作者：李平亚 主编 刘金平、冯浩 副主编
出版社：化学工业出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
止痛化癥胶囊：药学·药效学·临床研究试读：
前言
止痛化癥胶囊荣获了“吉林省名牌产品”、“妇科疾病类十强产品”（2011）、“行业典范 百姓安全用药”（卫计委2012）及“行业品牌值得信赖产品”（卫计委2013）等多项荣誉，是名副其实的中药大品种，但是综观该品种的科研历史及应用，存在着中医药行业产品众所周知的五大瓶颈问题：临床定位宽泛、药效物质不清、作用机制不明、制药工艺粗放、质控水平低下。因此深入开展其二次开发是十分必要的。
本书针对止痛化癥胶囊物质基础不清楚、质量控制水平不高、药理作用及机制不明确及临床适应证宽泛、优势不突出等问题，利用现代药物的研究手段及方法，深入开展了药学、药效学、入血成分及临床再评价等研究。围绕提高止痛化癥胶囊的质量，从新工艺剂量筛选入手，科学设置工艺品质调控点及质控指标，精准控制工艺参数，实现了批次间一致性目标；将化学组成、药效物质及入血成分及指纹图谱的研究结果整合到质量检测标准，显著提升了药品质控水平，为大幅度提高中成药质量标准提供了技术支撑；从药理学角度阐释了止痛化癥胶囊多组分、多通路、多靶点及多途径的整合调节机制；通过大量的临床研究结果，确定了止痛化癥胶囊的临床科学定位。
本书为广大的中药制剂研究人员、临床医生提供了深入了解及应用止痛化癥胶囊的科学依据，希望能使读者有所收获。编者2018年10月于长春Foreword
Zhitong Huazheng capsule, which has been awarded ‘Jilin Province Name-brand Products’, ‘Top 10 Products for Gynecology Diseases’(2011), ‘Industry Model, Public Safe Medication’(National Health and Family Planning Commission of China（NHFPC, 2012) and ‘Industrial Brand Trustworthy Products’ (NHFPC, 2013), is a A variety with large sales of traditional Chinese medicine. However, the development and the application of this drug shares the five common issues known as the bottleneck of the traditional Chinese medicinal products: lack of focus clinical target, ambiguous pharmacophore, unclear mechanism, low-grade production process, low-level quality control. Thus, revisit the properties of this drug in depth is extreme necessary.
This book focuses on the issues of the Zhitong Huazheng capsule in terms of ambiguous pharmacophore, low-level quality control, uncertain mechanism, unclear clinical target and non-prominent advantages. We employs state-of-art technologies and methodologies of modern drug development to study the pharmacy, pharmacodynamics, plasma composition of the drug metabolites and clinical revaluation. In order to improving the quality of the Zhitong Huazheng capsule, we screened the formulation, properly set the process quality control point and index, precisely controlled the process parameters and successfully achieved reproduction among different batches. While incorporating the chemical composition, pharmacophore, plasma component and fingerprint spectra, the quality control standard of the drug was improved significantly. This protocol may provide support for further improving the quality of the traditional Chinese medicine. Pharmacodynamics studies revealed the synergistic regulation mechanism of the Zhitong Huazheng capsule involving multi-component, multi-pathway, multi-target and multi-function. We also determined the proper clinical target through clinical trials of large samples.
This book provides scientific evidences of understanding and applying the Zhitong Huazheng capsule for the investigators of traditional Chinese medicine and clinical doctors. We sincerely hope the reader benefit from this book.EditorChangchun, October 2018第1章 简 介1.1 概述
止痛化癥胶囊是由吉林金宝药业股份有限公司生产的中药制剂，2002年批准上市。执行标准：部颁标准中药成方制剂第十三册，标准编号：WS3-B-2676-97，药品批准文号：国药准字Z22020845。
本品由全蝎、蜈蚣、鱼腥草、三棱、丹参、当归、炙黄芪、延胡索等19味中药精制而成。
止痛化癥胶囊为硬胶囊，内容物为棕褐色和黑褐色颗粒，气微香，味苦、微咸。党参、炙黄芪补血益气，具有免疫调节和抗炎作用；白术、山药、芡实补益脾胃、益肾气；当归、丹参、鸡血藤具有活血补血、调经止痛、舒经活络、促进微血管血管内皮细胞和微血管增殖的作用；三棱、莪术行气破血、消积止痛，具有较好的调节内分泌激素水平、抗血栓、抗炎、抗纤维组织增生等作用；延胡索、川楝子疏肝理气、镇痛抗炎，又有类激素样作用，能缓解一系列围绝经期症状；诸虫类药攻窜通络、活血止痛；炮姜、肉桂散寒止痛、活血通经。全方补中有消，攻中有补，标本兼治，攻补兼施，扶正不留瘀，祛瘀不伤正，共奏软坚散结、祛瘀止痛之效。【药理毒理】 ①药效学实验表明，本品具有明显的抗炎镇痛作用同时能促进生殖系统微循环化解体内肿块并有增强免疫力的作用。②体外试验显示，对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制和杀灭作用。③毒理实验表明，该药安全可靠；临床服用剂量均为安全。【功能主治】 活血调经、杀菌消炎、止痛化癥、软坚散结。本品用于治疗慢性盆腔炎、阴道炎、月经不调、痛经闭经、白带量多、子宫糜烂、色斑、肿块、具有杀菌、消炎、止痛、化癥的疗效。【规格】 每粒装0.3克，12粒/板，2板/盒。【用法与用量】 口服，每日2～3次，每次4粒，2周一疗程。【不良反应】 个别患者服用本品以后有头昏、无力症状。【注意事项】 孕妇忌用，请在医师指导下使用。【贮藏】 密封，置阴凉干燥处。1.2 质量标准1.2.1 品名
止痛化癥胶囊
Zhitonɡ Huɑzhenɡ Jiɑonɑnɡ1.2.2 处方
党参75g、炙黄芪150g、炒白术45g、丹参150g、当归75g、鸡血藤150g、三棱45g、莪术45g、芡实75g、山药75g、延胡索75g、川楝子45g、鱼腥草150g、北败酱150g、蜈蚣1.8g、全蝎75g、土鳖虫75g、炮姜22.5g、肉桂15g。1.2.3 制法
以上十九味，蜈蚣、全蝎、土鳖虫粉碎成细粉，其余丹参等十六味加水煎煮三次，第一次3h，第二次2h，第三次1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加入蜈蚣等细粉，混匀，制粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。1.2.4 性状
本品为硬胶囊，内容物为棕褐色或黑褐色颗粒；气微香，味苦、微咸。1.2.5 鉴别（1）取本品内容物9g，研细，加甲醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液；加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典（2015年版）》，以下简称《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B）实验，吸取供试品溶液5μL、对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。置紫外光灯（365nm）下检视，显相同颜色的荧光斑点。（2）取本品内容物6g，研细，加浓氨试液3mL及三氯甲烷40mL，摇匀，放置1h，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材2g，加甲醇50mL，浸泡过夜，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇溶解，制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ B）实验，吸取上述两种溶液各5～10μL，分别点于同一用1% 氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5∶4∶1）为展开剂，置以展开剂预饱和的展开缸内，展开、取出、晾干，置碘蒸气中熏至斑点清晰，取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（3）取本品内容物6g，研细，加甲醇40mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次25mL，弃去乙醚液。水液加盐酸调节pH值至2～3，用乙醚25mL提取，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，用水30mL洗涤，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材2g，加甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ B）实验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（19∶1∶0.1）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以2%氢氧化钠溶液，在紫外光（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（4）取丹参对照药材2g，加盐酸溶液（1→50）25mL，加热回流1h，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为对照药材溶液。另取丹参素钠对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ B）实验，吸取（3）项下的供试品溶液及上述对照药材溶液各2～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶2）为展开剂，展开、取出、晾干，置氨蒸气中熏15min，在紫外光（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（5）取本品内容物6g，研细，加甲醇40mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1g，加水50mL，煎煮1h，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录ⅥB）实验，吸取供试品溶液10μL、对照品溶液和对照药材溶液各5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶10∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%铁氰化钾溶液与1%三氯化铁溶液等体积的混合溶液（临用前配制）。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。（6）取本品内容物6g，研细，加80%丙酮100mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取鸡血藤对照药材2g，加80%丙酮40mL，同法制成对照药材溶液。再取芒柄花素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ B）实验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（20∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，在紫外光（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。（7）取本品内容物6g，研细，加甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，再加盐酸1mL，加热回流1h，立即冷却，加三氯甲烷振摇提取2次，每次25mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取山药对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ B）实验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮（9∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。1.2.6 检查
应符合胶囊剂项下有关的各项规定（《中国药典》2015年版附录ⅠL）。1.2.7 含量测定
照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版附录Ⅵ D）测定。1.2.7.1 色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，二甲基甲酰胺-冰醋酸水溶液（取二甲基甲酰胺溶液2mL，冰醋酸溶液1mL，加水95mL，混匀）为流动相B，梯度洗脱。梯度洗脱程序为0—25min，0→5% A。检测波长为283nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于6000。1.2.7.2 对照品溶液的制备
取丹参素钠对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含50μg的溶液（相当于每1mL含丹参素45μg），即得。1.2.7.3 供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品内容物，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸溶液（1→50）50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用盐酸溶液（1→50）补足减失的重量，摇匀，加入氯化钠5g，摇匀，离心，精密量取上清液25mL，用乙酸乙酯振摇提取4次（50mL、30mL、20mL、20mL），合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。1.2.7.4 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每粒含丹参以丹参素（CHO）计，不得少于0.20mg。91051.2.8 功能与主治
益气活血，散结止痛。用于气虚血瘀所致的月经不调、痛经、癓瘕，症见行经后错、经量少、有血块、经行小腹疼痛、腹有癓块；慢性盆腔炎见上述证候者。1.2.9 用法与用量
口服。一次4～6粒，一日2～3次。1.2.10 注意
孕妇忌用。1.2.11 规格
每粒装0.3g。1.2.12 贮藏
密封。1.2.13 版本《中华人民共和国药典（2015年版）》。参考文献
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［11］朱建波，顾红红．止痛化癥胶囊联合抗生素治疗慢性盆腔炎临床观察．新中医，2017，（4）：97-100．第2章 药学研究2.1 化学成分研究 2.1.1 无机元素分析——ICP-MS法测定止痛化癥胶囊中48种无机元素的含量
ICP-MS作为一种无机元素测试分析技术，具有检出限低、线性范围广、精密度高、准确性好、重复性好以及多种元素同时分析的特点。在食品科学和药学等分析领域得到了广泛的应用。本节建立了ICP-MS法同时测定了止痛化癥胶囊三批药材中48种微量元素的含量。为该药物的进一步研究提供了科学依据。2.1.1.1 材料（1）仪器
FW177型高速万能粉碎机，AL104型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），200目/英寸标准筛，高压釜，电热板，7500a型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国Agilent公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。（2）试剂
Li、Be、B、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Ta、W、Hg、Tl、Pb、Bi标准溶液（美国安捷伦公司混标CLMS系列，质量浓度均为10mg/L），In、Rh单元素标准溶液（美国安捷伦公司混标CLMS系列，内标，质量浓度均为50mg/L），Li、Y、Co、Bi质谱调谐液（质量浓度均为10mg/L）；超纯水（电阻率18.2MΩ/cm），硝酸（优级纯，ρ=1.42g/mL），氢氟酸（色谱纯）。实验用器皿均用10%硝酸浸泡过夜，用超纯水冲洗后备用。本实验所用各种酸均经亚沸腾二次蒸馏后使用。（3）药材
止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司生产，规格0.3g/粒，国药准字Z22020845，产品批号160701。2.1.1.2 方法与结果（1）仪器工作条件
用质量浓度均为10mg/L的Li、Y、Co、Bi调谐液对仪器进行最佳工作条件的选择，使仪器的各项参数均达到测量指标。射频（RF）入射功率1350W，等离子体气速15.0L/min、载气流速1.12L/min、冷却气流速13.0L/min，高盐雾化器、雾化室温度2℃，采样深度7.0mm，采取锥孔径1.0mm，截取锥孔径0.4mm，蠕动泵转速0.1r/s，氧化物+2+2+指标（CeO/Ce）小于0.5%，双电荷指标（Ba/Ba）小于1%，积分时间0.1s。（2）溶液的制备
① 标准溶液的制备
精密吸取48种待测元素分别稀释到质量浓度为10mg/L作为储备液，各标准溶液适量，用3% HNO溶液逐级稀释，制备成浓度分别3为10.0μg/L、30.0μg/L、60.0μg/L、120.0μg/L、250.0μg/L、500.0μg/L的Li、Be、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、Hg、Pb、Bi的标准工作溶液；浓度分别为5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L的B、Sc、Ti、Ge、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、La、Ce、Pr、Nd、Sm、W的标准工作溶液；浓度分别为2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、15.0μg/L、30.0μg/L、50.0μg/L的Eu的标准工作溶液；浓度分别为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、3.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的Gd、Dy的标准工作溶液；浓度分别为0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、3.0μg/L、5.0μg/L的Tb、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Ta、Tl的标准工作溶液。
② 供试品溶液的制备
精密称取止痛化癥胶囊6g，粉碎机粉碎，过200目筛，取粉末约0.2g，精密称定，置于5mL聚四氟乙烯溶样弹中，加入1.0mL硝酸及0.5mL双氧水，混匀。在120℃的电热板上对样品进行预处理，待液体蒸至湿盐状，加入1.4mL氢氟酸、1.6mL硝酸，将溶样弹加盖及钢套密闭，放入恒温干燥箱，190℃保持48h。在箱内自然冷却至室温后，在120℃的电热板上，蒸至溶液剩余至湿盐状，冷却，加50%硝酸3.0mL，将溶样弹加盖及钢套密闭，放入恒温干燥箱，150℃保持12h。冷却后，用高纯水将消解液移至PET（聚氯乙烯）样品瓶，定容至50mL，摇匀备用。同法制备空白溶液。
③ 内标溶液的制备
选用In、Rh作内标，所有空白溶液、标准溶液及测试样品均加入内标。精密吸取适量In、Rh标准溶液，用3%HNO溶液稀释制成1μg/3L的内标溶液。（3）测定方法7911454751535559
选择Li、Be、B、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Co、60656671727582858889Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Rb、Sr、Y、909395107111118121133137Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、139140141146147153157159163La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、165166169172175181182202Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Ta、W、Hg、205208209Tl、Pb、Bi等48种元素的相应同位素进行分析测定。根据元素质量数差别采用不同的内标进行校正，每个样品取3个数值。以校正后的强度结果为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，根据标准曲线计算得到样品的质量浓度。（4）方法学验证
① 线性关系
取“（2）①标准溶液的制备”配制的不同质量浓度的混合标准溶液，根据“（1）仪器工作条件”的工作条件进行测定，以标准溶液的质量浓度（C，μg/L）为横坐标，测量值与内标测量值的比值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到各元素的线性方程及相关系数，结果见表2.1。
② 检测限
精密吸取3%HNO空白溶液，在相同的条件下连续测定11次，测3定元素的信号响应值，以信号响应值的3倍标准偏差（3σ）所对应的质量浓度为各个元素的仪器检出限，见表2.1。结果显示，各元素的检出限均能满足分析要求。
③ 精密度试验
取“（2）①标准溶液的制备”项下的10μg/L的多元素混合标准溶液，连续进样6次，计算6次测得质量浓度的RSD，见表2.1。各元素RSD均小于4.69%，表明本法的精密度良好。
④ 重复性试验
取止痛化癥胶囊粉末（样品编号S1），按照“（2）②供试品溶液的制备”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别测定，统计6次重复进样的测定结果，结果见表2.2，计算各元素RSD小于4.93%，表明本法重复性良好。表2.1 各元素线性关系、检测限及精密度Tab. 2.1 Linearity，LODs and precision for test of elements
⑤ 稳定性试验
取止痛化癥胶囊粉末（样品编号S1）0.1g，精密称定，按照“（2）②供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2h、4h、8h、12h、24h依次进样测定各元素的含量，结果见表2.2。计算各元素RSD小于4.44%，结果表明，室温放置24h内，供试品溶液稳定性良好。
⑥ 加样回收试验
精密称取止痛化癥胶囊粉末（样品编号S1）0.25g，精密称定，共9份，按“（2）溶液的制备”项下的方法制备高、中、低三个浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备5份，分别加入适量的混合标准溶液，测定各元素含量，计算回收率，见表2.3。表2.2 重复性及稳定性试验结果（n=6）Tab.2.2 Results of repeatability andstability tests（n=6）表2.3 加样回收实验结果（n=5）Tab. 2.3 Results of recovery tests（n=5）（5）样品测定结果
按照“（2）溶液的制备”项下的方法制备止痛化癥胶囊（样品791145编号S1、S2、S3）的供试品溶液，分别测定Li、Be、B、Sc、47515355596065667172Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、7582858889909395107As、Se、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、111118121133137139140141146Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、147153157159163165166169Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、172175181182202205208209Yb、Lu、Ta、W、Hg、Tl、Pb、Bi 等48种微量元素的含量，结果见于表2.4。表2.4 止痛化癥胶囊无机元素含量测定结果/（μg/g）Tab.2.4 Contents of inorganic elements in Zhitong Huazheng capsule/（μg/g）2.1.1.3 讨论
本文采用ICP-MS法测定了止痛化癥胶囊中的48种微量元素的含量，结果表明重金属元素含量分别为Pb元素的质量分数为1.864μg/g，As元素的质量分数为：1.689μg/g，Cd元素的质量分数为0.122μg/g，Hg元素的质量分数为0.131μg/g。均低于《中国药典》2015年版对于中药材重金属含量的限定（Pb元素的质量分数为5.0μg/g，As元素的质量分数为2.0μg/g ，Cd元素的质量分数为0.3μg/g ，Hg元素的质量分数为0.2μg/g）。
止痛化癥胶囊中人体必需微量元素的含量普遍较高。其中，Cu参与和维持机体的造血功能，通过调节细胞色素氧化酶的活性，促进生物氧化为组织供氧。Sr可参与Ga的代谢，与骨骼的形成密切相关，同时有研究发现，Sr可以改善脂质代谢紊乱、降低心血管病的死亡率。Mn可以维持血糖、血脂和血压的正常，是体内多种酶的组成成分或激活剂，具有维持骨骼发育、促进糖和脂肪代谢及抗氧化等功能。Zn在体内参与多种酶及DNA的合成，促进生长发育，维持正常的免疫功能。Sn可以促进生长发育、血红蛋白的分解，有助于创伤愈合，及抑制癌细胞的生成。B影响Ca、Mg、P三种元素的代谢，可以增加骨密度，可以预防绝经后妇女的骨质疏松。Cr可以明显改善糖代谢，影响肝脏中脂肪与胆固醇的合成和降解，对蛋白质和RNA的合成均具有调节作用。Rb有类似K的作用，蓄积在红细胞中，在生理应激引起的神经传递中发挥着作用。Ni是多种酶的激活源，参与多种酶蛋白的组成，促进红细胞再生，刺激生血机能。V具有胰岛素样作用，能促进脂类代谢，抑制胆固醇的合成，对心血管功能有利。Se在预防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗病毒、防癌、保护视力以及免疫调节方面有着重要的作用。Co是维生素B的组成成分，有造血功能，12能促进各种物质的代谢。这些元素影响人体内多种酶的活性，参与蛋白质、氨基酸的合成，对止痛化癥胶囊药效的发挥产生直接或间接的影响。2.1.2 挥发性成分研究——顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法检测止痛化癥胶囊挥发性成分
固相微萃取技术（solid phase micro-extraction，SPME）属于非溶剂萃取法，是一种新型的样品预处理方法。此提取方法无溶剂、快速且灵敏，可以使样品的制备最小化。通过纤维头从样品中吸附待测物，并解吸于分析设备中的一种无溶剂样品预处理技术，其集采集、萃取、浓缩于一体，有装置简单、操作方便、适合与其他分析仪器连用的优点。为全面了解止痛化癥胶囊的挥发性成分，本文首次采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对止痛化癥胶囊的挥发油成分进行了分析鉴定。2.1.2.1 材料与仪器
止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司生产，规格0.3g/粒，国药准字Z22020845，产品批号160701。
美国Agilent公司5975-6890N气相色谱-质谱联用仪；手动固相微萃取装置（美国Supelco公司），萃取纤维头为100μm PDMS、7μm PDMS、 PA；20mL样品瓶（具聚四氟乙烯胶垫瓶盖，美国Agilent公司）；HP-1510 气相色谱顶空加热器（上海济成分析仪器有限公司）；FA1104N型电子分析平（上海菁华科技仪器有限公司）。2.1.2.2 实验方法（1）挥发油提取
将固相微萃取的100μm PDMS纤维萃取头置于气相色谱的进样口260℃、1mL/min下老化10min。止痛化癥胶囊去胶囊壳、药末粉碎、过200目筛，称取1.0g的粉碎后的药末置于20mL 样品瓶中，密封。60℃下顶空萃取60min，随后从样品瓶中拔出萃取头，立即插入色谱仪进样口，260℃解吸2min。（2）GC-MS分析
色谱条件：Agilent HP-35气相毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；程序升温，起始温度60℃，保持3min，以5℃/min升温到280℃，维持280℃至完成分析；汽化室温度260℃；载气为He（纯度99.99%），柱流量1.0mL/min，不分流进样。
质谱条件：电子电离源（EI），温度230℃；四级杆温度150℃。电离方式为EI，电子轰击能量70eV；溶剂延迟4min。数据采集模式为全扫描；质量扫描范围m/z 20～600；扫描速度150u/s。
用峰面积归一化法计算各组分的相对质量分数，对相对质量分数大于0.01%的挥发油成分进行积分并鉴定，利用美国Wiley7Nist05、NIST05两种质谱数据进行计算机检索比对，而后进行人工图谱解析确定化合物结构。2.1.2.3 结果与讨论
应用HS-SPME技术收集止痛化癥胶囊中的挥发油成分，热脱附后经GC-MS分析，共检出70个色谱峰，SPME-GC-MS分析止痛化癥胶囊挥发油总离子流图见图2.1。图2.1 止痛化癥胶囊挥发油总离子流图Fig.2.1 Total ion current chromatogram of essential oil from Zhitong Huazheng capsules
通过HPMSD化学工作站检索NIST02.L标准质谱图库，结合人工图谱解析，共鉴定出70种化学成分，已鉴定的化合物主要包括烯烃、有机酸、醛、酮、酯、杂环和芳香类化合物，占总流出峰面积的100.00%，采用面积归一化法确定各组分的相对含量见表2.5。表2.5 止痛化癥胶囊挥发油的SPME-GC-MS分析结果Tab.2.5 Analysis of Zhitong Huazheng capsules by SPME-GC-MS2.1.2.4 结论
采用SPME-GC-MS技术分析止痛化癥胶囊中的挥发油成分结果表明，止痛化癥胶囊挥发油中的成分含量较高的有5-甲基-2-糠醛（18.47%）、焦粘醛（16.23%）、2-乙酰吡咯（7.17%）、乙酸（5.79%）、薄荷酮（4.84%）、1-（2-呋喃基）乙酮（4.58%）等。以烯烃、有机酸、醛、酮、酯、杂环和芳香类化合物为主。E2.1.3 全成分分析——UPLC-Q-TOF MS技术结合UNIFI数据库快速分析止痛化癥胶囊的化学成分
近年来，超高效液相色谱与飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-EMS）已经成为天然药物中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。而UNIFI是一个简单、高效、全面的平台，数据库中包括600多种中药中发现的6000多种化合物信息，能够将数据采集、峰提取、分子式确定、数据库检索及生成报告相结合，对化学成分进行快速、全面地E定性分析。将UPLC-Q-TOF-MS与UNIFI平台相结合，已经被应用到传统中药及复方中药化学成分的快速鉴定中。本节采用UPLC-Q-ETOF-MS结合UNIFI平台，对止痛化癥胶囊的化学成分进行快速、全面的筛查分析，可为进一步阐明药效物质基础、全面的质量控制提供依据。2.1.3.1 实验部分（1）主要仪器与试剂
XEVO G2-S Q-TOF四级杆飞行时间质谱仪，ACQUITY UPLC二元泵和样品管理器（美国Waters公司），Masslynx™ V4.1工作站，UNIFI 1.7.0科学信息学系统（美国Waters 公司），N-A35型氮气发生器（上海金浪科技有限公司），FA1104N 型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），旋转蒸发仪（上海豫康科教仪器设备有限公司），TGL-16-aR型超速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
UPLC-MS 级乙腈（美国Fisher公司），甲酸钠、亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司），质谱用水为纯净水（市售）。止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司提供，批号为20161010。
木樨草素（111520-200504），山柰酚（110861-201310），柠檬酸（111679-201602），咖啡酸（110885-201102），咖啡酸乙酯（111678-200401），双氢槲皮素（180317）等6个对照品购自中国食品药品检定研究院（中国，北京）；奎宁酸（20150321），阿魏酸（110773-201012），丹酚酸B（150927），芒柄花黄素（17031005），丹参素（151106），原儿茶酸（171109），原儿茶醛（110810-200205），黄芪甲苷（0781-200311），迷迭香酸（11871-2001102），丹酚酸A（171217），丹酚酸C（171105）等11个对照品购自北京普天同创生物科技有限公司。（2）样品溶液的制备
取供试品内容物，研细，过40目筛，取约1g，用80%甲醇在80℃水浴中提取3次，每次3h。过滤后，将滤液合并，旋干。用1.0mL 80%甲醇将提取物溶解，过0.22μm的滤膜。备用。（3）UPLC-Q-TOF 检测条件
① 色谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm），柱温 30℃，样品管理器温度 15℃，进样体积10μL，流速0.4mL/min。流动相A：0.1%甲酸-水（体积分数）。流动相B：0.1%甲酸-乙腈（体积分数）。梯度洗脱条件：0—2min，10% B；2—26min，10%→90% B；26—28min，90% B；28—29min，90%→10% B；29—30min，10% B。
② 质谱条件E
电喷雾离子化源（ESI），MS continuum模式，采用正离子及负离子检测模式。全扫扫描范围m/z 100～1500。毛细管电压3.0kV，锥孔电压40V，锥孔气流量50L/h，脱溶剂氮气流量600L/h，氩气流量0.15mL/min，源温120℃，脱溶剂气温度300℃。采用亮氨酸-脑啡肽+-［M+H］= 556.2771、［M-H］ =554.2620作为Lock Spray校正标准液（100pg/mL），对仪器进行实时校正，其校正流速为正离子模式15μL/min，使用甲酸钠溶液对仪器进行校正。2.1.3.2 结果E
采用UPLC-Q-TOF-MS 模式采集数据，使用UNIFI软件进行止痛化癥胶囊化学成分的自动识别。首先，通过查阅文献建立止痛化癥胶囊数据库，作为原有的传统中药库的补充，将化合物化学结构保存成“.mol”格式的文件，将止痛化癥胶囊数据库导入到分析方法中；第二步，将原始数据通过Waters Compression and Archival Tool v1.10软件进行压缩；第三步，UNIFI软件自动筛查、鉴定，代替传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片断裂情况；第四步，建立一个过滤筛选方法，设定质量误差为-5～5ppm，且响应值大于4000；最后，通过结合碎片离子理论精确质量数、相对保留时间和分子式匹配软件Elemental composition、化合物结构匹配软件MassFragment、离线及在线质谱数据库（PubMed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）及相关文献对各主要化合物进行人工识别和确认。
利用UNIFI数据处理系统和MassLynx 4.1软件对止痛化癥胶囊提取物进行定性分析，正、负离子模式下的质谱基峰离子流图见图2.2.在止痛化癥胶囊中检测到68个化合物，其保留时间、分子式、准分子离子峰实测值及理论值、加合离子、质量误差和碎片离子的信息结果见表2.6，包括37个有机酸及有机酸酯、8个生物碱、9个黄酮、5个三萜皂苷、5个醛类、2个酮类、1个醌类、1个单萜类化合物。图2.2 止痛化癥胶囊提取物在正离子模式（A）及负离子模式（B）下的基峰离子流图Fig.2.2 Basic peak ion flow diagram of Zhitong Huazheng capsule extract in positive ion mode（A）and negative ion mode（B）E表2.6 止痛化癥胶囊提取物化学成分的UPLC-QTOF-MS鉴定结果ETab.2.6 UPLC-Q-TOF-MS identification results of chemical constituents in Zhitong Huazheng capsule extract*与对照品比较。2.1.3.3 讨论E
在本研究中，首次运用UPLC-Q-TOF-MS技术结合UNIFI数据分析平台定性分析了止痛化癥胶囊中的化学成分。E
UPLC能够进行高效的分离，Q-TOF-MS具有高灵敏度、高分辨率，能够进行精准检测，UNIFI能够进行快速筛查鉴定，将三者结合，E即可实现快速地分离、检测、鉴定。Q-TOF-MS 的 MS数据采集模式可通过低碰撞能扫描和高碰撞能扫描之间快速切换同时完成 2 种扫描功能的数据采集。排除假阳性结果，同时进行母离子、子离子、中性缺失分析。低能碰撞扫描一般都是6V，能量足够低，因此母离子不会断裂，保留母离子信息；高能碰撞扫描一般在15～40V，呈线性变化，导致产生碎片信息。低能碰撞和高能碰撞获得的信息再通过保留时间进行关联，为止痛化癥胶囊化学成分的定性分析提供化合物信息，实现快速鉴别。E
总之，本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术结合UNIFI数据分析平台对止痛化癥胶囊化学成分进行了快速定性分析，共鉴定了68个化学成分，包括37个有机酸及有机酸酯、8个生物碱、9个黄酮、5个三萜皂苷、5个醛类、2个酮类、1个醌类、1个单萜类化合物，为中药材化学成分的分析提供了一种快速检测的方法，同时也为止痛化癥胶囊的质量控制、药效物质基础的阐明提供了科学依据。2.2 HPLC指纹图谱研究
中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一，指纹图谱能全面整体地反映药品的质量，能为中药的质量评价和控制提供一个有效的参考方法。本节利用高相液相色谱法对止痛化癥胶囊进行指纹图谱研究，运用中药色谱指纹图谱中的特征峰进行化学指认，保证药品有效性及安全性，为制定全面的止痛化癥胶囊的质量控制方法奠定一定工作基础。2.2.1 材料2.2.1.1 仪器
Waters 1525型HPLC、Waters 2998二极管阵列检测器（AmericanWaters 公司）；FA1104N型万分之一电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司）；R201D恒温水浴锅、旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；KQ3200V型超声波清洗仪（150W，40kHz，昆山市超声仪器有限公司）。2.2.1.2 试剂
乙腈、甲醇（ 色谱级，美国 Fisher 试剂公司）；水为纯净水（市售）；其他试剂均为分析纯。2.2.1.3 药品及对照品
止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司提供，10批药品批号依次为160303、161002、160905、161001、160502、160501、160503、160904、161003、160701。
丹参素（151106）、原儿茶酸（171109）、党参炔苷（17062207）、紫草酸（171220）、丹酚酸B（150927）均购买自北京普天同创生物科技有限公司。迷迭香酸（11871-2001102）、原儿茶醛（110810-200205）购买自中国食品药品检定研究院（中国，北京）。2.2.2 方法与结果2.2.2.1 色谱条件
采用UniSil 5-120 C18 Ultra色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）（苏州纳微科技有限公司）；以乙腈-水（含体积分数为0.05%的甲酸）为流动相进行梯度洗脱。流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长280nm。流动相条件如表2.7所示。表2.7 流动相梯度洗脱表Tab.2.7 Gradient elution table2.2.2.2 供试品溶液的制备
取止痛化癥胶囊内容物，约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30mL，超声处理（功率150W，频率40kHz）45min，放冷，摇匀，过滤，将滤液蒸干后，用甲醇定容至5mL，过0.45μm滤膜，即得样品溶液。2.2.2.3 对照品溶液的制备（1）对照品溶液制备
精密称取丹参素对照品1.7mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇对其超声至溶解，并用甲醇定容至刻度线，使摇匀，作为丹参素标准对照备用液。同法精密称取原儿茶酸对照品3.2mg，原儿茶醛对照品2.8mg，迷迭香酸对照品2.2mg，党参炔苷对照品3.1mg，紫草酸对照品3.3mg，丹酚酸B对照品4.6mg，制备成丹参素标准对照备用液（0.17mg/mL），原儿茶酸对照品备用液（0.32mg/mL），原儿茶醛标准对照备用液（0.28mg/mL），迷迭香酸标准对照备用液（0.22mg/mL），党参炔苷标准对照备用液（0.31mg/mL），紫草酸对照品备用液（0.33mg/mL），丹酚酸B对照品备用液（0.46mg/mL），置冰箱中冷藏待用。（2）混合对照品溶液制备
精密丹参素对照品1.6mg，原儿茶酸对照品2.0mg，原儿茶醛对照品3.2mg，迷迭香酸对照品2.5mg，党参炔苷对照品1.1mg，紫草酸对照品1.3mg，丹酚酸B对照品1.9mg，混合置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。2.2.3 方法学考察2.2.3.1 精密度试验
取同一供试品溶液（批号160501），按“2.2.2.1”项下色谱条件，连续进样 6 次，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间 RSD 为 0.09%～0.40%，相对峰面积RSD为0.76%～2.94%，表明方法精密度良好。指纹图谱精密度相对保留时间和相对峰面积数据分别见表2.8和表2.9。表2.8 指纹图谱精密度相对保留时间数据（批号：160501）Tab.2.8 Fingerprint precision relative retention time data（lot Number：160501）表2.9 指纹图谱精密度相对峰面积数据（批号：160501）Tab.2.9 Fingerprint precision relative peak area data（Lot Number：160501）2.2.3.2 重现性试验
精密称取同一供试品溶液（批号160501）5 份，按“2.2.2.2”项下平行制备 5 份供试品溶液，按“2.2.2.1”项下色谱条件，进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.08%～0.95%，相对峰面积RSD为0.10%～2.87%，表明方法重复性良好。指纹图谱重复性相对保留时间数据和相对峰面积数据分别见表2.10和表2.11。表2.10 指纹图谱重复性相对保留时间数据（批号：160501）Tab.2.10 Fingerprint reproducibility relative retention time data（Lot Number：160501）
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]