作者：田野,王绿化
出版社：人民卫生出版社
格式: AZW3, DOCX, EPUB, MOBI, PDF, TXT
放射治疗中正常组织损伤与防护试读：
前言
放射治疗在恶性肿瘤治疗中发挥的重要作用已经被医学界同行认可并逐步被广大癌症病人所接受。在综合治疗条件下，各类精确放射治疗技术已经得到熟练运用，肿瘤患者生存率不断提高、生存期明显延长，追求更好的生活质量已经成为治疗中和治疗后关注的重点。但是，“放射线在杀死肿瘤的同时会对正常组织、器官造成一定程度损伤”这一问题在引起患者、家属甚至非放疗专业临床同道的担忧的同时，一定程度上也影响了放射治疗的选择和临床应用，而成为阻碍放射治疗可及性与提高肿瘤治疗效果的主要因素之一。
放射肿瘤学是一门临床交叉学科，它涉及的领域包括肿瘤学、放射医学与生物学、放射物理与技术学等方面。因此，在放射损伤发病机制、诊断与防治的临床、科研和教学工作中，需要对这些学科的理论与实践有较系统与深入的认知和熟练的运用。我国至今还没有这方面的书籍可供肿瘤学、放射治疗学、放射医学等相关人员学习、参考与使用。为此，我们邀请来自全国近二十家大学附属医院与科研院所在放射肿瘤学与放射损伤专业两个方面都具有丰富经验与深厚造诣的教授、主任们编撰了本书。
本书的安排与编写具有以下特点：第一，它涵盖了放射治疗相关的放射生物学、物理与剂量学、临床诊治与预防的各个方面。第二，既采用了近几年来国外本专业重要期刊、书籍所提供的文献资料，又融汇了各位作者本人的研究成果与临床工作经验。第三，从临床实践需求出发，突出了能够帮助与指导放射治疗临床工作的原则。本书力争达到对放射治疗相关的正常组织（器官）放射性副反应与并发症进行系统、全面、详实地阐述的目的。
但是，由于我们学术水平与工作时间有限，书中难免存在缺点与错误，请读者批评指正，以便再版时进行修订。
在本书出版之际，我们要感谢所有参编者付出的辛勤劳动，感谢张烨、陆雪官、胡春洪、惠周光等教授提出的意见与建议，特别感谢苏州大学附属第二医院放疗科的钱建军、赵培峰、徐美玲等同事在书稿收集、整理与审校等方面所做的细致而繁冗的工作。
本书的编写与出版得到了国家自然科学基金委（81773223、81803039）、江苏省科技厅（BL2018657、BK20180195）、江苏省医学创新团队（CXDT-37）、核工业集团公司青年英才工程、苏州市领军人才（62）等项目的资助。田 野 王绿化2019年1月第一章 放射损伤分子和细胞生物学机制
电离辐射对肿瘤和周边正常组织细胞的损伤效应及其受到微环境和体内外各种修饰因子的调节作用，是放射生物学的基础，其过程包括电离辐射在生物组织的能量沉积、生物物理反应、化学键断裂和生物大分子损伤以及一系列细胞学反应及其结局的分子调控。细胞是生命体的最小独立功能单元，细胞核DNA是电离辐射的靶分子，DNA损伤反应是电离辐射细胞效应的关键基础。此外，细胞质中的一些细胞器如线粒体、溶酶体、高尔基体等结构和功能变化，在放射细胞效应调节中也发挥了重要的作用。第一节 电离辐射导致的DNA损伤及修复机制
DNA分子是遗传的物质基础，确保其结构和功能的完整性对维持正常生命活动和物种特性延续至关重要。细胞核基因组DNA是电离辐射作用的关键靶，DNA损伤的类型和严重程度、细胞DNA损伤修复功能，是决定细胞放射敏感性的关键内在机制。正常组织细胞具备一系列高度进化保守而且近乎完美的DNA修复体系，从而维持机体的正常生理功能和遗传稳定性。细胞DNA损伤修复机制异常最直接的后果是改变细胞的放射敏感性。针对同一种类型DNA损伤，机体细胞通常具有互补的修复通路，或者互补的修复蛋白与调节分子。一、电离辐射导致DNA损伤
电离辐射是能够引起物质电离的带电或不带电粒子构成的辐射。带电粒子如α和β粒子可以与原子中的电子直接碰撞后将其击出，形成一个离子对，称为直接电离；不带电粒子如γ射线、X射线和中子引起的电离是与物质相互作用后产生的次级带电粒子产生的，称为次级电离。机体受到电离辐射作用后，发生化学键断裂或其他种类繁多的化学基团修饰反应，使生物大分子尤其是DNA受到损伤，引发生物化学和生物学级联反应。电离辐射对生物活性物质的作用有两个途径（图1-1-1）：一是直接作用于生物大分子如DNA，通过电离和激发使其发生化学键的断裂，造成分子结构的改变和生物活性的丧失，这种作用称为直接作用。二是射线与水分子相互作用，辐解产生自由基等活化产物，后者再作用于生物分子，引起其损伤，此类作用称为间接作用。射线的直接作用和间接作用是同时发生。在生物体内，由于水分子的大量存在，间接作用也具有重要的意义。图1-1-1 电离辐射对DNA分子的直接作用和间接作用
电离辐射致细胞DNA损伤包括DNA的单链断裂和双链断裂、碱基损伤、糖基损伤、DNA交联等多种类型，其中DNA双链断裂为危害最为严重的主要损伤类型。碱基损伤，可以发生在全部四种核苷酸碱基的不同位置，有由电离辐射引起的直接作用损伤，更多的是由辐射生成自由基诱发的损伤。电离辐射通过诱发自由基导致碱基损伤发生的位点和形式比较复杂、多样。此外，不同类型辐射对DNA损伤的效应会有差别，当细胞受到高传能线密度（linear energy transfer，LET）辐射如重离子、质子的照射时，会产生复杂的DNA簇集损伤（clustered damage），即在细胞双链DNA分子的局部小范围内产生包括断裂、碱基损伤等多种类型的DNA损伤的集合，由此增加了DNA修复的难度，产生更强的生物效应。
电离辐射引起DNA损伤的严重后果是导致细胞死亡，以及细胞遗传学变化即染色体数目和结构的异常（染色体畸变）和基因组不稳。电离辐射作用细胞的染色体数目畸变包括非整倍体（亚二倍体、超二倍体）和多倍体。染色体结构畸变有单体型畸变和染色体型畸变。前者包括单体裂隙、断裂和互换等；后者包括双着丝点、环、断片等非稳定性畸变和相互易位、倒位、缺失和插入等稳定性畸变。染色体稳定性畸变因能在体内长期保存，是许多恶性肿瘤发生的标志性信号。辐射诱发DNA损伤所导致的基因突变和染色体畸变，加剧了细胞基因组的不稳定性，导致细胞正常生长调控功能的丧失，促使细胞恶性转化，是二次肿瘤的生物学基础之一。受照射的癌细胞如果存活下来，由于电离辐射加剧了癌细胞的遗传不稳定性，有可能会发生放射抗性的表型变化。二、DNA损伤信号的细胞应答机制
针对各种形式的DNA损伤，细胞具有相应的信号感应和响应机制，随即触发系列的细胞学反应，包括基因转录调控、DNA修复、细胞周期检测点的启动和细胞自噬、凋亡等，发挥维持细胞存活和基因组稳定性的作用，或产生不良结局。
DNA分子损伤作为一种信号将激活细胞内一系列生化反应，引发多样性细胞放射损伤反应，其中的一个关键问题是DNA分子损伤信号在细胞中是被何种物质或分子识别并引发出下游的生化级联反应，这类识别DNA损伤信号的物质被称为损伤感应子和早期信号转导子。DNA损伤感应子（DNA damage sensor）是最先直接到达或接触DNA损伤位点并能识别损伤信号、启动细胞信号转导反应的物质。与之协同是信号转导子（mediator），即损伤感应器的功能伴侣，两者往往并存，难以严格区分。损伤信号转导子多具有激酶活性，将DNA损伤化学信号转变为生物化学修饰反应，激活下游的效应分子（effector）。损伤感应子一般还具有将DNA损伤响应蛋白招募到DNA损伤位点的功能。
通过生化、遗传和细胞学等分析手段，首先从酵母细胞中鉴定到了DNA双链断裂损伤的信号感应分子。芽胞酵母中的Rad24p被认为是一个最原初损伤感应分子，其与Rad17p·Ddc1p·Mec3p复合物结合，将启动DNA损伤后的细胞周期阻抑反应。Rad24p能与复制因子C多个亚基（Rfc2p-Rfc5p）形成稳定的复合物，而复制因子C能识别“引物-模板”结构，其功能是将增殖细胞核抗原（PCNA）招募到损伤部位。内含Rad24p的复合物作为损伤感应子，通过结合到双链或单链DNA损伤点，募集PCNA样信号感应复合物Rad17p·Ddc1p·Mec3p，或创立一个类似反应器样“车间”，激活下游的激酶或效应分子，如Rad53p。PCNA样蛋白Rad17p除能与Mec3p等形成异源聚合体外，还能自身结合形成同源聚合物（Rad17p·Rad17p），其结合位点不同于异源聚合位点，并且DNA损伤信号能增加这种同源聚合物的产生。Mec1p和Rad26p分别是芽胞酵母和裂殖酵母细胞中的人ATR同源物，拥有DNA损伤感应器特点，并具有磷酯酰肌醇蛋白激酶活性，其磷酸化作用底物就包括有被认为也是损伤感应分子的Ddc1p或Rad9p。DNA损伤感应机制从酵母到哺乳类细胞是高度进化保守的，虽然目前尚未在哺乳类细胞中确定很理想化的损伤感应子，但已了解到如下几个分子具有损伤感应子的部分特点，尤其在电离辐射致DNA双链断裂的损伤信号感应中发挥作用。（一）γH2AX
H2AX异组蛋白是真核细胞组蛋白的一个亚基，是染色质结构中核蛋白组分之一。电离辐射诱发DNA双链断裂，细胞中最早发生的生化反应事件之一就是H2AX蛋白的139位丝氨酸残基被磷酸化，形成的磷酸化蛋白即γH2AX。利用γH2AX单克隆抗体和免疫荧光杂交定位技术可观察到其特异定位于DNA断裂损伤位点，形成聚焦点（foci），即便mGy水平及极低剂量的照射，也能观察到诱发产生的γH2AX聚焦点。一旦DNA损伤消除（如被修复），该聚焦点就消失。γH2AX在损伤位点的出现，要早于其他的蛋白，而且位于DNA损伤位点的γH2AX还为招募其他DNA修复蛋白提供锚地平台，这些蛋白包括BRCA1、53BP1、MDC1、Nbs1和Rad51等。从一定意义上来说，γH2AX更像是在DNA损伤信号反应中扮演损伤感应子的角色。（二）Mre11复合物
Mre11复合物（MRN）目前被认为是真核细胞中最符合DNA损伤感应子特征的复合物，它是由Nbs1、hMre11和hRad50蛋白组成。Nbs1即人类隐性遗传疾病Nijmegen断裂综合征（NBS）易感基因产物，NBS患者对电离辐射敏感，为癌症高风险人群，和运动失调毛细血管扩张征（AT）患者有类似之处。有一个被称之为AT样失调症（A-TLD）是AT表型变化的温和变异型，即所表现出来的临床症状比较轻，其致病基因就是hMre11突变体，这种突变会影响hMre11基因的功能，但并不导致其完全失活。在细胞表型上，NBS细胞和AT细胞更为相似，如对电离辐射敏感、细胞周期检测点缺陷、野生型p53蛋白稳定性下降。NBS缺陷基因编码的蛋白Nbs1或p95，与hMre11和hRad50蛋白形成紧密结合的复合体。hMre11和hRad50是两个酵母蛋白的人类功能同源物，两者形成异源二聚体结合并稳定DNA双链断裂末端。酵母细胞中Mre11和Rad50蛋白参与DNA双链断裂的同源重组修复（HR）和非同源末端连接修复（NHEJ），它们与另一个蛋白Xrs-2p结合形成三元复合体，其中任一基因突变均显示出相同的表型改变，由此基本可以认定Nbs1就是Xrs-2p的功能同源物。
Nbs1蛋白结构上含有叉-头相聚（FHA）结构域和一个BRCT（BRCA1羧基端）结构域，这一点类似于其他DNA修复蛋白。细胞受到辐射作用后，hMre11、hRad50和Nbs1迅速在细胞核中共定位于DNA损伤位点，但在AT细胞或NBS细胞中就观察不到这种现象。同时，Nbs1又是ATM的磷酸化底物，而且磷酸化Nbs1只定位于DNA损伤位点，并不在细胞内扩散。研究发现，如果用一种野生腺病毒感染哺乳动物细胞，其中病毒蛋白E1b55K/E4能降解hMre11复合物，从而阻断了DNA损伤信号反应。如果用E4缺陷的腺病毒感染细胞，hMre11复合物的功能基本不受影响，此时的DNA损伤信号能诱发ATM和ATR激活等细胞DNA损伤反应。由此表明，尽管Nbs1是ATM的磷酸化底物，在DNA损伤反应中MRN复合物是处于ATM的上游，发挥DNA损伤感应子的功能。（三）Ku70/Ku80异源二聚体
一旦发生DNA双链断裂损伤，Ku70/Ku80异源二聚体就迅速结合到DNA断裂位点。Ku70/Ku80复合物有一个口袋结构，将DNA断裂末端套入其中，再被与ATM同属于PIKK激酶家族的DNA-PKcs亚基识别和结合，形成Ku-DNA末端-DNA-PKcs复合体，启动DNA双链断裂的非同源末端连接（NHEJ）修复。（四）MDC1和53BP1
MDC1（DNA损伤检测点蛋白1介导子）是一个染色质相关蛋白，含有FHA和BRCT结构域，通过FHA结构域与Mre11复合物结合，但这种结合是一种不依赖DNA损伤的行为。DNA损伤能快速诱发MDC1聚焦点的形成，如在电离辐射作用后1min内出现，而且与γH2AX形成共聚焦点，并包括另一个成分53BP1。53BP1是一个p53结合蛋白，其羧基端BRCT结构域是其DNA结合位点。
MDC1功能缺失，将产生类似于Nbs1的突变生化表型，包括ATM自磷酸化（1981位丝氨酸）与激酶活性降低。53BP1受到抑制，对Nbs1突变细胞来说，ATM自身磷酸化和ATM的激活受到明显影响；但对野生型Nbs1细胞来说，ATM活性将不受影响，但在DNA损伤位点会出现NFBD1/MDC1和Nbs1蛋白代偿性聚集增多。同样，MDC1结合到DNA损伤位点，为招募包括ATM在内的其他DNA修复蛋白提供了锚地平台。（五）BRCA1和BRCA2
BRCA1和BRCA2是人类乳腺癌的易感基因。BRCA1蛋白氨基端有一个环指结构，是介导蛋白间相互结合的结构域，另外，在其羧基端有一个BRCT结构域。细胞受到辐射作用时，BRCA1-RAP80-Abraxas复合物与DNA损伤位点的泛素化组蛋白结合，参与DNA损伤感应。同时，BRCA1与CtIP蛋白和MRN复合物结合（MRE11-RAD50-NBS1），感应DNA双链断裂损伤，开启DSB的同源重组（HR）修复模式。此外，BRCA1是通过与BRCA2和PALB2互作将HR修复蛋白Rad51招募到DNA损伤位点。BRCA1突变细胞，DNA损伤反应（DDR）信号过程异常、S和G2/M期检测点功能和同源重组修复缺陷。BRCA2缺陷细胞的周期检测点机制正常，但不能发生Rad51与单链DNA的结合，使同源重组修复异常。BRCA1和BRCA2缺陷，都表现出基因组不稳定性表型。三、DNA损伤的修复
DNA修复是一系列与恢复DNA结构的完整性与功能稳定性有关的DNA生物化学代谢反应，由于致损伤因子理化性质的不同，诱发的DNA损伤类型也有很大的差别，细胞中具有针对不同类型损伤的多种修复反应途径，在某些修复途径之间还存在交互重叠的反应。（一）直接修复
对DNA损伤最简单的修复方式是通过一步反应修复DNA损伤，把损伤点的序列恢复到原状。在有光的条件下光复活酶类可直接与损伤的DNA结合来扭转紫外线（UV）或化疗药物引起的DNA损伤。另一个直接修复酶是甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT），MGMT对修复甲基化损伤非常重要。（二）碱基切除修复
碱基切除修复（base excision repair，BER）是一个多步骤的修复过程，需要几种酶参与，主要是修复细胞内源性自发DNA损伤，如胞嘧啶的水解脱氨基、5-甲基胞嘧啶，以及简单烷化剂和电离辐射引起的某些简单类型碱基损伤。启动BER途径的关键修复酶是DNA糖苷酶，该类酶能识别并催化切割DNA分子中受损碱基与核糖基之间的糖苷键，将受损碱基释放出来，在DNA分子中产生一个脱碱基位点（AP位点），再由APE核酸内切酶在AP位点3’端切割磷酸二酯键，一个脱氧核糖磷酸二酯酶（dRpase）从5’端将AP位点的核糖基切除掉。DNA聚合酶Polβ修补缺口，同时也能切除5’无碱基的糖基，最后在XRCC1蛋白的参与下由连接酶LIG3连接后完成修复反应。
针对不同类型的碱基损伤，哺乳类细胞中存在多种DNA糖苷酶，它们具有高度进化保守性，如人MPG完全能够互补E.coli的alkA tag的突变表型，酵母细胞与人类细胞DNA糖苷酶之间的序列保守性达30%~50%。某些DNA糖苷酶只识别专门的碱基损伤底物（如尿嘧啶碱基），有些可识别多种碱基损伤底物，但AP位点形成以后的修复过程是共同的。
XRCC1（X射线修复交叉互补组1）是第一个从哺乳动物中分离出来的与电离辐射敏感性相关的DNA修复基因，其定位于19q13.2，32kb。XRCC-1基因缺陷细胞对DNA损伤事件敏感、单链断裂增加、姐妹染色体交换（SCE）频率比正常细胞高约10倍。（三）核苷酸切除修复与转录偶联修复
核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）在细菌、酵母和人类着色性干皮病（XP）细胞中被广泛的研究，它主要是修复外源损伤因素诱发的DNA碱基损伤。碱基切除修复只是切除受损碱基的“小修补手术”，而核苷酸切除修复是切除包括受损碱基上下游几十个碱基在内的“大修补手术”。
参与核苷酸切除修复途径的修复蛋白包括着色性干皮病患者的缺陷基因表达产物（XPA~XPG，即7个互补组基因）、ERCCs、复制蛋白A（RPA）、复制因子C（RFC）、增殖细胞核抗原（PCNA）和转录因子TFIIH等多达25个修复蛋白（表1-1-1）。
人类的NER系统相对复杂，大致可分为如下四个步骤①损伤识别：NER首先通过XPC-hHR23B复合物识别损伤碱基；②解螺旋和切割：由转录因子TFⅡH的亚基XPB-XPD将DNA解螺旋（约30bp），由XPA再确认损伤碱基、RPA与未损伤的链结合并稳定开放的DNA结构，然后通过XPG和ERCC1/XPF分别在受损碱基3’和5’切除一段约30个碱基的寡核苷酸；③修补缺口：在DNA聚合酶、RFC和PCNA的作用下，以正常的互补链为模板合成修补缺口；④连接：由DNA连接酶1连接断点，完成修复。
NER修复蛋白的命名有3大系列：①以仓鼠细胞UV敏感突变株切除修复交叉互补组（excision repair cross complement group，ERCC）命名；②以人类遗传性疾病着色性干皮病XP命名；③人类遗传疾病科卡因综合征（Cockayne syndrome，CS）命名。XP和CS患者有共同之处，即对UV敏感，但是XP患者患皮肤癌的风险性很高，而CS患者几乎没有患肿瘤的报道。至今所鉴定的XP细胞有7个互补组（XPA~XPG）和一个突变体，CS有2个互补组（CSA、CSB），任一基因的缺陷均导致UV敏感表型和NER缺陷。ERCC系列基因的分离鉴定是以仓鼠细胞UV敏感突变株为模型，通过转染人的基因组DNA或cDNA恢复突变细胞的UV抗性，从中克隆出人的DNA修复基因ERCC1~6。后发现某些XP蛋白和ERCC蛋白是同一种蛋白（表1-1-1）。表1-1-1 核苷酸切除修复途径的修复蛋白
上述核苷酸切除修复过程，是一种泛基因组核苷酸切除修复（global genome NER，GG-NER），这种修复的效率对于全基因组都是一致的。哺乳动物细胞中，还存在一种与基因转录活性状态相关联的核苷酸切除修复，即转录偶联修复（transcription-coulped repair，TCR-NER），其主要特征是活性转录基因的NER效率要明显优于非活性转录基因或沉默基因、基因转录链的修复要优于非转录链的修复。最先揭示这种修复现象的是美国Stanford University的Hanawalt和Bohr，他们通过实验比较了紫外线照射后CHO细胞中总的基因组DNA、处于活性转录状态的dhfr基因和不转录的dhfr基因5’端上游的DNA片段之间的DNA切除修复效率，发现这三者之间存在显著的差异，其中dhfr基因活性转录部分的嘧啶二聚体的切除修复异常活跃，8小时的修复量比总的基因组DNA和不转录部分的DNA要提高5~6倍。他们称之为DNA的不均一性修复。
转录偶联修复的关键是DNA损伤发生在转录基因或转录链时，RNA聚合酶Ⅱ在损伤位点受阻，立即有CSA和CSB结合并解除受阻RNA聚合酶Ⅱ、快速启动核苷酸切除修复反应，其后的解螺旋和切割及修复合成等步骤与上述泛基因组核苷酸切除修复相同。人类CSB基因编码蛋白有1493个氨基酸残基，分子量168kDa。后来证实CSB和ERCC6是同一种蛋白。通过同源比较发现，CSB蛋白属于SW12/SNF2家族。此家族所有蛋白均包含7个假想连续的DNA或RNA解旋酶结构域。除了解旋酶结构域外，CSB还包含一个酸性氨基酸链，一个甘氨酸富集区域，和两个假想的核定位信号序列。尽管在其结构中有着保守的结构域，CSB蛋白却并未表现出相应的解旋酶能力。就如SW12/SNF2家族的其他成员一样，CSB蛋白可能参与包括DNA修复在内的众多细胞功能如转录调控、维持染色体稳定性及染色质重构。
转录活性基因组中RNA聚合酶在DNA损伤处受阻时，在CSB蛋白的作用下形成RNA聚合酶-CSB-DNA-RNA四聚体，并进一步招募包括TFIIH核心亚基p62和XPB在内的修复因子，构建成一个修复“车间”。CSB可能通过招募蛋白因子参与DNA损伤位点的早期识别，由此来促进活性基因的修复。（四）跨越损伤复制机制
DNA复制过程中遇到碱基损伤时，还可通过启动跨越损伤复制机制（translesion synthesis，TLS），在不修复原损伤的情况下继续DNA的复制，结果是原来的损伤继续存在，新合成的DNA链可能是正确的也可能是突变的，这取决于所启用的跨越损伤复制的具体途径。两种跨越损伤复制机制：（1）DNA聚合酶的转换机制：
催化先导链DNA合成的聚合酶Polδ/ε在损伤位点受阻时，被可跨越损伤的聚合酶ζ-κ取代，继续DNA合成。这种途径产生的新生DNA具有很高的错误率。（2）模板转换机制：
滞后链DNA合成（冈崎片段）聚合酶Polα在损伤位点受阻时留下DNA单链缺口，通过同源链重组交换方式用未受损伤的新合成链填补。很显然，一些DNA同源重组修复蛋白如RAD52家族成员参与这一反应过程。这种机制新生的DNA是完全正常的。总之，不管新合成链是否正常，而原来的损伤仍然存在，因此具有很强的突变、甚至导致细胞癌变的倾向性。但这种细胞学反应过后，也可能还会继续启动其他DNA修复反应，如错配修复。（五）错配修复
错配修复（mismatch repair，MMR）是一种DNA复制后修复机制，主要是修复新合成DNA链上的错误。错配修复过程有4个主要的步骤：①错配碱基的识别；②修复蛋白的募集；③寻找错误碱基链的信号，切除含错配碱基的DNA链；④修补合成。参与错配修复过程的蛋白因子有多种，从细菌到人类有很高的同源保守性。人类至少有9个错配修复基因，分别为hMSH2（human MutS homologue gene 2）、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6、hMLH1（human MutL homologue gene 1）、hMLH3、hPMS1（human postneiotic segregation gene 1）、hPMS2。
DNA碱基错配有两种基本类型，一种是真正意义上的碱基错误配对如G-T，另一种是由于在一条链上插入或缺失一个或几个碱基而造成的无配对碱基环，它们分别由不同的修复蛋白复合物识别。人类细胞中hMSH2与hMSH6组合成异源二聚体hMutSα，主要识别碱基错误配对和单个无配对碱基环；hMSH2与hMSH3组合成异源二聚体hMutSβ，主要识别多个碱基插入或缺失产生的无配对碱基环。
人类MutL样蛋白存在两种复合物，分别是由hMLH1与hPMS2组合成异源二聚体hMutLα，和hMLH1与hPMS1组合成异源二聚体hMutLβ。其中hMutLα与hMutSα协同作用，参与碱基错误配对和单个无配对碱基环的修复；hMutLβ可能与hMutSβ协同作用参与多个无配对碱基环的修复。错配修复过程中对错误碱基链的切除和修补合成的蛋白/酶包括有聚合酶δ/ε、RPA、PCNA、RFC、核酸酶1（hEXO1）、内切核酸酶（FEN1）等，其中hEXO1可与hMLH1结合形成复合物。（六）DNA链断裂修复
DNA链断裂是电离辐射致DNA损伤的主要类型，包括单链断裂和双链断裂，DNA单链断裂修复过程相对双链断裂来说要简单。
1.单链断裂修复
对于DNA单链断裂而言，绝大多数哺乳类细胞都能快速高效率地修复，如电离辐射产生的单链断裂在受照后即刻就开始迅速修复，随后逐渐减慢，一般在1小时内修复可达90%，半修复时间大致为10~40分钟。
DNA单链断裂（SSB）的修补合成和重接关键在于断裂末端基团的化学结构，即需要3’端为磷酸基团和5’端为羟基基团。因此，单链断裂修复的启动首先是要识别断裂（缺口）点并对末端基团进行“修剪”，有3个关键的蛋白参与此修复反应步骤，即XRCC1、PARP和PNK蛋白，各自的功能是：（1）XRCC1是一个分子量为70kDa的蛋白，含633氨基酸残基，能识别和结合DNA单链断裂，因此被称为“缺口感应器”。XRCC1的羧基端含有一个BRCT功能结构域，能与连接酶Ⅲ、DNA聚合酶β和PARP等蛋白结合。（2）PARP是一个分子量为122kDa的蛋白，氨基端有DNA结合结构域、中部是自主修饰结构域、羧基端是催化部位，其主要功能是催化核蛋白的ADP核糖基化，此活性受DNA断裂激活。PARP与XRCC1结合参与DNA断裂修复的启动。（3）PNK（聚核苷酸激酶）负责将断点的3’端修剪为磷酸基团、5’端修剪为羟基基团。DNA断裂末端经过适当修剪后，由XRCC1/DNA聚合酶β进行修补合成，DNA连接酶3将断点连接。
2.双链断裂修复
DNA双链断裂直接破坏了DNA的结构完整性，被认为是最严重的DNA损伤类型，也是电离辐射所致DNA的主要损伤。DNA双链断裂未被及时修复时，DNA的复制和转录将被阻断，严重时导致细胞死亡。DNA双链断裂的错误修复或修复的不忠实性，将引起基因或染色体的缺失和重排性突变。
哺乳动物细胞中的双链断裂修复动力学过程可分为两个阶段，即早期的快速修复和随后的慢修复。快修复阶段可重接修复50%~70%甚至更高比例的DNA断裂，其半修复时间约为30分钟，而慢速修复阶段的半修复时间以小时计。不同细胞的修复水平有相当的差异，在体外实验中还可观察到细胞经长时间修复后还残留有一定量的双链断裂，这可能是造成细胞死亡的重要原因。
真核细胞DNA双链断裂修复通路有非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）、同源重组修复（homologous recombination，HR）和末端连接替代途径（Alternative end joining，a-EJ）等（图1-1-2），主要是NHEJ和HR修复通路。比较多的学者认为同源重组修复是酵母细胞中的主要修复机制，而非同源末端连接是哺乳动物细胞中的主导修复机制。但是近年来发现，同源重组修复在哺乳动物细胞中，特别是在晚S期和G期中发挥了重要作用。2图1-1-2 DNA双链断裂修复通路
同源重组修复是利用未受损伤的姐妹染色单体或同源DNA的遗传信息来修补断裂损伤的DNA，是一种具有高度保真性而且有效的DNA双链断裂修复机制。细菌中同源重组修复的关键蛋白是RecA，由它形成核蛋白纤丝启动同源DNA序列配对。酵母细胞中同源重组修复基因是属于Rad52附加位（epistais）基因组，包括有Rad50、Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57、Rad59、Mre11和xrs-2等。Rad51p的羧基端与RecA蛋白有约30%的同源性，Rad51p能与DNA分子形成核蛋白纤丝，这一点也与RecA有类似于之处。
有关人类DNA同源重组修复基因的研究，是依据同源保守性找到了部分酵母的同源基因/蛋白。另外，研究发现乳腺癌患者的遗传易感突变基因表达产物BRCA1和BRCA2也可能参与了电离辐射损伤的修复。实验表明BRCA1蛋白含有BRCT结构域，BRCA1和BRCA2可结合hRAD51，参与同源重组修复。
同源重组修复模型可概括为4个修复步骤：①DNA断裂的识别和断点“修剪”：由具有5’-3’核酸酶活性的hRAD50/MRE11/NBS1复合体结合在断点的3’端，切一个缺口，切除少数几个碱基，其作用依赖于CtIP蛋白。随后，在核酸酶EXO1的作用下，形成单链DNA末端，并结合RPA蛋白；②核蛋白纤丝的组装：由RPA推动核蛋白纤丝的组装，此蛋白复合体中包括有XRCC2、XRCC3、HsRAD51B、RAD51C和RAD51D。hRAD52具有激活纤丝组装的作用；③链的交换和DNA合成：可能在姐妹染色体联会介导因子（cohesins）的协助下寻找同源DNA，在hRAD51的介导下损伤DNA与同源双链DNA交换单链，利用正常的同源DNA作为模板，合成新的互补DNA链，形成了所谓“Hollidayjunction”；④交叉链的归位：即解除Holliday-junction。
同源重组修复主要是发生在晚S期、G期和M期早期阶段，是一2种无错误DNA修复机制。
非同源末端连接是哺乳动物细胞中一种很普遍的DNA双链断裂修复方式，其修复反应过程相对来说也比较简单。非同源末端连接反应中有6个核心修复蛋白，它们分别是DNA-PK复合物（Ku70、Ku80和催化亚单位即DNA-PKcs）、Artemis、XRCC4和DNA连接酶Ⅳ，其中任一基因缺陷或突变都会给细胞带来严重后果。
Ku70（XRCC6）和Ku80（XRCC5）蛋白首先识别和结合DNA双链断裂末端，其中Ku70和Ku80起到保护断裂末端的作用，DNA-PKcs启动DNA修复信号。DNA-PKcs是属于磷脂酰肌醇3激酶（PIKK）家族成员，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，属于同一家族的蛋白还有ATM、ATR蛋白等。当细胞DNA发生断裂损伤时，DNA-PK复合物就聚集到损伤位点上，随之蛋白激酶被活化，募集并磷酸化其下游的DNA修复蛋白如Artemis、XRCC-4和连接酶Ⅳ等，启动DNA链断裂的NHEJ修复。Artemis蛋白具有依赖于DNA-PKcs的内切核酸酶活性，以及不依赖于DNA-PKcs的5’外切核酸酶活性。XRCC4是一个38kDa蛋白，与DNA连接酶Ⅳ结合密切，体外实验中证明其能增强DNA连接酶Ⅳ的活性。DNA连接酶Ⅳ含有2个BRCT结构域，DNA连接酶Ⅳ通过这两个结构域与XRCC4相互结合，完成对断裂DNA的连接修复。
DNA双链断裂的HR修复是发生于S期后期和G及M早期，NHEJ2修复可发生于整个细胞周期中，修复通路的选择是受照射细胞DNA双链断裂修复机制调控重要内容，同样对细胞放射敏感性和基因组稳定性产生重要影响。由于HR是DSB的一种无错修复，细胞在正确时期正确选择HR修复，无疑更有利于细胞的恢复。细胞处于G期尚缺乏1同源的DNA模板，如果在此时错误的选择HR途径，无疑是致命的。相反，G期细胞如不能启动HR修复而过多依赖有错误倾向性的NHEJ2途径修复，很显然基因突变后果增加。
DNA损伤修复通路选择调节与细胞周期以及末端剪切形成单链DNA末端结构密切相关联。DNA双链断裂末端的3’单链DNA的形成，既是HR修复途径中RPA、Rad51纤丝形成和重组过程中同源DNA链的介入所必需，又对NHEJ途径有抑制作用，是DNA DSB的NHEJ和HR修复途径选择的关键控制点，核酸酶Exo1在此发挥作用。研究表明，DNA-PKcs在DNA损伤位点的存在，阻止了核酸酶Exo1与DSB结合，从而抑制了DSB的5’→ 3’切割和末端单链DNA的形成，及随后的同源重组修复。DNA-PKcs的这一作用受到其自身的磷酸化调节，不同位点的磷酸化会对DNA-PKcs的功能产生影响：如JK位点（T946和S1004）和T3950位点磷酸化，会抑制DNA-PKcs的NHEJ活性，转而促进HR修复。DNA-PKcs的ABCDE簇结构中的6个丝氨酸或苏氨酸残基位点发生自磷酸化，或被ATM磷酸化修饰，可导致DNA-PKcs发生很大的构象变化，促使DNA-PKcs从DNA断端解离，由此解除DNA-PKcs对DNA断裂末端单链切割的抑制作用。协同调节这一修复选择控制点的还包括Mre11-RAD50-NBS1（MRN）复合物，其进一步促进Exo1的招募和DNA-PKcs自磷酸化，促使细胞选择DSB的HR修复途径。
G期细胞中，P53结合蛋白1（53BP1）-RIF1结合DNA断点，阻1滞DNA断裂末端的单链切割，促使选择NHEJ修复。在修复通路选择中，53BP1和BRCA1是一个拮抗的关系。作为同源重组修复通路的核心蛋白，CtIP蛋白在受到照射损伤的G期细胞中被CDK激酶磷酸化，2然后结合BRCA1和MRN复合体，介导MRE11的核酸内切酶活性，执行DNA断裂末端的单链切割，促进同源重组修复的完成。第二节 电离辐射对细胞周期的影响一、细胞周期
细胞自一次增殖分裂结束开始生长到下一次细胞分裂终了形成新的子代细胞为止，所经历的过程称为细胞周期（cell cycle）。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配到两个子代细胞中。细胞周期的全过程分为间期与分裂期两个阶段。（一）间期
间期（interphase）阶段占据一个细胞周期循环中的大部分时间，为下一次细胞分裂做结构、功能和物质上的准备，如合成复制DNA、细胞体积增大等。间期又分为DNA合成前期（G期）、DNA合1成期（S期）与DNA合成后期（G期）三期。2（二）分裂期
细胞分裂期（mitotic phase）又分为前期、前中期与中期、后期、末期，一般历时1~2小时。在此过程中，发生了染色体形成和姐妹染色单体分离、中心体、纺锤体、中体等亚细胞结构的连续动态变化，以及调节有丝分裂过程的一系列蛋白在特定亚细胞结构上形成功能或结构复合体及共定位变化（图1-2-1）。图1-2-1 免疫荧光激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞有丝分裂过程中，磷酸化DNA-PKcs/pS2609与PLK1蛋白在中心体、着丝点、赤道板和中体等亚细胞结构上共定位
前期（prophase）自分裂期开始到核膜解体为止的时期，细胞染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体，在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。两个中心体（centrosome）向相反方向移动，在细胞中形成两极。而后，以中心粒随体为起始点开始合成微管，开始形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。在此期，核膜开始瓦解离散成囊泡状内质网；前中期（prometaphase）自核膜破裂起到染色体排列在赤道板上为止；中期（metaphase）细胞变为球形，主要过程是纺锤体的最终形成，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点（kinetochore）上，46条染色体均移和排列到细胞的赤道板上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，包括22对常染色体和2条性染色体（XY或XX）；后期（anaphase）通过纺锤体微管的运动，着丝点纵裂，每一条染色体的两个姐妹染色单体分开，染色单体遂分为两组，并以相反方向朝各自的中心体移动。与此同时，细胞被拉长，并由于赤道板部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形；末期（telophase），染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁，内质网囊泡组合为核被膜。细胞赤道部缩窄加深开始胞质分裂（cytokinesis），最后完全分裂为两个二倍体的子细胞。（三）G期或静息期细胞0
G期细胞是一群暂时离开细胞周期、停止增殖分裂亦不做分裂0准备的处于静息状态（quiescence）的细胞。处于G期细胞，其细胞0周期蛋白和周期素依赖性激酶消失、维系细胞周期运转的机器停止工作。G期细胞通常是终末分化的并执行特定生理功能的细胞。如肝0细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞、神经细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。但是，在某种刺激或应急状态下，这些细胞可能会重新进入细胞周期。体外培养的细胞当生长因子或营养缺乏而处于饥饿状态时，便停止分裂而处于G期状态。对于具有接触抑制生长特性的正常二倍体细0胞，在体外培养过程中随细胞的接触密度超过一定限度值，增殖速度下降，随即细胞增殖便停止下来，此时细胞就进入静息期。
值得注意的是静息期细胞与细胞衰老（senescence）都是停止增殖分裂的细胞状态，但两者存在实质上的差别。虽然许多G期细0胞是随同组织器官而走向死亡，但并非所有的细胞进入G期是必定0死亡的，只是由于缺乏任何的刺激而未能进入细胞周期中。细胞衰老就不同，它是细胞针对DNA损伤或降解所处的一种反应状态，致使一个细胞的后代丧失生存能力。另一点，细胞衰老不像静息期细胞，它是一种不可逆的细胞周期阻滞状态，直至细胞死亡。二、细胞周期检查点
细胞周期检查点（checkpoint）是细胞固有的一套暂停细胞周期进程、确保DNA结构完整性、DNA复制忠实性或姐妹染色单体分配准确性的内在检查机制。当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或DNA复制受阻或纺锤体结构缺陷时，这类调节机制就被激活，及时地中断细胞周期的运行，待细胞修复损伤或排除异常结构故障后，细胞周期才能恢复运转。因此，细胞周期检查点与DNA修复机制一样，在维持细胞的基因组和染色体数目稳定性中发挥重要作用。但持续延长的细胞周期阻滞，将导致细胞死亡的发生。
按照细胞周期进程的运行时间顺序，可将检查点分为G/S期1（边界）检查点、S期DNA复制检查点、G/M（边界）期检查点和M2期（纺锤体）检查点（图1-2-2）。很显然，发生在两个时相之间的交界点（G/S，G/M）检查点分别是阻止细胞由G期进入S期，或由121G期进入M期，避免受损DNA被复制或被转移给子代细胞。而S期检2查点是因复制叉处DNA合成复合体受阻而引发的，M期检查点是纺锤体装配异常或结构受损如微管蛋白被破坏而引发。根据激活检查点的诱因和调控内容，可分为DNA损伤检查点（G/S、G/M、DNA复制12检查点）和纺锤体结构检查点即M期检查点。图1-2-2 细胞周期及DNA损伤检查点和纺锤体结构检查点
有关细胞周期检查点机制的认识，最初很多是来自啤酒酵母或裂殖酵母细胞模型系统，酵母细胞DNA受到损伤时，可通过几个检查点机制启动细胞周期延迟或阻滞。哺乳类细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）家族成员，如ATM、ATR（AT和Rad3相关蛋白）和DNA-PKcs是调节能介导DNA损伤依赖的磷酸化事件，所不同的是ATM和DNA-PKcs主要是对DNA双链断裂损伤作出反应，即属于电离辐射损伤激活的PI3-K激酶；与此相反，ATR是被DNA大的损伤或复制叉受阻的信号如紫外线所致DNA损伤激活。高等生物与酵母细胞的另一个重要的区别是，p53蛋白在哺乳类细胞周期检查点的信号转导反应中发挥重要作用，而且无论是在DNA损伤诱导的暂时周期阻滞作用还是永久性阻抑反应直至凋亡发生，p53蛋白通过磷酸化激活多种信号转导蛋白或效应分子、扮演着不可替代的作用。而至今还没有发现酵母细胞存在类似p53蛋白的同源物。近期发现多个直接参与DNA修复的蛋白如BRCA1、DNAPKcs等在细胞G/M监测点和有丝分裂进程调节中发2挥重要作用。如DNA-PKcs缺陷会导致受照细胞G/M检查点缺陷、纺2锤体结构不稳定阻滞在M期。DNA-PKcs缺陷细胞在DNA损伤情况下，发生持续延长的M阻滞将导致细胞有丝分裂灾变死亡。三、电离辐射对细胞周期进程的影响及作用机制
细胞增殖分裂过程中，不断有序的由细胞周期的一个时相进入下一个时相循环往返，周期素（cyclin）和周期素依赖激酶（cycline-dependent kinase，Cdk）在此过程的调控中发挥了主导作用。周期素是一类小分子蛋白，在细胞周期过程中以振动方式循环交替的表达和降解。周期素通过结合激活周期素依赖蛋白激酶，形成Cyclin/Cdk复合物，推动细胞周期进程。Cdk的激酶活性是通过其磷酸化和去磷酸化来调节，也就是说细胞周期进程变化主要是通过调控Cdk激酶活性来实现的。DNA双链断裂是电离辐射诱发细胞周期时相进程改变的关键因素或分子信号。（一）G/S期阻滞1
在细胞由G期向S期行进的调控中，CyclinD与Cdk4或Cdk6结合1形成具有活性的复合物CyclinD/Cdk4/6，由其磷酸化pRB，促使转录因子E2F从pRB释放出来，激活CyclinE转录。CyclinE与Cdk2形成活性复合物，继而产生正反馈作用，进一步充分磷酸化pRB，增强E2F的释放，促使S期所需基因产物的大量转录生成，推动细胞由G期向1S期行进。
细胞受照后推动G/S进程的功能机制受到干扰，出现G抑制。11理论上，G抑制能使受照细胞获得时间来进行DNA修复。实验表明1G抑制与细胞内p53基因的存在状态有关。例如，p53基因为野生型1的正常小鼠成纤维细胞受2Gy或4Gy照射后，细胞呈明显的G抑制。1如用同源重组技术造成染色体上的野生型p53双缺失，则照射后不发生G抑制。在p53基因单缺失的小鼠细胞中，照射后呈现中间程度的1G抑制。又如在PKO细胞中原来表达的是野生型p53，照射后呈现G11抑制，如果细胞转染了突变型p53基因，则G抑制减弱。目前已发现1CIP多个下游基因受p53的转录调控，如Mdm2、p21、Gadd45、Bax、Fas等。Mdm2蛋白通过与p53蛋白的氨基端结合来介导后者通过泛素化-蛋白酶体途径降解。CIP
p21是现实p53的G/S阻滞调节功能的关键分子。p21是CDK1抑制因子，其转录受p53调控。在正常细胞中p21与增殖细胞核抗原PCNA、周期蛋白和CDK以四聚体形式存在，参与G/S转换的调节。1在通过基因剔除技术得到的p21缺失的小鼠上，辐射诱发的G抑制明1显减弱。
现已基本明确，G细胞发生DNA损伤时，至少可通过有两条机1制途径激活G/S期检查点，现实G期阻滞。11CIP
ATM/p53/p21途径是通过调节p53蛋白和其负调节分子Mdm2磷酸化来实现的。DNA损伤信号激活ATM，ATM一方面磷酸化p53和Mdm2，使两者解离，从而阻止了p53蛋白出核和泛素化降解。另一方面，ATM磷酸化激活Chk2，后者也可磷酸化p53，增加稳定性。CIPCIPp53蛋白水平上升，激活包括p21在内的靶基因的转录。而p21是Cdk抑制剂，能与CyclinE/Cdk2和CyclinD/Cdk4/6复合物结合，从而阻滞细胞的G/S期进程。此调节过程涉及基因转录的激活，通常需1要2~3h才能实现，因此，是一个慢的细胞周期调节机制。
ATM/Chk2/Cdc25a途径是通过磷酸化和泛素化等翻译后修饰机制实现的，是一个快速调节反应。ATM磷酸化激活Chk2，后者磷酸化并摧毁磷酸酶Cdc25a。在细胞正常生长状态下，Cdc25a能去除Cdk2分子中Thr14和Tyr15位点上具有抑制作用的磷酸化，从而维持Cdk2的激酶活性。DNA损伤后，通过ATM/Chk2途径磷酸化的Cdc25a被降解，Cdk2分子因保持有Thr14和Tyr15的磷酸化而失活，导致细胞G/1S阻滞。（二）S期阻滞
细胞在DNA复制过程中受到照射，DNA损伤导致DNA合成机器受到抑制或DNA复制过程受阻引起细胞通过S期的时间延长或S期阻滞。引发S期阻滞的DNA受损可以是DNA链断裂、DNA交联或加合物等多种形式，为了使DNA受损伤细胞能以DNA完整分子结构形式继续DNA的复制，由S期检查点构成的监视网络通过信号转导使细胞延迟
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]