基因工程实验技术与实施教程(txt+pdf+epub+mobi电子书下载)

作者：斯越秀

出版社：浙江大学出版社

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基因工程实验技术与实施教程试读：

基因工程是一门实验性很强的学科，近年来发展相当迅速，其任何进展都是以实验为基础的。基因工程方法与技术随着分子生物学的迅猛发展，已渗透到现代生命科学的各个分支领域，成为生物工程的核心技术。基因工程实验课程具有综合设计性和实践性强等特点，并且与农业、医药、环境、能源和食品等行业紧密结合，发展空间广阔。

近年来，我国高等教育改革步伐加快。21世纪的教育是开发人的创造力、想象力，培养创造能力、创新型人才的教育。根据新时代发展的需要，高等院校必须进行全面的教育改革，实现单一的验证理论向探索未知的转变；实现学科专业素质培养向综合素质教育的转变；实现侧重获取知识的教育向增强创造性教育的转变；实现学生被动接受知识向主动合作学习知识的观念转变。随着生命科学的迅猛发展和教育改革的不断深入，实验教学改革也在不断深化，构建相关实验的课程项目体系、改革实验教学模式及建立科学合理的实验考评考核方式是应用型人才培养的必要措施。本教材结合浙江省新世纪高等教育教学改革项目《以创新能力培养为导向的基因工程实验教学改革与探索》，浙江万里学院生物技术、生物工程专业实验教学体系建设，以及近十年的实践教学经验而编写，作为《分子生物学与基因工程》省级精品课程建设配套实验教材，是一本实用性较强的具有明显特色的基因工程实验教材。《基因工程实验技术与实施教程》是新的教学形势催生的产物，不同于传统的基因工程实验指导书，本教材由基因工程实验技术教学组织实施形式、基因工程实验技术与原理、基础实验、综合设计实验和附录五部分组成，并全程体现实验教学方法的实施和运用。

教程中所选实验项目融入了教师多年的实验教学经验，收集了部分现代基因工程实验指导教材的精华，内容涵盖基因克隆、表达、表达产物检测与分析等基因工程基本实验领域，涉及基因组DNA提取、质粒提取、PCR扩增目的基因、酶切、酶切产物纯化、连接、转化、重组子筛选鉴定、目的蛋白的诱导表达等常用的基因工程基本技术以及电泳技术、层析技术、分光光度法等分离鉴定和分析手段。

特别是教材的第一部分介绍教学实施方案，第四部分综合设计实验融教学组织实施方式于教学内容中，有利于教师实验的组织实施、学生预习和复习实验，对基因工程实验课程进行设计性、开放式实验教学改革有很大帮助。整个实验内容的编写思路是以专业的实践技能和行业应用为导向，循序递进设置实验项目，突出实验教学内容的技能综合性、设计性、应用性与自主探索性，构建基础性实验——综合性设计性实验的教学内容体系。本教材是高校生物专业学生自主学习的良好基因工程实验教材。

基础实验部分介绍10个基因工程基础实验技术，侧重于实验原理的学习、方法的掌握和分析讨论，着重训练学生的基本基因操作实验技能，并通过实验技术加深对理论知识的理解。综合设计实验部分以目的基因的克隆和原核表达为训练项目，包含4个研究性、行业相关性的实验项目。每个实验项目包括实验目的、实验背景、实验设计要求、实验设计示例、结果展示、合作研讨题、实验设计及学习参考资料7个内容。教材内容的编排与具体的教学实施过程配套。教师在教学过程可针对每个实验项目提出实验目标，并将实验方法和重要参数告诉学生，然后要求学生查阅相关文献和资料，每组学生根据实验总要求，自行确定实验材料、自主设计实验技术路线并提交，指导教师审核后参考实验指导书中的相关步骤与方法进行实验，形成总结性材料，从而进一步培养学生综合运用各种分子生物学实验技术能力、分析与设计能力、逻辑思维能力。同时为适应自主式学习需要，每个实验项目提供了课后研讨题及学习参考资料，便于学生开展实验设计及实验讨论。

在附录中，收集了基因工程实验常用的一些数据、分子生物学常用试剂的配制方法、实验注意事项等，为从事综合性基因工程实验的师生们提供方便。

本书特色：（1）教材内容围绕基因的克隆与表达，循序递进设置实验项目，构建基础性实验——综合性设计性实验的教学内容体系，明确基因的克隆与原核表达的实验教学技能体系。（2）教材中穿插了实验教学组织形式，便于教师实验教学的开展。综合性设计性实验项目的编写以专业的实践技能和行业应用为导向，以鼓励和培养学生自己动手、开发创新的精神为主导，在编写实验项目和内容的同时，更体现教学方法的改革和创新。（3）提供了实验的参考资料，有利于学生开展自主学习和自主设计实验。（4）提供实验研讨要求和题目，引导学生之间互相分析讨论实验全过程。

本教材主要针对地方本科院校、应用型人才培养目标而设计编写，也可供其他理工科高等院校的生命科学、生物技术、生物工程等专业学生及相关领域的科技人员使用。

本教材由斯越秀、王忠华、俞超、谭志文、毛芝娟、包永波、张捷等老师参与编写，借鉴兄弟院校基因工程实验教材经验，供我院开设的各专业选用。借此出版机会，表示由衷的感谢！

本书作为生物技术、生物工程专业课程实验教材，我们力求使之具备实验性、可操作性。但是由于主客观条件，限于我们的学识和水平，而且编写时间仓促，肯定有不少缺点和错误，敬请各位老师与同学提出宝贵意见，帮助我们不断改进教学，谢谢！编　者2011年6月  第一部分 基因工程实验技术教学组织实施形式一、实验学习目标《基因工程实验技术与实施教程》是以渐进式训练学生基因工程基础实验技能、学科研究综合设计技能为目标的实验教材。实验教学过程采用自主设计、全程参与、研讨合作的实验教学模式。通过实验前查阅资料和自主设计实验的要求，提高学生的创新意识，培养学生的创新能力和实验设计能力；通过学生准备实验和全程参与实验过程，培养学生掌握分子生物学实验的基本技术，规范操作技能，强化动手能力；通过学生之间相互合作、讨论和分析实验全过程的要求，培养学生分析研究问题的逻辑思维能力和团队合作精神。

基因工程实验技术课程开设的实验项目，包括基础性实验和综合设计性实验，通过这些实验项目的开设，以强化学生的分子生物学基本操作技能和综合应用能力，并达到以下目标：

1.巩固和深化对分子生物学基本理论的理解，训练并掌握基因工程相关实验技术的基本操作技能，为今后专业学习和科研工作打下实验技能基础。

2.通过基础实验的学习和操作，要求学生掌握基因组DNA的提取、PCR、质粒提取、酶切、连接、感受态细胞的制备、重组质粒的转化、重组子的鉴定、重组蛋白的诱导表达、目的蛋白的分离纯化、检测等基因工程基本实验技术。

3.综合设计性实验以目的基因的克隆和原核表达为训练项目，培养学生综合运用各种分子生物学实验技术的能力，提高实验设计与分析能力，培养分析问题、解决问题和实践创新的能力。二、实验学习要求

1.课前预习：基础实验学习前明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项。综合设计实验部分学习前，务必对基因工程实验技术与原理部分做好学习，明确实验目标，了解实验背景，查阅资料，按照要求分组写好实验设计方案。

2.实验过程：基础实验按照实验指导书所列步骤和要求实施实验操作，综合设计实验项目，鼓励学生综合所学知识开拓创新，可运用多种实验方法完成实验目标，也可根据指导书示例进行操作学习。

3.实验结果与分析：真实记录实验结果数据，对结果要认真分析，得出结论；异常的结果要进行理论分析并找出原因。坚持实验的严肃性、严格性、严密性。

4.讨论与报告：对实验结果进行分析研讨，写出实验报告或小论文，并汇报交流实验收获和知识拓展情况。

5.注意事项：严格遵守大型精密仪器操作管理及实验室规则，防止各种事故发生；综合设计实验每个项目都是连续的实验，每次实验结束应注意妥善保管各自的实验产物，以便为下次实验提供材料保证。三、实验教学组织实施流程

基因工程实验教学过程可把基础性实验融入综合设计性实验项目中，采取自主、开放、探索式实验教学方式，以“项目驱动”为主线，根据实际条件，开设几个综合设计性实验项目，让学生自主选择一个自己感兴趣的实验项目（每个项目64学时），自主设计实验方案，自主实施实验过程，教师仅起引导、辅助解疑的作用。综合设计性实验教学组织实施流程如下：（一）理论讲解与任务布置

第一次课，教师先发布实验项目，下达实验要求及项目完成的目标。教师把开展综合设计实验的总体思路、要求、方法和步骤告诉学生，让学生明确思想，做好准备。其次，教师简要讲解基因工程实验技术的基本原理，进行针对实验项目的理论辅导，使学生在设计和开展实验前具备分子克隆相关的理论基础，便于自主学习和设计。（二）分组与项目选择

学生自由组合分组或教师按学号安排，一般4人为一组，学生根据自己的兴趣在教师发布的实验项目中选择一个开展实验。根据选定的实验项目指定相应的实验指导教师。（三）实验方案设计与审核

学生在学习理论知识、查阅资料的基础上，写出实验设计方案。小组讨论每个组员的实验设计方案，最终形成小组的实验设计方案。老师审核实验设计可行性及修改后，进行实施训练。（四）实验实施

各小组先填写预约，申请提交实验中心，审核通过后，学生可根据自己设计的实验方案，利用课余时间到实验室进行实验；实验后，清理实验室、检查水电、登记离开。这段时间实验室全天对学生开放，并为学生配备所需的实验材料、试剂和仪器等，以满足实验需要。在项目的实施过程中，小组成员可进行合理分工。

指导教师负责实验实施全过程的指导。在实训过程中老师全程指导并及时与学生交流，互动式探讨实验遇到的问题，并分析解决，将传统的“学生”和“教师”的角色转换为实验探索合作者，教师成为解决仪器应用培训、疑难问题提供协助者。（五）实验总结

实验完成后，在教师指导下完成实验小论文的写作。重点强调4个方面的内容：实验意义；材料和方法；实验结果；分析讨论。论文完成后各小组制作演示汇报文稿（PPT），课堂上进行全班集中交流汇报演示。教师对学生每个汇报项目在给予肯定和积极鼓励的前提下，从设计内容、知识原理、演示文稿制作水平、发言水平以及对教师、学生所提出的质疑解答等方面进行点评，纠正及引导学生解决问题。通过讨论，鼓励学生学习的积极性及创新精神，引发同学深入思考，进一步提高学生掌握知识和技能能力。

因此，这一项目化训练从文献资料检索、阅读、思维能力、组织能力、计算机软件应用能力、口头表达能力、演讲能力、论文撰写能力、团结协作等多方面培养了学生综合能力，体现了合作式、自主探索式实验教学在培养综合素质应用型人才中的作用。（六）上交材料

整个实验过程需上交的材料包括：文档一、基因工程实验设计方案（小组）；文档二、基因工程实验报告（个人）；文档三、基因工程实验任务分工（小组）；文档四、实验研讨记录（小组）；汇报PPT（小组，电子版）。（七）实验考核

为充分发挥评价的激励作用，提高实验教学效果，适合以能力培养为核心的实验教学模式，应建立既注重过程又注重结果的课程考核方法，以促进学生的全面发展。本教程是以实验实施的参与过程、技能提高、设计与研究能力、实验结果与分析能力等为观察点，作为考核评价的主要依据。具体指标如下：

1.实验设计：考核实验设计方案格式，可行性、创新性，参考文献资料等。

2.实验研讨：以小组为单位对本实验进行小组研讨，形成研讨成果，并定期在全班大组中进行讨论汇报。讨论评价以小组为单位。

3.实验小论文：每个综合设计实验项目形成一篇研究性小论文。评价实验论文格式、实验论文数据及图谱结果、实验讨论分析，引用文献，观点阐述等。

4.实验操作测评：确定每个基础实验知识点与技能点，明确测评内容和要求，考试时由学生抽取1个考题，当场操作完成，当场评定打分。

5.实验理论测试：针对实验原理和内容进行理论考试。

6.平时表现与出勤：出勤情况、实验前的准备、实验过程、实验后的清理等给予相应的成绩。基因工程实验技术课程成绩构成表四、实验报告要求

实验报告是做完每个实验后的总结，完全是根据自己的实验历程所撰写的，除小部分引用他人的文献之外，都必须是实际实验过程和结果的记录。每个人要写一份自己的实验报告，照片等结果可以打印附上。

实验报告或实验小论文的格式可参考科学期刊里的论文格式，要求写得合理、准确。（一）封面

第一页为封面，依次写入实验课程、实验题目、组别、姓名、完成日期等信息。（二）摘要与关键词

摘要包括研究的对象和主要目的；研究的主要内容；主要成果及意义。从摘要的内容可以知道：你利用什么材料与方法，做了什么研究，得到了怎样的结果，得出了什么结论。

关键词：3～5个不等。（三）前言

简要说明实验的目的与目标。需要引用他人文献时要注明出处。注意引用的文献要尽可能是最新的文献，当然常规方法的引用文献除外。（四）材料与方法

描述要简洁，写出实验的实际操作步骤，记录自己所操作的流程与条件，不要完全照抄实验讲义或论文上的内容，但要写清楚，以便他人能够重复。若使用已知的报告或论文中的方法，要加注出处（参考文献）。（五）结果与讨论

结果是论文的核心之一，基本要求是表达清楚，前后连贯。应记录、陈述实际观察到的实验现象，简明点出获得的实验结果，而不是重复实验方法，也不是照抄实验书所列的应得到的实验结果。要详细记录实验现象的所有细节。切忌拼凑实验数据与结果。报告在实验中的真实发现是非常重要的，在科研中仔细观察，应特别注意未预期的实验现象。此外，实验数据要经过整理后，做成图表以便阅读，不要将原始资料完全抄录。请写出有意义的实验结果，但切勿遗漏重要结果。

图表一定要精确制作，正确而易懂的图表最有助于研究结果的阅读。图表都要加说明文字，好的图表只要阅读图表即可了解其实验结果。使用计算机软件作图，多参考别人如何安排图表内容，是最佳的学习方式。

一篇报告的分量主要反映在讨论这部分内容，讨论不是实验结果的重述，而是由结果所得到的观察，进一步综合分析，说明由结果所透露出来的信息。若有与事实或已知不符的现象，请仔细讨论或解释分析。讨论部分也可以包括对于实验设计的认识、体会和建议，以及对实验课改进的意见、对自己的实验质量作出的评价等。总之，这一部分最需要发挥专业实力与写作水平。（六）参考文献

报告中若有引用他人方法与结果，一定要列出参考文献。编辑参考文献要多花时间，不可因为文献不好查或不易输入而随便应付。参考文献的写法相当复杂，不同期刊有不同的格式，但应注意在同一篇文章中统一用一种格式。五、文档格式

文档格式详见格式一至格式四。格式一基因工程实验设计方案格式二基因工程实验报告

 实验名称：__________________

 班级组别：__________________学　　号：__________________姓　　名：__________________指导教师：__________________完成日期：__________________

报告内容应包括：摘要、关键词、前言、材料与方法、结果与分析、参考资料。具体格式如下：

1.论文标题

一、二、三、四级标题分别采用1、1.1、1.1.1、1.1.1.1依次标出。如“1前言、1.1研究现状、1.1.1国内研究现状”。标题文字为宋体小四加粗，数字为新罗马小四加粗，行距1.5倍，段前、段后间距设定为0。与正文内容之间不空行。

2.正文内容

宋体小四，不加粗。行距1.5倍，两端对齐，每段首行缩进2字符。段与段之间不空行，段前、段后间距设定为0。标点符号在中文状态下输入。

3.图表

图序及图名居中置于图的下方，图中的术语、符号、单位等应与正文表述所用一致；三线表，表序及表名置于表的上方，表中参数应标明量和单位的符号；图名、表名采用宋体五号，图序、表序为新罗马五号，加粗；表格中字体五号，左对齐，图表整体均要居中。若图或表中有附注，采用英文小写字母顺序编号，附注写在图或表的下方。如示例“表1”。表1　海洋化能异养细菌类型

4.参考资料

列出在正文中被引用过的文献资料。按顺序，在引用句句末以上标的形式标注［1］、［2］……按文中引用的顺序，将参考文献附于文末。作者姓名写到第三位，余者写“，等”或“，et al”。文献正文采用5号宋体及新罗马字体，行距1.5倍，标点符号在英文状态下输入。几种主要参考文献著录表的格式为：（1）书籍格式

［序号］作者著编.书名［M］.出版地：出版社，出版年：起止页码.与后面文字间空一格。一行不够到下一行，不缩进。如：

［1］池振明著.现代微生物生态学［M］.北京：科学出版社，2005，8：52.（2）期刊格式

［序号］作者.文章题目［J］.期刊名，年份，卷号（期号）：起止页码.如：

［2］韦蔓新，童万平.北海湾无机氮的分布及其与环境因子的关系［J］.海洋环境科学，2007，19（2）：25-29.（3）报纸文章格式

［序号］作者.文章题目［N］.报纸名，出版日期（版次）.如：

［3］谢习德.创造学习的新思路［N］.人民日报，1998-12-25（10）.（4）各类标准格式

［序号］发布单位.标准编号.标准名称［S］.

［4］中华人民共和国国家技术监督局.GB3100～3102［S］.（5）学位论文格式

［序号］作者.文章题目［D］.［XX学位论文］.授予单位所在地：授予单位，授予年.

［5］刘忠.新型液压冲击机械设计理论与控制策略研究［D］.［博士学位论文］.长沙：中南大学，2002.（6）电子文献格式［序号］作者.文章题目［文献类型标识/载体类型标识］.发表或更新日期（加圆括号）、引用日期（加方括号）和电子文献的网址.如：

［6］萧钰.出版业信息化迈入快车道［EB/OL］.（2001-12-19）［2002-04-15］.http：//www.creader.com/news/20011219/200212190019.html.格式三基因工程实验任务分工格式四实验研讨记录  第二部分 基因工程实验技术与原理第一章　基因组DNA的提取

一、概述

基因组是指细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和，或原核生物染色体、质粒、真核生物的单倍染色体组、细胞器、病毒中所含有的一整套基因。基因组DNA提取的基本原理在于利用基因组DNA较长的特性，当加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到与细胞器或质粒等小分子DNA分离的目的。在DNA提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应在温和的条件下操作，混匀过程要轻缓，以保证基因组DNA的完整性。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，初始DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

基因组DNA的提取通常用于PCR模板、Southern杂交、构建基因组文库（包括RFLP）等。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。无论何种生物基因组DNA，其提取方法基本可分为两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的方法，去除蛋白、RNA及其他大分子，再用乙醇沉淀出DNA。提取基因组DNA总的原则包括：（1）保证核酸一级结构的完整性；（2）其他生物大分子，如蛋白质、多糖、酚类、脂类分子的污染应尽量降到最低；（3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；（4）其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

二、基因组DNA的常用提取方法

1.CTAB法（植物DNA提取经典方法）

原理：CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（＞0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。该方法所需其他主要试剂还有：Tris-HCl（pH8.0）2＋2提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA可螯合Mg或Mn＋，从而抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，并存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧化剂，可有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

基本实验流程：

2.SDS法（动物DNA提取经典方法）

原理：SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，释放出核酸。提高盐（KAc或NHAc）浓度并降低温度（冰浴），可使蛋白质及多糖杂质沉4淀，离心后除去沉淀。上清液用酚/氯仿/异戊醇反复抽提除去蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。然后用RNase除去RNA即可得到较纯的DNA。

基本实验流程：

三、其他提取方法

1.根据细胞裂解方式的不同划分（1）物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。（2）化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法。（3）生物方式：酶法。

2.根据核酸分离纯化方式的不同划分（1）吸附材料结合法：硅质材料：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱，快捷高效。阴离子交换树脂：低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱，适用于纯度要求高的实验。磁珠：磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。（2）浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离。（3）有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用。（4）密度梯度离心法：利用内容物密度不同的原理分离各种内容物。

四、研讨题

1.基因组DNA提取的基本步骤及总原则是什么？

2.CTAB法和SDS法提取基因组DNA的共同点和不同点是什么？

3.DNA提取后跑电泳出现多个条带，分析其原因。

五、主要参考文献

［1］刘进元.分子生物学实验指导［M］.北京：清华大学出版社，2002.

［2］郝福英.分子生物学实验技术［M］.北京：北京大学出版社，1999.

［3］李钧敏.分子生物学实验［M］.杭州：浙江大学出版社，2010.

［4］朱旭芬.基因工程实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［5］［美］J.莎姆布鲁克著，黄培堂译.分子克隆实验指南（第三版）［M］.北京：科学出版社，2005.第二章　质粒载体

一、质粒概述

质粒（plasmid）是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质，为双股闭合环形的DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必需的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代，也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。质粒的复制和转录需利用宿主细胞编码的酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。天然质粒大小约1kb～200kb，F质粒（又称F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（产大肠杆菌素因子）等都是常见的。图2-2-1是常用的人工质粒pUC19。图2-2-1　pUC19质粒图谱

二、质粒的复制

质粒DNA携带有自己的复制起始区以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA外进行自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数不同，如pUC质粒拷贝数多达几千个。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000～3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40%～50%。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性。但利用不同复制系统的质粒，则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

三、质粒载体的构建

可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

人工构建的质粒根据其功能及用途分为：（1）基因扩增的质粒：拷贝数达到每个细胞数千。（2）测序质粒：高拷贝数、加装测定顺序所必需的序列。（3）整合质粒：带有整合酶，会识别基因组特定的位点整合自身的序列。（4）穿梭质粒：能在两种不同的受体细胞中复制。（5）表达质粒：使外源基因能在受体细胞内高效表达。（6）探针质粒：筛选克隆或寻找基因元件，它通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。

四、质粒载体的提取

从细菌中分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在提取质粒过程中，除了超螺旋形式的共价闭环质粒DNA（Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA（Open circular DNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（Linear DNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。三种形态质粒电泳图见图2-2-2。图2-2-2　质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图

1.碱裂解法提取质粒DNA

染色体DNA和质粒DNA均为共价闭环分子，但染色体DNA比质粒DNA大得多。当用碱处理DNA溶液时，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，而质粒DNA虽也变性，但在回到中性pH时即可立即恢复其天然构象。变性的长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，通过离心将两者分开，再通过乙醇沉淀即可分离到质粒DNA。

碱裂解法提取质粒流程图：

2.煮沸法提取质粒DNA

染色体DNA和质粒DNA均为共价闭环分子，但染色体DNA比质粒DNA大得多。当加热处理DNA溶液时，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，质粒DNA虽也变性但在冷却时即恢复其天然构象。变性长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，通过离心将两者分开，再通过乙醇沉淀即可分离到质粒DNA。煮沸法提取质粒流程图：

五、研讨题

1.质粒载体区别于天然质粒有何特性？

2.质粒DNA和基因组DNA提取有何异同？

3.质粒DNA提取过程中利用何种特性将它与染色体DNA分开？

六、主要参考文献

［1］李钧敏.分子生物学实验［M］.杭州：浙江大学出版社，2010

［2］梁国栋.最新分子生物学实验技术［M］.北京：科学出版社，2001.

［3］朱旭芬.基因工程实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［4］J.莎姆布鲁克［美］著黄培堂译.分子克隆实验指南（第三版）［M］.北京：科学出版社，2005.

［5］Williams R J.Methods in Molecular Biology［M］.Humana Press，2001.

［6］郝福英.分子生物学实验技术［M］.北京：北京大学出版社，1999.第三章　PCR基因扩增与引物设计

一、PCR原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR），1983年由Dr.Kary B.Mul-lis发明，是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。PCR技术操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面均得到了广泛的应用。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性（denature）：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（anneal）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸（extension）：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环：变性-退火-延伸这三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍（见图2-3-1）。图2-3-1　PCR反应示意图

二、PCR反应中的主要成分

1.引物

PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。PCR反应中引物浓度为0.1～0.5μmol/L，引物与模板的摩尔比至少为108∶1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。

2.4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）

dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0～7.5，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L，并分装小管，于-20℃存放，过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTPs浓度应在20～200μmol/L。dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错配误差。2＋

3.Mg浓度2＋

Mg浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真2＋2＋实性，Mg浓度过低，会显著降低酶活性。Mg浓度过高又使酶2＋催化非特异性扩增增强。Mg影响引物退火和解链温度，影响产物2的特异性以及二聚体的形成等，从而影响扩增片段的产率。通常Mg＋浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～2＋2＋5 mmol/L的递增浓度Mg进行预备实验，选出最适的Mg浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少高浓度的带负电荷的基团，如磷酸2＋2＋基团或EDTA等可能影响Mg浓度的物质，以保证最适Mg浓度。

4.模板

模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度，一般反应中的25模板数量为10～10个拷贝，对于单拷贝基因，就需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

5.TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30分钟，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量，工作浓度常用2.5～5U。TaqDNA聚合酶在75～80℃具有最高的聚合酶活性。75～80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上；55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒；温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。

TaqDNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性，没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应，此酶的错配率为0.1%～0.25%。TaqDNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性时，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。

6.PCR反应的缓冲液

反应缓冲液一般含10～50mmol/L Tris-HCl（20℃下pH值8.3～2＋8.8）、50mmol/LKCl和适当浓度的Mg。另外，反应液中可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/mL的牛血清蛋白（BSA），它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

7.其他因素

热启动：提高扩增的特异性。

添加剂：消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进DNA复性时的特异配对，增加或改进DNA聚合酶的稳定性。

液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却及反应成分的改变。

三、影响PCR反应的因素

1.预变性

第一轮循环前94℃预变性5～10分钟非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动，可减少聚合酶在低温下仍有活性，从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

2.循环中的变性步骤

循环中一般94℃、30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

3.引物退火

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。实际使用的退火温度比扩增引物的T值约低5℃。m一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。

对于20个核苷酸，G＋C含量约50%的引物，选择55℃作为退火温度的起点较为理想。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，即将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃进行，接近于Taq酶最适温度75℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。1kb以内的DNA片段，延伸时间1分钟。3～4kb的靶序列，需3～4分钟。扩增10kb需延伸至15分钟。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。

5.循环数

当其他参数确定之后，循环次数取决于DNA浓度。大多数PCR含25～40个循环，过多易产生非特异扩增。

6.最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5～15分钟.使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链，以获得尽可能完整的产物，对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

四、引物设计

1.引物设计的原则（1）引物长度：15～30bp，常用为20bp左右，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。（2）引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段。（3）引物碱基：G＋C含量以40%～60%为宜，G＋C太少扩增效果不佳，G＋C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列。（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。（5）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（6）引物5′端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上合适的酶切位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5′端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。（7）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。（8）简并引物应选用简并程度低的密码子，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

2.引物设计的操作流程（1）引物的设计以及初步筛选

引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成，目前运用软件Primer Premier 5或美国whitehead生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。

Primer Premier 5和Oligo 6可以在www.bbioo.comsoft下载，Primer 3的下载主页位置在http://www.broadinstitute.org/genome＿software/other/primer3.html。（2）引物的二次筛选

引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步骤应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在GenBank中进行回检。也就是把每条引物在比对工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的blastn中进行同源性检索，弃掉与基因组其他部分同源性比较高的引物，避免有可能形成错配的引物。一般连续10bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3′端应避免连续5～6bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点（如http://genes.mit.edu/GENSCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser软件），然后弃掉正好位于剪接位点的引物。（3）引物的最终评估

经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR扩增对引物进行最终的评估。一是PCR扩增的特异性和效率。经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即有无目的条带之外的多余条带。另外，PCR产物的量是否足够，即有无不出带和条带很弱的现象。二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。如果相差大于100bp，有可能是错配产物。三是是否形成引物二聚体带。（4）用比较基因组学分离新基因

扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点：①模板的选择。如果以DNA为模板设计引物，首先在GenBank中找到与待分离新基因同源的其他物种的该基因。利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的Blast工具和http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa的ClustalW2工具把已检索到的基因进行同源性比较，根据比较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物（如小鼠）保守功能基因DNA序列设计引物，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于2bp，特别是3′端必须完全同源。如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的ESTs重叠群为模板设计引物，要求ESTs与信息探针之间同源性大于80%，长度大于100bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。②引物序列最好位于相邻的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接处25bp以上，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

3.常用的引物设计工具

primer Premier：序列分析与引物设计，非常棒的一个软件。

Oligo：引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析，同时计算核酸序列的杂交温度（T）和理论预测序列二级结构。m

Primer Designer：免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。

Array Designer：DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。

Beacon Designer：实时荧光定量PCR分子信标（Molecular beacon）及TaqMan探针设计软件。

NetPrimer：JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行。

FastPCR 6.0.165b2：快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具。

The Primer Generator：在线引物设计程序。网址：http://www.hopkinsmedicine.org/。

Primer 3：比较有名的在线引物设计程序。网址：http://frodo.wi.mit.edu/primer3/。

Primo Pro 3.4：在线PCR引物设计JAVA系列软件。网址：http://www.changbio-science.com/primo/

Primer-BLAST：NCBI基于Primer3 and BLAST的在线引物设计软件。网址：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK＿LOC＝Blas-tHomeAd

AutoPrime：快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件。网址：

http://www.autoprime.de/AutoPrimeWeb

五、NCBI网站介绍及碱性磷酸酶基因的引物设计

NCBI为National Center of Biotechnology Information的简称，中文名称为美国国家生物技术信息中心，由美国国立医学图书馆（NLM）于1988年11月4日建立。该中心的主要任务为：为存储和分析分子生物学、生物化学、遗传学知识创建自动化系统；从事研究基于计算机的信息处理过程的高级方法，用于分析生物学上重要的分子和化合物的结构与功能；促进生物学研究人员和医护人员应用数据库软件；努力协作以获取世界范围内的生物技术信息。

NCBI提供检索的服务包括：

1.GenBank（NIH遗传序列数据库）

一个可以公开获得所有的DNA序列的注释过的收集。GenBank是由NCBI受过分子生物学高级训练的工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库的。它同日本和欧洲分子生物学实验室的DNA数据库共同构成了国际核酸序列数据库合作。这三个组织每天交换数据。其中的数据以指数形式增长，最近的数据为它已经有来自47000个物种的30亿个碱基。

2.Molecular Databases（分子数据库）

Nucleotide Sequence（核酸序列库）：从NCBI其他如Genbank数据库中收集整理核酸序列，提供直接的检索。

Protein Sequence（蛋白质序列库）：与核酸类似，也是从NCBI多个不同资源中编译整理的，方便研究者的直接查询。

Structure（结构）：关于NCBI结构小组的一般信息和他们的研究计划，另外也可以访问三维蛋白质结构的分子模型数据库（MMDB）和用来搜索和显示结构的相关工具。

MMDB（分子模型数据库）：一个关于三维生物分子结构的数据库，结构来自于X-ray晶体衍射和NMR色谱分析。

Taxonomy（分类学）：NCBI的分类数据库，包括大于7万余个物种的名字和种系，这些物种都至少在遗传数据库中有一条核酸或蛋白质序列。其目的是为序列数据库建立一个一致的种系发生分类学。

3.Literature Databases（文献数据库）（1）PubMed：是NLM提供的一项服务，能够对MEDLINE上超过1200万条的20世纪60年代中期至今的杂志引用和其他的生命科学期刊进行访问，并可以链接到参与的出版商网络站点的全文文章和其他相关资源。（2）PMC/PubMed Center：也是NLM的生命科学期刊文献的数字化存储数据库，用户可以免费获取PMC的文章全文，除了部分期刊要求对近期的文章付费。（3）OMIM（孟德尔人类遗传）：有关人类基因和无序基因的目录数据库由Victor A. McKusick和他的同事共同创造和编辑的，由NCBI网站负责开发，其中也包括对MED-LINE众多资源和Entrez系统的序列记录，以及NCBI中其他有关资源的链接。（4）Books：NCBI的书库不断收集生物医学方面的书籍，提供这些书籍的出版信息、摘要、目录和全文的链接，用户可以直接在检索文本框内输入一个观念就可以查询。

4.NCBI提供的附加的软件工具

开放阅读框寻觅器（ORF Finder）、保守域检索（Conserved Domain Search Service）、载体序列检索（Vector Alignment Search Tool）、有机小分子生物活性数据检索（PubChem Structure Search）、引物设计及分析（Primer-BLAST）等，所有的NCBI数据库和软件工具都可以从WWW或FTP来获得。NCBI还有E-mail服务器，提供用文本搜索或序列相似搜索访问数据库一种可选方法。NCBI网站上还提供了一些诸如研究热点问题、研究小组情况、教育培训、联系方式等信息，还提供了到NIH、NLM等的链接。

我们将以枯草芽孢杆菌的碱性磷酸酶为例讲解如何在NCBI网站查询基因编码序列以及对该序列进行限制酶切位点分析，然后根据相应的表达载体的多克隆位点选择合适的酶切位点进行引物设计。（1）碱性磷酸酶编码基因序列查找

NCBI的网站地址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，点击进入该网站，新版的界面如下：

枯草芽孢杆菌英文单词为Bacillus subtilis，碱性磷酸酶为alkaline phosphatase。

在Search栏选择protein数据库，搜索词为Bacillus subtilis and alkaline phosphatase。

图示如下：

点击即可进入Protein数据库中已有的Bacillus subtilis的碱性磷酸酶的有关信息。如下图所示：

结果显示了有1003条相关信息，每条相关信息包含了该蛋白质序列的长度大小，Gen-bank登录号以及该蛋白质序列对应的唯一的序列编号，即GI号。由于我们要查找的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis AS 1.398在NCBI上还没有登录碱性磷酸酶的相关序列，所以我们选择了Bacillus subtilis的另一个亚种Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.168，点击上图中右边TOP Organisms［Tree］项目栏中的Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.168（22）进入下图，数字（22）代表了有22条相关参考信息。

我们选择了第三条信息，alkaline phosphatase A［Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168］，该序列有461个氨基酸，序列登录号为NP＿388822.2，在Protein数据库里的序列编号GI为255767221。

点击第三条信息后进入以下界面：

此界面主要介绍了该碱性磷酸酶蛋白质序列的序列登录号、氨基酸长度大小、序列提交时间、名称定义、序列版本、序列来源菌株，有关该序列的参考文献、作者文章题目杂志等，最重要的一项是该序列对应的编码序列即CDS，如下图，点击该处可以得到该蛋白质序列的相对应的编码核苷酸序列。

点击上图中的CDS就可以得到碱性磷酸酶的全长基因编码序列了。

试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]

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