作者：任秀宝,郝希山
出版社：人民卫生出版社
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实体肿瘤细胞免疫治疗(第2版)试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
实体肿瘤细胞免疫治疗/任秀宝，郝希山主编.—2版.—北京：人民卫生出版社，2015
ISBN 978-7-117-21047-8
Ⅰ.①实… Ⅱ.①任…②郝… Ⅲ.①肿瘤免疫疗法 Ⅳ.①R730.51
中国版本图书馆CIP数据核字（2015）第158580号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯版权所有，侵权必究！实体肿瘤细胞免疫治疗第2版
主 编：任秀宝 郝希山
出版发行：人民卫生出版社有限公司 人民卫生电子音像出版社有限公司
地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号
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制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司
排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司
制作时间：2018年3月
版 本 号：V1.0
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标准书号：ISBN 978-7-117-21047-8
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任秀宝 1966年生，博士，教授、主任医师，博士研究生导师。现任天津医科大学肿瘤医院生物治疗科主任，中国医药生物技术协会医药生物技术临床应用专业委员会副主任委员兼秘书长，中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗分会副主任委员，中国抗癌协会肿瘤生物治疗专业委员会常委，天津市抗癌协会肺癌专业委员会常委，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室主任。多年来从事肿瘤生物治疗和肿瘤免疫方面的临床与应用基础研究，先后主持国家科技攻关计划、国家973专项课题、国家自然科学基金、天津市科委重点项目等十余项，近5年发表学术论文50余篇，其中SCI收录论文30余篇，获得省部级科研奖励3项，并获得“国家特支计划”百千万工程领军人才等荣誉称号。
郝希山 1945年生，中国工程院院士，教授，博士研究生导师，国家人事部、卫生部突出贡献专家。国际抗癌联盟（UICC）常务理事、第二届亚洲乳腺癌协会主席，中华医学会副会长，中国抗癌协会理事长，《中国肿瘤临床》中文版及英文版主编。1970年毕业于天津医科大学，一直从事肿瘤外科、肿瘤免疫及生物治疗研究。1984—1986年赴美国CENTOCOR生物技术研究所及纽约癌症纪念医院学习。创建了以放免方法测定培养液中以干扰素γ（IFN-γ）含量作为客观指数确定T细胞免疫功能的检测方法。回国后继续致力于肿瘤外科学及生物治疗方面的研究，先后承担国家攻关课题、“863”计划、国家自然科学基金等项目；以第一完成人先后获得国家科技进步二等奖2项、国家级教学成果一等奖、省部级一等奖3项；主编八年制临床医学规划教材《肿瘤学》，出版《简明肿瘤学》、《腹部肿瘤学》、《肿瘤手术学》等专著；发表学术论文300余篇。序
手术、放疗和化疗三大常规疗法为肿瘤患者的治疗做出了巨大贡献。然而，我国每年仍有约200万人死于癌症。究其原因，其一是缺乏早诊早治，其二是常规疗法的发展已进入瓶颈期。伴随着封闭免疫负调控的抗CTLA-4、抗PD-1抗体和CAR-T在临床治疗肿瘤的研究中获得显著疗效，人们已开始对免疫治疗有了新的认识。这些重大突破使肿瘤免疫治疗无用的理念被终止，而且肿瘤免疫治疗的发展仅仅处于一个好的开端，待发展的潜力巨大。三大常规疗法与免疫治疗的联合应用已显示出互补的优势。有效免疫治疗的介入也将会逐渐改变肿瘤的治疗原则，提高疗效，更符合中医扶正祛邪的理念。
天津医科大学肿瘤医院在我国是较早开展临床免疫治疗的研究单位，也是我国食品药品监督管理局曾经批准进行免疫细胞临床研究的少数单位之一。在郝希山院士的带领下和任秀宝教授等团队的努力下，对免疫细胞过继免疫治疗进行了科学的研究，并积累了丰富的经验。他们结合了国际免疫细胞和肿瘤疫苗临床研究的进展，以及肿瘤免疫理论的发展，由浅入深，结合实际应用，客观分析了各种疗法的利弊，精练地组织编写了此书。其第一版已受到国内相关领域人员的喜爱，从中获益。此次再版他们又进一步补充了相关研究的进展内容。该书对于从事肿瘤免疫治疗研究的人员具有很好的参考价值。张叔人2015年6月再版前言
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一，其发病率和死亡率逐年增高，在我国恶性肿瘤已成为居民死亡原因的首位。免疫治疗，又称生物治疗，通常是指通过调动宿主的防御机制或借助生物制剂的作用，以调节机体的生物学反应，从而抑制或阻止肿瘤生长的治疗方法。随着肿瘤治疗理念的变化，以及对于肿瘤发生、发展分子机制认识的深入和生物技术的迅速发展，免疫治疗因其疗效明显、无毒、副作用低等优点已经成为继手术、放疗、化疗之后第四类具有显著临床治疗效果及优势的抗肿瘤疗法。
目前常用的肿瘤免疫治疗手段主要包括细胞治疗、肿瘤疫苗、抗体治疗、细胞因子以及基因治疗等。近年来，美国FDA批准了Provenge树突状细胞疫苗以及免疫检查点阻断剂Ipilimumab、Pembrolizumab、Nivolumab等肿瘤免疫治疗新药。针对胰腺癌的CRS-207疫苗和GVAX Pancreas疫苗组合以及诺华公司、Juno公司各自的CD19-CAR-T也于2014年获得FDA突破性疗法认定。一切都预示着肿瘤治疗的又一个新时代即将到来。
天津医科大学肿瘤医院自20世纪80年代开始肿瘤免疫治疗的相关研究，在该领域积累了一定的经验。为与肿瘤免疫治疗同道切磋交流，对从事临床免疫治疗的医师有所裨益，我们组织本专业的医师和研究人员，撰写了《实体肿瘤细胞免疫治疗》一书。在人民卫生出版社的大力支持下，本书的初版于2010年与读者朋友们见面。令我们十分荣幸与欣慰的是，本书出版后得到了广大读者朋友们的热情支持与鼓励，已连续重印多次。这不仅反映了肿瘤免疫治疗领域的受关注程度，同时也是对我们努力的最大肯定与回报。
时光荏苒，岁月匆匆。距本书的初版已经过去五年时间。肿瘤的免疫治疗是一个发展十分迅速的领域，知识更新很快，正如热心的编辑所建议的，再版已势在必行。值此再版之际，我们力求在介绍肿瘤细胞免疫治疗基本概念的同时，将本领域的最新进展展示给大家，并把这五年来我们在基础研究与临床实践中的心得与大家共同分享。
本书重点介绍实体肿瘤的细胞免疫治疗，主要包括过继性细胞免疫治疗和细胞性肿瘤疫苗。全书从肿瘤免疫治疗的发展史讲起，对肿瘤免疫治疗的基本理论、常用治疗方法及其与传统治疗方法间的关系进行了详细论述，并专门开辟了新的一章对新型肿瘤免疫治疗方法做了深入浅出的讲解。接着，我们结合自己的临床实践，系统介绍了免疫治疗在常见实体肿瘤中的临床应用现状。全书注重实用，文字简洁，每一章既自成体系、相对独立，又互相联系、互相补充，是对目前肿瘤免疫治疗理论和实际应用的概括和总结。
临床细胞免疫治疗的发展日新月异，有许多经验和认识还有待总结提高，在编写过程中我们深感自身能力有限，因此难免疏失，恭请各位同仁批评指正。同时，希望同行联合起来深入开展临床相关研究，为肿瘤细胞免疫治疗提供更多的循证医学证据，加快我国肿瘤细胞治疗规范化、科学化发展的进程，建立统一规范的标准化治疗体系，进一步提高疗效。本书的编著得到诸位编写者的鼎力相助，在此表示感谢。任秀宝2015年6月23日于天津第1版前言
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一，其发病率和死亡率逐年增高，在我国恶性肿瘤已成为居民死亡原因的首位。WHO公布的数据显示，预计到2020年全球每年新发癌症患者将达到大约1500万人，因此如何预防及治疗癌症面临着巨大的挑战。长期以来，世界各国对肿瘤的防治和研究进行了大量卓有成效的工作，手术、放疗和化疗成为肿瘤治疗的三大常规治疗手段，但仍然对许多肿瘤不能达到有效的治疗。随着对肿瘤认识的不断深入，治疗的理念也在发生着改变。特别是2006年WHO提出“肿瘤是一种可以控制的慢性疾病”的概念后，肿瘤临床工作者在治疗那些不可治愈的肿瘤时，不再只追求“除恶务尽”，而是将肿瘤“慢性化”，让患者长期带瘤生存，并以保持良好的生活质量作为治疗的新目标。正是由于肿瘤治疗理念的变化，以及对于肿瘤发生、发展分子机制认识的深入和生物技术的迅速发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的第四种模式，并受到了越来越多的关注。
生物治疗通常是指通过调动宿主的防御机制或借助生物制剂的作用，以调节机体的生物学反应，从而抑制或阻止肿瘤生长的治疗方法。肿瘤生物治疗始于1889年，迄今已100余年，当时Coley利用化脓性链球菌及灵杆菌滤液治疗晚期肿瘤患者。20世纪80年代中期Rosenberg等人利用LAK/IL-2治疗那些用其他方法治疗无效的晚期转移性肿瘤患者获得成功，人们开始对生物治疗寄予希望。美国学者Oldham于1984年提出了生物反应调节（BRM）理论，并将生物疗法列为除手术、化疗、放疗之外的第四肿瘤治疗模式。以后随着免疫学、细胞生物学、分子生物学等学科的发展，新的治疗方法不断涌现，目前常用的生物治疗手段主要包括细胞治疗、肿瘤疫苗、分子靶向治疗、细胞因子以及基因治疗等。其中抗体治疗已成为内科治疗的重要手段，而细胞免疫治疗方面也给肿瘤治疗带来了新的希望，特别是2010年美国FDA批准了第一个治疗性疫苗用于前列腺癌的治疗，使人们感受到肿瘤治疗的又一个新时代即将到来。
天津医科大学附属肿瘤医院自20世纪80年代开始肿瘤生物治疗的相关研究，在细胞治疗、肿瘤疫苗等方面积累了一定的理论基础和实践经验，特组织本专业的医师和研究人员，撰写《实体肿瘤细胞免疫治疗》一书，重点介绍实体肿瘤的细胞免疫治疗，主要包括过继性细胞免疫治疗和细胞性肿瘤疫苗。本书涵盖了肿瘤免疫治疗的基本理论，常用的免疫治疗方法如过继免疫细胞治疗、肿瘤疫苗等，并系统介绍了免疫治疗在常见实体肿瘤当中的临床应用现状。全书注重实用，文字简洁，是对目前肿瘤免疫治疗理论和实际应用的描述和总结。
编写本书，旨在与肿瘤免疫治疗同道切磋交流，对从事临床免疫治疗的医师有所助益。由于临床细胞免疫治疗还只是发展的初始阶段，有许多经验和认识还有待提高，在编写过程中难免疏失，恭请各位同仁批评指正，深表感谢。同时，希望同行联合起来深入开展临床相关研究，为细胞免疫治疗提供更多的循证医学证据。本书的编著得到编写者的鼎力相助，在此一并表示感谢。2010年10月20日第1章 肿瘤细胞免疫治疗概况及发展史
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，其发病和死亡率呈逐年上升的趋势，而在我国恶性肿瘤已经成为居民死亡的首位原因。WHO公布的数据显示，2012年全球每年新发癌症病例大约1400万例，预计在20年内这一数值将达到2200万例。因此，预防和治疗癌症是我们面临的巨大的挑战。长期以来，手术、放疗和化疗成为肿瘤治疗的三大常规治疗手段，但对许多肿瘤仍然不能达到有效的治疗。随着对肿瘤认识的不断深入，肿瘤的治疗理念也不再只追求“除恶务尽”，而是将肿瘤“慢性化”，以让患者长期带瘤生存并保持良好的生活质量作为治疗的新目标。正是由于这种治疗理念的变化，以及对于肿瘤发生发展分子机制的深入认识和生物技术的迅速发展，免疫治疗已经成为肿瘤综合治疗的第四种模式，受到越来越多的关注。
充分调动机体的免疫系统来使肿瘤的治疗获益，长久以来一直是免疫学和肿瘤学的共同目标。免疫治疗通常是指通过调动宿主的防御机制或借助生物制剂的作用，以调节机体的生物学反应，从而抑制或阻止肿瘤生长的方法。近年来，基于CTLA-4单克隆抗体治疗在提高恶性黑色素瘤患者的总生存上取得的巨大成功，2011年《自然》杂志指出：“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”。2012年12月20日出版的《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列入2013年最值得关注的六大科学领域。继而，针对两个免疫检查点CTLA-4和PD-1的单克隆抗体以及嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）基因修饰T细胞过继治疗在临床获得的快速成功，显示了肿瘤免疫治疗的巨大潜力。2013年12月20日出版的《科学》杂志，将肿瘤免疫治疗列为本年度十大科学突破之首。2014年12月19日出版的《科学》杂志则再次将联合免疫治疗列为2015年值得关注的领域之一。
肿瘤的免疫治疗是一个发展十分迅速的领域，主要包括过继性细胞治疗（adoptive cell therapy，ACT）、肿瘤疫苗治疗、免疫调节治疗（如近来备受关注的免疫检查点阻断抗体）、分子靶向治疗、放免靶向治疗、肿瘤基因治疗和生物化疗等。本章主要介绍过继性细胞治疗和细胞性肿瘤疫苗治疗的发展概况。一、过继性细胞治疗（一）过继性细胞治疗概述及发展史
过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer，ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内，该过程通常还包括非清髓性预处理和免疫刺激剂的应用，有的方案还包括在扩增前对淋巴细胞进行基因修饰，使其靶向特定抗原、表达内源性免疫刺激分子，或回输后持续存在更长时间。+
需要注意的是，虽然ACT的治疗效果通常被归功于CD8细胞，+但有研究发现回输纯化的CD4细胞在黑色素瘤患者中也可导致持久的临床缓解。相反，虽然临床前试验中自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）取得了令人鼓舞的疗效，其在临床试验中的效果却尚不理想。类似的，B细胞在肿瘤ACT中的作用也尚未充分得到证实，而且有研究报道存在具有免疫抑制作用的B细胞，称为调节性B细胞（B regulatory cell）。
临床上，对于恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是最常用的ACT治疗。TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。该方法是20世纪80年代美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的Rosenberg等研发的。近期进行的一系列临床试验中，有部分转移性黑色素瘤患者在接受了TIL治疗后，其肿瘤出现持久的完全消退，这显示了ACT在肿瘤治疗中的强大潜力。在这些试验中，转移性黑色素瘤患者，经非清髓性预处理后，使用自体TIL联合IL-2治疗，总有效率接近50%，甚至可以有20%至40%获得持久的肿瘤消退，而且其中大部分是常规治疗难治的病例。然而，临床上很多情况下是无法应用TIL的，比如有的患者缺乏肿瘤标本，还有的患者肿瘤或转移灶中淋巴细胞浸润很少。在这种情况下，ACT就要使用外周血淋巴细胞了。最早发展起来的使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cell，LAK cell）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells，CD3-AK cells）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinduced killer cells，CIK cells）等。
LAK也是在20世纪80年代由Rosenberg等研发的，其实质是IL-2激活的具有杀瘤活性的NK和T细胞。1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）批准，首次将LAK细胞用于临床治疗。该疗法对转移性肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌和非霍奇金淋巴瘤患者的疗效较显著。但LAK杀伤力不强，临床应用需要大量输注。而且其扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用IL-2，从而导致明显的毒副作用，最常见和最严重的毒副作用是毛细血管渗漏综合征（capillary leak syndrome，CLS），主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。
CD3-AK是1989年NCI的Yun YS等用CD3抗体活化小鼠脾细胞后得到的，并在体外观察到其细胞毒活性强于LAK。动物体内实验，同样验证了CD3-AK的抗瘤活性。CD3-AK对肿瘤患者的疗效也有研究，但总的来说，对CD3-AK的研究数量远远不如TIL、LAK、CIK等。
CIK细胞是继LAK细胞治疗后又一个在临床上广泛开展的细胞治疗方法。早在1986年Schmidt等就发现在正常人外周血单个核细胞中有2%-5%的细胞同时表达CD3和CD56两种抗原，且这种细胞对K562有天然杀伤作用。这就是CIK细胞的雏形，当时人们对这种细胞了解甚少。CIK细胞在未经处理的外周血单个核细胞中比例很少，因此人们通过体外刺激培养以扩增其数量。1991年美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心报道了用IFN-γ、IL-2、抗CD3单克隆抗体和IL-1刺激外周血单个核细胞，诱导产生了CIK细胞。这种CIK细胞对淋巴瘤细胞有强大的杀伤作用而对正常的造血干细胞影响甚微。CIK细胞凭借其增殖速度快、杀瘤活性高、非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制、对正常骨髓造血影响轻微等优势，成为肿瘤治疗中重要的辅助治疗方法。
TIL属于天然的具有肿瘤特异性的淋巴细胞，而CIK等则是非特异性的活化的淋巴细胞。研究者曾尝试通过自体和异基因抗原体外诱导外周血淋巴细胞以产生抗原特异性T细胞，但真正能用于肿瘤患者临床治疗的可行方案却寥寥无几，其原因在于体外诱导的效率太低，操作过程复杂，扩增时间长，且扩增数量有限，因此往往达不到预期治疗效果。若能直接赋予外周血淋巴细胞肿瘤特异性反应能力，则有望大大提高ACT的疗效。所幸，随着生物技术的迅猛发展尤其是基因工程技术的进步，基因修饰的方法能够将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor，TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞或CAR-T细胞，从而人工赋予这些淋巴细胞对肿瘤抗原的靶向识别能力。
TCR是T细胞表面能够识别和结合蛋白质抗原的特异性受体。TCR基因修饰T淋巴细胞技术出现较早，但TCR具有MHC限制性，而且许多肿瘤细胞还能够通过下调或突变其MHC分子以逃避免疫监视，从而使得TCR基因修饰的T淋巴细胞的临床应用具有一定的局限性。
CAR分子在结构和功能上与TCR/CD3复合物十分类似，是表达在细胞膜外的单链抗体（single-chain fragment of variable region，scFv）通过胞外铰链区和跨膜区与胞内的T细胞活化序列组成的融合蛋白。第一代CAR-T细胞只具有单一的活化信号（常用CD3分子ζ链），体内存留时间短，很快出现失能。为此，第二代CAR在胞内部分增加了共刺激分子（最常用的是CD28）信号结构域，在提供活化信号的同时也提供了共刺激信号。第三代CAR的主要标志为胞内区采用了不止一个共刺激分子信号结构域。CAR对肿瘤细胞的识别是通过scFv介导的，不受MHC限制，其靶标分子可以不限于蛋白/多肽抗原。而共刺激分子信号结构域的引入则有效地克服了肿瘤通过下调共刺激分子造成的免疫逃逸，进一步增强了CAR-T细胞的活化能力和在病人体内持续存在的时间。
TCR基因修饰T淋巴细胞技术或CAR-T细胞技术使得研究者能够获得大量抗原特异性的T淋巴细胞，从而克服了黑色素瘤等少数肿瘤之外的其他类型肿瘤难以获取具有抗肿瘤活性的淋巴细胞的问题，大大推动了以免疫细胞为基础的肿瘤靶向治疗的发展，打开了癌症ACT新领域的大门。
手术、化学或放射治疗主要是通过外因的作用而达到治疗目的，而免疫疗法则体现了充分调动内因去实现治疗的思想。医疗实践已证明任何一种单一的治疗模式均不能圆满地解决肿瘤这一难题。因此，目前而言治疗肿瘤最理想的模式应是综合治疗。这并非把单一模式简单地相加，而是要根据不同肿瘤的特征和同一肿瘤所处的不同时期将各种治疗模式进行合理的组合。常规疗法可迅速清除大量的肿瘤细胞，降低体内肿瘤细胞负荷；而免疫疗法能持久清除残留在体内的少量的、播散的肿瘤细胞，且能提高机体因放、化疗而受损的免疫功能。故二者序贯性联合治疗，可提高肿瘤治疗效果，有可能达到治愈恶性肿瘤的目的。作为肿瘤免疫治疗主要组成部分的细胞免疫治疗也正逐步走向成熟。
肿瘤细胞免疫治疗作为肿瘤综合治疗的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗和其他生物治疗广泛联合，在多种肿瘤治疗中展示了其良好的应用前景。通过有计划合理地联合细胞免疫治疗和其他治疗手段，可望提高治疗效果，延长生存时间，改善肿瘤患者的生活状态，提高生活质量，最终达到长期带瘤生存或彻底治愈肿瘤的目标。（二）过继性细胞免疫治疗的共性问题和发展方向
1.过继性细胞免疫治疗的共性问题
TCR基因修饰T淋巴细胞和CAR-T细胞在临床试验中都取得了一定的成功，但大多数的此类临床试验中都观察到了不同程度的毒副作用，甚至包括一些致命的并发症。这些与基因修饰T细胞ACT治疗相关的副作用主要分为两大类，即正常组织毒性（on-target toxicity）和脱靶毒性（off-target toxicity）。前者指的是基因修饰T细胞对同样表达其靶点的正常组织的毒性，这种毒性很常见；后者则指对不表达这些靶分子的正常组织或器官的毒性，其发生有一定的几率，预防有一定困难。
基因修饰T细胞对正常组织的毒性一直妨碍着这些研究真正从实验室走向临床。如何鉴定出肿瘤细胞上合适的免疫原性的靶点，从而使得基因修饰T细胞只攻击肿瘤细胞而不损伤正常组织，是肿瘤ACT治疗成功与否的关键。
2.肿瘤过继性细胞免疫治疗靶点抗原的分类
在肿瘤ACT治疗的实践中常见的抗原根据其来源、表达部位以及突变与否可以分为七类。（1）过表达于肿瘤的分化抗原：
靶向肿瘤组织过表达而正常组织表达量很低的分化抗原曾经是肿瘤免疫治疗研究的热点。TIL治疗在转移性黑色素瘤患者中所取得的成功最初也被归功于这些TIL细胞所普遍表达的识别黑色素瘤/黑色素细胞分化抗原（如MART-1和gp-100）的TCR，但现在看来似乎没有这么简单。有研究者使用特异性靶向MART-1或gp-100的高亲和力TCR基因修饰的T细胞治疗转移性黑色素瘤，意外地观察到了对眼、耳等正常表达黑色素组织的严重毒性反应，包括前房浸润、虹膜扩张、听力下降等。而在TIL治疗有效的转移性黑色素瘤患者中却极少观察到这种毒性，这提示TIL其实是通过靶向其他的抗原发挥抗肿瘤活性的。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是胃肠道肿瘤过表达的另一个分化抗原，在靶向CEA的ACT治疗中也发生了类似的情况，有研究者报道，靶向CEA的高亲和力TCR可以导致严重的结肠炎。这些毒性在很大程度上妨碍了靶向分化抗原的ACT治疗的临床应用。
此外，还有若干使用CAR-T靶向此类分化抗原的研究正在进行中。前面提到过，第二、三代CAR-T具有更强的活化能力和在患者体内更长的持续时间，但也正因为如此，CAR-T的靶点选择必须更加谨慎，否则其对正常组织的毒性会更严重。例如，曾有研究者使用携带CD28和4-1BB共刺激结构域的靶向人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）的CAR-T细胞治疗了一位结肠癌肝肺转移的患者。该患者在接受CAR-T细胞输注后15分钟出现呼吸窘迫和严重的肺浸润，最终出现心脏骤停而死亡。研究者认为，这一毒性反应的根源在于肺上皮细胞低水平表达Her-2，结果导致大量CAR-T细胞浸润至肺部并引发了CAR-T常见的副作用：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），又称细胞因子风暴（cytokine storm）。（2）仅表达于肿瘤和非关键的正常组织的抗原：
靶向过表达于肿瘤组织的分化抗原的尝试受困于对正常组织的毒性，那么能不能靶向仅表达于肿瘤和非关键的正常组织的抗原呢？毕竟如果能够清除恶性肿瘤的话，付出某些非关键的正常组织受损的代价也是可以承受的。这方面一个相当成功的例子就是通过靶向CD19这一表达于正常B细胞的抗原来治疗白血病和淋巴瘤。2010年，研究者首次报告靶向CD19的ACT治疗晚期白血病和淋巴瘤获得成功，虽然在此过程中正常B细胞也同样被清除，但通过使用免疫球蛋白可以很大程度上克服这一毒性。2014年10月16日的《新英格兰医学杂志》报道CD19-CAR-T治疗30例复发、难治的急性淋巴细胞白血病患者，完全缓解率达到90%，缓解时间最长者达24个月。这一结果是十分令人鼓舞的，当前，已有多个靶向CD19的CAR-T疗法正在进行临床试验，诺华公司和Juno公司的CD19-CAR-T已分别于2014年7月和11月获得美国FDA突破性疗法认定。可惜的是，除CD19外，此类抗原尚未见其他成功的例子。（3）共有非突变的肿瘤特异性抗原：
癌-睾丸抗原（cancer-testes antigens，CTA）是此类抗原的代表，这类蛋白在胚胎时期表达，而在成年后的正常组织中通常处于表观沉默状态，但在约10%～80%的常见上皮性肿瘤中重新表达。这些肿瘤包括膀胱癌、肺癌、肝癌等。此类抗原中比较突出的一个是NYESO-1，现认为它仅表达于肿瘤。通过NY-ESO-1高亲和力TCR基因修饰的自体淋巴细胞治疗，研究者成功地使转移性滑膜肉瘤和转移性黑色素瘤患者体内的肿瘤大幅消退。应用这一方案治疗其他NYESO-1阳性实体瘤的研究正在进行中。必须要引起研究者足够重视的是，总数超过100种的CTA中，大部分在正常组织上有低水平的表达，而这同样可能成为严重毒性反应的源泉。此外，脱靶效应亦不得不防，比如，虽然人黑色素瘤相关抗原-3（melanoma antigen family A，3，MAGE-A3）不表达于正常组织，但靶向MAGE-A3的一个HLA-A2限制性表位的ACT治疗却意外地导致了严重的神经系统毒性。研究者最终发现这是因为该MAGE-A3表位与表达于脑的MAGE-A12的一个表位非常相似。（4）共有突变的肿瘤特异性抗原：
此类抗原指的是不表达于正常组织而又为某一类型肿瘤所共有的突变，这些突变是基因修饰淋巴细胞靶抗原的理想来源。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor vⅢ，EGFRvⅢ）是这类靶点的代表。EGFRvⅢ表达于约40%的高分级胶质瘤细胞表面。该突变来自于EGFR第2至第7外显子的框内缺失（in-frame deletion），并导致EGFR组成性活化，可以在没有配体结合的情况下激活酪氨酸激酶，启动下游信号传导，进而使含有此突变的细胞的增殖、侵袭以及运动能力增强，最终导致肿瘤的发生。EGFRvⅢ-CAR在小鼠脑胶质瘤模型中已经取得了成功，用于人的EGFRvⅢ-CAR正在研发中。（5）病毒编码的抗原：
参与肿瘤发生的病毒经常会导致外源病毒蛋白在肿瘤细胞上的表达，而正常组织则通常无此蛋白表达，因此，这些病毒编码的抗原也是理想的ACT靶点。此类备选的靶点包括人乳头瘤病毒（papillomavirus，HPV）E6、E7蛋白以及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）和LMP2等。这些抗原均不在正常组织表达。筛选此类抗原时有一点需要注意，作为ACT治疗的靶点，该蛋白应是被感染的细胞恶性转化所必须的关键分子。例如，现已上市的HPV预防性疫苗是根据HPV的衣壳蛋白L1设计的，而在宫颈癌进展过程中L1可能丢失，并不适于作为ACT治疗靶点。研究显示，HPV感染细胞产生的E6、E7等蛋白通过影响细胞内的p53、Rb等信号通路导致癌变，而且E6、E7蛋白在宫颈癌及癌前病变中持续表达，与癌变密切相关，很少发生抗原丢失及免疫逃逸。因此，对HPV所致宫颈癌和癌前病变的ACT治疗，选择E6、E7作为靶点比L1更为适当。（6）肿瘤间质的重要组分：
肿瘤细胞仅是瘤体的一部分，肿瘤间质的某些关键成分也可能成为理想的肿瘤免疫治疗靶点。血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）在肿瘤血管过表达，成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）在肿瘤间质活化成纤维细胞过表达，它们都可能成为ACT治疗的靶点。但需注意的是，这两个分子在正常组织也有低水平表达，以它们为靶点的治疗可能导致一定的毒性。（7）个体肿瘤的独特突变：
基因突变是恶性肿瘤中的一个普遍现象，同时基因突变本身也是细胞恶性转化的动因之一，未来肿瘤免疫治疗的进展很可能来自于免疫靶向这些突变蛋白。黑色素瘤含有非常多的突变，这可能源于紫外线对皮肤的致突变作用。本文开头就提到，部分转移性黑色素瘤患者在接受了TIL治疗后，出现持久的肿瘤完全消退。但也由此提出了一个问题，这些TIL细胞的抗原靶点到底是什么？毕竟，并非所有的接受上述治疗的患者都达到了长期缓解。对此一个可能的解释为：黑色素瘤含有的突变包括两类，一类是驱动性的，另一类是随机的。靶向突变基因产物的TIL大部分识别的是随机突变的产物，而对于肿瘤来说这些随机突变的产物并非是维持致瘤性所必需的。因此肿瘤细胞可以通过突变、下调、甚至基因缺失来逃避这些TIL的杀伤。相反，一旦TIL靶向肿瘤细胞某些不可丢弃的突变基因产物，亦即与致瘤性密切相关的驱动性突变的产物，就可能获得更好的疗效，甚至达到长期缓解。前面提到的EGFRvⅢ本质上就是一种驱动性突变的产物。这一科学假设现已得到证实，近期，Rosenberg的研究团队对经TIL治疗后获得长期缓解的恶性黑色素瘤患者的肿瘤进行了全外显子组测序和生物信息学分析，成功发现了这些患者体内TIL细胞的新的突变靶点。其结果表明，黑色素瘤TIL细胞造成持久的肿瘤完全消退的独特能力正是来自于其对个体肿瘤的独特突变的特异性识别。尤其值得注意的是，这些研究者最新发表的一份报告揭示，这些新发现的TIL靶点都来自于与细胞增殖相关的重要基因的突变。
3.展望
TIL在靶向黑色素瘤独特突变中取得的成功提示我们，识别其他肿瘤的独特突变的TIL或者基因修饰淋巴细胞很可能同样成为有效的治疗手段。然而，大部分其他类型实体瘤的突变数量仅有黑色素瘤的五分之一乃至十分之一，如何成功靶向这些突变可能会成为一个棘手的问题。在大部分肿瘤中，与驱动性的或随机的突变起反应的T细胞很可能十分稀少，但鉴定个体肿瘤的独特外显子突变并获得靶向这些突变的T细胞的方法正在积极研发中。
在不久的将来，我们将有望使用适当的基因筛选方法来分析每个肿瘤，找到对该肿瘤致癌性至关重要的基因突变，进而分离纯化出靶向该突变基因产物的T淋巴细胞，在体外对其加以培养扩增用于ACT治疗。甚至更进一步，分离纯化出这些T细胞后，我们还可以获取其TCR编码基因，以逆转录病毒、慢病毒等为载体，用该TCR基因修饰患者外周血T淋巴细胞，获得大量特异性靶向驱动突变基因产物的淋巴细胞，显著增强ACT的疗效。二、细胞性肿瘤疫苗
肿瘤疫苗属于肿瘤的特异性主动免疫疗法。需要指出的是，除了国外已上市的HPV疫苗是肿瘤预防性疫苗之外，大多数的肿瘤疫苗都是属于治疗性疫苗。预防性疫苗主要诱导特异性抗体和长寿命的记忆性B细胞，用以对抗感染。部分预防性疫苗，尤其是含有减毒病原体的疫苗，也可以引发细胞免疫反应。而治疗性疫苗则用以清除恶变的+细胞或者已被病毒感染的细胞，主要靠的是CD8细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）。
疫苗在抗感染免疫中取得的巨大成功使得人们开始考虑是否可以用同样的思路来治疗肿瘤。早在1902年Leyden和Blumentha就尝试将肿瘤细胞疫苗用于治疗病人，但结果并不乐观。1959年Graham使用自身瘤苗治疗了232例妇科肿瘤患者，得到的结论是：自身瘤苗能够用于治疗患者，不良反应少见；但这种治疗方法并不能有效改变疾病的自然病程，因此不推荐使用这种方法。尽管经历了挫折和失败，人们一直都没有放弃对肿瘤疫苗的研究。随着人类肿瘤抗原的不断发现及其基因的克隆成功，肿瘤的主动免疫再次受到重视。近期完成的多项大样本随机化Ⅲ期临床试验证实，肿瘤疫苗可以延长部分患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）或总生存期（overall survival，OS）。这一结果使得肿瘤疫苗的研究再次被推向高潮。
引发有效的抗肿瘤免疫的具体机制包括多个步骤。第一步，肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）由肿瘤细胞直接提呈，或者由树突状细胞（dendritic cell，DC）为主的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）捕获、处理并提呈。第二步，需要有适当的活化/成熟信号，使得DC能够分化、迁移到淋巴结，并将TAA提呈给初始T细胞（naive T）。第三步，T细胞扩增至足够的数量，以便识别并清除肿瘤细胞。在这一步，如果缺乏适当的成熟信号，抗原提呈将导致T细胞失能或者调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的产生，而Treg会抑制效应T细胞。最后一步，接受了抗原刺激的T细胞必须离开淋巴结，运动并浸润到肿瘤，而且要持续存在足够长的时间以杀死癌细胞。
可见，肿瘤的主动免疫是一个复杂、多组分的任务，肿瘤疫苗的成功依赖于抗原、佐剂、载体、接种途径等的优化组合。一个成功的肿瘤疫苗，除了能够成功活化naive T之外，还必须能够面对以下三方面挑战：①含有Treg和髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的免疫抑制的肿瘤微环境；②呈现免疫耗竭和衰老状态的肿瘤特异性T细胞；③高度突变的肿瘤所经常出现的抗原丢失和免疫逃逸。
肿瘤疫苗的形式主要有细胞性疫苗、蛋白/多肽疫苗和基因疫苗三大类。本书主要介绍细胞性疫苗，包括肿瘤细胞疫苗和DC疫苗。（一）肿瘤细胞疫苗
肿瘤细胞疫苗是将完整的肿瘤细胞经物理（如紫外线、放射性核素照射、热灭活等）或化学方法（如戊二醛、β-榄香烯等）处理后接种于患者，进入患者体内的肿瘤细胞的抗原可诱导产生抗肿瘤免疫反应。最早应用于临床的肿瘤细胞是自体肿瘤细胞。由于自体肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，具有和患者正常组织相同的人类白细胞抗原，因此无须考虑分离特定抗原且不会引发机体的免疫排斥反应，被认为是理想的肿瘤疫苗细胞。但是自体肿瘤细胞获取困难，特别是肿瘤病人一旦失去手术机会，就无法获取自体肿瘤细胞，因此这种疫苗的应用受到了限制。后来，人们使用人工培养的同种异体肿瘤细胞株进行肿瘤疫苗的研究。这种肿瘤细胞来源充足，但是患者HLA配型的不同以及异体肿瘤细胞同自体肿瘤细胞抗原性存在差异同样使其应用受到限制。
单独使用自体或异体的肿瘤细胞难以产生足够强度的免疫应答，免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况，常见的佐剂包括弗氏完全佐剂、新城疫病毒、卡介苗、明矾、短小棒状杆菌等。例如，1986年德国癌症治疗中心的Schriimacher首先使用禽类新城疫病毒处理自体肿瘤细胞，然后回输给患者，这种瘤苗在临床上仍沿用至今。随后，Schriimacher逐步将此疫苗用于结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤的治疗，取得了一定的疗效。
因为肿瘤细胞缺乏主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ类分子和B7共刺激分子，也不分泌增强机体免疫力的细胞因子，所以自体或异体的肿瘤细胞疫苗刺激免疫反应的作用还是十分有限的。随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰，将编码免疫共刺激分子（如B7家族的CD80、CD86）的基因导入肿瘤细胞中，为T细胞活化提供第二信号，有效地抑制了肿瘤细胞导致的免疫耐受。近年来，也有人将编码一些细胞因子如IL-2、IL-7、IL-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）等的基因导入肿瘤细胞，期望通过细胞因子蛋白的表达，改善肿瘤组织局部免疫微环境，增强T细胞的抗肿瘤免疫效应。临床前的研究认为，GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗是基因修饰策略较好的选择。GM-CSF转导疫苗后成为GVAX系列肿瘤疫苗，研究者对GVAX肿瘤疫苗进行了大量的Ⅰ/Ⅱ期乃至Ⅲ期临床试验，其中包括前列腺癌、肺癌、胰腺癌等。但这些临床试验并非是一帆风顺的，GVAX前列腺癌疫苗的两个Ⅲ期临床试验于2009年宣布被终止，主要原因是缺乏疗效甚至增加了死亡率。而在2014年7月，基于其在一项Ⅱ期胰腺癌临床试验中的优异表现，FDA授予针对胰腺癌的CRS-207疫苗和GVAX Pancreas疫苗这一免疫组合疗法突破性疗法认定，GVAX疫苗柳暗花明，又焕发了青春。另外，IL-2、CD80和CD40L等基因转染的肿瘤细胞疫苗治疗非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、急性髓系白血病、前列腺癌、肾癌和卵巢癌等肿瘤的临床试验也在进行中。（二）DC疫苗
有效的抗肿瘤CTL应答需要专职APC来激活。目前认为DC是体内功能最强的APC。DC作为高效的专职性APC，在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。基于DC的治疗方法与前面介绍的ACT的区别在于，虽然二者都涉及活细胞回输，但ACT回输的是自体的与肿瘤反应的淋巴细胞，而DC治疗的目的则在于重新活化内源的肿瘤特异性免疫反应，其本质是一种疫苗，而且DC治疗是不会使用清髓性预处理的。
DC可以从患者体内分离得到，或者在体外通过外周血单个核细胞进行诱导扩增，然后负载不同形式的抗原，使其成熟活化，最终回输体内。在过去的近20年间，研究者对这一过程的各个步骤、各个方面都进行了详细的研究，这些领域涉及：①不同的DC制备方法以及DC亚群；②不同的DC活化剂；③不同的抗原制备方法（从简单的短肽到DC与肿瘤细胞的融合）；④不同的DC回输途径等。这些研究的结论显示，基于DC的疫苗是安全的，而且可以诱导循环血中肿瘤++抗原特异性的CD4和CD8细胞的扩增。临床试验中，DC疫苗在肾癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤患者中显示了一定的疗效。而且令人鼓舞的是，DC疫苗治疗在部分病例可以达到肿瘤长期缓解。DC疫苗发展的一个里程碑是Dendreon公司研发的Provenge（Sipuleucel-T）。Provenge是用前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）与GM-CSF融合蛋白致敏的DC疫苗。研究显示，该疫苗可以使前列腺癌患者的中位生存期延长4个月。2010年4月，美国FDA批准Provenge用于治疗转移性前列腺癌。
为进一步增强肿瘤DC疫苗的疗效，研究者仍在进行不懈的努力。多种细胞因子组合以及Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂都曾被用来活化DC。例如，TLR3激动剂Poly I：C、TLR7激动剂咪喹莫特（imiquimod）、TLR9激动剂CpG寡脱氧核苷酸都曾被单独或联用以活化DC，从而增强DC的成熟和IL-12的分泌。前列腺素E2也被用来配合TLR激动剂以促进DC迁移到区域淋巴结。
使用配体激动剂靶向MHC分子和共刺激分子也被证明可以增强DC诱导CTL的能力。例如，联用DC疫苗和CD137激动型抗体在转移性结肠癌患者中显示了强大的治疗潜力。靶向DC表面的凝集素，如DCIR、DC-SIGN、Dectin 1、CLEC9A、DEC-205和langerin等，同样可以增强DC诱导的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，这些靶点可以用来在体内靶向DC，例如，NY-ESO-1与DEC-205抗体的融合蛋++白可以在体内靶向循环血中的DC并引发CD4和CD8细胞免疫反应。
随着分子生物学的发展，基因工程技术被用于DC疫苗的研究。将外源基因导入DC或者沉默特定基因，可以改变DC的性能，进一步增强肿瘤DC疫苗的效果。早期生长反应蛋白2（early growth response gene 2，Egr2）、细胞因子信号抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）都是DC介导的免疫反应的负性调控因子，沉默Egr2或SOCS1都已证实可以显著增强DC疫苗的效能。
DC疫苗与重组病毒联用可以增强疫苗的疗效。研究显示，共表达IL-12和GM-CSF的溶瘤腺病毒与DC疫苗具有协同作用。某些关键信号通路或关键分子的抑制剂同样显示了与DC疫苗的协同作用。吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的抑制剂1-MT被证实可以增强DC与肿瘤细胞融合疫苗或肿瘤细胞裂解物致敏的DC疫苗的效能。IL-15与p38抑制剂可以增强抗原负载的DC诱导CTL的能力。免疫检查点抑制信号通路是近年的研究热点之一，已证实免疫检查点的拮抗剂，如CTLA-4抗体和抗PD-1抗体，有助于克服肿瘤微环境中的免疫抑制状态，逆转肿瘤局部淋巴细胞的失能状态，从而显著增强肿瘤DC疫苗的效果。
前文ACT部分曾经提到，随着基因组测序技术的进步，现在研究者已经有能力鉴定来自个体肿瘤的独特突变的新抗原（neoantigen）。这些新抗原为我们提供了肿瘤个体化治疗的可能，负载这些新抗原的DC疫苗有望诱导出强大而又高度特异性的抗肿瘤T细胞免疫反应，最终清除肿瘤细胞，而不损伤正常组织。当然，基于新抗原的DC疫苗研究刚刚起步，距离临床推广应用还有相当长的距离。随着各相关领域的飞速发展，我们正在进入肿瘤免疫治疗的一个崭新的时代。未来的肿瘤疫苗方案应该针对每一个患者进行优化，包括个体化的新抗原选择、更有效的免疫佐剂，以及与免疫检查点拮抗剂、对抑制性细胞亚群的清除等治疗手段的联合应用。这样的方案可以降低肿瘤局部的免疫抑制，从而能够让基于新抗原的疫苗诱导出高度特异性的抗肿瘤免疫反应，达到靶向清除肿瘤细胞的目的。（曹水 魏枫）主要参考文献
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