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王金发《细胞生物学》笔记和考研真题详解试读：
第1章 细胞概述
1.1 复习笔记
细胞生物学（cell biology）是以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命活动规律的学科。
一、细胞的发现及细胞学说的创立
1．细胞的发现（1）1604年Jaqssen：发明第一台显微镜，但未观察到细胞；（2）1665年，英国物理学家和数学家胡克：用显微镜第一次观察到细胞；（3）1674年，荷兰布商列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）：发明高倍显微镜（300倍左右），第一次观察到完整的活细胞；（4）意大利的M．Malpighi与英国的N．Grew：注意到了植物细胞中细胞壁与细胞质的区别。
2．细胞学说的创立（1）细胞学说的创立
①第一阶段
1838～1039年，德国植物学家施莱登（Mathias Schleiden）和动物学家施旺（Theodor Schwann）创立了细胞学说，基本内容：
第一，地球上的生物都是由细胞构成的；
第二，所有的生活细胞在结构上都是类似的。
②第二阶段
1858年德国医生和病理学家魏尔肖（Rudolf Virchow）补充：
所有的细胞都是来自于已有细胞的分裂，即细胞来自于细胞。（2）细胞学说创立的意义
①大大推进了人类对生命自然界的认识，有力地促进了生命科学的进步；
②论证了生物界的统一性和生命的共同起源。
3．细胞学理论对细胞学发展的推动作用
19世纪的最后25年，即1875~1900年，是细胞学的经典时期，在细胞学说的推动下，取得了极为丰硕的成果，代表性的成就有如下几点：（1）原生质理论的提出；（2）细胞受精和分裂的研究；（3）一些重要细胞器的发现。
4．细胞生物学发展简史（1）细胞的发现及细胞学说的创立
从1665年到1874年。（2）细胞学的经典时期
从1875年到1900年的25年。（3）实验细胞学时期
从1900年到1953年的半个世纪里，细胞学的发展主要是采用实验的手段研究细胞学的问题，其特点是从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学、遗传发育机制的研究。
产生的分支学科：：
①细胞遗传学（cytogenetics）
细胞遗传学是指遗传学和细胞学结合建立的主要从细胞学的角度，特别是从染色体的结构和功能以及染色体和其他细胞器关系来研究遗传现象，阐明遗传和变异的机制的学科。
②细胞生理学（cytophysioIogy）
细胞生理学是指细胞学同生理学结合建立的主要研究细胞从周围环境中摄取营养能力、代谢功能、能量获取、生长、发育与繁殖机制以及细胞受环境影响而产生适应性和运动性活动的学科，细胞的离体培养技术对细胞生理学的研究具有巨大贡献。
③细胞化学（cytochemistry）
细胞化学是指细胞学和化学的结合主要研究细胞结构的化学组成及化学分子的定位、分布及其生理功能的学科。（4）细胞生物学的诞生
一般的看法是1965年，Derobetis将其编著的《普通细胞学》改为《细胞生物学》，标志着细胞生物学的诞生，20世纪80年代开始出现的分子细胞生物学（molecular cell biology），是细胞生物学的主要发展方向。
二、细胞的共性
1．细胞结构的共性（1）细胞都具有选择透性的膜结构；（2）细胞都具有遗传物质；（3）细胞都具有核糖体。
2．细胞功能的共性（1）细胞都具有一分为二的分裂方式；（2）细胞都能进行新陈代谢；（3）细胞都具有运动性。
3．细胞的形态（1）细胞具有多种多样的形态，有球形、杆状、星形、多角形、梭形、圆柱形等。（2）细胞形态结构与功能的相关性与一致性是很多细胞的共同特点
4．细胞的大小及体积的恒定
细胞最为典型的特点是在一个极小的体积中形成极为复杂而又高度组织化的结构。图1-1 典型的原核细胞、真核细胞、细胞器、病毒和分子的大小（1）来自不同物种的多数同类型细胞的体积一般是相近的，不依生物个体的大小而增大或缩小，器官的大小主要决定于细胞的数量，而与细胞的大小无关。（2）细胞本身的大小并非是随意改变的，细胞体积要维持相对恒定。（3）哺乳动物细胞的体积大小受几个因素的限制，
①体积与表面积的关系；
②细胞内关键分子的浓度。（4）细胞不仅对其体积的增大有限制，而且对体积减小也有限制，细胞体积的最小化受制于维持细胞生命活动所需的酶和蛋白质种类的最低量。
5．细胞及细胞器的计量单位
有两种计量细胞大小的单位，微米（μm）和纳米（nm），使用电子显微镜后又提出埃为超显微结构的计量单位，1埃等于0.1nm，但并不常用。图1-2 几种细胞结构的大小
三、细胞的分子基础
蛋白质、糖类、核酸和脂类等化合物也被称为生物分子（biomolecule）。
1．细胞中的水（1）含量
生命来自于水，细胞中水的含量最高，通常占细胞总质量的70％~80％（图1-6）。（2）功能
①反应剂：参与重要反应；
②溶剂：极性有机分子跟离子的良好溶剂。（3）存在形式
①游离水：是细胞代谢反应的溶剂；
②结合水：是以氢键和蛋白质结合的水分子，占细胞内全部水的4.5％，是原生质结构的一部分。
2．无机盐
无机盐是细胞的重要成分，并且是维持细胞生存环境的重要物质。（1）分类
①大分子的结构成分：主要是C、H、N、O、P、S等；22+2++++
②各种酶反应所需的离子：主要是Ca、Cu、Mg、K、Na、-Cl等；
③各种酶活性所需的基础微量元素：包括Co、 Cu、Fe、Mn、Zn等；
④某些生物需要的特殊微量元素：如I、Cs、Br等。（2）功能
①维持细胞内的pH和渗透压，以保持细胞的正常生理活动；
②同蛋白质结合组成具有特定功能的结合蛋白，参与细胞的生命活动；
③作为酶反应的辅助因子。
3．有机小分子
细胞内有4类有机小分子：单糖、脂肪酸、氨基酸和核苷酸。（1）糖类
糖是细胞的营养物，是细胞内贮存的营养物质，提供细胞代谢所需的能源。（2）脂
脂肪酸是脂的主要成分，是细胞膜的组分。（3）核苷酸
①组成脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
②参与细胞内化学反应间能量传递：例如三磷酸腺苷（ATP）是细胞内化学能的载体。
③作为细胞内通讯的信号分子：如环腺苷酸（cAMP）作为第二信使参与信号转导途径。（4）氨基酸
氨基酸决定了所组成蛋白质的特性，是蛋白质多种复杂功能的基础。
4．生物分子及其功能（1）分类
①生物大分子
细胞内有4种类型的生物大分子：核酸、蛋白质、多糖以及某些类型的脂类。
②大分子的构件
单糖、氨基酸、核苷、脂肪酸等。
③代谢物
不同的代谢途径中，通常先合成的物质是后合成物质的前体。
④非细胞功能分子
包括各种维生素、蛋白类激素、能量储存分子（如ATP）、某些磷酸化的物质以及代谢废物等。（2）生物大分子及其功能
①多糖（polysaccharide）
a．多糖
多糖是细胞的重要支持材料，是细胞壁的主要结构成分，青霉素之所以能够抑制革兰氏阳性菌的生长，就是阻止了细胞壁中特殊糖链的形成。
b．糖蛋白功能
第一，作为机体内外表面的保护剂及润滑剂，；
第二，作为载体与维生素、激素、离子等结合，有助于这些物质在体内转移和分配；
第三，参与细胞识别，是细胞识别的重要分子。
c．蛋白质的糖基化对蛋白质的影响
第一，糖基化往往使蛋白质在水中的溶解度增大。
第二，糖基化可能使蛋白质增加许多负电荷。
第三，糖基化对蛋白质的生物功能有很大影响，如糖蛋白的功能需要糖基维持。
第四，糖基化对蛋白质合成后加工和运输的影响很大的，糖基形成不同转运加工信号。
②核糖核酸与脱氧核糖核酸
a．脱氧核糖核酸即是DNA分子，是遗传物质，其结构是双螺旋的。图1-3 DNA的结构
b．RNA即是核糖核酸，种类较多，有tRNA、rRNA、mRNA，还有一些存在于细胞核和细胞质中的小分子RNA，它们具有不同的功能，在某些病毒中RNA是遗传物质。
③蛋白质
蛋白质是细胞内行使各种生物功能的生物大分子。表1-1 细胞内蛋白质的某些功能功能举例功能举例结构材料胶原、角蛋白激素胰岛索、生长激素++-K泵运动肌动蛋白、肌物质运输Na球蛋白乙酰胆碱受体营养储存信号转导酪蛋白、铁蛋血清白蛋白基因调控渗透压调节白白喉和霍乱毒素免疫作用毒素lac操纵子氧化还原酶、连接电子转移酶（催化作抗体酶等用）细胞色素
5．细胞结构体系的组装（1）组装步骤
①第一级是构成细胞的小分子有机物的形成，包括碱基、氨基酸、葡萄糖、软脂酸，这些构成了细胞的基石；
②第二级由基石组装成生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白质、多糖；
③第三级由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构，如细胞膜、核糖体、染色体、微管、微丝等；
④第四级由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器，如细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体、微体等，最后再由细胞器组成细胞。（2）生物大分子的组装假说
①模板组装（template assembly）
a．模板组装是指由模板指导，在一系列酶的催化下，合成新的、与模板完全相同的分子。
b．代表：DNA。
②酶效应组装（enzymatic assembly）
a．酶效应组装是指相同的单体分子在不同的酶系作用下，生成不同的产物。
b．代表：葡萄糖组装形成淀粉、纤维素等多糖的不同途径。
③自组装（self-assembly）
a．自组装是指生物大分子借助本身的力量自行装配成高级结构，即不需要模板和酶系的催化。
b．代表：核小体的组装。
这些假说还远远不能解释组装的真正机制。
四、细胞的类型和结构体系
两大类：原核细胞和真核细胞。
1．原核细胞（1）定义（prokaryotic cell）
原核细胞指细胞内没有典型的核结构，而只存在裸露的DNA拟核结构并且不存在除核糖体外其他复杂细胞器的细胞。（2）特点
①基因组很小；
②细胞内无复杂细胞器和细胞核结构；
③细胞体积小，繁殖快；
④进化地位低；
⑤无法进行复杂的细胞分化。（3）分类
①古细菌（archaebacteria）
包括产甲烷菌、嗜热菌、嗜盐菌等极端环境下生存菌群。
②真细菌（eubacteria）
真细菌包括支原体、衣原体、立克次氏体、细菌、放线菌与蓝藻等多个庞大的家族。（4）细菌表面结构
①细菌表面结构包括细胞质膜、细胞壁及其特化结构：中膜体、荚膜与鞭毛等。
②中膜体：即间体，是指细胞膜向内折皱形成的含有细胞色素和琥珀酸脱氢酶，为细胞提供呼吸酶的结构。图1-4 典型的细菌细胞形态结构（5）代表：支原体
①支原体是目前发现的最简单、体积最小的原核细胞，也是惟一一种没有细胞壁的原核细胞。
②支原体没有鞭毛，无活动能力，可以通过分裂法繁殖，也有进行出芽增殖的。
2．真核细胞（1）定义
真核细胞（eucaryotic cell）是指具有典型的细胞结构有明显的细胞核、核膜、核仁和核基质的细胞，既包括大量的单细胞生物和原生生物细胞（如原生动物和一些藻类细胞），又包括全部的多细胞生物（一切动植物）的细胞。（2）主要特点
以生物膜为基础进一步分化，使细胞内部产生许多功能区室，它们各自分工负责又相互协调和协作。（3）两种主要类型：动物细胞和植物细胞图1-5 动物细胞（A）和植物细胞（B）模式图表1-2 动物细胞与植物细胞的比较细胞器动物细胞植物细胞细胞壁无有叶绿体无有液泡无有溶酶体有无圆球体无有乙醛酸循环体无有通讯连接方式间隙连接胞间连丝中心体有无胞质分裂方式收缩环细胞板（4）真核细胞的结构体系
①生物膜体系（biomembrane system）
a．组分
包括细胞质膜、核膜以及各种细胞器的膜。
b．功能
第一，生物膜为细胞提供保护；
第二，生物膜使细胞内部结构区室化，使得各类反应进行得更加高效；
第三，细胞表面的细胞质膜进行选择性的物质跨膜运输与信号转导；
第四，双层核膜将细胞分成细胞质与细胞核，使得基因表达得以精密调控；
第五，生物膜为大量酶提供了附着位点，催化各类反应的发生。
②遗传信息表达体系（genetic expression system）
a．组分
由DNA和组蛋白构成。
b．功能
第一，储存遗传物质；
第二，调控基因表达。
③细胞骨架体系（cytoskeleton system）
a．组分
第一，胞质骨架：微丝、微管与中等丝等；
第二，核骨架：核纤层、核基质。
b．功能
第一，胞质骨架协助细胞信号传递与细胞运动，为细胞内物质的运输提供通道，形成有丝分裂的纺锤丝，对细胞起支撑作用，使细胞质基质更加区域化；
第二，核骨架与基因表达、染色质构建与排布有关系。
3．真核细胞与原核细胞的比较表1-3 原核细胞与真核细胞的相同点
序号内容1都具有类似的细胞质膜结构2都以DNA作为遗传物质，并使用相同的遗传密码3都以一分为二的方式进行细胞分裂4具有相同的遗传信息转录和翻译机制，有类似的核糖体结构5代谢机制相同（如糖酵解和TCA循环）6具有相同的化学能贮能机制，如ATP合成酶（原核7位于细胞质膜上，真核位于线粒体膜上）8光合作用机制相同（蓝细菌与植物相比较）9膜蛋白的合成和插入机制相同都是通过蛋白酶体（蛋白质降解结构）降解蛋白质（古细菌与真核细胞相比较）表1-4 真核细胞特有的特点
序号内容1细胞分裂分为核分裂和细胞质分裂，并且分开进行2DNA和蛋白质结合压缩成染色体结构，形成有丝分裂的结构3具有复杂的内膜系统和细胞内的膜结构（如内质4网、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、乙醛酸循5环体、内体等）具有特异的进行有氧呼吸的细胞器（线粒体）和光6合作用的细胞器（叶绿体）7具有复杂的骨架系统（包括微丝、中间纤维和微管）8有复杂的鞭毛和纤毛9具有小泡运输系统（胞吞作用和胞吐作用）10含有纤维索的细胞壁（如植物细胞）11利用微管形成的纺锤体进行细胞分裂和染色体分离每个细胞中的遗传物质成双存在，二倍体分别来自于两个亲本通过减数分裂和受精作用进行有性生殖
五、病毒——非细胞的生命体
1．病毒是比细胞更小的生命体（1）组分
蛋白质外壳和遗传物质的核。（2）分类
①按病毒成分分类
a．真病毒（euvims）；
b．亚病毒（subvims）
仅含有核酸或者蛋白质的具有侵染性的颗粒，包括：类病毒；拟病毒；卫星病毒和卫星RNA；阮病毒等。
②按侵染宿主分类
a．动物病毒；
b．植物病毒；
c．细菌病毒（噬菌体）。
③按遗传物质分类
a．DNA病毒（单双链）；
b．RNA病毒（单双链）。图1-6 常见病毒的形态和结构（3）病毒只能在细胞中增殖
病毒的增殖过程：
①吸附；
②侵入；
③复制；
④成熟；
⑤释放。
六、细胞生命的进化
1．细胞生命的起源（1）地球和原始大气层的形成；（2）有机分子的自发形成；（3）分子聚合体的形成；（4）生命初级聚合体的形成；（5）原始细胞的形成。
2．真核细胞的起源（1）真核细胞是由原核细胞进化而来；（2）原核细胞向真核细胞进化的主要事件是呼吸代谢的发展和内膜系统的形成；（3）能量转换有关的细胞器线粒体和叶绿体的起源主要是通过内共生机制；（4）内膜系统是通过质膜的内陷形成的。图1-7 质膜内陷形成核膜和内质网的假定方式图1-8 真核细胞进化的主要过程
3．从单细胞向多细胞进化（1）细胞在向多细胞机体进化过程中，最重要的特点是出现细胞的分化；（2）在多细胞的机体内，有一部分细胞高度特化，成为下一代机体的起源，即生殖细胞（germ cell）。
七、我国细胞生物学的发展战略
1．细胞生物学的主要研究内容和发展方向图1-9 细胞生物学研究的范畴
2．我国细胞生物学发展战略
我国重点研究方向（1）细胞的结构与机能；（2）染色体的结构及其基因表达调控；（3）细胞骨架及核骨架系统；（4）胞外基质；（5）细胞周期调控；（6）细胞分化、衰老、死亡及相关基因的研究；（7）细胞信号传导；（8）细胞社会学；（9）细胞结构体系的组装及细胞工程；（10）生殖有关的细胞生物学问题；（11）肿瘤的细胞生物学；（12）进化细胞生物学；（13）植物细胞工程。
1.2 名校考研真题详解
一、选择题
1．最大的细胞是（ ）。[复旦大学2004研]
A．精细胞
B．卵细胞
C．肝细胞
D．神经细胞
E．上皮细胞【答案】B
2．有关原核细胞与真核细胞的比较，下列说法错误的是（ ）。[南开大学2007研]
A．现有资料表明真核细胞由原核细胞进化而来，自然界真核细胞的个体数量比原核细胞多
B．真核细胞内有一个较复杂的骨架体系，原核细胞内并没有明显的骨架系统
C．真核细胞基因表达有严格的时空关系，并具有多层次的调控
D．真核细胞内膜系统分化，内部结构和功能的区域化和专一化，各自行使不同的功能【答案】A
3．下列生物中属于原核生物的一组是（ ）。[湖南大学2007研]
A．蓝藻和酵母菌
B．蓝藻和硝化细菌
C．绿藻和根瘤菌
D．水绵和紫菜【答案】B
4．最早原核细胞产生于______年前。[南京师范大学2008研]【答案】30亿
二、填空题
1．自然界最小、最简单的细胞是______。[上海交通大学2007研]【答案】支原体
2．在多细胞生物发育中，细胞有四种基本的行为，即：细胞增殖、细胞分化、______和______。[中山大学2007研]【答案】细胞衰老；细胞死亡
三、判断题
1．限制细胞大小的因素很多，包括核糖体的大小、表面积/体积比、细胞核产生的mRNA的数量、细胞含水量等。（ ）[中山大学2007研]【答案】对
2．细胞内的生物大分子是指蛋白质、脂类和DNA等。（ ）[中科院-中科大2007研]【答案】错【解析】脂类不是生物大分子。
四、名词解释题
细胞融合。[郑州大学2004、2008研]
答：细胞融合是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。动物细胞融合一般要用灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如PEG）介导；植物细胞融合时，要先用纤维素酶去掉纤维素壁。细胞融合技术是单克隆抗体制备等的基础。
五、简答题
1．模式生物在细胞生物学的研究中具有重要作用，请列举三种不同的模式生物分别在细胞生物学重要问题研究中的贡献。[中山大学2009研]
答：用于细胞生物学的研究的模式生物有：病毒、细菌、酵母、线虫、斑马鱼、小鼠、拟南芥等。（1）酵母：对细胞周期调控的研究和细胞周期蛋白的发现。（2）非洲爪蟾：其卵很大，常用来进行细胞分裂和胚胎早期发育的研究，MPF的研究工作和纯化均以其为模式生物。（3）线虫：在显微镜下身体透明，细胞易于追踪的优点，通过它发现了细胞程序性死亡的很多机制。
2．简述2002年和2004年诺贝尔奖获奖项目中有关细胞生物学的研究内容主题。[武汉大学2005研]
答：2002年的医学或生理学奖：器官发育的遗传基础和细胞程序化死亡。
2004年的化学奖：泛素介导的蛋白质降解途径；医学或生理学奖：气味分子受体和嗅觉系统的组成。
3．简述细胞学说的基本内容。[北京师范大学2005、2007研]
答：施旺和施莱登两人共同提出了细胞学说，当时细胞学说的基本内容是：（1）细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来，并由细胞和细胞产物所构成；（2）每个细胞是一个相对独立单位，既有“它自己”的生命，又对与其他细胞共同组成的整体的生命有所助益；（3）新的细胞可以通过已经存在的细胞繁殖产生。
二者提出细胞学说后又经过了诸多的补充完善，但基本内容不变。
4．二聚体往往是细胞中许多蛋白质分子发挥功能的有效形式。试举例并简述细胞生物学研究中常用以鉴定蛋白质以二聚体形式存在的两种方法。[中科院-中科大2008研]
答：（1）跑SDS-PAGE看分子量大小；（2）对蛋白单体进行不同标记，用其中一种抗体进行免疫沉淀，再用另一种抗体做western检测；（3）蔗糖或者CsCl密度梯度离心，再做western；（4）过分子筛，看分子量大小。
5．简述细胞体积守恒定律。[南京师范大学2008研]
答：不同细胞的大小变化很大，如人的卵细胞的直径只有0.1mm，而鸵鸟的卵细胞的直径则有5cm。但是同类型细胞的体积一般是相近的，不依生物个体的大小而增大或缩小。如人、牛、马、鼠、象的肾细胞、肝细胞的大小基本相同。因此，器官的大小主要决定于细胞的数量，与细胞的数量成正比，而与细胞的大小无关，把这种现象称为“细胞体积的守恒定律”。
六、论述题
为什么说“细胞是一切生物生命活动的基本单位”？[郑州大学2007研、南开大学2005研]
答：（1）一切有机体都是由细胞构成的，细胞是构成有机体的基本单位。世界上的生物种类很多，形态结构千差万别，但一切有机体均是由细胞构成的，只有病毒是非细胞形态的生命体。单细胞生物的有机体仅由一个细胞构成，多细胞生物由多个细胞构成。构成高等生物体的细胞虽然都是高度社会化的细胞，具有分工与协同的相互关系，但它们又得保持着形态和结构上的独立性，每个细胞都是具有自己独立的一套完整的结构体系，成为有机体的基本结构单位。（2）细胞具有独立的有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位。这是由细胞自身结构的装置及其协调性所决定的，是长达数十亿年进化的产物。细胞结构完整性的任何破坏，都会导致细胞代谢有序性和自控性的失调。（3）细胞是有机体生长发育的基础。有机体的生长于发育是依靠细胞的分裂、细胞体积的增长，细胞的分化与凋亡来实现的。研究生物的生长与发育必须要以研究细胞的增值、生长、分化与凋亡为基础。（4）细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性。每个细胞无论其来源，都包含着全套的遗传信息，即全套基因，在特定条件下，都具有发育为一个完整独立的生命单位的潜能。（5）没有细胞就没有完整的生命。无数的实验证明，任何细胞结构完整性的破坏，都将使细胞无法实现完整的生命活动。从细胞中分离出的任何结构，甚至保持完好的细胞核和含有遗传信息的叶绿体、线粒体，都不能在体外培养持续生存并作为生命活动的单位而存在。（6）此外，病毒虽然是非细胞形态的生命体，但它们必须在细胞内才能表现基本生命特征（繁殖与遗传）。因此，就病毒而言，细胞是生命活动的基本单位这一概念也是完全合适的。
第2章 细胞生物学研究方法
2.1 复习笔记
一、显微成像技术
1．光学和电子显微镜成像原理（1）显微镜基本要素
①照明系统；
②被观察的样品；
③聚焦和成像的透镜系统。（2）基本原理
当样品被放置在光或电子束的通路中，光束或电子束被改变的物理特征能够用肉眼观察或被显像板记录下来。（3）相关概念
①焦距
焦距是指透镜的中心平面到焦点的距离；
②孔径角
孔径角是光从样品进入显微镜的物镜镜口角，角孔径越大，透过透镜的信息越多。
③分辨率
分辨率是指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力，分辨距离越小，分辨率越高。
④最大分辨率
最大分辨率是指能够区别两个点间最近距离的能力。
⑤放大率
放大率是指最终成像的大小与原物体大小的比值。
总放大率＝物镜放大率×目镜放大率。表2-1电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空光学显微镜300nm可见光玻璃透镜不需真空200nm（油可见光玻璃透镜不需真空镜）100nm紫外线石英透镜不需真空电子显微镜0.1nm电子束电磁透镜真空
2．常用的光学显微镜（1）主要类别
光学显微镜的种类很多，如相差显微镜、暗视野显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜等，根据实验目的选择不同的种类。
①普通双筒显微镜（binocular microscope）
优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。
②荧光显微镜（fluorescence microscope）
a．工作原理
利用紫外线发生装置（如弧光灯、水银灯等）发出强烈的紫外线光源，通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来。
b．应用
可用于研究细胞内物质的吸收、运输以及化学物质的分布及定位等。图2-1 荧光显微镜的光通路
③相差显微镜（phase contrast microscope）
a．工作原理
它是利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。
b．独特功能
①将直射的光（视野中背景光）与经物体衍射的光分开；
②能将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。
c．应用
是能观察无色、透明、活细胞中的结构。图2-2 相差显微镜的光学部件及光线通路
④暗视野显微镜（dark field micmscope）
a．工作原理
使用了一种特殊的照明方法，使光线不能直接进入物镜和目镜，这样，在观察样品时就不能直接看到照明光线，而只能观察被检物体所反射或衍射的光线，因而使被检物体在黑暗的视野中呈现明亮的像。
b．应用
用以观察未经染色的活体或胶体粒子，主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。图2-3 暗视野显微镜的光学
⑤倒置显微镜（inverted microscope）
倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。图2-4 倒置显微镜（2）光学显微镜的样品制备
①光学显微镜样品制作过程
a．固定；
b．包埋；
c．切片；
d．染色。
②放射自显影（autoradiography）技术
a．定义
放射自显影技术是指用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。
b．原理
利用放射性同位素所发射出来的带电离子（α或β粒子）作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，潜影可用显影液显示，成为可见的“像”。
c．应用
对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪。
3．电子显微镜（electron microsoope）（1）基本组成
①电子光学系统（镜筒）；
②真空系统；
③电子学系统（供电系统）。（2）主要类别
透射电子显微镜和扫描电子显微镜，在两者的基础上还发明了透射扫描电子显微镜、免疫电子显微镜、高压电子显微镜等。
①透射电子显徽镜（transmission electron microscope，TEM）
a．工作原理
让电子束穿透样片而成像。
b．应用
用于观察光学显微镜下观察不到的亚显微结构。
②扫描电子显微镜（scanning electron mieroscope，SEM）
a．工作原理
利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射，二次电子能够产生样品表面放大的形貌像。
b．应用
可用于观察核孔复合体等更精细的结构，但不能观察活的生物用品。图2-5 扫描电子显微镜的光学系统
③扫描透射电镜（scanning transmission electron microscope，STEM）
a．工作原理
有透射电子能透过样品成像，又能在样品表面进行扫描而成像，具有TEM和SEM两者特性。
b．应用
可用于观察厚度大样品，主要用于生物大分子的分析。图2-6 扫描透射电子显微镜
④高压电镜（high-voltage electron microscope，HVEM）
a．工作原理
与透射电子显微镜基本相同，只是采用高电压。
b．应用
可用于较厚切片细胞结构的研究。（3）电子显微镜的样品制备
①基本过程
a．固定；
b．包埋；
c．切片（超薄切片）；
d．染色等。图2-7 电子显微镜样品的制备过程
②其他技术
a．负染色（negative stainning）
第一，原理
用重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）对铺展在载网上的样品进行染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，图像背景是黑暗的，样品颗粒则透明光亮，即只染背景而不染样品。
第二，应用
用于生物大分子精细结构（三维结构）的观察。
b．喷镀技术（shadow casting）
第一，原理
样品朝向加热丝的一面被金属覆盖，而背向加热丝的样品面和背景则不能被金属覆盖，在电子显微镜下观察时，被金属覆盖的很暗，而未被覆盖的则光亮，形成明显对比。
第二，应用
用于观察细胞表面或者生物大分子表面结构的观察。图2-8 喷镀技术
③冷冻断裂复型和冷冻蚀刻
a．冷冻断裂复型（freeze-fracture replication）技术
冷冻断裂复型技术是指先将生物样品在液氮中进行快速冷冻，然后转移至冷冻装置，在真空条件下，用冰刀横切冷冻样品，使样品的内层被分开露出两个表面P面（靠近细胞质的半层膜）和E面（靠近细胞质基质的半层膜）的技术。
b．冷冻蚀刻（freeze-etching）技术
冷冻蚀刻技术是指将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，之后对浮雕表面进行铂-碳复型，除去生物样品后在电镜下观察样品断裂面结构的技术。图2-9 冷冻断裂与冷冻蚀刻技术
c．应用
可以用于细胞膜双分子层蛋白含量与结构的分析。
4．间接成像技术（1）扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）
①工作原理在低电压下，二电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，当二电极之间近到一定距离（50nm以内）时，电极之间产生了电流，称隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系，可将扫描过程中电流电话转化成图像，由此样品的表面形貌也可确定。
②STM的主要特点
a．分辨率：侧分辨率为0.1～0.2 nm，纵分辨率可达0.001 nm；
b．工作环境：真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）；
c．属于非破坏性测量，可在生理状态下进行样品观察；
d．观察到的是样品表面立体三维结构；
e．体积小，便于携带。
③应用
①直接观察到 DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构；
②用于纳米生物学乃至纳米科学各领域研究。（2）原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）
原子力显微镜是在STM的基础上发展起来的一种显微镜，可用于非导体样品结构的观察。（3）X射线衍射（X-ray diffraction）
①X射线衍射技术并不涉及显微镜，但是能够根据X射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。
②X射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。
二、细胞化学技术
细胞化学技术不是单一的技术，而是一整套有关联的技术，包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、示踪细胞化学技术等。
1．酶细胞化学技术（enzyme cytochemistry）（1）定义
酶细胞化学技术是指通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内定位的技术。
②基本原理
a．酶反应：酶作用于底物的反应，形成的产物称为初级反应产物；
b．捕捉反应：捕捉剂与初级反应产物的作用，产生可在显微镜下观察到的最终反应产物。
③特异性
设计酶的细胞化学反应，最重要的是找到酶的特异性反应底物。
④捕捉反应方法
金属盐沉淀法、色素沉淀法。
2．免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）（1）定义
免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。（2）分类
①免疫荧光技术（immunofluorescence technique）
免疫荧光技术是指将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
②免疫电镜技术（immunoelectron microscopy technique）
a．定义
免疫电镜技术是指如同荧光显微镜一样，采用一些特殊技术增强电子显微镜样品反差，从而进行亚细胞结构和分子定位的方法。
b．分类
第一，免疫铁蛋白技术；
第二，免疫酶标技术；
第三，免疫胶体金技术。
3．其他细胞化学技术（1）显微分光光度术（microspectrophotometry）
显微分光光度术是指将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术，它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测定基础，可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。（2）显微荧光光度术（microfluorometry）
显微荧光光度术即细胞荧光光度术，是指利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定的方法。（3）核磁共振技术（nuelear magnetic resonance，NMR）
核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中小分子质量（20kDa以下）的蛋白质、核酸以及其他分子的结构，而不损伤细胞。
三、细胞分选技术（cell sorting technique）
主要用流式细胞仪（FCM）对细胞或染色体进行分选，并对单个细胞或其他生物微粒进行定量分析，包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白等。
1．流式细胞仪的基本结构（1）激光光源；（2）流室；（3）讯号检测器；（4）讯号分析部件。
2．细胞分选
用带能够同待分选细胞表面特征性蛋白（抗原）结合且能够同某种荧光染料结合的抗体作为探针与细胞进行温育，带荧光标记的细胞能激活荧光检测器，而所有细胞都能激活干涉检测器，在电场中带荧光标记细胞与普通细胞所带电荷不同而移向不同的两级，从而达到分离目的。图2-10 流式细胞仪分选细胞示意图
3．染色体分选（chromosome sorting）
与细胞分选原理一样，仅所用的荧光标记探针不一样，染色体分选是用带有荧光标记的DNA探针同特异染色体结合，使待分选的染色体带上标记。
四、细胞工程技术（cell engineering technique）
1．细胞工程技术（1）定义
细胞工程技术是指利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，属于细胞生物学和遗传学的交叉领域。（2）主要内容
包括细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养等。
2．细胞培养（cell culture）
细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号转导、细胞的合成代谢等。（1）体外细胞培养的条件
体外培养细胞必须注意3个环节：营养、生存环境和废物的排除。
①体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的，培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素，一般在合成培养基中要加入血清；
②体外细胞培养必需模拟体内细胞生长的环境；
③活体内生长的细胞所产生的代谢物和废物通过一定的系统进行利用和排除。（2）原代培养（primary culture）和传代培养（subculture）
①原代细胞（primary culture cell）和传代细胞（subculture cell）
a．原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞；
b．传代细胞是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。
②原代培养和传代培养
a．原代培养是指从机体内取出的组织或者细胞直接进行培养，培养至第10代的细胞培养过程；
b．传代培养是指原代细胞增殖到一定程度后取出放入新的培养基培养的过程。（3）细胞系和细胞株
①细胞系（cell line）
细胞系是指经过原代培养10代后少数存活能继续顺利地传40～50代次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为的传代细胞，分为有限细胞系跟永生细胞系；
a．有限细胞系是指传代培养到第50代时难以再继续存活下去的细胞系；
b．永生细胞系是指在传代过程中的部分发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传代培养下去的细胞系。
②细胞株
a．细胞克隆是指用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的具有基本相同的遗传性状的细胞群体；
b．细胞株是指细胞系中经过生物学鉴定的具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆。（4）动物细胞培养方法
动物细胞培养分为贴壁培养和悬浮培养。
①贴壁培养
贴壁培养即单层细胞培养，是指分散的细胞悬浮在培养瓶中很快（几十分钟至几小时）就贴附在瓶壁上呈单层生长的培养方式，细胞间有接触抑制特性。
②悬浮培养
悬浮培养是指细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长的培养方式，培养条件复杂，但是容易同时获得大量的培养细胞。图2-11 转基因植物组织培养（5）植物组织培养（plant tissue culture）
植物组织培养是根据植物细胞的全能性发展起来的利用植物植株的不同组织培养成完整植株的方法。（6）植物细胞培养方法
①单倍体细胞培养
这种培养方法主要用花药在人工培养基上进行培养。
②原生质体培养
a．原生质体诱导发育成完整植株；
b．原生质体与体细胞杂交后经诱导发育成完整植株。
3．细胞融合与单克隆抗体技术（1）细胞融合（cell fusion）
①定义
细胞融合是指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
②基本过程
a．细胞融合形成异核体（heterokaryon）；
b．异核体通过细胞有丝分裂进行核融合；
c．最终形成单核的杂种细胞。
③细胞融合方法
a．灭活的病毒（如仙台病毒）作为促融剂；
b．化学物质（如聚乙二醇，PEG）作为促融剂；
c．电融合技术方法。图2-12 细胞融合（2）单克隆抗体技术
①定义
单克隆抗体技术是指将抗原免疫过的B淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞融合形成的能产生针对该特异抗原的特异性抗体且能够无限增殖的杂交瘤细胞的技术。
②原理
B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂；而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体，将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两亲本细胞的特性，既能产生抗体又能无限增殖，融合细胞通过HAT培养基筛选，在HAT培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。
③应用
单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟了一条广阔途径，而且在临床诊断与肿瘤等疾病的治疗中也具有重要作用。图2-13 单克隆抗体技术（3）显微操作术（mieromanipulation technique）
显微操作技术是指用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术。
3．动物细胞核移植克隆技术（1）定义
动物细胞核移植克隆技术是指将一个细胞的细胞核取出放入去核卵细胞中，并诱导其分化发育形成完整个体的技术。（2）应用
①结合转基因技术生产药物；
②用于基因结构和功能、基因治疗、遗传病及人类衰老等的研究方面。图2-14 细胞核移植克隆绵羊
五、分离技术
包括细胞组分的分离和生物大分子的分离。
1．离心分离技术（1）速度离心分离细胞器和大分子
①基本原理
主要是根据被分离物质的体积差异，在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降的速度也就不同，体积大的沉降得快，反之沉降得慢。
②方法
a．差速离心（differential centrifugation），主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。图2-15 差速离心的原理图2-16 移动区带离心分离
b．移动区带离心
这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。（2）等密度离心分离细胞器和大分子
与速度离心分离不同，等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。
在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。图2-17 密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体
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