作者：刘小玲、孙鹂 主编 吴宝金 副主编
出版社：化学工业出版社
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动物细胞培养技术试读：
前言
在多年的本科教育教学工作中，我们感觉现有的教学条件和教学方法已经很难适应越来越快的发展需要。由于缺乏适合本科生实用的《细胞培养技术》相关教材和实验指导材料，遂产生编写《动物细胞培养技术》教材的想法，目的是编写实用实训型教材，包括实验指导部分，这既符合医学等相关专业培养需要，又紧跟前沿领域技术，使学生更有效地掌握实验操作技能，从而具有可持续发展的空间。
本教材第一部分内容包括动物细胞培养的基本概念，动物细胞培养的基本知识，动物细胞培养的准备工作，动物细胞培养的基本技术和方法，动物细胞培养在医学研究领域的应用和特殊细胞培养，以及干细胞技术，包括诱导多能干细胞（iPS细胞）技术等。第二部分包括每一部分涉及的主要实验实训材料。本教材创新之处主要体现在内容的广度，它涉及干细胞领域和人类诱导的多能干细胞（iPS细胞）技术，使学生较早接触这个新型领域和前沿技术。
本教材适用于医学、药学、生命科学等相关专业本科学生，以及相关专业研究生教学训练，也可作为实验技术人员和自学入门者的参考书。
本书在编写过程中得到了杭州师范大学攀登工程基金（国家规划教材培育）、浙江省自然科学基金（编号Y2080747）和杭州市科技发展计划项目基金（编号20100333T15），杭州市重点实验室项目（实验动物科学实验室）的部分经费支持。杭州师范大学的同仁，上海复旦大学，澳门大学，山西医科大学和上海斯丹赛生物有限公司干细胞实验室的专家和教授参与了部分章节的编写和校对工作，在此一并致谢。
由于编写的时间和经验有限，疏漏之处在所难免，敬请读者批评指正。刘小玲2012年12月第一部分 动物细胞培养技术第一章 绪论教学目的及要求
1.掌握动物细胞培养的基本概念；
2.熟悉动物细胞培养技术的应用；
3.了解动物细胞培养技术的发展史。第一节 动物细胞培养的基本概念
一、动物细胞培养的概念
从动物体内取出的组织或细胞，在体外模拟体内生理环境下建立无菌、适温和适宜营养的条件，使细胞生存和扩增，并维持其正常结构与功能的方法，称为动物细胞培养。
培养细胞常见的组织来源主要有猴、啮齿类、禽类的胚胎和脏器。根据需要选用不同的动物组织，经分散、酶消化、单层细胞培养等步骤，获得动物组织细胞系。在多数情况下，需利用原代细胞培养技术，即直接从动物活体内取出组织、细胞进行第一次的培养。与组织、器官培养不同的是，细胞培养采用的原始培养对象是单细胞悬液，而组织培养采用的是组织块或薄片，器官培养采用的是整个器官、器官的一部分或器官原基。
动物细胞培养技术目前已经发展到一个新的阶段，从不同组织得到的各类型细胞可在体外反复传代长期生长。源自动物和人的胚胎和成年组织、正常和肿瘤组织均可建立细胞系（celline），类型包括上皮细胞和成纤维细胞等。有些在体内自身更新能力强的上皮细胞，通过改进培养技术可具备无限增殖能力，可成为永久性细胞系或株（continuous cell line or strain）；但大多数体外培养的正常组织细胞仅为有限期的传代，称有限细胞系或株（finite cell line or strain）。
啮齿类动物细胞在体外具有较高的转化率，经肿瘤细胞或SV40感染，以及化学物质处理后即可获得稳定的细胞系。美国ATCC（American Type Culture Collection）保存有大量的细胞系，并能购买到。
干细胞（stem cells）技术是通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。胚胎干细胞（embryonic stemcell，ES cell）与其他普通细胞相比有许多独特之处，其培养也有相应的特殊性。2006年，日本科学家Yamanaka建立的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）技术，以病毒载体、质粒等介导特定转录因子（如Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4）过表达，迫使体细胞重编程为类似于ES cell的多能干细胞状态，该技术的诞生为干细胞研究领域带来了重大的突破。
二、动物细胞培养的优点
1.简化细胞生长环境
生物体内任何一个细胞不论是其生存环境还是其发挥功能的条件都非常复杂，不易研究。要想了解某一种细胞的生存条件和生物学功能，有效的方法就是将所研究的对象孤立出来单独分析。细胞培养技术使细胞在存活的基础上独立研究其生命活动、逐项研究细胞生存条件和细胞功能成为可能。
2.方便控制实验因素
在培养条件下，细胞生存的理化环境如pH值、温度、CO压力2等都可以人为控制，并且可以做到很精确，并保持其相对的恒定。在培养液中有针对性地加入或者删除某种成分，即可研究这种实验因素对细胞的生物学作用。
3.易于观测实验结果
利用细胞培养技术研究细胞的生命活动规律，可以采用各种实验技术和方法来观察、检测和记录。如通过倒置相差显微镜等直接观察活的细胞；应用缩时电影技术摄像，或通过闭路电视长时间连续记录和观察被培养细胞的体外生长情况，可直观揭示培养细胞的生命活动规律，以及所施加因素引起的反应；利用同位素标记、放射免疫等方法可检测细胞内的物质合成和代谢变化等。
此外，培养技术的发展和成熟，使可供研究的细胞种类极其广泛。从低等动物细胞到高等动物细胞，以至人类细胞：胚胎细胞和成体细胞，正常组织细胞和肿瘤组织细胞皆可用于培养，为多种学科的实验研究提供广泛的实验材料。该技术可同时提供大量均一性较好的细胞群，并降低实验成本，动物细胞培养能够进行大规模生物制品的生产。目前，利用动物细胞大规模培养技术生产的生物产品包括酶、单克隆抗体以及多种疫苗等生物制品或者基因工程产品。
动物细胞培养虽然具有以上一系列优点，但也有不足之处，主要表现在失去体内细胞的制约和整体调节作用后，培养细胞的形态和功能会发生一定程度的改变；实验试剂对细胞形态和功能也有影响，如胰蛋白酶对细胞表面受体、抗原酶等均有破坏作用；培养过程中，长期传代、冻存等操作也可使培养细胞发生染色体非整倍体改变等。此外，体外培养的动物细胞对营养的要求较高，一般需加入10％的胎牛或新生牛血清，动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。总之，动物细胞体外培养终究是一种人工条件，始终不如真正的体内生存条件完美。因此，在利用培养细胞作研究对象时，不可与体内细胞完全等同来对实验结果轻易做出判断。
动物细胞培养技术的进步也在于如何去探索和洞悉细胞的生物学特性，在体外造就一个接近体内细胞的生理环境，满足细胞对能量、物质和信息三者统一的要求，环境条件的设计成为至关重要的影响因素。只有在体外条件下，细胞仍然保持在体内的生物学特性，才能用培养的细胞去完成细胞生物学所研究的内容。第二节 动物细胞培养技术发展史
1885年，德国学者Roux用温生理盐水培养鸡胚神经板组织达数月，并首次采用“tissue culture”这一概念。1898年Liunggren将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后用于移植手术，获得成功。Jolly于1903年将蝾螈的白细胞输注入生理盐水或血清中培养，并观察到活细胞的游走及分裂。Beebe等研究者于1906年用动物血清培养犬传染性淋巴瘤细胞达3天。这些尝试为以后的动物细胞培养方法奠定了基础。
动物细胞培养技术的真正创立是从美国生物学家R.Harrison（1907）和法国学者A.Carrel（1912）两人开始的。
Harrison在无菌条件下，将蛙胚髓管部的小片组织接种于蛙的淋巴液中，共同保持在一单盖玻片上，然后翻转盖玻片，使组织小片和淋巴液悬挂在盖玻片表面，再将这块玻片密封在一个下凹的载玻板之上，一定时间后更换淋巴液。用这种方法，Harrison将蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久。Harrison的实验开创了动物组织和细胞培养的先河，标志着盖玻片悬滴培养法的建立。他首次成功地在体外培养液（凝结的淋巴液）中培养了神经元，证实了原始的胚胎神经元或成神经细胞的胞质向外突起而形成轴突，并不断延伸的假说，从而结束了从19世纪以来关于神经轴突形成理论的争论。他在实验中设计并总结了一整套合理的无菌操作技术，故Harrison被公认为“组织培养之父”。
A.Carrel把外科手术无菌技术的构思和操作带到了组织培养实验中，在无抗生素条件下，仅靠小心细致的操作，使鸡胚心脏植块连续培养长达34年，实验中可做到绝对无菌。Carrel的另一个重要贡献是将组织包埋技术、营养供应以及传代培养等许多重要的培养条件和方法引入组织细胞培养过程中，从而使多种动物组织细胞培养获得成功。1923年，Carrel和Harrison等设计了使用卡氏瓶（Carrel flask）培养的方法，以扩大组织细胞的生存空间，并发表了大量论文，为组织细胞培养的发展奠定了基础。在此之后，相继出现了各种类型的培养瓶、培养皿以及多孔培养板等培养器材。
1910年，美国医生Burrows和Carrel用血浆或组织匀浆液与血浆混合液代替淋巴，成功培养了犬、猫、小鼠、豚鼠甚至恶性细胞的外植物。他们创造性的研究成果揭示了离体动物组织在合适条件下具有近于无限生长繁殖的能力。此后，美国学者W.H.Lewis和M.R.Lewis等开始研究和运用已知成分的人工合成培养液。Eagle等在细胞培养技术及培养液的开发研究上作出巨大贡献，以他命名的Eagle培养液作为主要培养液沿用至今，并由此衍生出许多种类，而应用于各种细胞培养。此后30年里，许多科学家相继研究出合成培养液，这些人工合成培养液可大幅降低天然培养液所占比重，甚至出现用纯合成已知成分培养细胞的方法，即无血清培养液（serum free medium，SFM）培养法。
20世纪50年代末，组织细胞培养技术进入繁盛阶段，在培养用器皿、培养液和培养方法等方面都有极大改进。培养细胞在基础研究与应用领域中得到愈来愈广泛的使用，尤其在医学基础学科和临床医学中的研究与应用发展迅速。
目前，动物细胞培养技术已成为实验室常用的研究方法和应用手段，在生物学、医药学、环境保护、农学等方面，动物细胞培养技术成为应用范围极广和利用价值极高的技术。有关细胞培养方面的杂志有《In Vitro》，此外，世界著名杂志如《Cell》、《Science》、《Nature》、《European Molecular Biology Organization Journal》、《Journal of Cell Biology》，每年都有大量有关细胞培养的文献报道。尤其于20世纪末，人们提出与实施的“人类基因组计划（human genome project，HGP）”，近年来再次兴起的干细胞研究，以及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stemcell，iPS）等，都离不开细胞培养技术。细胞培养技术日益成为生物工程研究与生产以及临床治疗的重要手段。第三节 动物细胞培养技术的应用
动物细胞培养技术可从细胞水平帮助人类揭示生、老、病、死的规律，是探索优生、防治疾病、抗衰老的手段或途径。随着细胞生物学和分子生物学的相互渗透，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，使细胞培养技术在阐明基因结构与功能、基因在细胞生长和分化中的作用、细胞癌变机制等方面发挥了重要作用。
一、在生物学领域基础研究中的应用
培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测等优势，因此可进行细胞生物学的基础理论研究，如正常或病理细胞形态、结构、细胞器及其功能、生长周期、遗传物质、核型变异、细胞转化等。离体培养细胞便于进行环境、药物等影响因素的研究，探索其作用机制，使研究方法简便、结果可靠、成本降低。当今细胞生物学研究的热点，如细胞通讯和信号转导、细胞增殖与周期调控、细胞生长和分化、细胞衰老和死亡等，以及干细胞应用和细胞工程研究等，都要以培养细胞学为基础，以细胞培养技术为手段和工具。
干细胞具有较强的再生能力，在一定条件下可分化、增殖出各类细胞。但干细胞在体内数量极少，需分离并在体外大量扩增，使之长成各种组织或器官。目前干细胞的分离培养技术在造血干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞方面比较成熟，已成为干细胞研究的首要课题。虽然目前对干细胞的了解仍存在盲区，不论从深度与广度上，还是从临床应用上，干细胞的分离培养与诱导分化等都是细胞培养技术的研究重点。近年来的诱导性多能干细胞（iPS）技术的诞生，更为干细胞领域带来了重大突破。
二、在生物制品生产上的应用
生物反应器的开发研究可将编码某生物活性物质的基因导入动物受精卵，随后从这种受精卵发育的动物组织、体液分泌物中可获得外源基因的表达产物。
利用这种细胞融合与杂交技术进行细胞工程研究与开发，目前可生产的生物制品包括各类疫苗、干扰素、激素、生长因子、酶、单克隆抗体等。各类生物制品销售额逐年增长，尤其全球抗体市场增长迅猛，1999年全球抗体的销售额为12亿美元，2004年上升到105亿美元，2008年超过400亿美元，2011年则超过1100亿美元。随着现代生物技术发展，利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品是生物制品行业发展的必然趋势，其中的核心技术即为细胞悬浮培养。该技术结合筛选驯化的高表达细胞株和个性化培养基控制细胞培养过程，实现提高生产效率及产品质量，降低生产成本的目的，这是当前国际上生物制品生产的主流模式。
三、在临床医学上的应用
细胞是生命的基础，细胞健康是人体健康的根本已成为人们的共识。21世纪，世界卫生组织（WHO）对疾病康复的新定义是：治愈疾病最根本的途径是修复细胞，改善细胞代谢，激活细胞功能。
1.淋巴细胞培养技术的应用
淋巴细胞在培养环境中受某些生长因子的刺激，出现旺盛的分裂、增殖。淋巴细胞培养的成功对反映机体免疫功能状况起很大作用，如研究细胞标记，检测T、B细胞数量及功能，检测T细胞亚群（CD3、CD8、CD4等细胞）的变化，研究T、B细胞与细胞因子、体液因子的信息传递等，检测细胞因子产生能力，如白细胞介素（interleukins，IL）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、干扰素（interferon，IFN）等，检测细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）等细胞毒作用，制备淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK细胞）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）等用于临床肿瘤治疗、癌症的早期诊断和预防，也可以通过培养淋巴细胞，对其染色体进行对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行早期预防和治疗。
2.遗传性疾病的产前检查
用羊膜穿刺术获得羊水中的胎儿细胞进行培养，便可在妊娠早期诊断胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸形。少量胎儿脱落细胞经2～4周生长，形成单层上皮样细胞，进行染色体分析，或检测甲胎蛋白等，可于产前筛查出几十种代谢性疾病与遗传性疾病，较准确地指导优生优育。
此外，细胞培养技术尚用于药物效应检测、肾衰性贫血等临床诊疗。
四、在动物育种上的应用
利用细胞融合技术、细胞杂交技术以及转基因技术，人们能够在细胞水平操作并改变动物基因，进行遗传物质重组，从而完成新品种的培育。目前，卵母细胞体外培养、体外受精、胚胎分割和移植等技术已较成熟，并应用于家畜繁殖生产中。这些研究成果和克隆羊多莉的问世，为动物遗传育种开辟了一条新途径。单元小结
本章主要介绍了动物细胞培养的基本概念，动物细胞培养发展史，以及动物细胞培养在各相关领域中的应用等内容。动物细胞培养是指从动物活体内取出的组织或细胞，模拟体内生理环境，在体外建立无菌、适温和适宜营养的条件，使细胞生存和扩增，并维持其正常结构与功能的方法。动物细胞培养技术从创立至今已有100多年历史，到20世纪50年代，在培养器材、培养液和培养方法等各方面都有很大改进，使细胞培养技术进入迅速发展阶段。近年来干细胞研究的再兴起和诱导多能干细胞技术的建立，使细胞培养技术成为人类疾病康复的重要手段，它使上世纪的药物治疗转变为本世纪的细胞治疗，使细胞培养技术更接近为人类服务的目的。动物细胞培养技术主要涉及生物学领域基础研究、生物制品生产、动物育种和临床医学等领域。相关链接
1.http://www.bioon.com/experiment/cellular11/309902.shtml
2.http://baike.baidu.com/view/626863.htm
3.http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_culture复习思考题
1.什么是动物细胞培养？
2.简述动物细胞培养技术的应用领域。（刘小玲）第二章 动物细胞培养的基本知识教学目的及要求
1.掌握动物细胞培养的基本知识；
2.熟悉细胞培养实验室常规设备。第一节 培养细胞的细胞生物学特征
细胞培养是指将体内某组织中分离的细胞置于体外模拟环境中，使其生长分裂，并维持其结构和功能的培养技术。每种培养细胞可视为特定的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相似的基本结构和功能，也可能有一些不同于体内细胞的性状。
一、培养细胞的生长类型和形态特征
培养细胞根据是否需要贴附支持物，可分为贴附型和悬浮型两大类。（一）贴附型细胞
贴附型细胞指贴附于支持物才能正常生长的细胞。大多数培养细胞属于这种，可分为以下四种类型（图2-1）。图2-1 培养细胞的形态
1.成纤维型细胞
此类细胞在支持物表面生长时呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出长短不同的突起，生长时呈放射状、旋涡状或似栅栏状。凡中胚层间质起源的组织细胞（如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞等）进行培养时，表现为成纤维型生长。
2.上皮型细胞
细胞呈扁平不规则多角形，有圆形细胞核位于细胞中央，细胞间紧密相连，有连接成片的能力，细胞密集稍高时集结成单层膜状。来源于内、外胚层细胞，如皮肤、消化管上皮、肝、胰、肺泡等组织细胞培养时，在培养时呈上皮型生长。
3.游走型细胞
这种细胞呈散在生长，一般不连接成片状。胞质常伸出伪足或突起。细胞能速度较快且方向不规则地游走或呈活跃的变形运动。此型细胞不很稳定，有时难以和其他类型细胞区别。常见于单核巨噬细胞系统的细胞和培养早期的羊水细胞。
4.多型细胞
多型细胞是形态上不规则的细胞，一般分为胞体和胞突，胞体略呈多角形，而胞突常为细长形。如神经细胞等难以确定其规律和特定形态的细胞，可统归于此类。（二）悬浮型细胞
少数细胞培养时不贴附在支持物上，呈悬浮状态生长。包括一些取自血、脾或骨髓的细胞，尤其是血液白细胞及癌细胞。此型细胞悬浮生长良好，细胞呈圆形，呈单个细胞或是细小的细胞团。悬浮细胞生存空间大，能够大量增殖，具有传代方便、易于收获细胞等优点，适于进行血液病的研究。
二、培养细胞分化状态的变化
细胞在离体之后，失去了神经体液的调节和不同种类细胞间的相互影响，生活在相对恒定的环境中，其分化可能会出现不适应和去分化等变化。不适应性表现为，分化能力减弱或不明显，逐渐失去形态和功能特性。去分化是指细胞在体外不可逆地失去原有特性，但是去分化并不代表分化能力完全丧失。细胞是否表现分化，关键在于是否存在使细胞分化的条件。从正常培养细胞接触抑制和密度抑制的特点，可看出培养细胞仍可被视为整体。这种相互作用与依存的关系调控着细胞的分化过程。体内外细胞分化的具体表现常常不同。如二倍体成纤维细胞于体外可传代50代左右，相当于150～300个细胞周期，呈现着发展分化的生命过程。
三、培养细胞的生长特点
细胞在体外培养时具有贴附、接触性抑制和密度依赖性抑制等生长特点。（一）贴附
贴附并伸展是多数贴壁细胞的生长特点。细胞的贴附与伸展分为几个阶段。以成纤维细胞为例，一般细胞接种后，5～10min便可见细胞以伪足附着于底物形成一些接触点；接着，细胞逐渐呈放射状地伸展开，细胞体的中心部分随之变为扁平；最后，细胞变为成纤维细胞的形态。细胞附着于底物并非一种需要能量的过程，一般认为与电2+荷相关。一些特殊的促细胞附着物质、离子作用（Ca）、机械、物理、生物因素等都会影响细胞贴附。（二）接触性抑制
接触抑制是某些贴附型细胞生长特性。以成纤维细胞为例，正常细胞在不停地活动或移动中，细胞膜呈现特征性皱褶样活动。当细胞相互靠近时，将停止移动并向另一个方向离开；细胞被围绕接触时将不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动停止，此即接触抑制。正常细胞不会相互重叠生长，但转化细胞或癌瘤细胞间的接触抑制下降，可重叠生长。（三）密度依赖性抑制
当细胞生长汇合成单层时，细胞间比较拥挤，扁平形状减小；与培养液接触的表面区域亦减小，同时，紧靠着细胞周围的一些营养物质将逐渐消耗。这种形成单层的细胞，在静止状态能维持一段时间，但不发生分裂增殖，这种生长特性即为密度依赖性抑制。转化细胞或恶性肿瘤细胞的密度依赖性调节通常降低，可以生长至终末细胞密度。
四、细胞的生长和增殖过程
细胞的生长和增殖过程可从三个不同的层面进行描述，即单个细胞、细胞系及每代细胞的生长过程，具体介绍如下。（一）单个细胞的生长过程
即细胞周期，是指从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次分裂结束为止。细胞周期一般分为先后连续的4个时期：①G1期（gap1），指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间；②S期（synthesis-phase），指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中；③G2期（gap2），指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期，又称D期（mitosis or division），细胞分裂开始到结束。细胞周期的长短与物种的细胞类型有关，不同类型细胞的G1期长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞；②休眠细胞，暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等；③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂，又称终末细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。（二）细胞系的生长过程
从体内组织直接分离并置于体外培养的细胞，在其传代之前称为原代培养。培养细胞经持续生长繁殖，达到一定细胞密度后，应当进行分瓶传代。传代生长之后的细胞便成为细胞系。正常细胞系的寿命只能维持一定的寿命期限，称为有限细胞系。细胞系能够存活时间的长短，主要取决于来源的种族、组织及年龄。组织细胞的培养过程一般可分为三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期（图2-2）。图2-2 培养细胞的生长与增殖过程
1.原代培养期
新鲜组织自体内取出并在体外培养，生长至第一次传代的时期。原代培养通常为异质性，含较少的生长组分，为二倍体核型。此期细胞的形状与体内相似，细胞移动较为活跃，有细胞分裂并不旺盛，相对于部分传代细胞，原代细胞更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。
2.传代期
原代培养达一定细胞密度后，应接种培养，即传代。传代约数天至1周左右即可重复一次，持续数月。此期细胞增殖旺盛，仍为二倍体核型，并保留原组织细胞的特征。大多数细胞系是有限细胞系。当反复长期传代，细胞将逐渐失去二倍体性质，细胞增殖变慢而停止分裂，进入衰退期。
3.衰退期
在体外培养细胞的生命期间有“危机期”，有限细胞系若不能通过，将进入衰退期而趋于死亡；在传代过程中，少数细胞系通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。（三）每代培养细胞的生长过程
每代细胞的生长过程可分为三个阶段：首先进入生长缓慢的潜伏期，随后为增殖迅速的指数生长期，最后到达生长停止的平台期（图2-3）。图2-3 培养细胞的生长过程
1.潜伏期（latent phase）
细胞在被分瓶接种后，首先经过悬浮期。此时，细胞在培养液中呈悬浮状，胞质回缩，胞体呈圆球形。接着，细胞贴附于载体表面，称贴壁。贴附是贴壁型细胞生长增殖的前提条件。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段。此时，细胞有运动或活动，但基本无增殖，少见分裂相。潜伏期与细胞种类、培养基性质和细胞接种密度等密切相关。原代培养细胞的潜伏期较长，为24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞系的潜伏期短，仅需6～24小时。当开始出现细胞分裂相并逐渐增多时，细胞进入指数增殖期。
2.指数生长期（logarithmic growth phase）
指数生长期是细胞分裂增殖最旺盛的阶段，呈分裂相的细胞显著增多。此期细胞呈分裂相的比例可作为判定细胞生长是否旺盛的重要标志，通常以细胞分裂相指数（mitotic index，MI）作为衡量标志，即在特定细胞群体的每1000个细胞中的呈分裂相的细胞数。细胞的分裂相指数一般介于0.1％～0.5％之间，原代培养细胞的分裂相指数较低，连续细胞系和肿瘤细胞的细胞分裂相指数可高达3％～5％。此时细胞的活力最好，是进行各种实验及细胞冻存的最佳时期。
3.平台期（plateau）
又称停滞期（stagnate phase）。经过指数生长期的快速增殖，当细胞数量达到饱和密度后，细胞的增殖活动停止，但仍有代谢活动。若不进行及时分瓶传代，因培养液中营养耗尽、pH值下降、代谢产物积聚等原因，细胞形态就会发生改变，贴壁细胞开始脱落，严重的发生死亡。在光镜下，活细胞是均质而透明的，结构不明显，在生长期常有1～2个核仁。当细胞机能状态不良时，细胞的轮廓增强，反差增大。若在胞质中出现颗粒、脱滴和腔泡等现象时，表明细胞代谢不良。第二节 培养细胞的生长条件
一、营养需要
离体细胞体外培养需要供其生存的营养和适宜的环境。在组织培养技术发展的早期，多数细胞培养是在血浆或血纤维蛋白原凝块中，或在组织提取物中生长。经反复的研究已证实，体外培养细胞如体内一样需要一些基本营养物质及促生长因子等。（一）氨基酸
氨基酸是细胞合成蛋白质的基本原料。尽管不同种类的细胞对氨基酸的需求各异，但都离不开12种必需的氨基酸，这些必需氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸。此外，谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在细胞代谢过程中具有重要作用。（二）碳水化合物
碳水化合物是细胞生长的主要能量来源。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。培养的动物细胞时几乎都以葡萄糖作为必需的能源物质。（三）无机离子与微量元素
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等常量元素外，还需要多种微量元素，如铁、锌、锰、钼、硒、铜、钒等。（四）维生素
维生素是维持细胞生长的一大类生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K。水溶性维生素包括生物素、叶酸、吡哆醇、核黄素、烟酰胺、泛酸、硫胺素和维生素B。维生素12C对能够合成胶原的细胞更为重要。（五）促生长因子及激素
各种生长因子及激素对维持特定类型细胞的功能、保持细胞的分化或未分化状态具有十分重要的作用。
二、生存环境（一）温度
恒定而适宜的温度是维持细胞旺盛生长的必要条件之一。不同种类的细胞对培养温度要求不同。细胞代谢随温度降低而减慢，对低温的耐受力较高温强。但当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质内冰晶损伤而死亡。培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），在深低温时如-80℃或-196℃（液氮），细胞可长期保存。（二）气体环境
适宜的气体环境也是哺乳动物细胞培养生存的必需条件之一，所需气体环境主要有氧气和二氧化碳。通常把细胞置于95％空气加5％二氧化碳组成的混合气体环境中开放培养。氧气的主要功能是参与三羧酸循环，产生供给细胞生长分裂需要的能量和合成细胞生长所需要的多种成分。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长分裂所需成分，它在细胞培养中的另一作用在于维持培养基的pH值。（三）渗透压
尽管大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性，细胞最好生活在等渗环境之中（细胞内外的渗透压一致）。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260～320mOsm/kg的范围都适宜。人血浆渗透压290mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压。小鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。
三、缓冲系统
大多数培养细胞所需pH值在7.2～7.4之间。细胞培养最适pH值随培养细胞的种类不同而异。多数培养液pH值的维持靠NaHCO与3CO体系进行缓冲，此时，气体环境中的CO浓度应与培养液中22NaHCO浓度相平衡。如果培养箱空气中CO浓度设定在5％，则培32养液中NaHCO的浓度需为1.97g/L；如果CO浓度维持在10％，培养32液中NaHCO的浓度需为3.95g/L。在细胞培养过程中，细胞培养瓶的3盖子不应拧得过紧，以保证培养瓶内外的气体交换。
四、无污染及无毒环境
这是保证细胞培养成功的基本条件。培养细胞对微生物及有害有毒物质没有抵抗能力，培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。第三节 细胞培养实验室要求
一、动物细胞培养实验室的设置
细胞培养是一种无菌操作技术。细胞培养室的设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。常规细胞培养实验室应包括以下分区。（一）无菌操作区
一般由更衣间、缓冲间、操作间组成。更衣间供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。缓冲间位于更衣间与操作间之间，保证操作间的无菌环境。无菌操作间则专用于无菌操作和细胞培养。其大小要适当，其顶部不宜过高以保证紫外线的有效灭菌效果，墙壁光滑无死角，以便清洗和消毒。（二）孵育区
对无菌的要求不如无菌区那样严格，仍需清洁而无灰尘，应在干扰少的区域。（三）制备区
主要进行培养液及有关培养用液体等的制备，必须严格无菌操作。（四）储藏区
主要是取放方便，主要有冰箱、干燥箱、液氮罐、常规培养用耗材等。此环境也需要清洁、无灰尘。（五）清洗和消毒灭菌区
灭菌应该与其他区分开，主要进行所有细胞培养用器皿的清洗、准备及灭菌等工作。
二、动物细胞培养实验室的设备（一）超净工作台、生物安全柜
是常用的无菌操作装置，按气流方向的不同可分为水平流和垂直流两种，以垂直流较为常用，气流从上向下流动，形成气流屏障，能较好地保持台面的无菌操作。（二）控温设备
主要指CO培养箱、三气（O、N、CO）培养箱、隔水式电热2222恒温培养箱、生化培养箱、冰箱、低温冷藏箱、水浴箱、水浴摇床、制冰机等。（三）离心机
常用为低速离心机，或根据需要选择冷冻离心机。（四）显微设备
倒置显微镜，另外可根据需要选配相差装置、荧光装置、保温装置、缩时拍摄装置等。（五）细胞计数设备
血细胞计数板或电子细胞计数仪等。（六）消毒设备
高压灭菌锅和电热干燥箱及过滤器等。（七）水纯化设备和分析设备
纯水仪、酶标仪、紫外分光光度计等。（八）配液设备
电子天平、pH计、磁力搅拌器等。
三、动物细胞培养实验室常用器具（一）培养用器皿
培养瓶、培养皿、多孔培养板等。（二）操作用器皿
玻璃瓶、吸管、加样器、离心管、试管架、橡皮吸头、冻存管、注射器、漏斗、量筒、试剂瓶等。（三）器械
主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有手术刀、手术剪、眼科虹膜剪、血管钳、组织镊和眼科镊等。单元小结
本章内容主要从培养细胞的生物学特征、生长条件和细胞培养室的要求三方面进行简要概括。了解培养细胞的生长类型和形态特征，分化状态的变化，生长特点及增殖过程；掌握培养细胞的营养和环境要求；熟悉细胞培养室常规的设置与设备，从而对细胞培养基础理论形成初步的认识，为后续的相关实验奠定基础。复习思考题
1.简要概括培养细胞的类型。
2.简述培养细胞的营养需要？
3.在体外培养过程中，每代细胞的生长过程包括哪几个阶段？（吴宝金）第三章 动物细胞培养的准备工作教学目的及要求
1.掌握动物细胞培养用品的清洗、包装和灭菌；
2.熟悉动物细胞培养基的分类；
3.了解动物细胞培养基的配制方法。
动物细胞培养的准备工作对开展细胞培养异常重要，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括：器皿的清洗、干燥与消毒；培养基与其他试剂的配制、灭菌及分装；无菌室或超净台的清洁与消毒；培养箱及其他仪器的检查与调试等。
第一节 细胞培养用品的清洗、包装和灭菌
一、细胞培养用品的清洗（一）玻璃器皿
组织细胞培养中，玻璃器皿的用量大，清洗要求非常严格。玻璃器皿的清洗步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗等。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，更不能残留任何物质。
1.浸泡
新的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和玻璃表面附着的碱性物质。清水浸泡包括：①初次使用和使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉；②再次使用的玻璃器皿，因使用后的玻璃器皿表面常附有大量的蛋白质，干涸后不易洗掉，浸泡时要求将玻璃器皿完全浸入水中，不能留有气泡或浮在液面上。
2.刷洗
选用合适的软毛刷和优质洗涤剂刷洗浸泡后的玻璃器皿，以去除器皿表面附着较牢的杂质。刷洗强度和时间要适度，以免损害器皿表面光泽度。刷洗干净的玻璃器皿用清水冲净皂液、晾干，准备浸酸。
3.浸酸
浸酸是玻璃器皿清洗过程中的重要环节。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，其强氧化作用可除掉刷洗不净的微量杂质。常用的清洁液按重铬酸钾（g）与浓硫酸（ml）及蒸馏水（ml）的配制比例不同分为强清洁液、次强清洗液和弱清洁液（处方和配制方法详见实验教程）。
浸酸操作时应注意保护好面部及身体裸露部分；将器皿内充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面；浸酸时间一般过夜或更长，最短不应少于6h；反复浸酸后的玻璃器皿可能会发脆，放取器皿时要轻拿轻放。
4.冲洗
浸酸后的玻璃器皿都必须用清水充分冲洗，使瓶壁不留污渍或酸液残迹。若用手工操作，则需流动的自来水冲洗10～15次，最后再用蒸馏水清洗3～5次，晾干备用。冲洗也可选用洗涤装置，既省力又有效。（二）胶塞
橡胶制品主要指瓶塞。带有大量滑石粉及杂质是新购置瓶塞的主要问题，先用自来水作一般冲洗后，然后，按以下方法做常规处理：①每次用后立即置入水中浸泡；②用2％NaOH或洗衣粉煮沸10～20min，以除掉其中的蛋白质；③自来水冲洗后，用稀盐酸浸泡30min或蒸馏水冲洗后再煮沸10～20min，晾干备用。（三）塑料制品
塑料制品现多为一次性物品，采用无毒并经特殊处理的包装，打开包装即可用。必要时可按以下步骤清洗：①用2％NaOH溶液浸泡过夜；②用自来水充分冲洗，再用5％盐酸溶液浸泡30min；③用自来水和蒸馏水依次冲洗干净，晾干备用。注意清洗时应选用棉花或柔软纱布擦洗，用硬毛刷可导致塑料表面损坏后细胞不易贴壁。
二、细胞培养用品的包装
合格的包装对细胞培养用品的消毒和储存至关重要。常用包装材料有牛皮纸、硫酸纸、铝箔、纱布、棉布、不锈钢饭盒、储槽等。注射器、金属器械等小型器皿用牛皮纸或纱布包装后再装入饭盒或储槽内，较大的器皿可行铝箔或棉布包扎。
三、细胞培养用品的消毒灭菌
细胞污染的首要问题是细菌、真菌和病毒等微生物污染。污染的主要原因是操作者对以下常规环节的疏忽引起，如无菌操作间或周围空间的不洁，尤其是超净台内消毒不彻底。由于培养各环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作规范，防止发生污染。
消毒方法分为三类：物理灭菌（紫外线、干烤、高压蒸汽、过滤等）、化学灭菌（各种化学消毒剂）和抗生素（青霉素、链霉素、庆大霉素二性霉素等）。（一）物理消毒法
1.射线消毒灭菌60
主要使用Co、X射线进行消毒灭菌，用于牛血清和塑料制品的灭菌。
2.紫外线消毒
低能量电磁辐射的紫外线可杀死多种微生物。目前常用的无臭氧型紫外灯用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等，这是常使用的消毒方法之一。消毒时，根据不同目的设置消毒距离：空气消毒时，灯管应距地面2.5m以内，台面消毒应在80cm以内，培养器皿的消毒在30cm以内。消毒的时间与效能存在一定关系，但不是绝对的，紫外线照射时间再长，也不能达到100％灭菌，最多只能把90％的细菌消灭，过长照射没有意义。消毒时，消毒物品不宜相互遮挡，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外灯消毒时，操作人员应注意：①不进入紫外线照射区域，因紫外线对皮肤和眼睛均可造成伤害；②切勿在紫外灯照射的超净台内操作，因其对培养的细胞和试剂等也产生不良影响。
3.干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。将细胞培养所用器皿放入干烤箱内，注意物品间保留间隙，并不要靠近加热装置。加热至160℃，保持90～120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，持续5～8h。干热灭菌后首先要切断电源，待箱体冷却后再取出物品，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内玻璃器皿破裂。
4.湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
湿热灭菌是最有效的灭菌方法。主要用于布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液的灭菌。应注意，不同压力下蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。通常选用压力102.97kPa（121℃），20～30min可达到灭菌目的。
消毒时消毒器内物品不能装得过满，以防止消毒器内气流受阻而发生危险。要定时检查压力及其他安全参数，防止消毒时意外事故发生。
5.滤过除菌
培养用液和各种不能高压灭菌的溶液可用此法灭菌，采用金属滤器或小型塑料滤器，极大方便了操作。（二）化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
1.70％（或75％）酒精
手、实验用品和工作台面常用70％酒精棉球（卫生级酒精）消毒，是细胞培养室常用消毒液体之一。
2.0.1％新洁尔灭
超净台旁应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布，用于手和前臂的清洗，以及工作后超净台面的清洁。
3.来苏儿水（煤酚皂溶液）
主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，空气的消毒尤其是污染细胞的消毒处理。
4.0.5％过氧乙酸
该药液为强效消毒剂，10min即可杀死芽孢。用喷洒和擦拭方式用于各种物品的表面消毒。（三）抗生素消毒
利用抗生素消毒是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法，最常用于培养液的消毒。细胞培养实验中常用的抗生素有青霉素G、链霉素、庆大霉素、二性霉素B等，不同抗生素杀灭不同微生物，应根据需要选择。单元小结
清洗培养用品的过程是细胞培养成功与否的重要环节。一定要用自来水冲洗10～15次浸酸之后的玻璃制品，因为残存的洗液对细胞粘附有很大的影响。清洗塑料制品时切记不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后，细胞不易贴壁。干热灭菌时，器皿烤完后，应等待温度降下之后才能开烤箱门；高压灭菌后，器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。使用化学消毒法时，配制70％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。相关链接
1.http://shiyan.ebioe.com/animalcellculture04_2.htm
2.http://www.51protocol.com/cell/cell2/20090306/60873.html
3.http://www.viansaga.cn/FileUpLoad/cell％20culture％202.pdf
4.http://www.5ibio.com/html/cell/20070528/11822.html复习思考题
1.简述细胞培养用的玻璃器皿的清洗步骤。
2.简述培养用品消毒灭菌的方法。（孙鹂）第二节 细胞培养常用液体分类、配制和无菌处理
细胞在体外的生存环境是人工模拟环境，除需无菌、温度、空气、pH等条件以外，最主要的是培养基。细胞的生长环境、营养和生长物质均由培养基提供。因此，细胞培养基的设计应该是为细胞提供尽可能接近体内的环境。培养基必须具有下述基本条件：①营养物质，培养基必须供给活细胞所需要的全部营养；②缓冲能力，培养基必须含有非毒性的缓冲液，而且pH值在7.2～7.4之间；③等渗性，溶解于培养基的物质浓度产生的渗透压必须与细胞内一致；④无菌，培养基不能有微生物，微生物在培养基中繁殖会破坏培养的活细胞。
培养基种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按来源分为合成培养基和天然培养基。合成培养基的主要成分有氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其他辅助物质。
此外，细胞培养还涉及平衡盐溶液、消化液等，均需要严格的pH条件和无菌处理。
一、平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）
BSS又称生理盐或盐溶液，具有维持渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时供给细胞生存所需能量和无机离子。其中盐是细胞生命所需成分，而且在维持渗透压，缓冲和调节溶液的酸碱度方面起着重要的作用。绝大多数培养基是在BSS基础上，添加氨基酸、维生素和其他与血清中浓度相似的营养物质。
常用的平衡盐有：①D-PBS平衡盐，不含碳酸氢钠；②Hanks平衡盐（HBSS），含碳酸氢钠0.35mg/L；③Earle′s平衡盐（EBSS），2+2+含碳酸氢钠2.2mg/L；④PBS平衡盐，无Ca、Mg。详见表3-1。表3-1 几种常见平衡盐溶液组成成分
二、消化液
消化液用于分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶（Trypsin）和二乙胺四乙酸（EDTA）两种溶液最为常用。两者可以单独使用，也可以混合使用。（一）胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，必须放置冷暗干燥处保存。胰酶主要可以水解细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。牛或猪的胰腺是目前胰酶的主要来源。胰酶溶液在pH8.0、温2+2+度37℃时消化作用最强。胰酶活力会因Ca、Mg和血清蛋白的存2+2+在而降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca、Mg的D-Hanks平衡盐溶液配制，浓度为0.25％。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，胰酶的消化作用即可终止。
胰蛋白酶溶液配制：（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks平衡盐溶液（pH7.2左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks平衡盐溶液。搅拌混匀，置室温4h或4℃冰箱过夜，并不断搅拌振荡；（2）次日，先用滤纸粗滤，再在超净台内用针式滤器（0.22μm微孔滤膜）抽滤除菌。然后，分装于小瓶，-20℃保存以备使用，以免分解失效。常用浓度为0.25％或0.125％，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH值至7.2左右。（二）EDTA·Na溶液4
EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，价格低廉，对细胞有一定的离散作用，使用方便。
常用工作液浓度为0.02％，可按1:1与0.25％的胰蛋白酶溶液混合使用（混合液）。
三、天然培养基
来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基称之为天然培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，天然培养基成为体外细胞培养唯一培养基，由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。
细胞培养的发展，培养基的质量是关键，而培养基的主要成分中动物血清（serum）对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。牛血清在动物血清的应用中是最为广泛的，所以保证血清质量是促进生物制品质量提高的重要环节。（一）血清种类
当前牛血清是用于组织培养的主要血清，也用人血清、马血清等培养某些特殊细胞。在细胞培养中牛血清是用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新生牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛或8月龄胎牛的心脏穿刺取血；新生牛血清取自出生10天以内的新生牛；小牛血清取自出生16周以内的小牛。（二）血清的主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂的混合物，组成成分虽大部分已知，但有一部分尚不清楚，且随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同，血清组成及含量也不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性具有生理平衡的作用。
四、合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。目前合成培养基已经成为一种标准化商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且不断发展。合成培养基的出现极大地促进了组织培养技术的普及与发展。这类培养基化学成分精确、重复性强，微生物生长缓慢，但价格昂贵，适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。（一）基本培养基
1.基本组分
由无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物四大类物质。除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入pH指示剂——酚红（当溶液pH值为7.2～7.4时呈桃红色，当溶液酸性时pH值小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH值大于8.4呈紫红色）。
2.种类（1）MEM（minimum eagle medium）仅含12种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐，由于成分简单，易于添加某种特殊成分适于某些特殊细胞培养。（2）DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）在MEM培养基的基础上研制而成。在MEM的基础上增加了各种成分用量，又分为高糖型（<4500g/L）和低糖型（<1000g/L）。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。（3）IMDM（Iscove’s modified Dulbecco’s medium）含有42种成分，与DMEM比较增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。适合细胞密度较低、细胞生长困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养、DNA转染后转化细胞的筛选培养。（4）RPMI1640最初是为培养小鼠白血病细胞而设计的。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634直至RPMI 1640。其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞和正常细胞的原代培养和传代培养等，是目前应用最为广泛的培养基之一。
3.培养基的配制
目前在国内市场主要是干粉型，只有在应用过程中正确配制，才能保证培养基质量。配制培养基要注意以下问题。（1）认真阅读说明书，说明书注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须3添加的，如NaHCO、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。3（2）配制时要保证充分溶解，在培养基完全溶解之后，NaHCO、3谷氨酰胺等物质才能添加。（3）应使用双蒸水或三蒸水酸制培养基，离子浓度低，三蒸水为最佳。（4）所用器皿须经过严格消毒。（5）应马上过滤配制好的培养基，无菌保存于4℃。（二）完全培养基（complete medium，CM）
可满足某微生物的各种营养缺陷型菌株生长需要的天然或半合成培养基。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和核苷酸之类的天然物质（如蛋白胨或酵母膏等）配制而成。完全培养基与基本培养基相互配合，可分离、筛选微生物的营养缺陷型突变株。（三）无血清培养基
不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。一般认为是由两部分组成，即基础培养基和替代血清的补充因子。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。
1.无血清培养基的基本配方
无血清培养基的基本成分为基础培养基及添加组分。基础培养液DMEM最为常用，一般两者以1:1混合。添加组分包括以下几大类物质。（1）促贴壁物质
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