作者：董汉平 等
出版社：石油工业出版社
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内源微生物采油技术论文集试读：
前言
随着油田开发程度的逐步加深以及经济发展对石油需求的不断增大，当今油田开发面临的一个重要问题是怎样提高已开发油田的采收率。我国油田普遍采用同步注水开发方式进行开发，改善水驱、三次采油及微生物采油技术（MEOR）都是提高水驱油田采收率的强化采油技术。
微生物采油技术从19世纪20年代就开始受到国外学者的关注。1975—1990年以来，先后在美国、苏联、加拿大、英国、罗马尼亚、澳大利亚、中国、德国等国家进行了理论研究和现场试验工作，处于蓬勃发展阶段。大量矿场试验说明，微生物采油技术可以有效提高石油采收率。
微生物采油技术主要有两种方式：一是以美国为代表的将筛选出的菌种在地面培育后同营养液一起注入油藏，利用其代谢产物提高石油采收率；二是以苏联为代表的内源微生物采油技术，通过往油藏注入营养液和空气，激活油田注水过程中在地层内形成的稳定的微生物群落，以达到提高石油采收率的目标。
我国油田的MEOR技术始于20世纪80年代，以外源微生物采油技术研究、试验及引进为主。2000年以来，在与俄罗斯合作研究试验基础上，结合国内油田实际，开始了内源微生物采油技术自主研发的新阶段。
目前，我国相当一部分油田进入注水开发的后期，地层中已经形成了稳定的微生物群落，微生物提高石油采收率具有较大的开发潜力，仅中国石油天然气股份有限公司各油田适合微生物驱的储量约为855.09×10t。同时，该技术具有成本低、施工简便、环境友好和适用范围广等优点，是一种经济效益显著的驱油技术。为了加强内源微生物采油技术研究，中国石油天然气集团公司先后牵头承担了国家973项目“化学驱和微生物驱提高石油采收率的基础研究”和国家863项目“内源微生物采油技术研究”，形成了中国石油天然气集团公司、中国石油化工股份有限公司、北京大学、南开大学、华东理工大学等单位组成的攻关团队。通过联合攻关，在内源功能菌群驱油机理、新型培养技术、廉价长效激活剂的筛选、注采配套工艺技术、现场监测和效果评价技术等方面取得了一系列进展，并针对高含水、水驱稠油、聚合物驱后三类典型油藏，相继展开了油田矿场试验。部分试验区已见到了明显降水增油效果。
为了系统总结国家863项目取得的主要成果，更好地和国内外从事微生物采油技术的同行进行充分的交流，我们编写了本文集。本文集共收录论文63篇，由项目各课题负责人和科研骨干编写。论文分别从内源高效菌群的构建、内源微生物营养特征及激活剂筛选、内源微生物代谢作用机制、内源微生物物理模拟和数值模拟评价技术、矿场试验方案设计及效果评价等方面较系统地总结了内源微生物采油技术的进展，可供从事微生物采油工作的技术人员及有关院校师生参考。
本文集涉及多项内源微生物采油的先进技术，必将深化微生物驱油机理的理论认识，推进微生物采油技术合理应用，为我国油田稳产、保障能源供应作出贡献。
由于本文集涉及成果仅是项目研究的阶段成果，不当之处，欢迎指正。
本文集的出版得到了国家863项目（No.2009AA063504）的资助，在此表示感谢！编 者2011年12月油藏微生物群落结构研究综述李 彦 赵洁玉 汤岳琴 吴晓磊（北京大学工学院能源与资源工程系）
摘 要 本文描述了在油藏极端环境下，研究油藏微生物群落的目的及意义。系统阐述了目前国内外油藏微生物群落研究的方法，包括微生物人工培养的方法以及分子生物学分析方法。列举了在油藏环境中的几种主要的微生物类群，主要有石油烃降解菌、硫酸盐还原菌、产甲烷菌、硝酸盐还原菌等。并且对油藏微生物群落研究工作进行了展望：油藏微生物群落研究的日趋完善和深入，有利于更加有针对性和目的性地开展后续的油藏开采和石油污染治理工作。
关键词 油藏微生物群落 微生物采油 分子生物技术引言
我国是一个能源消耗大国，石油供需矛盾已经成为制约我国国民经济发展的重要因素之一。加之陆上主力油田已经进入中后期开发阶段，而目前通过一次、二次石油开采，仍然有大约60%的石油残留在地下无法被利用。因此亟须新的技术来提高石油产量和采收率。微生物三次采油技术具有成本低、适用范围广、环境相对友好等优点而备受重视，其实质是通过人为干预调整油藏微生物生态，逐步形成有利于提高原油采收率的油藏生态环境，通过微生物的代谢作用及代谢产［1］物的作用，最终达到提高石油产量和采收率的目的。研究油藏微生物生态对微生物提高原油采收率技术的发展具有重要的现实意义。其中，如何准确掌握油藏微生物群落结构的遗传多样性及动态变化，有的放矢地对油藏微生物群落进行调控成为该技术的核心所在。1 典型的油藏生态环境
油藏环境是一种典型的极端生态环境，油藏的温度、压力和矿化度比较高，温度一般为40～180℃，压力在几兆帕到数十兆帕之间，矿化度可达20%以上，过去一直认为是“生命禁区”。但随着油田的长期注水开发，一些营养物质及地面微生物的输入，逐渐形成了比较稳定的微生物群落。在厌氧、高温、高压、高矿化度和贫营养等极端的理化因子的长期作用下，造就了这些油藏微生物对极端环境条件的适应性和生存依赖性，形成了丰富的油藏极端微生物资源和基因资源［2，3］。
对于特定油藏，由于其复杂的理化因子综合作用的影响，形成的微生物群落也大相径庭。包括温度、矿化度、pH值、压力、溶氧浓［4］度和有机质含量等都会影响到微生物群落结构的组成。其中温度是油藏微生物分布的主要影响因素。微生物内生物分子的热不稳定性［5，6］的阈值决定了油藏微生物生长的温度范围。
油藏矿化度、pH值以及油藏压力、溶解氧浓度也是影响油藏微生物种群的重要因素。Orphan等人用克隆文库法和富集培养法研究了加利福尼亚州陆上和海上未注水高温油藏中的菌群分布，检测到的菌种主要为嗜热发酵菌、异养硫呼吸细菌和古菌，这一结果与厌氧富含硫和有机物的油藏环境条件相吻合。2 油藏微生物群落研究方法
对油藏微生物群落的分析主要可以分为：传统的人工纯培养的方法和现代分子生物学的分析方法。2.1 人工纯培养方法
传统的人工纯培养方法的具体步骤通常为：利用常规的培养条件和富集培养基将微生物从油藏群落中分离出来，通过对分离菌株进行［7，8］种类鉴别、计数和功能测试来了解油藏微生物群落结构。但是这种方法仅能培养极少数微生物（0.01%～1%），而且由于人工培养条件的选择性，检测到的微生物也是选择和富集后的结果，并不能完全准确地反映油藏中的真实情况。从而导致无法对油藏微生物群落进行准确、有效地调控，也无法高效地提高原油采收率。针对这些情况，提高微生物的可培养性已经成为微生物领域中新的研究热点，可以通过减少富营养的毒害作用，利用来自于油藏环境的物质作为基质，或者以多聚物为碳源，以及降低营养基质的浓度，从而改善微生［9，10］物的可培养性，油井中的嗜热球菌长期适应油井中营养匮乏的贫营养环境而更能耐受饥饿。也只有在模拟油井中极端环境的条件下，才能对这些微生物进行培养。此外，还可以通过加入调节微生物相互作用的信号分子来简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生［3］长繁殖的要求；在培养基中添加不同的电子供体和电子受体也可以提高油藏微生物的可培养性；以及利用微生物细胞分散法、延长培养时间等方法提高油藏微生物群落的可培养性。2.2 现代分子生物学的分析方法
现代微生物分子生态分析方法突破了纯培养瓶颈，能从分子水平上较为客观地揭示环境微生物的多样性，近年来在油藏微生物群落研究中的应用发展迅速，促进了人们对油藏微生物多样性的认识，成为人们分析油藏微生物群落结构的新工具。
目前测定微生物群落结构的方法主要包括：16S rRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）和末端限制性片段长度多态性技术（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）等。测定群落功能的方法主要包括：实时定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）、基因芯片技术（Geochip）和放射性同位素标记（Radiography）等。2.2.1 16S rRNA基因序列分析
细菌的16S rRNA基因分子的平均大小分别是1500bp左右，其基因内的可变区部分以不同的速率进化，通过测定16S rRNA基因全序列或大部分序列，并将测序结果在GeneBank中进行比较，确定样品中所含微生物群落的丰度以及多样性，同时它们携有的信息用于系统发育关系的分析。首先从油井水样中富集细菌并提取总DNA，然后设计细菌通用的或特异性引物，通过PCR的方法直接在油藏样品总DNA中扩增出16S rRNA基因，将这些片段的混合物构建到合适的克隆载体上，转化到受体菌中后筛选阳性克隆，进行序列测定，分析比对序列，从而鉴定样品中细菌的种类。较其他方法而言，16S rRNA基因［11］序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。但是这种方法需要耗费的工作量及资金都比较大，而且难以穷尽样品中所有的生物群落的多样性，无法对目标菌群进行原位和实时跟踪分析。2.2.2 变性梯度凝胶电泳技术
变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法运用到油藏微生物研究中是从油井水样样品直接提取总DNA，经PCR扩增得到含有某一高变区的目的DNA序列产物，通过DGGE得到带谱。因为DGGE带谱中的每个条带很可能就代表一个不同的微生物物种，所以DGGE带谱中条带的数量反映出该油藏中微生物群落中优势类群的数量。
该技术主要是基于核酸序列的不同而将片段大小相同的DNA序列分开。双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，从而使具有不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，结束电泳时，形成［12］相互分开的带谱。该技术可以快速对群落的变化迁移进行比较性分析，但是易受PCR偏差的影响，而且只能检测样品中丰度在1%～2%以上的微生物种类，属于半定量技术，需要辅助于克隆文库。佘跃惠等人通过用PCR-DGGE的方法对新疆克拉玛依油田一中区注水井及油井的微生物群落结构的研究发现了假单胞菌属（Pseudomonas）、硫酸盐还原菌属（Sulfate reducing）、氨基杆菌属（Aminobacter）等和拟杆菌纲（Bacteroidetes）的拟杆菌属（Bacteroides），为该油田下一步微生物提高原油采收率的现场应用［13］提供了很多有价值的信息。2.2.3 限制性内切酶片断长度多态性技术（T-RFLP）
限制性内切酶片断长度多态性技术（RFLP）主要是利用能识别特定的DNA序列的限制性核酸内切酶处理群落16S rDNA的PCR扩增产物，基于不同种群的16S rDNA序列的差异，将得到的长度和数量不同的DNA片段，用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并利用溴乙啶等荧光燃料进行显色，得到的特异性图谱来分析微生物群落结构。
近年来发展起来的末端限制性片断长度多态性技术（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）也是RFLP的一种，只是PCR扩增中使用的引物一端或两端带有荧光标记，酶切所得的末端片段被标记，电泳后通常只分析末端片段的种类、长度与数量。每一种长度的末端片段被认为至少代表一种微生物的基因型，因此可以反映对应的样品中的微生物群落的组成结构。由于使用了荧光或放射性标记，具有较高的灵敏度、方便快捷等特点，而且可以有效检测［14］到群落中相对丰度在0.1%以上的微生物类群。值得一提的是这种方法也是一种半定量的分析，需要结合克隆文库来对样品进行系统透彻解析。陈海鹰等用T-RFLP的方法分析了胜利油田沾3区块营养剂注入前后的微生物群落的变化，结果发现营养物注入后，T-RF的数量与丰度都有显著提高，且不同时期呈现出不同的群落结构。从而证明了T-RFLP方法是跟踪油藏微生物群落动态和对比分析群落结构的［15］有效方法。2.2.4 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术主要是根据那些已公布的、定位在不同分类等级的rDNA分子的特征位置，设计以rDNA为靶点的寡核苷酸探针，然后用荧光标记探针于原位鉴定单个细胞。目前这一技术主要应用于原核生物，可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置标示，甚至估算单个细胞在原位的生长速率。该方法研究油藏微生物生态的基本步骤为：（1）水样中细菌的富集；（2）样品细胞的固定；（3）用含荧光标记的16S rRNA寡核苷酸探针的杂交液处理固定好的细胞；（4）样品温育使标记探针和互补rRNA序列杂交；（5）杂交后洗去未杂交上的探针；（6）样品用荧光显微镜进行微生物鉴定和计数。Yumiko Kodama等人利用针对古生球菌属的特异性探针对被原油污染的地下水微生物群落进行了荧光原位杂交技术（FISH），对其中的古生球菌的多样性、丰度及活性进行了研究［16］。2.2.5 基因芯片技术（Geochip）
基因芯片（Geochip）技术是用一种高通量基因芯片，分析微生物群落，并研究其群落结构对生态系统的作用。该高通量基因芯片，囊括了参与主要地球化学循环（如碳循环、氮循环、金属抗性、有机物降解、硫循环和磷循环等）的微生物功能酶类的寡聚核苷酸探针编码。这样就可以通过已知碱基顺序的DNA片段，结合被标记的具有碱基互补序列的DNA或RNA，从而确定其相应的类别，并由此推断环境［17］样品中具有各种功能的微生物类群。
尽管目前针对16S rRNA的基因芯片还处在基础研究阶段，但随着16S rRNA/DNA技术的广泛应用，这类产品的市场化是必然趋势。Eliza-veta A Bonch-Osmolovskaya等人.对俄罗斯西伯利亚地区Samotlor油田高温油藏内的嗜热性微生物群落进行寡核苷酸微芯片（Microchip）分析，并针对嗜热菌和古生球菌设计探针，发现这些细［18］菌的分布比过去认为的更广泛得多。此外，采用实时荧光定量PCR的方法可以对某些特定功能的菌群进行准确定量，考察它们在原始样品中的含量。
随着现代生物技术的迅猛发展，焦磷酸测序技术、新一代高通量测序技术等新技术不断涌现，将会极大地扩宽油田微生物群落研究的深度和广度。其中建立在rRNA基因序列比对基础上的分析方法是相对成熟的。这些方法看似独立，实则相互影响互为补充，只有综合运用取长补短，才能深入说明油藏微生物群落的结构和功能。3 油藏中常见的微生物群落
经过对油藏的长期开发，不同的油藏形成了其特有的、稳定的微［19］［20］生物群落。早在1992年，Bernard等人通过对一些油藏分离菌的生理生化性质的研究发现，这些性质与当地油藏环境是密切相［21］关的。对现有的微生物菌群，微生物学家将其分为以下几类。（1）硫酸盐还原菌（Sulphate-reducing Bacteria）。
硫酸盐还原菌在油田污水回注系统和油层缺氧环境中广泛存在。SRB代谢产生HS酸性气体，可以提高地层压力，溶解碳酸盐岩层，2促进原油的释放和增大地层的渗透率。某些菌种还可以降解石油中的重馏分，改善原油的流动性能，提高石油采收率。但是，另一方面这类菌产生的气体中含有大量硫化氢，增加生产设施的腐蚀问题，并带来严重的生产安全问题。具有代表性的有嗜温硫酸盐还原菌，如脱硫弧菌属（Desulfovibrio）；还有嗜热硫酸盐还原菌，如脱硫肠菌属（Desulphfotomaculum）。（2）烃降解菌（Hydrocarbon Degrading Bacteria）。
烃氧化菌（HDB）可以通过自身的代谢作用产生分解酶，乳化原油，能降解C—C的正构烷烃，裂解重质烃类和石蜡，降低原油1030的黏度，改善原油的流动性能，提高原油采收率，还可代谢产生表面活性剂、聚合物、有机酸、醇类和二氧化碳等有利于驱油的产物。具有代表性的菌株有微球菌属（Micrococcus）、节杆菌属（Arthrobacter）、红球菌属（Rhodococcus）和盐杆菌属（Halobaeterium）等。这类细菌在注水井及近井底地带最为丰富，是注水油层中微生物食物链的启动环节。（3）产甲烷菌（Methanogenic Bacteria）。
产甲烷菌为严格厌氧菌，在低盐度到高盐度的中温油藏中都有产甲烷菌存在。一般认为高温高盐环境使得微生物群落急剧减少。筛选到的甲烷生成菌包括甲烷杆菌和甲烷八叠球菌，这类细菌处于油层生态系统的最后阶段，可以解除生物链的末端抑制，使得一系列的生化反应持续不断地进行。对微生物采油而言，油藏中产甲烷菌的生长繁殖可以促使发酵菌等微生物更好地生长繁殖。除上述微生物外，还有铁细菌、硫细菌、硝酸盐还原菌等。此外，还有绝大多数的未培养微生物。这些微生物菌落对石油的生产都有一定的影响。
根据微生物对油藏开采的利弊，微生物学家将油藏微生物划分为有利和不利于油藏开采的两种细菌群落。其中微生物对提高石油采收率的有益菌有：石油烃降解菌、脱氮菌、产甲烷菌；微生物对提高石油采收率的有害菌有：硫酸盐还原菌、铁细菌、硫细菌、腐生菌等。4 油藏微生物群落研究的发展趋势
随着现代生物技术的飞速发展，以及其在油藏环境研究中的不断渗透，油藏微生物群落正在将其真实的面容逐渐展示在人们的面前，由一开始人们心目中的“生命禁区”到现在逐渐被人们所认识，再到以后的完全被油藏微生物研究者所了解，并用于指导现场的微生物采油以及石油污染治理的开展。当然这其中也有许多应注意之处，比如在油藏开发过程中要尽量避免外源微生物对油藏土著微生物的“污染”，分析过程中将几种分析方法相互结合等，这样才能够使得油藏微生物的研究工作更加有的放矢，使得油藏环境中有益微生物发挥更好的作用，有害微生物的危害降到最低，微生物采油的优势得以更加高效、充分地发挥。参考文献
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21 向廷生，王莉，张敏.油藏微生物及其在石油工业中的应用.生物技术，2005，15（4）：87～90生物表面活性剂在采油生产中的研究及应用1，21121王兴彪 聂 勇 汤岳琴 吴 钢 吴晓磊12（ 北京大学工学院， 中国科学院生态环境研究中心）
摘 要 综述了生物表面活性剂用于石油开采的研究历史、采油机理、表面活性剂类型、菌株选育、影响活性的因素、菌种性能评价、表面活性剂在采油工程中的应用，同时比较了生物表面活性剂在石油开采中的优势和缺点。
关键词 生物表面活性剂 采油 应用引言
微生物在一定条件下培养，其代谢过程中分泌具有表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽、表面活性蛋白、磷脂、脂蛋白或中［1］性类脂衍生物等。这些物质同时含有脂肪烃链构成的非极性憎水基和极性亲水基。这种由细菌、酵母和真菌等多种微生物产生的具有表面活性的化合物称为生物表面活性剂（Biosurfactant）。生物表面活性剂能显著地降低表面张力、改善界面性质。和化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有选择性好、用量少、无毒、能够被生物降解、不对环境造成污染、可用微生物引入化学方法难以合成的新化学基团等优点。
对生物表面活性剂的研究来源于在采油和相关行业中的应用，由于它对生物表面活性剂的纯度和专一性要求不高，可用已生产好的生物表面活性剂注入地下或在岩层中培养微生物产生生物表面活性剂来［2］用于强化采油。我国油藏及储层类型多，原油性质变化大，地质条件复杂，对微生物驱油机理的研究非常重要。1 生物表面活性剂用于石油开采的历史
在提高石油采收率的技术中应用表面活性剂不是最近提出来的。1927年，L.C.Uren和E.H.Fahmy认为：“油与注入介质的界面张力和该方法所获得的采收率之间存在着明显的关系。界面张力降低，驱替效率提高”。同年，H.Atkinson提出使用皂的水溶液或其他水溶液，降低油与注入介质之间的界面张力，提高石油采收率并申请了专利。20世纪30年代初的专利中，De Croot曾提出表面活性剂有助于提高石油采收率。Blair和Lehman在1942年申请了有关油井增产措施的专利，在石油开采文献中第一次提出了应用微乳液，即向生产井中注入透明［3］乳状液除去有害蜡固体的方法。1946年，Zobell首次进行了详细的微生物提高石油采收率的研究工作，此后陆续报道了美国、东欧、中国、马来西亚、阿根廷、澳大利亚和中东等国家和地区成功的实验［4］研究和矿场试验。1959年，Holm和Bernard发表专利，建议采用溶有0.1%～3%的表面活性剂的低黏度烃作为注入剂，以减少活性剂在亲水油层中的吸附。1967年，Jones提出了一项专利，介绍了在提高石油采收率时，采用较高表面活性剂浓度的水溶液体系和胶束分散体系。1973年，壳牌石油公司的Hill等提出用水溶性表面活性剂采油，这一体系用于美国伊利诺伊州贝通油田的焦油泉砂层时，把表面活性剂水溶液与聚合物混合，采出了85%的残余油。由此可见，在这些提高石油采收率的研究中，生物表面活性剂的研究是重点内容。2 生物表面活性剂驱油机理
生物表面活性剂的驱油原理是通过加入表面活性剂直接降低油水界面张力，增加原油流动性，同时加大原油与岩石的剥离程度而提高［5］采出效率。一般采油用生物表面活性剂至少应具备以下条件：（1）能使原油与水的界面张力降至较低的程度，应低于0.001～0.01mN/m，具有适宜的溶解度、pH值、浊点和相持性；（2）可降低岩层对原油的吸附作用；（3）在储层的环境中，能长时间保持理化稳定性，耐温、耐盐性好，对电解质不敏感；（4）能与大部分的储层接触，提高驱油率；（5）影响油、水（或岩石）间的界面膜。同时，与岩石吸附量小、较大扩散速度等也应该在考虑范围之内。3 采油用表面活性剂的类型
国内外研究开发的采油用表面活性剂的类型主要有：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂，非离子—阴离子复合型表面活性剂以及高分子表面活性剂。不同类型的表面活性剂的［6］优缺点列于表1。表1 不同类型表面活性剂在采油中的优缺点比较4 采油用生物表面活性剂产生菌的研究
采油用生物表面活性剂的生产首先依赖于生产菌，不同生产菌产生不同的表面活性剂，或多种生产菌产生同一类表面活性剂。由于采油用生物表面活性剂对提取和纯化要求不高，因此研究主要集中在微生物筛选改良和培养上。微生物大部分来自自然界，主要来源于油藏［7，8］［9］及油污环境中。谢丹平等由一株以石油为碳源生长，并产生表面活性物质的假单胞菌XD21（Pseudomonas sp.XD21），通过正交优化得到了产生表面活性剂的最佳发酵条件，并测定了产生表面活性剂与原油降解的关系以及表面活性剂成分的鉴定。梁凤来等［10］从华北油田马二断块得到了烃降解细菌NX22，在油藏温度（87℃）条件下用人造均质岩心进行的物理模拟驱油实验表明，NX22菌适应地层条件，具有增采和改善原油性质的作用。宋茂勇等［11］从胜利油田污水中分离到一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）G31，该菌能产生有机酸和表面活性物质，可用于微生物采油。
现阶段对表面活性剂微生物的研究主要集中在从原油开采地土壤中分离选育生物表面活性剂的产生菌，即对于内源微生物进行研究和探索，然后对其进行培养并用于采油。根据生物表面活性剂对采油过程的作用，生物表面活性剂产生菌的筛选改良、优化培养条件（营养培养基和原油培养基）、优化条件产生生物表面活性剂的效率等方面将是研究重点。5 影响生物表面活性剂采油的因素5.1 采油用生物表面活性剂对微生物的影响
生物表面活性剂产生菌性能的研究，包括微生物的种类（筛选和改良）、营养培养基等对微生物的影响。目前在微生物提高石油采收率技术（MEOR）中应用的生物表面活性剂的生产菌主要是从矿井或［5～8］者矿区的土壤中分离选育的，并结合油藏及储集类型和原油的性质筛选最佳的内源微生源。对非内源微生物的研究还是一个新的领域，由于非内源微生物对环境的要求与特定油藏的实际环境存在难以预料的差异和不确定因素，所以这方面的研究虽已开始，但进展相对缓慢。5.2 油藏及储层类型和原油性质的影响
油藏及储层类型和原油性质对于微生物的筛选起决定性作用。这也是现阶段采油用生物表面活性剂的产生菌主要分离、选育自采油区的原因。即使同一种生物表面活性剂的产生菌对原油的降解效果在不同的油藏也不尽相同。5.3 其他采油用化学试剂及高压、高温、高盐的影响
在采油过程中会使用到各种作用不同的化学试剂，这些化学试剂在一定程度上影响生物表面活性剂产生菌的正常生长。化学试剂对微生物的影响主要是对微生物细胞结构的影响，一些具有表面活性的物质直接破坏细胞结构，使微生物死亡。另一方面，化学试剂与微生物细胞中的某些物质结合，使其丧失原有生化性能，不能正常代谢，最终导致死亡。高压、高温、高盐的条件使微生物生存的条件遭到破坏或使其不能正常地分泌生物表面活性剂，无法发挥作用。
在含化学试剂的地层水中，往往存在由自发突变而抵抗化学试剂的微生物。可以从产出液中筛选这些微生物，经过二次筛选得到采油用菌种既可以满足微生物采油的需要，又能抵制化学试剂的不利影响。也可以在工业菌种的培育中运用遗传学改造的技术对某个用于生物技术目的的菌株进行多方位改造，通过诱变和基因重组等改良得到抵抗化学试剂的微生物。5.4 生物表面活性剂及产气和产溶剂的梭菌在优化采油的协同作用
近年来，产气和产溶剂的梭菌已广泛用于溶剂的商业生产中，这些厌氧菌在发酵过程的初始生长期能够代谢产生H、CO、醋酸和丁22酸。当培养进入发酵的第二阶段时（即平稳期），在细胞代谢中有一个转变，产生溶剂，产生的溶剂有丁醇、乙醇、异丙醇和其他溶剂。这些气体及液体的代谢产物溶解在原油中使原油黏度下降，最终达到提高石油采收率的目的。在MEOR中，微生物产生的表面活性剂和所产气及溶剂的协同作用有利于原油的降解和降低原油的黏度，在采油［12］工程中有一定的使用价值。6 生物表面活性剂产生菌的性能评价
评价生物表面活性剂产生菌的指标为最大菌体浓度变化、表面张力降低幅度、代谢产物表面活性剂乳化原油能力及黏度的变化、培养液值、混合气体的量及组成、原油组分变化、降黏性能等。
室内筛选菌种的评价方法有：气相色谱分析，用于测定生成气体的组成和性能；原油黏度测定，用于测定发酵液的降黏作用；原油全烃色谱分析法、恩氏蒸馏法及族组成方法，用于测定原油发酵后组成和性能的变化；油水界面张力测定及有机酸含量分析，用于确定发酵液中微生物产生的活性代谢产物；岩心模拟驱油实验和高压模拟驱油实验，用于测定微生物提高石油采收率的程度。如果菌种能引起一个以上测定值的显著变化，则该菌种可以作为培养目标。有些复配物中虽然不引起测定值的显著变化，但也有可能有增效作用，故应根据实［13］验结果作出判断。7 生物表面活性剂在采油工程中的应用
生物表面活性剂具有起泡和消泡性能，以及较强的乳化及分散、防腐功能，可有效改变岩石表面的润湿性，有助于原油从岩石表面剥落。近年来，生物表面活性剂在提高采油量的应用上日益发展。在采油工程中的应用主要是利用微生物表面活性剂回收岩石层中的石油，作为石油三次收回剂提高石油采收率。
我国在微生物驱油上作了一定的研究，但主要是室内模拟。大庆［14］油田微生物驱油先导性矿场实验室选取了头台油田用一个五点法小型井网作为微生物驱油先导试验区，在菌种筛选、性能评价、菌种对油藏条件的配伍研究等方面进行了研究。结果表明，6个菌体在65℃下与头台原油共同发酵后，原油中轻组分增加，按参数ΣC/21ΣC计算的增加率为41.0%～97.0%，原油黏度（48.9mPa·s）下降2217.7%～44.2%。发酵液与原油间的界面张力（35.6mN/m）下降56.8%～66.3%。菌种尺寸最大为1.2～2.4μm，与头台油藏的渗透率相适应。在渗透率为0.559mD、0.581mD、0.590mD的两个均质、4个非均质人造岩心上，采收率提高6.08%、5.81%、4.60%，平均［15］5.81%。克拉玛依油田通过室内筛选复壮，选育出对克拉玛依稠油具有显著降黏作用的微生物菌种。室内降黏实验结果表明，菌种对稠油的降黏率可达70%，同时菌种可以改善稠油的流体性质。原油组分分析结果表明，菌种能够降解稠油中的非烃和长链饱和烃。并首次在克拉玛依油田进行了6口井的微生物吞吐开采稠油矿场试验，累［16］计增油865t。周玲革等从青海油田地层水中分离培养出4株微生物菌种，对其进行了耐温、耐盐性等检测，分析了微生物处理前后原油组分变化情况。结果表明，微生物菌种能适应青海油田温度及高矿化度地质环境，作用于原油后对原油中的长链饱和烃类物质有较好的降解作用，能使其分子链变短，并产生有机酸或石油羧酸盐类表面活性剂等低分子物质，使原油黏度、凝点及蜡含量均出现明显下降，改善原油流动性，提高石油采收率。吉林油田通过筛选微生物菌种、菌种分类、菌种性能评价等室内研究和微生物放大发酵工艺、注入工艺，综合评价微生物采油现场实验研究及试验效果，讨论微生物在地层中［17］的生长繁殖、运移及提高采收机理。大港油田应用微生物驱油的注入技术进行了大量现场研究和两个油田断块的试注，使注入工艺［18］得到逐步完善，形成了体系。近年来，国内在微生物驱油上的［19］［20］研究比较多，文留油田、河南油田、百口泉采油厂［21］［22］、新北油田等都进行了相关研究。现阶段主要是室内模拟，也有已经在采油井上试用，在提高采收率上取得了明显的效果。8 采油用生物表面活性剂在应用中的优势、劣势比较
生物表面活性剂也有其不足之处，如油层被生物体堵塞，使石油采收率甚至比不用表面活性剂驱油法更低，开采的油品质量下降等。另外，微生物进入地层后还可能发生如下变化：微生物不适应地层中高温、高压、厌氧等环境，很快丧失生物活性或死亡；微生物发生生理变化，如产生芽孢等，使其代谢活性低，不生长等；微生物进入底层后，适应了地层环境，并利用地层中一切可利用的条件进行生长代谢和繁殖，但由于地层中营养含量极少，需要依靠注入水不断提供新营养维持生存，这也是注水井近井地带易堵塞的原因。
尽管有以上困难，但由于石油属于不可再生资源，而伴随我国对石油矿藏的需求量不断加大，增加石油开采量和采出程度势在必行。采油用生物表面活性剂的应用在我国主要集中在微生物驱油上，对这个领域的研究是20世纪90年代中期开始的，现在大部分还处于室内模拟阶段，部分已应用于实际生产中。尤其是在三次采油上表现出比［23］其他三次采油方法明显的优越性，有很强的应用前景。采油用生物表面活性剂未来的研究重点集中在提高抗盐能力、增强耐温性能、降低成本以及获得高适应性菌株等方面。参考文献
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23 窦启龙，陈践发，王杰.微生物采油技术的研究进展及展望.天然气地球科学，2004，10：559～563石油烃微生物厌氧降解机制的研究进展聂 勇 方 卉 梁洁良 王兴彪 汤岳琴 吴晓磊（北京大学工学院能源与资源工程系）
摘 要 微生物提高石油采收率技术被认为是最具前途的提高石油采收率技术之一，而石油烃的微生物降解在该技术的应用中起重要的作用。微生物在厌氧条件下以硝酸盐、硫酸盐等作为电子受体，通过琥珀酸盐合成途径、脱氢途径等降解各种饱和烷烃和芳香烃，这些途径中烷基琥珀酸盐合成酶、苯酰琥珀酸盐合成酶、乙苯脱氢酶等起着关键催化作用。本文综述了国内外有关石油烃微生物降解途径和代谢相关基因的研究进展，主要包括饱和烃和芳香烃的厌氧降解机制。
关键词 石油烃 厌氧 降解引言
我国大多数陆上油井开采已经进入中后期，石油自主产量成为国民经济发展和战略部署的重大问题，因此如何提高采收效率、延长油井寿命成为石油工业界关注的热点。同时，如何治理长期开采所造成的生态和环境污染也成为研究的重点，它对于经济的可持续发展具有重要意义。微生物提高石油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR）技术是目前被认为最具前途的提高石油采收率技术之一，主要利用特殊微生物或者微生物的代谢产物作用于原油或地层，改善原油在地层中的流动性，通过调堵以扩大水驱波及体积等来提高石油开采量和采收率，具有操作简便、不伤害地层、不污染环境、产出液不需特殊处理等优点。针对我国的油藏特点（陆相沉积生油、稠油比例大等），MEOR技术在我国具有巨大的发展潜力，是一项具有长远意义的提高石油采收率的技术。
在地表环境中，人们发现微生物能够在好氧条件下降解原油中的烃类物质，因此在MEOR技术中，将含有氧气和营养物质的水注入地下被认为是必须的手段。这种方法的缺点也很明显，由于油井处于很深的地下，为缺氧环境，一旦外界供给的氧气和营养物质中断，石油烃的好氧代谢就会终止，影响MEOR的效果。同时大量的水和营养物质的注入不仅成本高昂，同时对环境和生态也会造成一定的破坏。
石油烃厌氧微生物降解的研究是近年国外新兴的快速发展的一个研究领域。随着从油田中陆续鉴定出具有厌氧降解石油烃功能的微生物，相关的机制被阐明，人们认识到石油烃的厌氧微生物降解将成为MEOR技术中新的手段。充分认识到厌氧降解的机制将为这一技术的应用提供充分的理论基础。1 石油烃的厌氧降解途径1.1 饱和烃1.1.1 甲烷
甲烷厌氧降解的发现源于对它在海洋深度分布的研究。从海底开始，甲烷浓度随着海水深度的降低逐渐减少，由于深海里的厌氧环境，这一现象暗示在深海里存在着甲烷的厌氧降解活动。研究人员通过对1313C含量的分析发现，海水中残余的甲烷富含C，暗示甲烷生物降解的可能性。而CO、HCO、CO在甲烷相对较少的区域，21314它们的C的含量也较其他区域少。外源添加C标记的甲烷到缺氧的深海中，能够检测到带有放射性的CO。这些结果进一步证实深海2中CH能够通过生物厌氧降解生成CO。然而迄今为止，还没有鉴定42分离出一株能够不用O作为电子受体独自氧化甲烷的微生物。研究2人员通过对海洋沉积物的研究发现，甲烷的厌氧降解由甲烷氧化古细［1］菌和硫酸盐还原菌协同作用完成。
在假设的模型中，可利用甲烷的古细菌（MUA）组成小团，外面包裹有硫酸盐还原菌（SRB）。由这两种细菌构成的“菌团”能够利用甲烷和硫酸盐生成CO和HS，总的反应式如下：22（1）
甲烷氧化的机制目前有两种假设，如图1所示，一种是利用还原等价物作为反应中间产物的代谢方式。在该假设模型中，H、甲酸2被认为可能作为还原等价物参与到甲烷代谢中；还有一个假设的还原等价物是电子穿梭体，它假设两种细菌紧密连接，电子通过细胞间隙相互传递而不发生扩散损失。另一种甲烷厌氧氧化机制是醋酸作为中间产物的代谢途径，在该模型中，MUA利用环境中的CO，将甲烷氧2化成为醋酸，醋酸通过细胞间传递到达SRB，被代谢生成CO，重新2［2］传递到MUA，形成CO循环。这两种假设目前都没有直接的证据2证实，而甲烷的厌氧代谢反应也被认为是产生甲烷反应的逆反应。图1 甲烷厌氧降解途径1.1.2 其他饱和烷烃
从20世纪40年代起，人们就开始关注石油烷烃的厌氧降解［3］
，研究发现在深海油井中，烷烃可以作为SRB的电子供体和唯一碳源。起初，一种不依赖于氧气的脱氢反应被认为是烷烃厌氧降解的起始反应。该反应中，烷烃脱氢产生双键，再经过水合反应后成为微生物能够利用的碳源。但是这一假设在后续的实验中无法重复和验证，人们对该假设产生了疑问。直到从油井和深海泥床中分离出能够以硫酸盐或者硝酸盐作为电子受体降解烷烃的微生物，烷烃代谢的机制才［4］逐步被解释清楚。通过对底物和电子受体的精确测量，分别提出了在硝酸盐还原菌（式2）、硫酸盐还原菌（式3）和产甲烷菌（式4）［2］中烷烃代谢的3种反应，以鲸蜡烷为例反应如下所示：（2）（3）（4）
研究表明，在SRB中，烷烃的厌氧降解都是开始于加C反应。通过放射标记示踪，SRB支链脂肪酸的甲基正是来自于烷烃末端的C。反应的起始是通过对烷烃第2个C原子的活化，C—H键被打开。而根据各烃类物质的C—H键能，第2个C原子的C—H键能要低于末端C原子的C—H键能，这也正好符合放射性示踪实验的结果。研究还发现，该起始反应也可发生于烷烃第3个C原子。目前至少已经证实一种代谢途径——琥珀酸盐途径（图2），烷烃的第2个C原子的C—H键打开，与外源的延胡索酸反应，生成烷基琥珀酸盐，烷基琥珀酸盐的继续代谢过程还没有完全阐明，但比较一致的观点是它参与到脂肪酸的代谢途径。图2 烷烃代谢的琥珀酸盐途径
另一个假设的代谢途径是烷烃的羧化反应，该假设认为两个外源的CO分子加入到烷烃的第3个C原子上，而末端的第2个C原子与第32个C原子的C—C键断裂，失去两个烷烃本身的C原子。反应生成脂肪-酸，直接参与到脂肪酸的β氧化途径中。但是该假设目前尚未取得直接的证据。
Widdel等人还发现，在无硫酸盐培养基中，以长链烷烃为唯一碳源严格厌氧富集沟渠底泥时，长链烷烃能够转化生成甲烷和CO气体2（式4）。随后他们将厌氧富集的产物重新接到新的培养基中时，发现该富集产物仍然具有将长链烷烃转化成为甲烷的能力。当在培养基中加入少量的硫酸盐时，该富集产物产甲烷的能力增强，推测是因为硫酸盐还原菌改善了产甲烷菌的生长条件。有趣的是，16烷、15烷等长链烷烃作为碳源时能够发生这种产甲烷现象，而癸烷、正己烷等短链烷烃作为碳源时，富集产物不能将之转化成甲烷。之前关于油井产甲烷的研究中，研究者推测油井中的烃好氧降解菌所产生的烃氧化产物如脂肪酸等可以被产甲烷菌群利用从而生成甲烷。Widdel等人关于长链烷烃产甲烷的报道却证明，即使是完全厌氧的条件下，长链烷烃［5］同样可以在产甲烷菌群的作用下产生甲烷。该发现为利用残油产甲烷的应用提供了直接的理论依据。1.2 芳香烃
比较烃类化合物C—H键能可以看出，断裂芳香烃C—H所需的能量远低于烷烃，芳香烃成为研究微生物厌氧降解石油烃的最方便的物质。根据苯环上烷基基团的类型和数目，芳香烃的代谢主要可分为两种方式，甲苯为代表的琥珀酸盐途径和以乙苯为代表的脱氢途径。下面详细介绍这两种代谢途径。
芳香烃的琥珀酸盐途径与烷烃的琥珀酸盐途径类似（图3），这种途径在SRB和硝酸盐还原菌中均有发现。对于甲苯和二甲苯，甲基的C—H键被打开，延胡索酸与之反应生成苯基琥珀酸。乙苯的琥珀酸盐途径开始于乙基第2个C原子的C—H键的打开，与延胡索酸生成琥珀酸盐。目前尚无证据证实琥珀酸盐途径能够发生于乙基苯乙基的第1个C原子上。苯基琥珀酸盐通过苯酰辅酶A转移酶的作用生成苯酰辅酶A。而苯酰辅酶A通过加氢和开环反应生成酯酰辅酶A，参与到代谢中。图3 芳香烃代谢的琥珀酸盐途径
乙苯还可以通过脱氢反应完成厌氧降解（图4）。在该途径中，乙苯乙基的第2个C原子的C—H键被打开，失去一个H并加上了一个羟基，生成苯乙醇。该反应同样适用于含有丙基或以上的苯衍生物。反应所生成的苯乙醇的后续代谢途径尚不清楚，至少可以证实SRB无法继续氧化苯乙醇。图4 芳香烃代谢的脱氢途径
苯是芳香烃中最为稳定的化合物，目前证实它可以通过不同电子受体进行代谢。然而迄今为止，尚未纯化出能单独厌氧降解苯的微生物，而根据16S rRNA分析，已经确定具有硫酸盐还原功能的菌团具有厌氧降解苯的能力。苯厌氧降解的代谢途径还不清楚，由于苯环C—H键断裂所需要的键能甚至高于氧化甲烷所需的能量，因此苯的初始代谢步骤可能有一种新的途径。
除了上述几种常见的代谢途径外，还存在其他一些途径，例如萘的羧化反应等，由于机制尚不明确，这里不做详述。2 石油烃厌氧降解相关基因的研究进展
多种基因被发现参与到石油烃的厌氧代谢中。2002年，Widdel实验室以EbN1为研究对象，通过加入乙苯刺激微生物，表达特异蛋白［6］
研究小组利用双向电泳技术和N-末端测序，得到了在乙苯刺激下能够特异表达的蛋白N端的序列。随后他们通过构建shotgun文库，对EbN1的全基因组进行测序，利用生物信息学方法分析ORFs，通过生物信息学分析的结果与特异表达蛋白N末端序列进行比对，筛选出7个特异表达基因。通过对相邻DNA的分析，得到了乙苯脱氢酶的相关基因和它们的排列（图5）。根据分析，乙苯脱氢酶共有3个编码基因（ebdA，B&C），其中ebdA是主要的酶催化位点，含有钼结合区域，ebdB和ebdC为乙苯脱氢酶亚基的编码基因。另外，还发现了ebdD基因，认为它是ebdA编码蛋白的分子伴娘，帮助ebdA蛋白的成熟和折叠。
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