效有重要意义。如前所述，常见的小型化抗体有：Fab片段、单链抗体、双链抗体，以及最小识别单位（minimal recognition unit）等。小型化的抗体有许多优点：①分子量小，免疫原性低；②容易进入实体瘤周围的微循环甚至实体瘤内部；③其血液循环和全身的廓清速度较快，半衰期短，肾脏蓄积很少；④无Fc段，不容易与具有Fc受体的非靶细胞结合；⑤小型化抗体基因构建比较简单，易于操作和改造；⑥可与高效“弹头”药物构成免疫偶联物。[17]
最近，Cheng等 报道了双特异性力达霉素强化融合抗体Anti- CD20Fab- LDM，该融合抗体特异性靶向CD20过表达的恶性B细胞淋巴瘤。Anti- CD20Fab- LDM对CD20阳性的B淋巴瘤细胞具有强烈的杀伤作用，半数抑制率为0. 01～0. 03nmol，体内对移植性Raji淋巴瘤也有很好的抑制作用，最大剂量为4nmol/kg，对肿瘤生长抑制率为90. 1%，而游离力达霉素的肿瘤抑制率为85. 0%。此外，Anti- CD20Fab- LDM对利妥昔单抗耐药的患者肿瘤细胞也有效，显示出对耐药恶性B细胞淋巴瘤的强大抑制作用。
由于EGFR和HER2是两个很有效的抗体药物靶点，已经在临床[18]上得到很好的应用，Guo等 进一步制备了抗EGFR和HER2双靶点Ec- LDP- Hr- AE强化融合抗体。该融合抗体能特异性地与肿瘤细胞结合，然后内化进入细胞质，对肿瘤细胞产生强烈的杀伤作用。体内成像结果显示Ec- LDP- Hr- AE能够富集于肿瘤内，显著抑制裸小鼠移植瘤SK- OV- 3的生长，抑瘤效果优于单靶向融合抗体。此外，Zhong等[19] 构建了抗Ⅳ型胶原酶的双scFv力达霉素融合抗体dFv- LDP和dFv- LDP- AE。该融合抗体对3种移植性肿瘤都有很好的疗效，dFv- LDP和dFv- LDP- AE对移植性肺癌PG- BE1的抑制率分别为77. 5%和94. 2%。而且，当dFv- LDP和dFv- LDP- AE联合应用时效果更佳，能够使微血管密度逐渐减少，早期移植性肿瘤缩小。五、免疫融合蛋白
利用DNA重组技术制备具有治疗性抗体功能的融合蛋白，是抗体药物研究的发展趋势。通过基因工程方法可以制成融合蛋白，融合蛋白是由抗体片段（大多为单链抗体）与具有生物活性的“弹头”部分（主要为毒素片段、细胞因子或多肽等）融合而成。到目前为止，大多数抗体与毒素融合蛋白（免疫毒素）在血液肿瘤治疗中取得成功，有20多种免疫毒素在临床研究阶段，用于血液恶性肿瘤和实体肿瘤治疗。抗体与细胞因子融合蛋白，常用的细胞因子有IL- 2、TNF、IFN等，发挥细胞因子的特异性作用。将抗体与药物代谢酶融合，构建抗体导向酶-前体药物，在疾病组织激活前体药物，发挥治疗作用。目前，融合蛋白在恶性肿瘤、老年性疾病以及抗病毒治疗等研究中取得进展。
吉妥单抗（Mylotarg）是抗CD33抗体与细胞毒药物calicheamicin的化学偶联物，对急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）[20]有很好的疗效，但有明显的骨髓毒性和肝毒性。ten Cate等 构建了抗白血病融合抗体scFvCD33：sTRAIL，它是一个抗CD33单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（soluble tumor necrosis factor- related apoptosis- inducing ligand，sTRAIL）基因融合抗体。CD33阳性单核细胞对scFvCD33：sTRAIL耐受，但对吉妥单抗的处理敏感。scFvCD33：sTRAIL对急性髓性白血病细胞的杀伤活性要比吉妥单抗强30多倍。而且，当scFvCD33：sTRAIL与Bcr- Abl酪氨酸激酶抑制剂格列卫（Gleevec）联合应用时，显示更强烈的抗CD33阳性白血病细胞活性。研究报道，有10%～40%的人胃癌HER2过表达。[21]Zhang等 构建了抗HER2的单链抗体和活性caspase- 3的融合抗体HER- PECP3，该抗体与NIH3T3细胞共孵育，结果导致抗体的细胞内化和诱导细胞凋亡。HER- PECP3能够阻断裸鼠移植性HER2过表达人胃癌的生长，并显著诱导细胞凋亡，还能延长荷瘤小鼠的存活时间。
抗体靶向超抗原已经被发展成为治疗许多恶性肿瘤的新策略。特异性靶向胃癌细胞的超抗原葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B，SEB）被融合到胃癌相关抗体MG7的单链抗体（MG7- scFv）中，该抗体识别在胃癌细胞中频繁表达的MG7抗原。重组融合抗体MG7- scFv/SEB对MG7抗原阳性胃癌SGC- 7901细胞具有高度亲和力，当与效应细胞-外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）共同孵育后，MG7- scFv/SEB能够有效地抑制SGC- 7901细胞的增殖并诱导细胞凋亡。在体外，MG7- scFv/SEB处理的PBMC显著增加Th1细胞因子（IFN-γ和IL- 2）的产生，并轻微增加Th2细胞因子（IL- 4和IL- 10）的产生。动物实验表明，与对照组比较，MG7- scFv/SEB具有更显著的肿瘤抑制作用，并能够延长[22]小鼠的生命周期 。
神经胶质衍化神经营养因子（glial- derived neurotrophic factor，GDNF）是帕金森病（Parkinson disease，PD）相关的营养因子，由于它不能透过血脑屏障（blood- brain barrier，BBB），常采用脑内注[23]射方法给药。为了提高其受体介导转运通过BBB的能力，Fu等 将GDNF与抗鼠转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）的嵌合单抗重链融合，获得融合抗体cTfRMAb-GDNF。该融合抗体保持了对GDNF受体和TfR二者的低结合常数（纳摩尔水平），静脉注射能够迅速进入小鼠脑部。cTfRMAb- GDNF静脉注射处理实验性PD小鼠，使阿扑吗啡诱导的小鼠旋转下降44%，安非他明诱导的小鼠旋转降低45%，纹状体酪氨酸羟化酶活性提高272%，但并不影响其他组织的酪氨酸羟化酶活性。圈套受体（decoy receptor）如人肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）是潜在的脑疾病治疗剂，但分子量大，也难以通过BBB。为了提高圈套受体通过BBB的能[24]力，Boado等 将人TNFR-Ⅱ胞外区与抗人胰岛素受体（HIR）单链抗体融合，HIR单链抗体作为特洛伊木马运送TNFR通过BBB。体内试验显示，灵长类动物脑对融合抗体HIRMAb- TNFR有较高的摄取率，注射剂量的3%被摄取进入脑部，而对照组TNFR- Fc不能通过BBB。
流感病毒的红细胞凝集素抗原（hemagglutinin antigen，HA）是一种在感染细胞表面富集的免疫原，可以作为抗体特异性作用靶分子，以清除病毒感染。鱼精蛋白（protamine）已经被证明是传送[25]DNA进入细胞的有效载体。Suzuki等 构建表达了重组融合抗体scFV- tP，它含有抗anti- H5N1流感病毒HA的特异性单链抗体，以及含有22个氨基酸的人剪切鱼精蛋白（truncated protamine，tP）。生物学活性显示，scFv- tP能够识别HA，结合并传送质粒和寡核苷酸DNA进入流感病毒感染的狗肾传代MDCK细胞。更重要的是，混合转染scFv- tP和NP特异性siRNA质粒，能够显著抑制感染性MDCK细胞中流感病毒的复制。六、胞内抗体
抗体工程技术的进展使得人们能够对抗体分子进行改造，同时人们对细胞内蛋白传导信号也有了更深入的了解，从而可将基因工程抗体导向不同的亚细胞区室。这两项重要进展的结合，派生出了一项全新的胞内抗体（intracellular antibody）技术。胞内抗体是一种在细胞
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